Recherche fondamentale

7 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des instillations intranasales d'allergènes jusqu'à cinq fois par semaine et, pour la mesure de la fonction respiratoire, sont anesthésiées, curarisées puis trachéotomisées avant des aérosols de méthacholine, une intervention terminale. Le porteur affirme que les modèles d'asthme "n'induisent pas d'effets indésirables particuliers". Sur le remplacement, il indique que les cibles thérapeutiques ne peuvent être définies qu'in vivo, tout en mentionnant des coupes de poumon cultivées qui remplacent certaines expériences de mise au point.

Objectifs

L’asthme est une maladie complexe et chronique associée à une hyperréactivité bronchique, une inflammation pulmonaire, et un remodelage des voies respiratoires. L’asthme allergique est un problème mondial : en 2014, le nombre d’individus atteints était estimé à 334 millions. En France, 20 à 25% de la population générale souffre d’une maladie allergique, et la prévalence de l’asthme atteint 7%. Cette maladie entraîne 2000 décès par an, dont environ 200 parmi les enfants, les adolescents ou les adultes de moins de 45 ans. L’asthme provient de l’interaction complexe entre des facteurs génétiques et des agents environnementaux comme les allergènes, les pathogènes respiratoires ou encore les polluants. En outre, des observations cliniques et expérimentales suggèrent que des perturbations du microbiote gastrointestinal , ainsi que des perturbations du rythme circadien peuvent rompre des mécanismes de tolérance immunologique et pourraient influencer la capacité de l’hôte à développer ou non de l’asthme. Ces données suggèrent que l’environnement pourrait donc intervenir à la fois dans l’induction et l’amplification de l’asthme allergique. Le projet vise à étudier le rôle de l’environnement sur le contrôle de la réponse immune dans l’asthme allergique. Des interventions thérapeutiques sous forme de d’antagonistes de l’immunité innée, des anti cytokines ou récepteurs de cytokines ou des vaccins seront également testées.

Bénéfices attendus

1. Evaluation du rôle de certains récepteurs de l’immunité innée, cytokines, cellules innées, dont le rôle dans la physiopathologie de l’asthme allergique est totalement inconnu. 2. Elucidation du rôle des polluants de type HAP dans le développement des asthmes sévères caractérisés par une forte composante Th17 et Th22 et dans la régulation cytokinique. 3. Implication de certaines populations cellulaires dans le lien reliant le rythme circadien et l’asthme. 4. Implication de certaines populations cellulaires dans l’exacerbation de l’asthme induite par les agents pathogènes 5. Identification de nouvelles thérapeutiques dans l’asthme

Procédures

Les animaux reçoivent des intra nasales d’allergènes de 1 à 5 fois par semaine (durée 5 à10 minutes) ou d’autres produits (administration non invasive) de 1 à 5 fois par semaine (durée 5 à10 minutes), pour lesquels une anesthésie par isofluorane est pratiquée. Pour les groupes pour lesquels une analyse de la fonction respiratoire est prévue (Flexivent), les animaux sont anesthésiés et curarisés avant la trachéotomie et le branchement à l’appareil de mesure. Quatre aérosols de méthacholine sont effectués à différente concentrations, et la procédure dure 30 minutes. Cette intervention est terminale.

Impact sur les animaux

Les modèles d’asthmes n’induisent pas d’effets indésirables particuliers. Le retentissement sur la fonction pulmonaire est évalué sur animaux avec anesthésie létale.

Devenir

L’analyse des résultats obtenus dans les différentes expériences nécessite d’avoir accès aux organes (dosage des protéines, des gènes, coupes de poumon en gel, évaluation histologique) et au sang (réponse humorale) et de pouvoir analyser la réponse fonctionnelle respiratoire. Toutes ces procédures nécessitent une anesthésie létale afin d’empêcher toute souffrance de l‘animal.

Remplacement

Les alternatives non animales de ce projet sont l’homme lui même. Cependant, si des prélèvements périphériques (sang) et même bronchiques peuvent être obtenus chez l’homme, les expériences in vivo visant à définir de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’asthme restent cantonnées aux animaux. Il s’avère à l’heure actuelle impossible d’évaluer l’implication de certaines populations cellulaires ou molécules cibles thérapeutiques in vivo chez l’homme, sans avoir en amont un solide background des effets potentiellement bénéfiques de ces voies/molécules dans cette pathologie. Par contre on peut envisager des remplacements partiels de certaines parties expérimentales. Ainsi, nous avons mis au point un système de coupes de poumon frais cultivables dans du milieu permettant une évaluation ex vivo par exemple de la meilleur dose d’antagoniste ou de la meilleure cinétique à utiliser, ce qui permet de remplacer un certain nombre d’expériences animales de mise au point.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, dans la plupart de nos protocoles, un seul groupe témoin est utilisé et permet la comparaison avec les différentes souris génétiquement modifiées. De plus les analyses statistiques effectuées dans nos travaux précédents nous ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser, soit 6 souris par groupe, en répétant l’expérience 3 fois afin d’obtenir suffisamment de cellules à analyser pour la cytométrie en flux, 8 souris par groupe pour l’analyse des résistances des voies aériennes par flexivent (indépendamment de la cytométrie en flux car il a été montré que l’acétylcholine (dont un équivalent : la métacholine, est utilisée pour mesurer l’hyperréactivité bronchique au Flexivent®) induisait l’activation des cellules immunitaires comme les lymphocytes (augmentation rapide et transitoire du Ca2+ intracellulaire), ce qui pourrait modifier l’analyse de l’activation et de la production de cytokines des différentes cellules immunitaires analysées dans nos protocoles), et 4 souris par groupe pour l’histologie (de nouveau indépendamment des autres mesures car les lavages bronchoalvéolaires ou le flexivent endommage considérablement la structure du poumon).

Raffinement

Afin de réduire stress et souffrance, un enrichissement de l’environnement est pratiqué dans notre animalerie (maison rouge dans toutes les cages, maximum 4 souris par cage, possibilité de rajouter du carton). De plus, une surveillance régulière journalière des animaux est effectuée, et la mise à mort par injection létale de pentobarbital réalisée en cas de souffrance identifiée par des caractéristiques telles que : prostration, poils hirsute, perte de poids (égale ou supérieure à 15% du poids initial).

Choix des espèces

Les modèles animaux souris reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreuses souris génétiquement modifiées ou anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées et des cibles thérapeutiques pertinentes chez l’homme. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-8 semaines) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, subissent une chirurgie de 15 à 20 minutes pour induire une hypertension puis des mesures de pression et une échocardiographie sous anesthésie, pour étudier le remodelage des vaisseaux. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, infection et hémorragie et que l'anesthésie peut entraîner un arrêt cardiaque, tout en affirmant que l'hypertension induite reste indolore. Sur le remplacement, il affirme que la régulation de la pression artérielle ne peut être évaluée qu'in vivo et impose le modèle murin.

Objectifs

L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'altération de la structure des vaisseaux et le développement de l’hypertension artérielle. Plusieurs travaux ont corrélé l’activation d’un récepteur membranaire avec l’augmentation de la pression artérielle plus particulièrement chez les mâles. Notre objectif est de démontrer que cette voie régule la pression artérielle et la structure des vaisseaux, de comprendre quelles cellules vasculaires sont affectées et quelle est l'origine de l'effet dépendant du sexe.

Bénéfices attendus

L'identification de nouveaux acteurs régulant la structure des vaisseaux et jouant un rôle dans le développement de l'hypertension va permettre de mettre à jour de nouvelles cibles potentielles pour le traitement des hypertensions résistantes aux traitements actuels (environ 15% des malades).

Procédures

Au total 600 souris seront utilisées pour 3 procédures légères ou modérées. Dans les procédures modérées 1 et 2, les 480 souris seront soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes durant 1 semaine puis 2 fois par semaines pendant 5 semaines. Elles seront soumises à une procédure chirurgicale de 15 à 20 min pour mettre en place des modèles d’hypertension. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie et sous analgésique donné en préventif mais aussi en post-chirurgical. La pression sera mesurée à la queue de façon hebdomadaire. Les souris seront aussi étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie légère quelques jours avant la fin de la procédure où la pression sera mesurée dans la carotide sous anesthésie puis les souris seront euthanasiées. Dans la procédure 3 légère, les 120 souris seront soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes durant 1 semaine. La pression sera mesurée à la queue toutes les 2 semaines pendant 3 ou 6 mois. Les souris seront aussi étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie légère quelques jours avant la fin de la procédure où la pression sera mesurée dans la carotide sous anesthésie puis les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui pourront entrainer de la douleur péri et post-opératoire. Les procédures chirurgicales ou d’injection peuvent aussi conduire à des infections. Lors de la chirurgie, il peut y avoir une hémorragie. L’anesthésie peut aussi entrainer un arrêt cardiaque. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Selon notre expérience, les modèles transgéniques, utilisés à l'état adulte, n’entrainent pas de phénotype douloureux pour les animaux.

Devenir

Les 600 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression artérielle sous anesthésie. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et vasculaires et étudier les tissus.

Remplacement

Dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (progéniteurs en culture, cellules vasculaires en culture), cependant la régulation de la pression artérielle et la participation de cellules au remodelage vasculaire ne peuvent être évalués qu'in vivo, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins.

Réduction

Ce projet implique 600 souris au total avec des lots de 10 et 15 animaux. La taille des effectifs des différents lots a été déterminée grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. A notre connaissance, ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.

Raffinement

Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. En post-opératoire, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les 2 jours pendant 1 semaine. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémiques en péri-opératoire et à 24h et 48h en post-opératoire et pourra être renouvelée en cas de souffrance de l’animal. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique ou par administration d’antibiotique.

Choix des espèces

Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin de permettre la modification de l'expression de certains gènes ou de marquer des cellules par immunofluorescence. Seuls des modèles de souris existent pour ces altérations géniques. De plus la souris est un modèle couramment utilisé pour l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle. Les études sur le rôle de la voie ciblée sur le remodelage vasculaire et la pression artérielle seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines. De plus, la voie étudiée est importante pour le développement de la souris, donc nous utiliserons les souris à l'âge adulte (entre 8 et 15 semaines) afin de ne pas perturber leur développement en modulant la voie étudiée.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leur moelle osseuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des injections répétées de LPS ou de 5-FU, des irradiations aux rayons X et des prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour étudier la voie PIWI/piRNA dans les cellules souches du sang au cours du vieillissement. Le porteur indique que la transplantation ou les injections répétées peuvent provoquer une aplasie de la moelle osseuse, et fixe un point limite de perte de poids de 20 % déclenchant la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme que l'obtention de ces cellules impose des prélèvements invasifs et rend le modèle murin "indispensable".

Objectifs

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à l’origine de toutes les cellules du sang et assurent leur renouvellement en continue. Afin de répondre à l’homéostasie ou à un stress, ces cellules peuvent sortir de leur état latent, proliférer et se différencier. L’induction de la prolifération des CSH peut conduire à un vieillissement précoce. La voie PIWI/piRNA a été montré pour être nécessaire pour limiter la perte de fonction des cellules souche intestinale chez la drosophile en réponse a un stress induisant la prolifération. Nous souhaitons donc utiliser différents modèles de stress prolifératifs afin d’analyser l’importance de la voie PIWI/piRNA dans les CSH.

Bénéfices attendus

Le projet est un projet de recherche fondamentale. Le contrôle de l’intégrité génomique des CSH est indispensable afin de maintenir une hématopoïèse efficace. En effet, l’apparition de dommages de l’ADN comme ceux pouvant être engendrer par les éléments transposables, peuvent conduire soit à une senescence et donc à une diminution de la production de cellules sanguines soit au contraire à l'apparition de clones leucémiques. Il est donc important de bien connaitre les acteurs permettant de contrôler ces éléments transposables, tel que la voie PIWI/piRNA.

Procédures

Ce projet compte 10 procédures différentes comprenant des injections en intrapéritonéale notamment de LPS ou de 5-FU et des irradiations par rayon X sur animaux vigiles, des injections en sous-cutanées et en retro-orbitale ainsi que des prélèvements de sang en retro-orbitaux sous animaux endormis. Chacune de ces procédures est très rapide (de l'ordre de quelques secondes ou de quelques minutes pour l'irradiation), elles sont indolores au moment de la manipulation car au besoin elles sont réalisées sous anesthésie générale par isofluorane (1-3 mn en boîte à anesthésie isofluorane 4%, débit 2L/mn). Certaines injections en intrapéritonéales seront réalisées plusieurs fois (entre 1 et 10 fois tous les 2 à 14 jours d'intervalle selon la procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront être soumis à des irradiations par rayon X, une transplantation par injection intraveineuse de cellules hématopoïétiques, des injections en intrapéritonéale ou sous cutanées. Chacune de ces procédures est très rapide (de l'ordre de quelques secondes ou de quelques minutes pour l'irradiation), elles sont indolores au moment de la manipulation car au besoin elles sont réalisées sous anesthésie générale par isofluorane. Cependant, la transplantation ou des injections répétées de 5-FU ou de LPS peuvent entrainer une aplasie médullaire des animaux. Ces animaux seront donc surveillés quotidiennement.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chacune des procédures afin de pouvoir analyser les cellules souches hématopoiétiques présentes dans la moelle osseuse.

Remplacement

Dans l'impossibilité d'obtenir des échantillons de cellules souches hématopoiétiques (nécessitant des prélèvements invasifs), l'utilisation de modèles animaux est indispensable. De plus, la seule manière d'aborder de manière efficace et pertinente les questions que nous posons est de combiner des expériences in vivo, en utilisant les différents modèles de souris génétiquement modifiées. Ne pouvant donc pas remplacer le modèle murin, nous réduirons l'utilisation de souris au nombre minium possible.

Réduction

Sur la base de nos données préliminaires, nous calculerons le nombre minimum de souris nécessaire pour chaque expérimentation permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif (calcul du n avec un test unilateral pour une différence de 10%, un risque alpha de 5%, une puissance beta de 80%). Nous inclurons dans nos groupes expérimentaux aussi bien les males que les femelles afin de limiter au strict minimum le nombre d’animaux produits pour l’expérimentation. Ainsi, pour ce projet, nous utiliserons 600 animaux.

Raffinement

Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les souris afin d'améliorer le bien-être de l'animal pour obtenir des données fiables. Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur. Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si des signes de souffrances apparaissaient, les animaux seront mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement sera enrichi par des dômes en carton ou du coton.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. De nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiés (que nous ou d'autres ont créées) permettant de poser les questions biologiques qui nous intéressent existent déjà. Des souris adultes entre 6 semaines et 20 mois seront utilisées car nous analysons l'importance de la voie PIWI au cours du vieillissement des CSH.