Recherche fondamentale

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies cérébrales, la pose d'une pompe pour des perfusions dans le cerveau et des tests de tolérance au glucose, une partie soumise à un régime gras, pour étudier une voie moléculaire liée au diabète de type 2. Elles sont hébergées seules et tuées par dislocation cervicale pour prélèvement des tissus. Le porteur qualifie de "besoin crucial" la recherche de nouvelles cibles et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité participe au développement de pathologies chroniques tel que le diabète de type 2 (DT2). Le DT2 se caractérise par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion et d’action de l’insuline. Au cours de l’obésité, une saturation de la capacité de stockage du tissu adipeux (TA) favorise une hyperlipidémie qui conduit à l’accumulation des acides gras en excès dans les tissus périphériques insulino-sensibles favorisant l’altération de leur fonctionnement. Cette lipotoxicité peut notamment être induite via la synthèse de dérivés lipidiques tels que les céramides : des médiateurs clés de l’insulino-résistance (IR) qui constitue le principal facteur de risque du DT2. Le traitement du DT2 est une priorité de santé publique mondiale, un certain nombre de médicaments antidiabétiques sont arrivés sur le marché mais ont échoués en raison de problèmes de toxicité. Nous avons un besoin crucial de nouveaux paradigmes pour développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Aussi, il est actuellement reconnu que l’hypothalamus joue un rôle crucial dans la régulation de la prise alimentaire et le contrôle de l’homéostasie glucidique via l’intégration de signaux métaboliques périphériques tels que la leptine et l’insuline. L'homéostasie glucidique est principalement contrôlée par la sécrétion d'insuline qui maintien la glycémie en favorisant le stockage du glucose en excès dans la circulation sanguine dans les tissus cibles insulino-sensibles. Il est également reconnu que l’expansion du TA au cours de l’obésité s’accompagne d’une altération de la sécrétion d’adipokines (molécules produites par le TA) notamment la résistine, une hormone connue pour son rôle causal dans le développement de l’IR et du DT2. La résistine agit au niveau de l’hypothalamus en promouvant l’IR et de la neuro-inflammation participant ainsi à la dérégulation de l’homéostasie glucidique. Compte tenu de l’implication de l’hypothalamus dans la pathogénèse du DT2, il est primordial de comprendre quels sont les mécanismes sous tendant des dysfonctionnements hypothalamiques induits par l’action de la résistine et comment ils précèdent et provoquent la survenue de l’IR et du DT2. Nous évaluerons l’implication potentielle de la synthèse de novo des céramides dans la médiation des effets insulino-résistants et inflammatoires de la résistine au niveau hypothalamique et leurs conséquences sur le contrôle de l’homéostasie glucidique.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’implication de la synthèse de novo des céramides hypothalamiques dans l’inflammation hypothalamique et la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la résistine. Cette étude vise à mettre en évidence la synthèse de novo des céramides comme nouvelle voie de signalisation participant à la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par l’action hypothalamique de la résistine en situation d'obésité. Cette voie de signalisation contribuerait ainsi à la dérégulation du contrôle hypothalamique de l’homéostasie glucidique induite par la résistine. Le rôle de la synthèse de novo des céramides a été clairement établit dans la lipotoxicité touchant les tissus périphériques. Des recherches préliminaires déjà effectuées au laboratoire laissent apparaitre un nouveau concept dans les dysfonctionnements moléculaires hypothalamiques qui impliquent une interaction entre une adipokine, la résistine, et la synthèse de novo des céramides. Ainsi, cibler la synthèse de novo des céramides au niveau central permettrait de prévenir l’insulino-résistance et l’inflammation hypothalamique et d’en éviter les répercussions néfastes sur l’homéostasie glucidique. Il apparait alors que comprendre plus en profondeur le rôle du métabolisme des céramides hypothalamique permettrait de générer de nouveaux inhibiteurs moléculaires ciblant la synthèse de novo des céramides ou ses dérivés pour prévenir les effets de l’obésité au niveau hypothalamique et ainsi éviter le développement du DT2.

Procédures

Les souris de toutes les procédures (P) subiront 2 chirurgies stéréotaxiques, sauf la moitié des souris de la P1 qui, après les 10j suivant l'injection de l'adénovirus, seront soumises à un régime riche en graisse : - Une 1ère chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) afin d'injecter les adénovirus dans le troisième ventricule. - Une 2ème chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) 10j plus tard pour poser le système de pompe et de canule ALZET pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires (15j). Les souris de la P1 subiront, à la fin des 15j de perfusion ou de régime riche en graisse, un test de tolérance au glucose (GTT) (120 min). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvement à la queue de sang afin de mesurer l’insulinémie. Les souris de la P2 subiront, à la fin des 15j de perfusion, un test de sensibilité à l’insuline (ITT) (120 min) ainsi qu’un GTT 2 jours après l’ITT. Pendant l’ITT, aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Pendant le GTT, aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvement à la queue de sang afin de mesurer l’insulinémie. Les souris de la P3 subiront, à la fin des 15j de perfusion, un test de tolérance au pyruvate (PyTT) (120 min) ainsi qu’un test de tolérance au glycérol (GyTT) (120 min) 2 jours après le PyTT. Pendant le PyTT et le GyTT, aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie (7x5µl de sang = 35µl). Les souris de la P4 subiront, en parallèle de la pose des pompes, l’implantation d’un cathéter intraveineux dans la jugulaire de chaque souris de la procédure dans le but de réaliser un clamp euglycémique hyperinsulinémique (2h) : prélèvement de sang toutes les 20min pendant 2h pour suivre la glycémie. Les souris de la P5 subiront, à la fin des 15 jours de perfusion, une mesure de l’activité nerveuse autonome au niveau de la branche thoracique du nerf vague et du tronc sympathique le long de l’artère carotide (20 min) grâce à une incision de la peau et de la couche musculaire.

Impact sur les animaux

Les procédures font intervenir des injections et perfusions stéréotaxiques, chirurgies qui peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux tels qu’une perte de poids, des troubles alimentaire, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crâne.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter les tissus pour de réaliser des RTqPCR sur l'hypothalamus et le foie, des immunohistochimies sur coupes de cerveau, une analyse lipidomique de l'hypothalamus et estimer l'incorporation du glucose par les tissus insulino-sensibles.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscle, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l’organisme des besoins énergétiques. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions, c’est pour cela que l’utilisation de modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, des données préliminaires ont été obtenues sur une culture cellulaire in vitro sur une lignée cellulaire neuronale hypothalamique murine adulte (mHypoA) afin de mettre en évidence l’implication du métabolisme des céramides dans l’inflammation et l’altération de la sensibilité à l’insuline chez ces modèles cellulaires, il nous reste à démontrer que cela est bien le cas in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux nous avons effectué un travail préliminaire qui nous a permis d’identifier l’enzyme SPT, première enzyme de la synthèse de novo des céramides comme étant impliqué dans la médiation des effets pro-inflammatoire et insulinorésistant de la résistine dans la lignée cellulaire neuronale hypothalamique murine adulte (mHypoA). Le nombre d’animaux a été calculé pour que le test statistique de Kruskal-Walllis puisse être fiable et robuste, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d’animaux le plus faible possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en cage individuelle puisqu’il est primordial pour notre étude de contrôler quotidiennement et individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Il est indispensable d'avoir un suivi personnalisé du poids corporel et de la prise alimentaire, en effet, si nous n'obtenons pas de résultats homogènes au sein d'un groupe expérimental lors de l'analyse d'un GTT ou d'une RTqPCR par exemple, nous remonterons l'historique de l'animal en comparant sa prise alimentaire et son poids corporel notamment afin de vérifier s'il a plus ou moins mangé/pris de poids qu'un autre individu du même groupe expérimental, ce qui permettra d'expliquer certaines différences. Bien que les procédures chirurgicales soient lourdes et douloureuses, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. En effet, les chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous Isoflurane accompagnée d'une injection de Lidocaïne au niveau de site de l'incision avant en tant qu'anesthésique local. Durant toute la procédure chirurgicale, les animaux reposent sur un tapis chauffant et reçoivent une injection de solution saline (NaCl 0,9%, 10ml/kg/h) en sous-cutanée pour prévenir leur déshydratation. Aussi, lors de la phase de réveil, les animaux, toujours sur un tapis chauffant, reçoive une injection intrapéritonéale de glucose 5% (2g/kg). De plus, en période post-opératoire, pour suivre l'antalgie, dès la fin des sutures, du Ketoprofene (2mg/kg) est injecté en sous-cutané, ainsi que le jour suivant l'opération. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux. Elle se compose de score et d'actions à réaliser selon le score. La grille de contrôle du poids est la suivante : normal : score = 0 ; perte de 5 à 10 % : score = 1 ; perte > 15 % : score =2. La grille de contrôle du comportement est la suivante : normal : score = 0 ; prostration, manque de toilettage : score = 1 ; hyperactivité lors de la manipulation, vocalisations sonores répétées : score = 2. Un score égal à 1 dans les deux grilles déclenche la sortie de l'animal de la procédure. Un score égal à 2 dans les deux grilles entraine la sortie de l'animal de la procédure et l'euthanasie si absence d'amélioration des scores.

Choix des espèces

Le modèle de souris est un outil complémentaire essentiel, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.

40 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de moelle osseuse, puis une blessure musculaire provoquée par injection d'un agent chimique dans les deux pattes, pour étudier le rôle d'une protéine dans la régénération du muscle vieillissant. L'irradiation provoque une immunodépression et une fatigue de plusieurs jours. Le tissu musculaire est prélevé après la mise à mort, et le porteur indique avoir mené en amont des essais sur cultures cellulaires.

Objectifs

Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion. Certaines cellules de l'immunité jouent un rôle important dans ce processus, comme les macrophages. Cependant, au cours du vieillissement, le processus de réparation musculaire se fait mal, en partie car les macrophages fonctionnement moins bien. Une protéine X a été montrée comme régulant l'activité des macrophages dans des modèles mimant la réparation musculaire in vitro. La validation du rôle de cette protéine dans les macrophages au cours de la régénération musculaire in vivo chez la souris âgée nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation du gène à l’origine de cette molécule. Une approche réductrice en nombre d'animaux consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses âgées saines. De cette manière, seuls les macrophages sont inactivés pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire avec un agent chimique est réalisée afin de pouvoir analyser la régénération musculaire de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider le rôle de cette molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire dans la souris âgée.

Bénéfices attendus

Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace est altéré au cours du vieillissement. La connaissance des mécanismes moléculaires du processus de régénération pourrait ouvrir des voies thérapeutiques afin d'aider ce processus. L'étude permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les macrophages pour la régénération musculaire dans le sujet âgé.

Procédures

Les souris subiront les interventions suivantes : - irradiation (1 fois 10 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - prélèvement sanguin (1 fois 10 minutes sous anesthésie) (pour un seul groupe de souris, 1/3) -traitement antalgique par injection sous cutanée - induction de blessure musculaire : injection dans les deux pattes d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie et analgésie).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (irradiation, injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur. L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et une perte de mobilité pendant environ 4 jours, et peut entraîner chez certains individus à une perte de poids de corps jusqu'à 5 jours après l'irradiation, et qui est récupérée ensuite. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager (la douleur étant traitée par analgésique).

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

Les alternatives non animales ont déjà été utilisées en amont de ce projet. Il s'agit d’expériences de culture cellulaire in vitro, qui montrent un rôle de la molécule dans la fonction des macrophages dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro. L'étude analysant les effets du vieillissement, des souris agées (24 mois) sont utilisées.

Réduction

Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car il permet de répondre à la question et car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux. Les études précédentes ont montré qu’un nombre de 5 individus par point d’analyse est suffisant pour réaliser des statistiques. De plus, l'établissement d'une lésion aux deux pattes de chaque souris permet de réduire par deux le nombre d'animaux, sans impact sur la mobilité des animaux.

Raffinement

Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie et l'analgésie lors de l'injection de la moelle osseuse, du prélèvement sanguin et de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions prophylactiques strictes et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée trihebdomadaire, la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique. Des points limites ont été établis sur l'observation du comportement des animaux et leurs poids.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme sont observées au cours de la régénération musculaire. Le modèle murin permet des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles (évaluation de la fonction contractile du muscle). L'existence de lignées murines génétiquement modifiées et permettant le traçage des populations de macrophages est un argument supplémentaire pour l'utilisation de cette espèce. Les souris sont utilisées à l'âge de 22 mois car le projet concerne la régénération musculaire chez l'individu âgé.

785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de cellules de glioblastome issues de patients, puis jusqu'à cinq types d'interventions, imagerie de fluorescence, injections répétées sur cinq semaines, gavages sur cinq cycles et perfusion cardiaque. Le sang et les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que le passage par un modèle animal est "indispensable" avant de tester ces molécules sur des patients.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde. Le traitement standard actuel (extraction chirurgicale, radiothérapie et chimiothérapie) n’est malheureusement pas curatif et la survie médiane des patients est de 14 mois. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies contre ce cancer. Le projet compte évaluer des molécules capables de cibler et d’éliminer les cellules de GBM, seules ou en combinaison avec des nanotechnologies. Le développement pharmaceutique de ces formulations a permis de formuler ces médicaments pour une utilisation clinique (formulations validées sur des lignées cellulaires de GBM humain). Il est maintenant important d’évaluer l’intérêt thérapeutique de ces nouvelles molécules sur différents modèles animaux, avant d’envisager un essai clinique chez l’Homme. Le projet consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients, dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats médicaments après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées).

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients (PDX), dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats-médicament après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées). Si l’intérêt thérapeutique est attesté et les doses maximales tolérées et efficaces déterminées, ces travaux pourront servir pour réduire le nombre de souris utilisées lors d’une future étude sur des modèles PDX où les cellules tumorales seront injectées au niveau du cerveau (= modèle orthotopique), modèle plus proche de l’Homme. La combinaison des résultats sur ces modèles sous-cutanés et orthotopiques de PDX serviront de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 2 types d'intervention : l’implantation tumorale sous-cutanée et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, un suivi de la biodistribution des molécules par imagerie de fluorescence (3 sessions au maximum sur une semaine qui durent plusieurs dizaines de minutes chacune), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) et une perfusion cardiaque. Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront jusqu’à 4 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Certains candidats médicaments pouvant être composés d’un anticancéreux, des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études de biodistribution et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur intérêt thérapeutique avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur efficacité chez les deux sexes. Des travaux in vitro sur cultures cellulaires vont être menés sur les cellules tumorales utilisées dans ce projet préalablement à son démarrage pour valider les formulations testées. Il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ces types de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacés par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du GBM, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité que nous allons effectuer dans un autre projet (n° APAFIS 38113) va nous permettre de raffiner la dose administrée. Le nombre d’animaux d'un sexe sera également réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez l'autre sexe. Un seul modèle tumoral sera testé chez le deuxième sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il est préférable de ne pas utiliser moins d’animaux, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffinée la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administré jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisées ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle sous-cutané de GBM chez la souris.

30 ouistitis vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des captures, des contentions, des séances d'IRM sous anesthésie et une biopsie de peau sous anesthésie, pour caractériser leurs capacités socio-cognitives et établir des corrélats cérébraux et génétiques. Le porteur classe les tests comportementaux, réactivité à l'humain et à la nouveauté, hors du champ des procédures réglementées, ne comptant comme telles que l'imagerie et la biopsie. Il affirme que le primate non-humain est "nécessaire" en neurosciences et que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

Ce projet vise à caractériser le phénotype des ouistitis hébergés dans notre établissement. Pour cela, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux. La plupart des tâches comportementales seront réalisées grâce à des dispositifs installés sur les cages d'hébergement. Ces tests ne sont pas considérés comme des procédures selon la définition de la Directive, car ils n'entraînent pas de stress/souffrance/angoisse supérieurs à ceux causés par l'introduction d'une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. En parallèle de ces tests comportementaux, certains animaux pourront être amenés à être testés dans un dispositif en 3 dimensions ou dans un dispositif de réalité virtuelle, qui se situent en dehors de la zone d'hébergement et nécessitent donc une capture et un isolement des animaux. De plus, afin de caractériser au mieux nos animaux, nous pourrons être amenés à réaliser des imageries cérébrales anatomiques (IRM) sous anesthésie afin d'avoir un corrélat entre le comportement et les structures cérébrales. Pour compléter la caractérisation, nous réaliserons le génotypage des animaux étudiés grâce à une biopsie de peau, sous anesthésie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux caractériser les capacités cognitives des ouistitis en captivité et d'établir des corrélats neuroanatomiques et génétiques avec ces capacités. Les observations des animaux dans leur groupe permettront de compléter cette caractérisation avec des informations sur l'organisation sociale des groupes.

Procédures

Les captures sont réalisées en quelques minutes.Si les animaux doivent être identifiés par rasage, la contention durera 5 minutes au maximum, environ une fois par mois (au maximum, en fonction de la visibilité de l'identification). Le transport dans les pièces de test durent entre 2 et 5 minutes. Chaque animal sera impliqué dans les tests comportements de réactivité à l’humain ou à la nouveauté sur la même période de temps, environ 5 fois/mois mais jamais dans la même journée. Ils resteront une heure au maximum dans les dispositifs. La procédure d’imagerie sera réalisée 2 fois (renouvelée une fois si les images recueillies ne sont pas correctement exploitables). Une session dure 3 heures environ (de la capture au réveil). L'isolement suivant le réveil dure environ 30 minutes. Une seule biopsie sera réalisée par animal (30 minutes d'anesthésie environ si réalisée en dehors d'une autre intervention).

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet les nuisances attendues seront liées - à la capture, le transport et l'isolement des animaux lors des tests dans les dispositifs extérieurs aux hébergements, - au stress lié à la présentation d'intrus/d'objets nouveaux, - au stress éventuel lié au retour dans le groupe, - à la capture et le rasage d'une petite partie de la queue ou du dos pour l'identification des animaux si cela s'avère nécessaire. - à la capture et l'anesthésie lors des biopsies de peau, - à des infections qui pourraient survenir suite à la biopsie, - à la capture et l'anesthésie et au retour dans le groupe pour les sessions d'IRM

Devenir

Les animaux seront gardés en vie pour poursuivre leur caractérisation comportementale et les observations pour déterminer les interactions sociales.

Remplacement

D’une manière générale le modèle primate non humain est nécessaire en neurosciences pour des raisons de proximité anatomiques, physiologiques et éthologiques avec l’Homme. Ce projet a pour objectif de caractériser les comportements socio-cognitifs chez le ouistiti, cette étude nécessite donc l'utilisation d'animaux en comportement, et ne peut pas être remplacé par une étude in silico ou par une étude comportementale chez l'Homme. L'utilisation d'animaux est donc indispensable.

Réduction

Des statistiques descriptives seront utilisées pour l'évaluation des comportements et pour calculer un score pour les tests de réactivité (comptages, pourcentages, moyennes et modes) et des comparaisons pourront être effectuées entre individus. Ces données pourront être utilisées comme données contrôle pour des études ultérieures. Le nombre d'animaux utilisés est estimé à N=30 sur 3 ans. Ce nombre correspond au nombre d'individus hébergés dans notre animalerie et du turn-over potentiel. Le projet vise à caractériser l'ensemble des individus de notre colonie.

Raffinement

Afin de réduire le stress lié à la manipulation des animaux, des visites préalables seront réalisées pour que les animaux s'habituent à l'expérimentateur. En ce qui concerne la capture, deux solutions sont possibles et seront choisies en fonction de la tolérance des individus au contact humain : soit ils seront capturés à la main ou au filet, soit ils seront conditionnés à entrer dans une boîte de transport. Les observations comportementales ne pourront être réalisées et correctement interprétées qu'à la condition que les animaux ne présentent pas un niveau de stress important. Si les animaux sont capturés à la main/au filet, de la gomme arabique leur sera systématiquement proposée immédiatement après la capture. Généralement, lors des premières captures, les animaux peuvent vocaliser (cris d'alerte/cackles) mais ce comportement peut être réduit en les plaçant dans l'obscurité (creux de la main), ou en leur proposant des friandises. Ce comportement indicateur de stress disparaît en général lors des captures suivantes si aucun acte pouvant entraîner une gêne n'est pratiqué lors des premières. Si ce comportement venait à se prolonger, la capture serait alors systématiquement réalisée via une boîte de capture, qui sera ensuite placée dans une boîte de transport qui sera elle-même recouverte de tissu opaque lors du transport dans la pièce de test. De la même façon, une fois les animaux capturés à la main ou au filet, ils seront placés dans cette boîte. Les imageries seront réalisées sous anesthésie générale ainsi que les biopsies de peau. Dans la mesure du possible ces biopsies seront réalisées lors d'une anesthésie prévue par ailleurs (session IRM ou acte zootechnique - pose de puce ou contrôle sanitaire). La réintroduction dans le groupe après toute sortie sera monitorée afin de s'assurer qu'aucun conflit ne survienne. Dans le cas où des tensions seraient détectées une surveillance accrue serait mise en place.

Choix des espèces

Nous avons choisi le ouistiti pour les similarités qu'il présente avec l’Homme en terme de structure sociale et de capacités sociales (prosocialité) et cognitives. Le ouistiti est un modèle émergent dans le domaine des neurosciences, il est important de caractériser au mieux ses comportements cognitifs, ses interactions sociales, ainsi que son tempérament en lien avec le génotype des individus afin de mieux connaître l'espèce et de pouvoir raffiner les procédures expérimentales qui impliquent des individus de l'espèce. Tous les individus de notre colonie seront observés et étudiés, quel que soit leur stade de développement. En effet, cela permettra de suivre les modifications comportementales lors de la caractérisation de la colonie. Les tests comportementaux nécessitant un isolement des animaux ne débuteront pas avant 18 mois (âge adulte). Une session d'imagerie pourrait être réalisée avant atteinte de l'âge adulte afin d'étudier d'éventuels changements au cours du développement.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Huntington, elles subissent des injections intracérébrales sous anesthésie, des gavages répétés sur quatre mois, de l'imagerie cérébrale et une batterie de tests comportementaux évaluant motricité, sociabilité, vocalisation, anxiété et anhédonie, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur n'attend que peu d'effets indésirables hormis la douleur des chirurgies et le stress de la contention. Il affirme que les interactions entre neurones et astrocytes ne sont pas reproduites in vitro ou in silico et qu'un modèle murin est nécessaire pour tester cette thérapie génique.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative d’origine génétique sans traitement curatif. Elle se caractérise par la mort de neurones du système nerveux central, ce qui provoque d’importants troubles moteurs, cognitifs et comportementaux chez les patients. Un défi majeur est de retarder l’âge d'apparition des symptômes et de ralentir la progression de la maladie de Huntington. La production et l’élimination du cholestérol, qui est essentiel pour le cerveau, est altéré dans la maladie de Huntington. Le métabolisme du cholestérol implique un dialogue finement régulé encore mal compris entre les neurones mais aussi leurs partenaires, les astrocytes. Les études pilotes montrent que la thérapie génique avec CYP46A1, qui vise à rétablir le métabolisme du cholestérol, impacte aussi les astrocytes et les rend réactifs. Nous faisons l’hypothèse que les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets bénéfiques de cette stratégie thérapeutique. L’objectif de ce projet est de mieux définir le potentiel thérapeutique de CYP46A1 dans un modèle murin pertinent de la maladie de Huntington et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. D’une part, il s’agit d’établir si les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets thérapeutiques de la CYP46A1 : une approche préclinique complète évaluera les effets thérapeutiques au niveau moléculaire, histologique, biochimique, métabolique, comportemental et de la connectivité cérébrale. Il s’agit également de comprendre quels sont les effets de CYP46A1 sur la morphologie des astrocytes du striatum et leur transcriptome (ensemble des gènes exprimés par une cellule). Pour cela, les souris anesthésiées recevront des injections intracérébrales de vecteurs viraux dans le striatum ou un traitement pharmacologique oral qui mime les effets d’une surexpression de CYP46A1. Ces souris seront analysées par un panel d’approches précliniques (analyse des performances motrices et des altérations comportementales par des tests du comportement, de l’imagerie cérébrale non invasive sur souris anesthésiée, par résonance magnétique nucléaire pour identifier des altérations morphologiques et du métabolisme cérébral et enfin par des techniques d’analyses post-mortem variées).

Bénéfices attendus

Cette analyse préclinique va permettre de confirmer les effets bénéfiques d’une thérapie génique et pharmacologique sur les altérations comportementales typiques de la maladie de Huntington mais rarement étudiées dans les protocoles précliniques. De plus, l’analyse par une méthode non-invasive par imagerie cérébrale va permettre d’évaluer l’effet de ces approches thérapeutiques sur un ensemble de paramètres fonctionnels pertinents pour une future étude clinique. Enfin une meilleure compréhension du rôle des astrocytes, des partenaires essentiels aux neurones, permettra de mieux comprendre les effets intracérébraux de ces thérapies et d’affiner leur utilisation clinique.

Procédures

Certaines souris seront soumises à une injection unique intracérébrales sous anesthésie et analgésie pendant environ 30 min, puis à des tests comportementaux étalés sur plusieurs jours avec au moins 2 jours de repos entre chaque tests, qui visent à évaluer les capacités motrices, la sociabilité, la vocalisation, l’anxiété et l’anhédonie des souris. Chacun de ces tests durent moins de 30 min par souris, sauf la cage d’activité qui permet de suivre le comportement spontané de la souris dans une cage dédiée pendant 24h. Certaines souris auront aussi deux sessions d’imagerie cérébrale sous anesthésie (moins de 2h30/souris). Certaines souris recevront à des injections intracérébrales sous anesthésie et analgésie de 30 min, puis une injection retro-orbitaire 6 mois plus tard, sous anesthésie gazeuse, pendant 5 min. D’autres souris recevront des gavages en contention pendant 1 min, 3 fois par semaine pendant 4 mois. souris seront habituées à l’expérimentateur et à la contention avant de démarrer les gavages.

Impact sur les animaux

Très peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux utilisés dans ce protocole à part la douleur lors des chirurgies intracérébrales, le stress lié à la contention lors du gavage et à la manipulation lors des tests comportementaux.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Ce projet est basé sur des résultats obtenus in vitro qui ont mis en évidence les effets bénéfiques de la modulation du métabolisme du cholestérol dans le contexte de la maladie de Huntington. Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules, dont les astrocytes. Ces interactions qui sont très probablement à la base des effets thérapeutiques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. En particulier, il existe des souris transgéniques modèles de la maladie de Huntington qui ont la mutation génétique responsable de cette maladie et permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques très importants de la maladie de Huntington : les altérations comportementales (ex. atteintes motrices, anxiété), les déficits métaboliques et les altérations des connections cérébrales, ainsi que leur potentielle restauration par nos stratégies thérapeutiques.

Réduction

Le projet prévoit au maximum 370 souris. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux sera réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple, les mêmes souris auront une évaluation extensive de leur comportement ainsi qu’une analyse de plusieurs paramètres par imagerie et pour finir une analyse histologique complète du cerveau avec quantification d’une dizaine de paramètres/souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant les sessions de tests comportementaux et l’habituation à la contention permet de réduire le stress des souris. Un soutien thermique sera mis en place lors des chirurgies et sessions d’imagerie.

Choix des espèces

Les souris modèles de la maladie de Huntington permettent d’étudier les cellules cérébrales (neurones, astrocytes…) in situ, dans un contexte génétique permettant le développement de la maladie de Huntington. Ces souris présentent des altérations moléculaires, cellulaires et comportementales caractéristiques de la maladie de Huntington. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés. La MH est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.

411 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est génétiquement modifiée et suivie jusqu'au développement de lymphomes, une autre reçoit une injection de cellules de lymphome puis des anticorps, avant la mise à mort pour étudier le rôle du gène Jarid2. Le porteur indique que les lymphomes provoquent de gros ganglions et une augmentation de la rate et du foie, la mise à mort intervenant à la palpation d'une hépatosplénomégalie ou à 20 % de perte de poids. Il affirme que ce cancer exige un microenvironnement complet et que les modèles génétiques ne sont disponibles que chez la souris.

Objectifs

Il a été décrit ces dernières années une nouvelle entité de lymphome, à la fois chez la souris et chez l'homme, dont la cellule d'origine est un lymphocyte T non conventionnelle appelé lymphocyte NKT. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans ce cancer, des études du génome c'est à dire au niveau de l'ADN, ont été réalisées sur les lymphomes générés chez la souris et ont mis en évidence des altérations du gène Jarid2. Ce gène est particulièrement intéressant car son implication dans la biologie des lymphocytes NKT normaux a déjà été décrit. Ces résultats suggèrent que ce gène pourrait jouer un rôle essentiel dans les mécanismes à l'origine de ce cancer. L'objectif de ce projet est donc d'étudier chez la souris l'impact de l'invalidation du gène Jarid2 sur la survenue de ces cancers et d'identifier de potentielles voies thérapeutiques qui pourront être testées dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires associés à ces lymphomes sont encore mal connus et la mise en évidence d'un gène responsable de ce cancer peut constituer une nouvelle approche thérapeutique pour des patients dont la survie à 5 ans ne dépasse actuellement pas 30% et pour lequel les solutions thérapeutiques sont mimines.

Procédures

Génération d'une nouvelle lignée par croisement de souris avec différentes modifications génétiques puis observation des souris afin de mettre en évidence le dévelopement de rares lymphomes. Injection unique de cellules de lymphome par voie intraveineuse après anesthésie (durée de quelques secondes). Injections répétées d'anticorps 1 jour sur deux pendant 2 semaines par voie intrapéritonéale (durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables seront associés au développement de tumeur et en particulier de lymphome qui se caractèrisent par des adénopathies (gros ganglions) ou des hépato-splénomégalie (grosse rate, gros foie). Cependant, les nuisances de ces souris seront modérées car les points limites mis en place permettront de mettre à mort la souris dès les premiers signes de souffrance. Suite aux transferts de lymphomes aux souris C57BL/6, celles-ci vont développer assez rapidement (de 30 à 60 jours post-transfert) des lymphomes NKT. Les nuisances seront alors modérées car les points limites mis en place permettront de mettre à mort la souris au premier signe de souffrance. L'injection des cellules de lymphomes préalablement congelées dans des souris receveuses syngéniques C57BL/6 n'entrainera qu'une nuisance légère. L'injection des anticorps bloquants anti-ICOS se fera sur animaux vigiles par voie intrapéritonéale et n'entrainera qu'une nuisance légère.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort soit parce qu'elles développent une pathologie soit en raison d'un vieillissement avancé. Pour les expériences de transfert de lymphome, toutes les souris seront mises à mort car elles auront toutes été transférées avec des cellules de lymphome NKT et développeront donc toutes une lymphome.

Remplacement

Les objectifs du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement des lymphomes NKT nécessite la présence d’un microenvironnement qui joue un rôle clef dans le développement et le maintien du lymphome. Aussi les invalidations génétiques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez la souris, justifiant le développement de ces modèles chez la souris.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons : 1- mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem en congelant le maximum de cellules et de morceaux d'organes afin que ceux-ci soient exploités pour diverses études in vitro sur ces lymphomes et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris. 2- effectuer une étude statistique descriptive qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux.

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur associée aux lymphomes, des points limites prédictifs pour limiter les souffrances seront mise en place. La mise à mort sera pratiquée lorsque l'un des points limites suivants sera atteint : mise en évidence d'une hépatosplénomégalie par palpation de l'abdomen des souris, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Dans le cadre des premiers travaux, la plupart des souris ne développeront pas de lymphome et un grand nombre d'entre elles vont entrer dans un processus de vieillissement avancé. Au delà de 15 mois, ces souris seront donc surveillées 3 fois par semaine avec prise de poids et prise de température. Dès qu'une perte de poids de 10% sera constatée, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids de 20% est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une température entre 34 et 36°C, placer les souris dans une enceinte chauffante pendant 48h. En dessous de 34°C, l’animal devra être mis à mort.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale de choix pour étudier l'impact de l'invalidation d'un gène sur le développement de lymphome. En effet, nous disposons chez cette espèce des souris pour lesquelles le gène Jarid2 a été invalidé. D'autre part, le modèle de lymphome étudié a été développé chez la souris p53KO et le croisement de ces souris p53KO avec les souris invalidées par Jarid2 permettra de comprendre le rôle de ce gène dans le développement de ce cancer. Les souris seront générées par croisement au sein de notre établissement utilisateur et seront suivis jusqu'à la mise à mort des souris lorsque les points limites seront atteints. Pour les expériences de transfert, les souris receveuses seront commandées à l'âge de 6 à 7 semaines et seront utilisées à l'âge de 8 à 12 semaines correspondant à l'âge adulte de ces souris. L'utilisation de souris adultes est justifiée par le besoin d'avoir des souris receveuses ayant un système immunitaire mature.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion musculaire est provoquée par injection d'une toxine dans la patte, puis leur activité est mesurée dans des roues pendant un isolement, avec des injections d'antalgiques, avant la mise à mort pour prélever le muscle. Le porteur présente le projet comme un raffinement visant à mieux évaluer la douleur d'un modèle de blessure musculaire par la mesure de l'activité motrice. Il affirme que ce raffinement d'un protocole in vivo rend l'expérimentation animale "indispensable".

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis dans certaines conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies). Le modèle standard de blessure musculaire est celui de l'injection d'une toxine dans la patte arrière de l'animal. Ce modèle est très courant et très standardisé. La lésion musculaire induit une douleur qui n'est pas quantifiable en analysant le comportement de l'animal. En vue de raffiner le protocole, l'étude vise à analyser l'effet de deux antalgiques sur l'activité motrice des animaux, indicative de la douleur, à la suite de l'induction de la lésion.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de définir le meilleur protocole pour raffiner le modèle expérimental. Il s'agit d'une part de valider l'impact de la blessure sur l'activité des animaux, d'analyse l'impact des analgésiques sur cette activité (les analyses seront réalisées en aveugle) et d'autre part de s'assurer que la prise d'antalgique n'impacte pas le processus de régénération musculaire.

Procédures

Les souris seront installés dans des cages individuelles équipées de roues d'activité pendant 24h. Les souris subiront des injections de faible volume en sous cutané (1 au maximum) et en intramusculaire (2 au maximum). La durée de ces injections est d'environ 10 secondes (contention totale 30 secondes).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections intramusculaire, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur modérés et de l'isolement des animaux pendant 48h, le temps de la mesure de leur activité physique avant et après la lésion.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

L'analyse de la régénération musculaire peut être en partie étudiée in vitro. Cependant, la coordination des processus biologiques qui la régule ne peut se faire qu'in vivo. L'étude de composés favorisant la régénération musculaire ne peut se faire qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale. En outre, cette étude ayant pour but de raffiner un protocole expérimental in vivo, l'expérimentation animale est indispensable.

Réduction

L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Le nombre de souris est diminué par deux car les deux pattes des animaux sont utilisées, sans que cela n'impacte la mobilité de l'animal.

Raffinement

L'étude vise à évaluer la meilleure prise en charge de la douleur à la suite d'une induction de lésion musculaire. Aucun comportement anormal n'est attendu dans ce protocole, les animaux reprenant une activité normale après l'induction de la lésion. L'évaluation de la douleur sera donc estimée par la mesure de l'activité physique des souris. Lors de l'induction de la lésion, des anesthésiques sont utilisés, et différents analgésiques seront comparés.

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l’homme. Les animaux sont utilisés entre 6-8 semaines, à l'âge adulte.