Recherche fondamentale

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains sont tués comme donneurs de peau, les autres reçoivent une greffe cutanée sous anesthésie puis portent un pansement pendant sept jours qui réduit leur mobilité. Tous sont tués pour des prélèvements de tissus. Le projet étudie l'effet d'une déficience en CD45 sur le rejet de greffe, le porteur affirmant qu'aucune expérience in vitro ne rend compte des mécanismes immunitaires en jeu.

Objectifs

La transplantation représente un moyen thérapeutique efficace pour palier au dysfonctionnement de certains organes. Cependant, en l'absence de traitement du receveur, le greffon est rejeté par le système iimunitaire de l'hôte. Aujourd'hui le rejet de greffe est contrôlé par l'utilisation d'immunosuppresseurs pharmacologiques. Cependant, ces drogues ont des effets secondaires importants et ne sont pas toujours suffisantes pour prévenir le rejet. C'est pourquoi il est nécessaire de trouver des traitements alternatifs à ces immunosuppresseurs. Notre équipe a montré que l'utilisation d'un anticorps ciblant et déplétant la molécule CD45 normalement exprimée à la surface de sous populations de lymphocytes T, permettait d'induire une tolérance d'une greffe cardiaque chez le rat. L'objectif de ce projet est d'analyser plus profondément le rôle intrinsèque de la molécule CD45RC dans la fonction de ces sous-populations de lymphocytes T, dans le contexte de greffe de peau chez le rat. Pour cela, nous avons à disposition un modèle de rat déficient pour la molécule CD45RC qui a été généré par la plateforme Transgenèse rat du CR2TI.

Bénéfices attendus

Prolongation de la survie du greffon chez les rats déficients pour la molécule CD45RC

Procédures

- Prélevement de greffons sur animaux donneurs euthanasiés - Greffe de peau sur animaux receveurs anesthésiés (1/animal) - Retrait des pansements au bout de 7 jours sur animaux receveurs anesthésiés - Suivi du bien etre de l'animal et du greffon quotidiennement - Injection dose analgésique en post-opératoire - Prélevements post-mortem sur animaux receveurs euthanasiés

Impact sur les animaux

Douleur et stress engendré par la chirurgie. Mobilite réduite lié à la pause d'un pansement pendant 7jours.

Devenir

Euthanasie des animaux à la fin de l'expérimentation pour effectuer des prélevements de tissus post-mortem.

Remplacement

A ce jour, aucune expérience in vitro ou modélisation informatique ne permet de rendre compte de l'ensemble des mecanismes immunitaires qui rentrent en jeu dans un modèle complexe comme le modèle de greffe de peau. La nature de cette étude ne permet donc pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux et il n'ya pas d'alternatives non animales à la greffe de peau

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Concernant les donneurs de peau, 1 animal est suffisant pour greffer 5 receveurs. Nous estimons que 5 receveurs par groupe est le nombre minimal requis pour obtenir des résultats significatifs. L'approche statistique adoptée est la suivante : Deux expériences indépendantes seront menées comprenant 5 animaux receveurs par groupe. En cas de résultats significatifs, de nouvelles expériences pourront être menées pour confirmer les premieres observations (3 au maximum). Dans le cas contraire, le protocole sera arrêté.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement pour observer leur comportement général (mobilité, prise alimentaire, toilettage, posture, pilo-érection) suite à la chirurgie et pour surveiller le maintien du pansement avant son retrait à J7. Si un signe clinique sévère est observé (amaigrissement important, prostration, posture voutée), l’animal sera sacrifié pour des raisons éthiques. Pour réduire la douleur et la souffrance animale liées à la chirurgie, les animaux reçoivent au moment de la greffe de la kétamine, nécessaire à l'anesthésie des animaux et qui présente une action analgésique. De même une dose de buprénorphine (0.05mg/kg) pourra être administrée en post-opératoire (injection sous-cutanée) pour soulager la douleur. Afin de réduire le stress, différents types d'enrichissement (briquettes de bois, tunnel en carton) sont placés dans les cages et les rats seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi car nous disposons de cette lignée de rats déficients pour la molécule CD45RC. Les rats utilisés auront entre 12 et 16 semaines. Les animaux donneurs ne doivent pas etre trop jeunes pour disposer d'assez de greffons à partir d'un meme animal. Les animaux receveurs seront utilisés dans une tranche d'age relativement proche de celles des animaux donneurs.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections de tamoxifène, une greffe de cellules tumorales, et pour une partie une chirurgie d'ablation des ganglions lymphatiques, avec un suivi par imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Elles sont ensuite tuées pour prélever plusieurs organes. Le projet étudie le rôle d'une protéine dans les métastases et le lymphœdème, le porteur affirmant que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

Le projet vise à déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt, une phosphatase, dans les vaisseaux lymphatiques dans deux contextes liés au cancer : (1) les métastases d’origine lymphatique et (2) les lymphoedèmes post-résection des ganglions lymphatiques. Les métastases représentent la dissémination d’une tumeur dans le corps. Les lymphoedèmes sont des accumulations de fluide dû à un défaut des vaisseaux lymphatiques pour évacuer le surplus de fluide. Dans certains cancers, la résection des ganglions, soit l’opération de retirer les ganglions lymphatiques proches de la tumeur, est souvent nécessaire pour prévenir la formation des métastases. Malheureusement, cela peut avoir des effets négatifs tels que le lymphoedème. Par cette étude, nous voudrions répondre aux questions suivantes : (1) est-ce que l’expression de cette protéine dans les cellules lymphatiques joue un rôle majeur dans le développement de métastases, notamment dans la lymphangiogenèse associée ? (2) Cette protéine est-elle impliqué dans la formation de lymphoedème suite à une résection de ganglions lymphatiques ?

Bénéfices attendus

Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre protéine d’intérêt, une phosphatase, a un effet sur la prolifération, la migration et le bourgeonnement des cellules endothéliales lymphatiques. Ceci suggère que cette protéine pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la formation des vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse). Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La formation des vaisseaux lymphatiques est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes (accumulation de fluide dans une partie du corps) ou les métastases (dissémination de cellules tumorales). Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme traitement additionnel pourrait améliorer le traitement des cancers. On observe déjà ce type de traitement pour inhiber la formation de vaisseaux sanguins autour de la tumeur. Cependant, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre protéine d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs. Cela pourrait également devenir une cible thérapeutique contre la formation de lymphoedème qui a aussi pour origine un dysfonctionnement des vaisseaux lymphatiques.

Procédures

Avant chaque procédure, tous les animaux (soit 320 max) recevront 6 injections de tamoxifen réparties sur 2 semaines. Chaque injection dure moins d’une minute par souris. Pour chaque procédure, les animaux sont anesthésiés sous isoflurane (un gaz) ou par injection d’anesthésiants. Pour l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée, les animaux recevront une application d'analgésique local avant l'injection de cellules. Les animaux subissant une chirurgie plus importante recevront une injection d’analgésique avant chirurgie. 160 souris auront une injection de cellules tumorales (mélanome ou cancer du poumon) en sous-cutané, 80 souris auront une injection de cellules du cancer du sein au niveau des glandes mammaires et 80 souris subiront une chirurgie pour retirer les ganglions lymphatiques de la patte. Chaque chirurgie n’excède pas 5 minutes par souris. Après chirurgie, tous les animaux seront gardés en observation pendant le développement de la maladie jusqu’à la mise à mort. Si nécessaire, les souris recevront 1 ou 2 injections supplémentaires d’analgésique contre la douleur ou l’application d’un désinfectant cutané contre le risque d’infection. Les souris ayant reçu une injection de cellules tumorales auront un suivi du développement de la tumeur par imagerie 2 fois par semaine. Pour cela, les souris seront anesthésiées par isoflurane et recevront une injection d’un composé permettant la localisation des cellules tumorales avant d'être placé dans un imageur adapté pour une acquisition d’image sur animal vivant. L'acquisition d'image prend 6 à 25 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront suivis quotidiennement avec une fiche de suivi hebdomadaire et une pesée 3 fois par semaine. L’apparence et le comportement des animaux seront marqués sur la fiche de suivi. Pour chaque expérience, les animaux pourront présenter une perte de poids, des signes de douleur ou de gêne avec possible prostration, cachexie, tremblement ou isolement (voir chaque procédure pour plus de détails). Tous ces critères sont considérés comme des points limites lorsqu’ils dépassent un certain seuil. Le seuil est déterminé par le personnel de l’animalerie qui a une longue expérience de ce type de procédure. Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal est immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer s’il y a une différence au niveau de la formation des métastases et de lymphoedème. Ainsi plusieurs tissus et/ou organes seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Le projet vise à caractériser le rôle d’une protéine spécifique au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. L’étude des métastases demande un organisme entier puisque les cellules tumorales circulent d’un organe à un autre en utilisant le système circulatoire de l’organisme. Le lymphoedème est également une pathologie qui s’étudie à l'échelle d'un corps entier. Il est également important de noter que des interactions complexes entre différents types cellulaires est nécessaire pour l’observation de ces phénomènes.

Réduction

Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, un nombre de 10 souris par génotype sera nécessaire pour chaque expérience et les expériences seront répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats) pour chaque procédure. La variabilité entre les expériences et entre les animaux pouvant être importante, un nombre d’animaux suffisant et plusieurs expériences permet d’avoir des résultats scientifiquement robustes. Nos 2 génotypes d’intérêt sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée pour limiter le nombre d’animaux. Donc 2 x 10 souris = 20 souris/expérience. Donc pour la procédure 1, où nous avons 2 lignées cellulaires différentes : 20 souris x 4 expériences x 2 lignées cellulaires = 160 souris. Pour la procédure 2 : 20 souris x 4 expériences = 80 souris. De même pour la procédure 3. Donc, nous estimons le nombre maximal d’animaux à 320. Pour la procédure 2, nous n’utiliserons que des souris femelles pour l’étude sur le cancer du sein. Afin de ne pas perdre les mâles des mêmes portées, nous les utiliserons pour les autres procédures en essayant de garder quand même une certaine mixité. Le ratio femelle/mâle des procédures 1 et 3 sera donc plus de l’ordre du 1 pour 3 que du 1 pour 1 dans certaines expériences en parallèles avec celles de la procédure 2. Les études statistiques seront réalisées avec les tests statistiques adaptés aux résultats.

Raffinement

Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections de tamoxifen de chaque procédure, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement grave au niveau du site d'injection, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour chaque acte chirurgical, les souris seront anesthésiées et placées sur un tapis chauffant (37°C) avec une application de gel ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutané (procédure 1), un analgésique local sera utilisé pour prévenir la douleur dû à l’injection. Lors de l’injection des cellules tumorales dans la glande mammaire (procédure 2) et l'opération de retrait des ganglions lymphatiques (procédure 3), un analgésique et un désinfectant cutané seront utilisés pour réduire la douleur et prévenir les infections. Après chirurgie/implantation, les souris sont remis dans leurs cages avec leurs congénères (5 souris/cage) et observées jusqu’à leur réveil avec une vérification 1h après. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. De la nourriture humide sera mise à disposition dans les cages si nécessaire, par exemple pour aider à l’alimentation suite à la chirurgie. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi quotidienne. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.

Choix des espèces

Le projet vise à caractériser le rôle de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro puisque cela demande une conformation 3D à l’échelle d’un organisme entier, mais également des interactions complexes entre différents types cellulaires. L’implantation de tumeur chez la souris est par ailleurs une expérience couramment utilisée pour l’étude de la formation des métastases. La lignée de souris de notre projet, déjà existantes, permettra de déléter spécifiquement notre protéine au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra d’étudier l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques dans les cas de métastases et de lymphoedème. Les souris sont également immunocompétentes car les cellules immunitaires peuvent avoir une grande influence sur les vaisseaux lymphatiques, notamment dans les cas de cancers où le microenvironnement est important. Nous commencerons les expériences sur des souris âgées entre 6 et 8 semaines afin d’avoir une bonne induction de la délétion de la protéine. L’utilisation de jeunes animaux permet également une croissance tumorale optimale et un système immunitaire performant. En effet, dans notre étude, il se peut que le système immunitaire ait un rôle important en lien avec les vaisseaux lymphatiques que nous étudions. Ces expériences d’implantation de tumeur peuvent prendre plusieurs semaines à plusieurs mois, particulièrement pour l’observation de métastases, donc il est mieux de commencer le plus tôt possible.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'un lymphome que le porteur décrit comme envahissant les tissus et aboutissant à la mort de l'animal, puis des injections de cellules et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs tissus. Le projet évalue des cellules NK humaines produites selon un procédé breveté comme immunothérapie anticancéreuse, en vue d'un dossier réglementaire pour un essai clinique.

Objectifs

Nous produisons des lymphocytes « Natural Killer » humains à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, en passant par un stade de précurseur lymphoïde, selon une technique brevetée, qui permet d’obtenir en 2 à 3 semaines de très grandes quantités de lymphocytes NK immatures, présentant un degré de pureté supérieur à 90. Nous avons également montré que nous pouvions combiner la culture à une modification génétique par transduction lentivirale, qui permet d’apporter des propriétés antitumorales supplémentaires (par exemple un récepteur antigénique chimérique appelé CAR, dirigé contre un antigène tumoral). Les lymphocytes produits sont fonctionnels in vitro. Notre objectif est de caractériser in vivo la biodisponibilité et la fonction de ces cellules lymphocytaires, non modifiées ou modifiées génétiquement pour exprimer un CAR, et à les comparer à des lymphocytes matures du sang et des lymphocytes dérivées de cellules souches hématopoïétiques selon un protocole qui ne passe pas par l’étape précurseur lymphoïde. Ces deux sources de lymphocytes sont utilisées dans le cadre d’essais cliniques, mais présentent un certain nombre des défauts (résistance à la transduction, expansion limitée, apparition précoce de marqueurs d’épuisement). Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéficiente humanisée et suivrons des schémas expérimentaux publiés. Nous répondrons à la question de la biodisponibilité in vivo des lymphocytes après greffe chez la souris. Nous validerons dans une étape pilote le modèle tumoral. Enfin, nous explorerons la capacité des lymphocytes armées avec un CAR à détruire des cellules tumorales par imagerie sur souris anesthésiée. Ce projet nous apportera les réponses scientifiques et les preuves précliniques du potentiel de ces cellules en immunothérapie anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la capacité des cellules NK produites dans nos conditions (brevetées) à persister après greffe. Il permettra également de valider la fonctionnalité des cellules NK. Au terme du projet, s’ils sont positifs, les résultats seront utilisés pour documenter le dossier exigé qui sera soumis aux autorités réglementaires pour la mise en place d’un essai clinique de phase I/II pour le traitement des lymphomes B. Les schémas expérimentaux et les résultats serviront de base à l’exploration de l’efficacité des cellules NK pour traiter des tumeurs solides.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni procédures chirurgicales n'est prévu dans l'étude. Les interventions se limiteront à : 1) Injection d'agent de conditionnement. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. L’ensemble des souris (314) sont injectées 1 fois avec cet agent. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. 2) 3 jours après l’injection de l'agent de conditionnement, injection(s) de l'agent théeapeutique NK et/ou des cellules cancéreuses après anesthésie générale : 172 souris injectées 1 fois; Durée de l’intervention 5 minutes/ souris. 142 souris injectées 2 fois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 3) Injection de molécule pour permettre le suivi par bioluminescence après anesthésie générale. Maintien de l’anesthésie gaseuze durant l’aquisition au lecteur de bioluminescence. 164 souris injectées et anesthésiées 8 fois maximum pendant 1 mois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 4) Prélèvement de sang après anesthésie générale : 150 souris, 1 prélèvement par souris juste avant la mise à mort. Durée de l’intervention : 10 min/souris. 5) Mise à mort par dislocation cervicale immédiatement après le prélèvement de sang. Toutes les souris (314) sont concernées. Durée de l’intervention : 1 minute/souris. Au total, 150 souris subiront 4 injections et 1 prélèvement de sang. Les 22 aurtes souris subiront 12 injections et 8 séances d’imagerie. Les 142 souris restantes subiront 13 injections, 8 séances d’imagerie et 1 prélèvement de sang.

Impact sur les animaux

Le modèle tumoral est un modèle d’un lymphome de Burkitt, une tumeur liquide qui envahit les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate) et aboutit à la mort de l’animal. Les cellules NK ne provoquent pas d'effets indésirables. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée et un stress.

Devenir

Tous les animaux du projet (314) seront mis à mort pour prélèvement de tissus et leurs analyses (à J4 ou J7). Ces dernières nous permetteront d'étudier la biodisponibilté.

Remplacement

Notre protocole de production de cellules NK est, en soit, une méthode de Remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches humaines isolées de sang de cordon ou ou de donneurs adultes pour produire et expandre des cellules NK ex vivo avec un système complètement in vitro, sans nécessité de faire maturer les cellules humaines chez la souris. Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long développement et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique. Les cellules NK produites selon le nouveau procédé ont été complètement caractérisées phénotypiquement et fonctionnellement. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des cellules NK dans les différents organes immunitaires, ou leur capacité à migrer dans les tumeurs, et à les détruire. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.

Réduction

Pour répondre à des questions de biologie cellulaire et moléculaire, nous utiliserons des cultures primaires, ce qui réduit fortement l’utilisation d’animaux. Cependant, les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour les réponses physiopathologiques liées à une manipulation génétique ou traitement pharmacologique. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et le stress infligés aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques sont prévues. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans le modèle tumoral en particulier, dans le cas où l’induction de la tumeur est à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit, perte d'intérêt de l'exploration, perte de poids, comportement stéréotypique lié au stress), l’expérience sera interrompue et l'animal mis à mort. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). D’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvent seuls dans les cages. Si une souffrance est avérée avec un score supérieur à 6 défini dans les procédures, les NSG-IL15 seront mises à mort pour une étude macroscopique des organes et/ou de l’immunohistochimie et/ou une analyse du statut sanitaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. Par ailleurs, il existe de nombreux outils (ex : anticorps) qui sont développés parfois exclusivement chez la souris. Les essais précliniques sur animaux sont exigés par les autorités réglementaires dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés in vitro seront testés chez l’animal. Les animaux utilisés seront au stade adulte, entre 10 et 12 semaines de vie. Ce choix se base sur l’âge auquel les lymphomes B se déclarent chez l’Homme et sur un protocole ayant montré des résultats encourageants.

40 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Trente-trois subissent une autogreffe de l'utérus puis une seconde opération sans réveil quatre jours plus tard, les sept autres servant de témoins avec la même chirurgie. Le porteur décrit les risques de cette chirurgie longue, hypothermie, douleurs et hémorragie interne, et un hébergement seul de quatre jours en post-opératoire. Le projet cherche des marqueurs sanguins de rejet du greffon utérin, le porteur qualifiant le modèle ovin de "meilleur modèle animal" et le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Deux études préliminaires ont permis de démontrer la faisabilité, puis la maitrise de la greffe utérine chez la brebis. La mise en évidence de marqueurs sanguins reflétant un défaut de fonctionnalité de l’utérus, et en particulier un état inflammatoire important, permettrait de modifier les modalités de surveillance et de mettre en place une stratégie préventive et thérapeutique pendant la chirurgie et en post opératoire afin d’optimiser la réussite de la transplantation. A ce jour, la surveillance repose sur les biopsies répétées du col de l’utérus sources d’inconfort, d’hémorragie et d’infections. L’identification de marqueurs sanguins permettrait de remplacer cette méthode invasive. De plus, cette approche pourrait permettre de mettre en évidence des marqueurs ayant un intérêt similaire dans des situations de greffe d’autres organes. Nous nous proposons de comparer l'impact de deux solutés de préservation d’organe sur la survie du greffon à court terme dans un modèle d'auto-transplantation chez la brebis. Cet objectif sera évalué au travers de 4 paramètres: 1) Évaluation de l'expression de marqueurs de l'inflammation et d’absence de circulation sanguine dans la muqueuse de l’utérus à J4 de la transplantation, par l'analyse de l'expression de 90 gènes connus impliqués dans l'inflammation, 2) Comparaison de l'expression des protéines exprimées dans la muqueuse utérine à J4 de la transplantation entre les deux solutés testés 3) Par une approche immunologiques utilisant des anticorps, analyse de la localisation de protéines dans la muqueuse utérine du groupe contrôle et des deux groupes expérimentaux, 4) Évaluation de la corrélation entre les paramètres précédents, l'analyse histologique et l'état clinique du greffon en fonction du soluté de préservation d'organe utilisé.

Bénéfices attendus

Le succès des premières greffes utérines chez l'l’humain suggère une demande potentiellement croissante pour une telle intervention. On estime globalement que 4000 à 5000 femmes en France pourraient être candidates à une greffe utérine dans l'avenir. L'équipe de recherche collabore dans ce travail avec l'équipe de l'hôpital travaillant sur un essai pilote évaluant la faisabilité, l'efficacité et la sécurité de la greffe utérine à partir de donneurs vivants apparentés pour 10 patientes avec une malformation congénitale caractérisée par l’absence d’utérus et d’une partie du vagin (syndrome de Rokistanski). La première greffe utérine en France a été réalisée en Mars 2019 et a abouti à une naissance vivante par césarienne en février 2021. En transplantation utérine humaine, le diagnostic de rejet du greffon est réalisé sur des analyses de tissus à partir de prélèvements répétés du col de l’utérus qui contribuent à générer des microtraumatismes tissulaires. Identifier des marqueurs non invasifs indiquant la bonne circulation du sang et l’absence d’inflammation pendant et après transplantation de l'utérus permettrait de limiter les interventions traumatisantes et de mettre en place une stratégie thérapeutique pour assurer la réussite de la transplantation.

Procédures

33 brebis subiront une procédure chirurgicale d'autogreffe et seront réopérées sans réveil 4 jours plus tard. 7 brebis témoins subiront une procédure chirurgiale similaire mais sans greffe pour servir de témoins et seront réopérées sans réveil 4 jours plus tard.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à une chirurgie longue : risques d'hypothermie, douleurs, difficultés à se lever et se déplacer, diminution du transit digestif et de l'appétit. Les effets indésirables comprennent aussi les risques inhérents à toute chirurgie abdominale : risque d’infection, risque de plaie digestive, risque de plaie vasculaire ou de rupture des sutures vasculaires avec hémorragie interne. En postopératoire, les brebis sont hébergées seules dans un box dédié et sous surveillance humaine. Cet hébergement, de 4 jours, est nécessaire pour le suivi d’ingestion alimentaire et le suivi de la reprise du transit digestif. Mais aussi pour éviter l’arrachage du cathéter et une blessure au niveau de la suture par une congénère.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par injection de pentobarbital en IV sous anesthésie générale. L’utérus sera prélevé afin d'évaluer l'expression de marqueurs de l'inflammation et corréler ceux-ci aux analyses histologiques du greffon en fonction du soluté de préservation d'organe utilisé.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer de manière non invasive des marqueurs inflammatoires et de mauvaise circulation sanguine lors d'une greffe utérine. L'utilisation d'un modèle animal est indispensable car il n'existe aucun modèle alternatif permettant de reproduire les réactions complexes d'inflammation suite à une greffe d’organe entier.

Réduction

Les chirurgies de greffe utérine sont réalisées en autotransplantation, ce qui évite de recourir à un animal donneur. Le nombre d'animaux nécessaire est donc divisé par deux.

Raffinement

Pour limiter le risque d’hypothermie, les brebis seront installées sur un tapis chauffant pendant toute la chirurgie. La température corporelle, la fréquence cardiaque et la saturation pulsée en oxygène (SpO2) de la brebis seront également monitorées durant la chirurgie. Un cathéter sera posé pour administrer en continu une solution physiologique pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Cette voie, permettra également l’injection régulière d’analgésiques pendant l’opération. Ce cathéter sera conservé pendant les 4 jours post opératoire pour éviter de piquer l'animal plusieurs fois lors de prélèvements sanguins ou de l'administration d'analgésiques. En début de post opératoire, la température corporelle de la brebis sera contrôlée et maintenue grâce à des lampes chauffantes. Durant les 4 jours de post opératoire, les brebis seront sous surveillance permanente. La gestion de la douleur sera suivie par scoring des mimiques faciales basé sur des critères décrits dans la littérature. Si le score de la douleur est supérieur à cinq, cela justifie la mise en place d’une analgésie adaptée Le suivi des constantes physiologiques sera réalisé plusieurs fois par jour (température corporelle, fréquences cardiaque et respiratoire, glycémie),. Une analyse sanguine quotidienne (hématologie, biochimie et gaz du sang) permettra d’adapter les traitements. Le confort des cages de post opératoire sera renforcé par l’ajout de tapis, qui permettent de maintenir l’animal dans un environnement sain et facilitent les premières levées de l’animal et ses déplacements. Après la première phase de post opératoire, deux cages seront jumelées afin de permettre à l’animal d’avoir plus d’espace d’exercice. De plus, des enrichissements lui seront proposés (brosse, ballon, râtelier à foin, ambiance musicale). Afin de favoriser la reprise de l’appétit de l’animal, une alimentation variée lui sera proposée régulièrement (eau, foin, granulés, herbe, salade) en fonction de ses goûts et sera contrôlée par des pesées systématiques des quantités distribuées et consommées. Si le niveau d'inconfort/de douleurs ainsi que l'altération de l'état général de l'animal est constaté malgré les traitements analgésiques, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L'avantage de la brebis dans la recherche sur la transplantation, comparativement aux autres espèces qui ont été testées, est que le bassin est plus large et que l'anatomie de la vascularisation ressemble aux vaisseaux pelviens humains. Le modèle ovin a été défini dans la littérature internationale comme le meilleur modèle animal pour la recherche sur la greffe utérine. Utilisation d'adultes à maturité sexuelle, ayant mis bas deux fois. Ce modèle permet d'avoir un utérus qui a deja fait preuve de sa fonctionnalité et des vaisseaux de calibre optimal, car une brebis ayant eu plus de deux gestations ) pourrait présenter des veines de trop gros calibres (varices).

1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie, une privation alimentaire contrôlée avec isolement, et un conditionnement par trois chocs électriques d'une seconde. Elles sont tuées entre cinq et quatre-vingt-dix minutes après ce conditionnement pour des analyses du cerveau. Le projet cherche à distinguer le vieillissement normal de la mémoire de la maladie d'Alzheimer, en comparant des souris jeunes et des souris de vingt à vingt-deux mois.

Objectifs

La réalisation du présent projet intervient dans le cadre d’un besoin sociétal croissant concernant la prise en charge des individus vieillissants. En effet, le vieillissement de la population de nos sociétés occidentales est en train de devenir un problème de santé publique. Le nombre de personnes atteintes de formes pathologiques de vieillissement, comme la Maladie d’Alzheimer, est en croissance constante et se traduit par une augmentation parallèle des dépenses de santé. Cependant, un des problèmes majeur des études s’intéressant au vieillissement est qu’une grande majorité de ces dernières s’attachent à étudier les mécanismes altérés dans des cas pathologiques, dont le plus répandu est la Maladie d’Alzheimer. De ce fait, de nombreux aspects du vieillissement normal (qui semblent plus subtils) et les altérations qui en découlent restent méconnues et/ou peu caractérisées, ce qui pose le problème de la distinction entre les modifications dues à la senescence ou à la pathologie. Ainsi, il convient de distinguer les altérations de la mémoire relevant du vieillissement normal de celles relevant du vieillissement pathologique afin de développer des approches thérapeutiques plus adaptées en fonction du type de vieillissement. L'objectif de ce projet est d’améliorer la caractérisation des déficits de mémorisation liés au vieillissement normal, afin de le distinguer plus clairement de la maladie d’Alzheimer, forme de vieillissement pathologique la plus répandue.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d’améliorer la caractérisation des déficits de mémorisation liés vieillissement normal, afin de le distinguer plus clairement du vieillissement pathologique. Cette distinction plus fine permettrait de développer des approches thérapeutiques plus adaptées en fonction du type de vieillissement considéré.

Procédures

Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 45 min. Les animaux sont soumis à une procédure comportementale (1 seule fois) où il recevront 3 chocs électriques (0.3 mA, de 1 seconde).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables chez les animaux sont liés à : - une chirurgie - une privation alimentaire - un isolement pour contrôler de manière fine la quantité de nourriture de chaque animal - un très court effet nociceptif dû à la procédure de conditionnement. Néanmoins, afin de réaliser nos études neurobiologiques, les animaux sont mis à mort rapidement (90 min ou 5 min) à la suite de ce conditionnement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation d’analyses.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.

Réduction

Concernant la réduction, l’effectif se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux. Nous avons aussi effectué au préalable des analyses ex vivo afin d’améliorer au mieux la sensibilité de chaque technique immunohistochimique.

Raffinement

Pour les procédures avec restriction alimentaire, les animaux sont isolés une semaine avant le début de la restriction, afin de contrôler le rationnement alimentaire de chaque animal. Ces animaux sont surveillés et pesés quotidiennement à partir du moment où les animaux sont en restriction alimentaire et la quantité quotidienne de nourriture sera adaptée en fonction de leur poids. Leur perte de poids (95 à 88 % de leur poids de base) est ainsi progressive et contrôlée. Si la perte de poids dépasse les 12%, alors on augmente la ration alimentaire. Si l’animal continue à perdre du poids, alors on rajoute de la nourriture en poudre. Si malgré ces mesures conservatoires, l’animal ne reprend pas son poids initial, ceci est considéré comme un point limite et l’animal est sacrifié. Lors de l’isolement, un tube en carton est rajouté dans la cage pour augmenter l’enrichissement. De plus, on vérifie tous les jours que les cages avec des animaux seuls sont collées les unes aux autres pour augmenter les interactions olfactives et visuelles. Outre le poids, d’autres indices seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures et des points limites précis et adaptés ont été définis. En cas de présence d’individus agressifs avec leurs congénères, l’individu agressif est isolé. Les animaux présentant des lésions cutanées reçoivent une pulvérisation d’un spray antiseptique sur la zone concernée, ainsi qu’une injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien pour atténuer la douleur. Au cours des procédures expérimentales, si un des points limites est atteint, l’animal reçoit une injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien pour atténuer la douleur. Si nous n’observons pas d’amélioration, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. En cas d’absence d’amélioration après traitement, il sera mis à mort par dislocation cervicale. Si après 24h l’état de l’animal s’est amélioré, avec une reprise de poids, celui-ci est conservé dans l’étude.

Choix des espèces

La souris: -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris: pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet des approches invasives (approches pharmacologiques etc.) permettant d’étudier l’effet de molécules sur le système nerveux central et les phénomènes de mémorisation via l’étude comportementale -offre la possibilité d’être manipulée génétiquement par injection de virus ce qui permettra l’analyse des modifications neuromorphologiques. Tous les animaux utilisés seront adultes. Cependant, il y aura deux conditions d’âge. Il y aura tout d’abord des animaux jeunes adultes (âgés de 3 à 4 mois) qui serviront de groupe contrôle pendant le test, les animaux jeunes ne devant pas présenter de déficit de mémorisation. Ensuite, il y aura des animaux âgés (20 à 22 mois) qui, selon les données antérieures, présentent un déficit de mémorisation dans la tâche comportementale utilisée.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq à quinze jours, dont le porteur reconnaît le risque de perforation de l'œsophage ou de passage dans les poumons, subissent un test d'effort sur tapis roulant une heure par jour et un séjour de sept jours en cage métabolique isolée. À la fin, les 650 sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet étudie le rôle de deux facteurs de transcription dans la croissance musculaire, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire ce processus.

Objectifs

Le muscle squelettique est un tissu hautement spécialisé capable de se régénérer et de s’adapter à son environnement. La mécanotransduction se définit par la façon dont la cellule intègre le signal mécanique et le transforme en signal biochimique lui permettant de réagir, de s’adapter et même de modifier l’expression de ses gènes. Nous nous intéressons à 2 facteurs de transcription qui ont récemment été identifiés pour jouer un rôle clef dans la mécanotransduction dans divers tissus dont le muscle squelettique. De récentes données, montrent que ces 2 facteurs sont importants pour maintenir le bon fonctionnement du muscle squelettique adulte et la taille des organes car leur dérégulation peut conduire à un phénotype musculaire retrouvées dans différentes pathologies musculaires telles que les dystrophies musculaires. Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels spécifiquement dans le muscle.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à des désordres de croissance, de régénération et de respiration mitochondriale dans le muscle. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans d’autres pathologies musculaires et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Des souris seront soumises à des injections par gavage quotidiennement durant 5-15 jours pour induire l'inactivation de gènes spécifiques et seront ensuite mises à mort pour examen des tissus. Des souris seront soumises à un test d'effort musculaire à l'aide d'un tapis de course informatisé pendant 1H sur une période de 5 jours consécutifs pour évaluer les fonctions métaboliques dans le tissu musculaire. Des souris seront placées en cage métaboliques pendant 7 jours.

Impact sur les animaux

Certaines souris pourraient dévéloppées des problèmes de locomotion. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’oesophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. La mise en cages métaboliques des animaux pendant 7 jours peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A l'issue des Procédures, l'ensemble des 650 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La croissance et régénération musculaire est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle cellulaire ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations hormonales. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes concernés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.

Réduction

L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. De plus, l’expérience du laboratoire montre qu’un groupe de 50 animaux est suffisant pour le test statistique choisi. Des groupes de 50 animaux seront donc utilisés. De plus, nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour avoir une puissance statistique (n= 650).

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement, d’élevage et de soins sera respecté par l’emploi de points limites précoces entraînant la mise à mort des animaux. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton et de « maisons » en carton. Les animaux sont observés tous les jours par le personnel qualifié pour assurer leur bien-être. Pendant les procédures, les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites tous les jours. Par ailleurs, toute procédure douloureuse ressentie par les souris entrainant une douleur, une souffrance ou une angoisse entrainera la mise à mort de l'animal. Le traitement au tamoxifen est donné sous forme de gavage quotidien qui sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des gavages sera réduit au minimum possible. Selon les seuils atteints, l’interruption de la procédure et la mise à mort anticipée de l’animal sera possible.

Choix des espèces

Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes de la signalisation hippo jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons également de nombreux outils (anticorps, vecteurs, méthodes) adaptés à la souris ; 4) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. L’âge des animaux choisis pour l’induction au tamoxifen sera de 1 à 3 mois. Il est nécessaire que l’organogenèse soit terminée. L’âge de mise à mort sera choisi en fonction de l’âge de la survenue du phénotype musculaire attendus vers 1,5-4 mois.