Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Evaluation des effets de la greffe de poils humains sur la cicatrisation de plaies cutanées chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour l'induction d'une plaie cutanée et la greffe de cire contenant ou non des poils humains, puis un hébergement individuel jusqu'à leur mise à mort à deux ou quatre semaines. Le porteur indique une souffrance limitée dans le temps et un stress lié à l'isolement, atténué selon lui par des cages transparentes, et présente l'étude comme préliminaire. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de suivre la fonctionnalité d'une greffe dans la durée.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer chez la souris les effets de l’implantation de poils humains sur la cicatrisation de plaies cutanées. Il s’agit d’une étude préliminaire qui sera suivie, si les résultats sont concluants, par un projet plus conséquent. Des poils, prélevés par épilation à la cire sur un donneur humain sain, seront implantés dans le lit de plaies cutanées induites chez des souris possédant un système immunitaire fonctionnel ou non fonctionne , permettant ainsi d’évaluer d’une part la présence éventuelle d’une réaction de rejet, et d’autre part de suivre l’évolution du processus de cicatrisation au cours du temps. La comparaison se fera avec des souris qui seront greffées avec de la cire dépourvue de poils humains. Les poils greffés seront laissés en place tout au long de l’expérimentation. Un prélèvement cutané au large de la région greffée sera effectué sur une moitié des souris à un temps de cicatrisation moyen, 2 semaines, l’autre partie sera prélevée après cicatrisation complète de la plaie cutanée, soit environ 4 semaines. Un ensemble d'analyses sera effectué sur les prélèvements cutanés.
Bénéfices attendus
Les follicules pileux sont des mini-organes complexes qui résident dans une couche de la peau. Lorsque la peau est blessée, les cellules du follicule pileux s'activent et commencent à migrer vers le site de la plaie et contribuent au processus dee cicatrisation. Des greffes de poils pourraient ainsi permettre de favoriser la régénération du tissu cutané au niveau d’une plaie cutanée de taille importante tout en favorisant la repousse des poils au niveau de la zone lésée, permettant également d’avoir une cicatrice plus esthétique car beaucoup moins visible, les poils ne repoussant pas ou très peu au niveau d’une plaie cutanée de taille importante. Cela permettrait de réaliser une autogreffe en prélevant sur le patient des poils pour lui implanter directement dans la plaie à traiter, évitant ainsi tout rejet et traitement anti-rejet.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de cire contenant ou non des poils humains, effectuée sous anesthésie générale. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes seront protégées par une compresse et un pansement de couverture qui seront changés 2 fois par semaine, et des observations et un scoring seront réalisés lors de chaque change effectué. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Le maintien des souris greffées ou non en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture et la compresse, et surtout le greffon de cire.
Impact sur les animaux
L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe de cire contenant ou non des poils peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation. Le processus cicatriciel est en effet long passant par différentes phases et la peau néoformée est une peau très fragile. Cet hébergement en cage individuelle des souris peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris de voir au moins une de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de poils humains et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 40 souris greffées nécessaires à la réalisation de ce projet seront mises à mort pour moitié 2 semaines après réalisation de la greffe et pour l’autre moitié 4 semaines après réalisation de celle-ci. Un ensemble d’analyses sera réalisé sur des prélèvements cutanés effectués au large de la région greffée.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de greffes, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme, et le temps de cicatrisation est relativement court par rapport à l’utilisation d’autres espèces, permettant d’obtenir des résultats plus rapidement. Son utilisation est par ailleurs largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).
Perturbation endocrinienne de la relation Reproduction-Immunité-Métabolisme énergétique chez le bar européen par du triphényle phosphate
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système urogénital
700 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés pendant deux mois au triphényl phosphate, un plastifiant suspecté d'agir comme perturbateur endocrinien, à concentration environnementale, puis maintenus neuf mois avant d'être tués pour prélèvement d'organes et de tissus. Le porteur décrit un suivi par grille de score, un individu à la nage désordonnée étant mis à mort au point limite, et ne prévoit pas d'intervention sur animal vigile ou anesthésié en dehors de cette fin. Il affirme que les approches in vitro ou in silico ne permettent pas d'évaluer l'impact du produit sur un "organisme entier", ce qui justifierait selon lui le passage par le poisson vivant.
Objectifs
L'immunité est une fonction majeure impliquée dans les défenses contre les agents pathogènes. Chez les vertébrés à mâchoire, les lymphocytes T ont la particularité de se développer dans le thymus lui-même sujet à des variations de taille suivant l'âge ou les taux plasmatiques des hormones sexuelles. Ces variations ont été associée à une altération de l'abondance des sous-types de lymphocytes T périphériques, une diminution de la réponse immunitaire adaptative, une augmentation de l'incidence des maladies infectieuses et une augmentation de la tolérance immunitaire (grossesse). Nous avons montré que les effets des estrogènes sur le thymus et les lymphocytes T étaient conservés entre le bar et les mammifères et que l’exposition à de l’estradiol (E2) modulait chez le bar la plasticité thymique et augmentait sa tolérance immunitaire. Chez le poisson, le thymus subit une involution hivernale puis une reformation en été qui semble avoir lieu chez des juvéniles de l'année mais également des individus matures avec chez ces derniers une involution plus marquée ainsi qu'un dimorphisme sexuel. En plus des hormones sexuelles, celles du métabolisme semblent également être des éléments de premier ordre dans ce phénomène. Ces dernières ont un rôle dans la gestion des réserves énergétiques ou le métabolisme en général, mais également dans la régulation de la reproduction. Ainsi, les fonctions de reproduction, d’immunité et de métabolisme sont étroitement liée. Au sein de ce projet, nous testerons dans un premier temps (1) l’hypothèse selon laquelle l'involution thymique serait influencée par les hormones stéroïdes résultant d’un compromis énergétique (trade-off) entre immunité et reproduction. L’action des perturbateurs endocriniens à activité estrogénique (PEE) sur les téléostéens est bien documentée (reproduction, croissance, immunité…) mais rares sont les études analysant les impacts sur plusieurs fonctions physiologiques à la fois. Le triphényl phosphate (TPP), détecté dans les eaux de surface de nombreux pays, est un plastifiant suspecté PEE, connu pour affecter la reproduction, l’immunité et le métabolisme. Ainsi, dans un second temps, (2) nous évaluerons l’impact du TPP sur ce trade-off établi entre ces trois grandes fonctions.
Bénéfices attendus
- Chez les poissons téléostéens, les connaissances concernant la régulation endocrinienne et environnementale (incluant la contamination environnementale) de la reproduction et de l’immunité par les hormones du métabolisme sont quasiment inexistantes. Or il s’avère que la compréhension de ces mécanismes est à la base de cette demande. Les mécanismes étant très conservés chez les vertébrés, les résultats permettront par ailleurs de mieux comprendre le lien existant entre certaines pathologies humaines métaboliques, l’immunité et la reproduction. - L’étude de l’action du TPP sur un équilibre affectant plusieurs fonctions physiologiques permet une vision plus intégrative et de mieux appréhender les risques environnementaux et sanitaires associés à la présence de ce contaminant largement utilisé dans les produits de la vie quotidienne. Nous pourrons faire une évaluation intégrative de la santé des individus de poissons mais aussi plus largement des populations. - Ce travail aidera, par extrapolation, à élucider l’impact du TPP dans certaines pathologies humaines métaboliques, mais aussi sur l’immunité et la reproduction qui, chez les sujets obèses, sont moins performantes.
Procédures
Les animaux seront exposés à un contaminant à concentration environnementale pendant 2 mois, puis maintenus en condition non contaminée pendant 9 mois (température, luminosité, pH contrôlés). Aucune intervention sur animal vigile ou endormi. Chaque individu sera euthanasié pour prélévement d'organes et tissus.
Impact sur les animaux
Le projet est divisé en deux périodes. Durant la première, les poissons seront maintenus en conditions contrôlées mimant une évolution naturelle des saisons. Durant la seconde, les individus seront exposés à un contaminant à concentration environnementale pendant 2 mois, puis maintenus en condition non contaminée pendant 9 mois (identique à la première période). Un période d'acclimatation de 7 jours sera respectée afin de permettre leur habituation et une meilleure gestion du stress. Des contrôles quotidiens seront effectués afin de s'assurer du bien-être des poissons et du respect des conditions d'hébergement (température, pH, luminosité...). Dans le but de réduire au maximum la douleur, l’angoisse et la souffrance des animaux nous utiliserons durant toute l’expérimentation la grille de score de la Fraunhofer institute. Un animal qui présenterait une nage sur le dos avec des mouvements non coordonnés, nage erratique serait immédiatement euthanasié (point limite) après anesthésie (MS222).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement d'organes et tissus.
Remplacement
Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de ce PEE sur un organisme entier. Afin de comprendre l’impact de ce TPP sur la physiologie du poisson, nous devons obligatoirement passer par un modèle vivant. Cependant, toutes les études préalables de définition de concentrations utiles ont été réalisées par une approche in vitro.
Réduction
- Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux, nous avons calculé l’effectif nécessaire pour pouvoir détecter un effet significatif s’il existe réellement. Pour cela, il est nécessaire de décrire plusieurs paramètres : la puissance statistique souhaitée (habituellement 90%), delta (différence de moyenne attendue), sd (écart-type attendu des données), le risque alpha (habituellement 5%). Les paramètres delta et sd ont été obtenus à partir d’expérimentations précédentes sur des bars matures mâles et femelles. Résultat : - Les concentrations utilisées sont en cours de détermination grâce à des tests in vitro. Ces derniers permettront de cibler les concentrations intéressantes afin de limiter le nombre de conditions et donc d’organismes utilisés. - Plusieurs mesures biologiques et chimiques sur chaque individu
Raffinement
Dans le but de réduire au maximum la douleur, l’angoisse et la souffrance des animaux nous utiliserons durant toute l’expérimentation la grille de score de la Fraunhofer institute qui est un bon guide pour la prise de décision quant à la souffrance animale. Un animal qui présenterait une nage sur le dos avec des mouvements non coordonnés, nage erratique serait immédiatement euthanasié (point limite). Nous souhaitons qu’à la base de cette grille de score nous restions avec des animaux qui sont en code couleur vert.
Choix des espèces
Le bar Européen constitue une espèce à fort intérêt écologique et économique et, du fait de sa production aquacole importante, son système immunitaire et reproductif font l'objet de nombreux articles scientifiques. De plus, suivant nos recherches, chez le bar, le thymus et les lymphocytes T font l'objet d'une régulation fine par les composés oestrogéniques, ce qui suggère que l'immunocompétence du bar pourrait être impactée par des perturbateurs endocriniens oestrogéniques présents dans son environnement. Cette espèce constitue donc un modèle de choix pour notre étude. Ce poisson est par ailleurs soumis à des restrictions croissantes de pêche en Europe de l’Ouest (850/98/EU ; 2018/120/UE) car les stocks de celui-ci sont actuellement en déclin et cela ne résulte probablement pas uniquement d’une activité de surpêche. Les individus seront pris à un âge où ils sont encore sexuellement immatures mais immunitairement matures (dès 180 dph, cohortes 1b et 2b) et matures à la fois sexuellement et immunitairement (dès 450 dph, cohorte 1a et 2a). Nous sommes intéressés par l’étude des étapes clés correspondant au basculement d’une immunité « entière » à une immunité moins complexe et en fonction de la saison et de la mise en place d’une stratégie de reproduction. Chez les bars, en termes de reproduction, les mâles développent leurs gonades dès 310 dph et les femelles en condition contrôlée dès 240 dph. Pour ce qui attrait à l’immunité, les bars sont matures dès 180 dph.
Maturation des circuits de l’adaptation au stress de l’ontogénie à la pathologie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour implanter des électrodes ou des fibres optiques dans le cerveau et injecter des virus, puis des tests comportementaux sur animaux vigiles, pour étudier l'influence des hormones de stress sur les circuits sociaux et un modèle du syndrome de Prader-Willi. Le porteur indique des douleurs modérées après les injections et la chirurgie, et un stress appliqué aux souris vigiles lors des tests. Il affirme que l'étude du comportement social suppose l'interaction entre êtres vivants, ce qui rendrait "impossible" le recours à un modèle in vitro.
Objectifs
Le stress est un facteur de risque de plusieurs maladies mentales affectant des millions de gens et imposant un coût socioéconomique important. Comprendre pourquoi certaines personnes sont plus de susceptibles que d'autres aux maladies mentales liées au stress est un défi prioritaire de la communauté Européenne et des associations de malades. Notre hypothèse est que le stress créerait un déséquilibre de perception entre des signaux d'alerte et de sûreté échangés entre partenaires sociaux. L'impact du stress serait d'autant plus important qu'il se rapprocherait de la période sensible du développement du cerveau. La persistence de ce déséquilibre chez l'enfant pourrait entrainer des troubles anxio-dépressifs chez l’adulte. De nombreuses études cliniques sont actuellement menées chez l’Homme dans lesquelles les hormones (ocytocine et vasopressine sont utilisées dans l’espoir de corriger les troubles d'anxiété et de comportements sociaux. Cependant, le mode d’action de ces deux hormones dans le cerveau reste méconnu. Un déficit de sécrétion de ces hormones pourrait avoir des conséquences directes sur le comportement social. C’est le cas par exemple de la maladie rare génétique du syndrome de Prader Willi (PWS) et du syndrome de Schaaf Yang (SY). Les trois quart des malades présentent des troubles du spectre autistique d’ordre cognitif et de sociabilité qui se manifestent chez l’adulte. De plus, l'administration d'un traitement chez les patients atteints de PWS montre un réel bénéfice à l'age adulte tant sur le comportement social que sur les autres troubles associés à la maladie comme par exemple l'hyperphagie. Le projet vise donc à suivre l’influence des hormones de stress sur le développement des cellules impliqués dans la perception des signaux d'alerte et de sûreté échangés avec des partenaires sociaux. Un autre des objectifs de ce projet est de mieux comprendre comment les neurones se mettent en place dans un modèle de PWS et leur impact sur le comportement social et le dernier objectif est de tester un traitement pour les personnes étant malades.
Bénéfices attendus
Cette étude représenterait un progrès significatif afin de comprendre comment le stress ou une maladie génétique influence la mise en place des circuits neuronaux ainsi que le comportement social. Dans un second temps, cela nous permettra de mieux caractériser le fonctionnement du traitement de PWS par l'ocytocine.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales sous anesthésie générale. Cela concerne l'implantation des électrodes électroencéphalographiques ou des fibres optiques ainsi que l'injection de virus pour exprimer des transgènes traceurs ou bien modificateurs. Une facon de réduire les nuisances prévues consiste à poser les implants pendant la même procédure que l'injection de virus. Cette méthode est efficace en terme de résultats et permet de réduire le nombre d'intervention. Chaque procédure ne durera pas plus de 40 minutes et elles seront faites par un experimentateur formé avec soin pour respecter les normes européennes d'expérimentation animale.
Impact sur les animaux
Des douleurs modérées peuvent être constatés chez les souris suite à des piqures d'injection. Sont également à prévoir des douleurs modérés après la chirurgie sous anesthésie générale (des anesthésiques locaux sont administrés systématiquement après la chirurgie afin de diminuer les effets indésirables) et du stress sur animaux vigiles sera appliqué pour les test comportementaux.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en respectant les bonnes pratiques et conformes à la protection des animaux pour vérifier l'inclusions ou non des individus avec les recombinaisons génétiques attendus.
Remplacement
La souris et l’homme partagent environ 98% de leurs 30 000 gènes, cela en fait donc un bon modèle pour étudier certaines maladies génétiques, d'autant que nous savons maintenant comment facilement manipuler leur génome. De plus, l'architecture cérébrale de la souris et de l'homme présente de nombreuses similitudes permettant de mieux comprendre les comportements humains grâce à la caractérisation du comportement de ce rongeur. Ces études du comportement social nécessite l'interaction entre des être-vivants rendant impossible l'utilisation de modèle in-vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit grâce à une approche longitudinale de sorte que chaque individu est son propre controle. Le nombre d’animaux par groupe et par condition est determiné à minima afin d'obtenir des données statistiquement significative.
Raffinement
Les animaux ne sont pas isolés et ont un environnement enrichi. Des points limites ont été clairement établis ainsi que les mesures appropriés afin de prendre en charge la douleur. Les animaux sont manipulés par l'expérimentateur tous les jours de manière douce afin d'eviter le stress avant les procédures experimentales. Les animaux sacrifiés à la fin de l'experimentation seront utilisés afin de corréler les données obtenues lors des test de comportement social aux études de biologie moléculaire permettant ainsi une exploitation optimale des souris.
Choix des espèces
La souris est un animal facile à élever et à manipuler, pour lequel les caractéristiques pharmacologiques des récepteurs de l’ocytocine et de la vasopressine sont bien connues, dont les rythmes électro-encéphalographiques sont bien décrits et rapportés à des comportements caractérisés. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu'à l'âge adulte afin de réaliser des études longitudinales de comportement.
Virus du Nil occidental (West Nile virus) : évaluation dans un modèle animal des facteurs génétiques impliqués dans la virulence
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Infectées par le virus West Nile, elles peuvent développer une perte de poids, une perte d'équilibre, une paralysie et mourir, un point limite de deux signes cliniques déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Le porteur compare la virulence de virus chimériques assemblés en laboratoire pour identifier les facteurs génétiques en cause. Il indique que la capacité du virus à infecter le système nerveux ne peut s'étudier qu'in vivo et présente ce modèle comme "nécessaire".
Objectifs
L’infection au virus West Nile (VWN) constitue un risque majeur pour la santé humaine et animale notamment chez les oiseaux sauvages et les équidés. Les symptômes liés à la maladie vont de la simple fièvre jusqu’à des atteintes neurologiques pouvant être mortelles dans les cas les plus sévères. Ce virus est présent dans de nombreux pays européens, avec 49 cas équins et 1 humain en 2015 ou encore 13 cas équins et 26 cas humains dans le sud de la France en 2018. Le VWN est retrouvé tous les ans dans le sud de la France. Sa transmission est assurée par les moustiques du genre Culex. Le réchauffement climatique impactant la distribution des espèces de moustiques, la répartition géographique de certains agents vectorisés par ces derniers, dont le VWN, peut se voir modifiée dans les prochaines années. La compréhension des mécanismes de la virulence chez l’hôte vertébré permet d’anticiper et de réagir rapidement face aux nouvelles épidémies. Actuellement, malgré la présence de traitement chez l’animal, aucun vaccin n’a été développé chez l’Homme. L’étude des facteurs impliqués dans la virulence s’ancre dans une dynamique de proposition de nouvelles cibles afin de disposer de solutions vaccinales. La souche WN Israël 1998 est considérée comme très virulente chez l’oiseau, tandis que la souche WN Italie 2008 est faiblement virulente. Des outils innovants en laboratoire ont rendu possible la génération de VWN modifiés, appelés chimères, par un assemblage artificiel de régions génétiques d’intérêts issus de ces deux souches et potentiellement impliquées dans la différence de leur virulence. Ces chimères ont déjà fait l’objet d’une étude dans des modèles cellulaires en laboratoire. Mais le VWN a la capacité à infecter le système nerveux. Cette capacité neuroinvasive ne peut s’étudier qu’à l’aide d’un modèle in vivo. L’évaluation de la virulence de ces chimères sur un modèle murin permettra de mieux comprendre le mécanisme de virulence de ces deux souches et d’identifier les facteurs génétiques potentiellement impliqués dans la virulence chez les vertébrés.
Bénéfices attendus
Nous avons choisi d’étudier la différence de virulence (dangerosité, capacité à se répliquer et à entraîner une possible mortalité) engendrée par la souche WN Israël 1998 et la souche Italie 2008 en modifiant leur génome. Pour cela, nous avons décidé d’échanger une partie de génome d’un virus avec une partie du génome de l’autre virus afin de reconstituer un génome entier, modifié, comprenant d’une part des fragments du premier virus et d’autre part des fragments du deuxième virus. Nous avons eu recours à une méthode au laboratoire permettant de remplacer un fragment génomique du virus Israël 1998, par le même fragment mais issu du virus Italie 2008. Ces virus ayant une virulence différente, cela permet de comprendre quel fragment peut être responsable d’une virulence amoindrie chez Italie 2008 par rapport à Israël 1998. A plus long terme, cette étude permettra d’identifier de nouvelles cibles pour la lutte antivirale.
Procédures
Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles (à la queue ou à la joue) ou sur souris anesthésiés (au sinus rétro orbital) par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement dure quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlés tous les jours.
Impact sur les animaux
Les souris sont sensibles à l’infection par WNV. Les signes cliniques décrits sont la perte de poids, perte d’équilibre et de motricité d’un membre, paralysie et la mort. Les animaux seront contrôlés tous les jours puis 2 fois par jour dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices.
Devenir
West Nile est un virus de classe 3, zoonotique. Les souris peuvent mourir de l’infection. Toutefois, un point limite (moment à partir duquel l’expérimentation sera arrêtée) est défini pour cette procédure expérimentale à savoir la présence simultanée de deux signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices. Dans le cas où les souris n’ont pas présenté ces signes avant la fin de l’expérimentation, elles seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes, et l’analyse de la quantité de virus dans ces différents prélèvements.
Remplacement
Les différences de comportement des constructions virales réalisées entre les virus WN Israël 1998 et Italie 2008 ont d’abord été étudiées sur des modèles alternatifs (culture cellulaire). Cependant, le modèle in vitro ne permet pas d’évaluer le pouvoir infectieux (développement de signes cliniques, présence de virus dans la circulation sanguine), la localisation du virus dans un organisme (« préférence ») et la virulence (mortalité). Le modèle in vivo est nécessaire pour cette étude.
Réduction
Au total 60 souris maximum seront impliquées dans ce projet d’étude. Six groupes seront constitués. Cinq souris seront utilisées par groupe afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement et scientifiquement. Le nombre de 5 souris par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure expérimentale par des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis pour une comparaison de moyennes d’échantillons indépendants (quantité moyenne de virus retrouvé dans le sang à un temps donné, suivi de mortalité), test t pour une comparaison de moyenne entre seulement deux échantillons,...). Un résultat sera considéré comme statistiquement significatif si la valeur « p » est strictement inférieure à 5% (p < 0,05). Un duplicat pourra être effectué en cas de la non infection des souris ou bien réaliser la même étude pour d’autres virus West Nile modifiés avec des facteurs génétiques d’intérêts.
Raffinement
Les souris seront plusieurs par cage (5/cage) avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton). Une surveillance bi-quotidienne des animaux est mise en place à compter de l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux trop sévèrement atteints, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte de poids, poils ébouriffés, dos voûté, troubles de la coordination des mouvements, perte d’équilibre, perte de motricité.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour le virus West Nile, de par sa grande sensibilité à l’infection après inoculation par différentes voies. Elle développe généralement des signes neurologiques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris auront entre 7 et 8 semaines. Les souris seront donc des adultes et cela facilitera les prélèvements sanguins car elles seront plus grosses.
Etude des mécanismes de la mort subite et inexpliquée en épilepsie
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
528 souris modèles du syndrome de Dravet vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes et de sondes, des crises d'épilepsie provoquées par inhalation de gaz de façon répétée et des tests comportementaux d'exploration et de mémoire, l'induction augmentant volontairement la fréquence des morts subites. Le porteur étudie les mécanismes de la mort subite en épilepsie, avec une gamme de médicaments protecteurs présentée comme une perspective. Il affirme qu'aucune crise ne provoque de douleur chez la souris et juge l'usage d'animaux vivants "absolument nécessaire".
Objectifs
Le syndrome de Dravet est une maladie développementale et épileptique sévère, due aux mutations d’un gène codant pour un canal laissant passer le sodium, caractérisée par une apparition précoce (
Bénéfices attendus
La SUDEP est la cause principale de décès chez les patients épileptiques et représente une énorme source d’angoisse pour la majorité des patients épileptiques et leurs familles à cause de son caractère imprévisible, sans aucun signe précédent la mort, et de ses conséquences dramatiques. Ce projet permettra une meilleure connaissance des mécanismes sous-jacent, l’identification de biomarqueurs et de cibles pharmacologiques permettant d’inhiber la SUDEP. Cela pourrait ouvrir une voie pour une nouvelle gamme de médicaments qui protègeraient de la SUDEP. La démonstration du rôle d’un neuromédiateur dans le réveil et l’arrêt de l’apnée post-crise représente l’objectif clinique final de notre projet, et toute la partie préclinique que nous réaliserons permettra de mettre en place le modèle d’analyse et de prédiction des crises.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie (maximum 1h30) qui permet d’implanter des électrodes et des sondes pour mesurer les paramètres physiologiques d’intérêt (activité électrique du cerveau et du cœur, ventilation) et récolter un peu de liquide sous-cutané pour mesurer les molécules d’intérêt. Les périodes d’enregistrement seront sur des périodes de 4 jours maximum, avec des pauses de 2 à 4 jours. Pour que les animaux deviennent épileptiques, ils respireront un mélange d’air et d’un gaz qui déclenche une crise au bout de 20 minutes environ. Ce protocole d’induction est répété quotidiennement pendant une première série de 5 jours, puis après une pause de plusieurs semaines, une seconde et dernière série de 5 jours avec ou non des enregistrements en même temps. Certains groupes auront un fin tube implanté qui permettra d’injecter des molécules d’intérêts sans toucher et stresser l’animal (pas de piqure). Un groupe d’animaux suivra des tests comportementaux très peu invasifs (exploration de nouvelles cages, de nouveaux congénères et mémorisation de parcours ou d’objets).
Impact sur les animaux
Les modèles de souris utilisés sont élevés en routine. A noter, aucune douleur n’est associée aux crises d’épilepsie qui se traduisent par une « extinction » de la conscience chez les humains, ce qui est très probablement la même chose chez les souris. Les crises induites artificiellement pendant les procédures et les crises spontanées apparaissant chez les animaux devenus épileptique sont absolument de même nature, elles ont une durée inférieure à 1 minute. Après les crises, les animaux ont une période d’immobilité d’environ 1 minute puis reprennent leur activité normale. La SUDEP est une mort soudaine, il n’y a aucun signe prédictif et donc aucune douleur ou nuisance quelconque avant son apparition. Les anomalies cardiaques mesurées sur des animaux adultes favorisent probablement la SUDEP mais ne se traduit pas par un phénotype visible, les animaux ont une activité physique normale. Les défauts cognitifs observés chez les adultes traduisent notamment des pertes de mémorisation mais cela n’est pas associé à une douleur pour les animaux. Les anomalies cardiaques et cognitives sont des conséquences à moyen terme, observées après plusieurs jours et non pas immédiatement après le début des premières crises. En résumé, les animaux épileptiques ont un comportement normal pendant leur élevage mais meurent soudainement (SUDEP) avec une fréquence faible, 5%. Les inductions artificielles de crises pendant les procédures vont augmenter la fréquence des SUDEP pendant toute la durée des procédures jusqu’à la mise à mort (effet attendu pour pouvoir étudier les SUDEP). Comme expliqué ci-dessus aucun autre comportement ou effet indésirable n’est attendu. Les nuisances principales induites par les procédures seront les chirurgies d’implantations (sondes et électrodes) et les enregistrements chroniques. Les animaux implantés sont étudiés pour une durée maximale de 40 jours avant mise à mort. Les animaux sont isolés pendant les périodes d'inductions et les périodes d'enregistrement et de tests de comportement (moins de 3h à chaque fois).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, la majorité seront ensuite utilisés afin de récupérer le cerveau pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques, cela apportera de nombreuses informations supplémentaires aux paramètres mesurés in-vivo.
Remplacement
L’épilepsie est un syndrome complexe avec des mécanismes de mise en place peu connus qui impliquent le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le système cardiaque et vasculaire et probablement le système immunitaire. Il est donc impossible d’étudier ces mécanismes dans des systèmes in-vitro et l’utilisation d’animaux vivants est absolument nécessaire.
Réduction
Nous utilisons indifféremment les mâles et les femelles qui seront répartis dans les groupes d’étude, soit une perte minimale. Les croisements ont été optimisés afin que la quasi-totalité des animaux à phénotype dommageable produits soient utilisés dans les procédures expérimentales. Une procédure est exploratoire et permet la mise au point fine des expériences et une optimisation du nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimum d’animaux nécessaires dans chaque groupe de chaque procédure a été calculé avec des outils statistiques afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en répondant à la question scientifique. Pour les mises au point, nous réutilisons des souris non utilisées dans les procédures.
Raffinement
Les animaux seront hébergés (au minimum 2 et maximum 5 par cage) avec un abri, de la ouate et une buchette pour leur permette des activités variées. Les conditions de réalisation des chirurgies ont été optimisées afin de réduire au maximum la souffrance des animaux ; tapis chauffant avec sonde rectale pour maintien précis de la température, application d’anesthésique local, cage de réveil chauffée, traitements antalgiques et antiinflammatoire (pendant et après la chirurgie) et une grille de score avec des actions précises mise en place. Nous utilisons des électrodes implantées en routine depuis plusieurs années dans des cages adaptées (connectique souple et rotative) et en alternant les périodes d’enregistrement avec des périodes de repos sans enregistrement pour diminuer la contrainte. Les animaux en enregistrement ne présentent aucun signe de souffrance (enregistrements déjà réalisés sur plusieurs mois). Ils sont enregistrés par 2 dans une cage. Ils sont séparés, et non pas isolés, par une paroi métallique munies de nombreux trous de 1 cm de diamètre permettant les contacts, des échanges de ouate et d’odeurs. Les animaux tests sont des animaux sauvages à phénotype non dommageable. Nous utilisons des cathéters implantés pour injecter les animaux sans manipulation et sans piqure ce qui évite tout stress au moment de l’injection.
Choix des espèces
Plusieurs types de souris modèles du syndrome de Dravet sont utilisés, ils reproduisent très bien les symptômes observés chez les patients humains. Nous avons basé ce projet sur un modèle que nous utilisons couramment et connaissons bien, que nous n’avons pas besoin de générer une autre lignée et que nous pouvons sélectivement augmenter le taux de SUDEP à plusieurs âges (après induction). L’utilisation des souris DBA/1 est basé sur leur pertinence en tant que modèle de la SUDEP et parce que cela ne nécessite aucun croisement supplémentaire, les animaux sont tout de suite utilisables dans les procédures, et elles présentent un phénotype normal avant l’induction (élevage classique). Le choix de lignées spéciales avec des mutations qui permettent d’utiliser des outils génétiques couplés à une stimulation chimique ou lumineuse est restreint par la disponibilité de lignées ciblant spécifiquement les neurones d’intérêt qui sécrètent la sérotonine ou le neuromédiateur d’intérêt. Les lignées achetées puis croisées pour aboutir aux génotypes nécessaires sont normales. Seuls les animaux issus des derniers croisements destinés aux procédures devraient avoir un phénotype dommageable. Les crises peuvent être induite sans limite de P19 jusqu’à l’âge adulte. Nous utiliserons les animaux dès le sevrage à l’âge P21 pour avoir des animaux assez robustes et mimer l’apparition des crises chez les jeunes. La plupart des mesures sont sur des animaux plus âgés (P50 ou P70) pour pouvoir comparer aux données de nos collaborateurs sur des patients adultes.
Régulation de l’entrée et de la sortie des lymphocytes du ganglion lymphatique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des gavages de tamoxifène et des injections de cellules et de fingolimod, quelques-unes une prise de sang, avant mise à mort pour la recherche fondamentale. Le porteur étudie l'entrée et la sortie des lymphocytes dans le ganglion lymphatique et le rôle de deux récepteurs, avec des retombées cliniques présentées comme à moyen terme. Il affirme qu'il n'est "pas possible" de remplacer les animaux, ces mécanismes n'étant pas reproductibles de façon fiable en culture cellulaire.
Objectifs
Les cellules immunitaires circulantes, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des organes lymphatiques en franchissant les portes d’entrée et de sortie qui sont gardées par les cellules endothéliales lymphatiques. C’est uniquement à l’intérieur de ces organes que les lymphocytes sont activés pour lutter contre des pathogènes ou le cancer. L’objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes d’ouverture et de fermeture des portes en analysant la fonction de deux molécules appelées RANK et LTbR. Ce sont des récepteurs qui activent la cellule endothéliale et qui sont déjà connus pour leur fonction dans le développement des organes lymphatiques.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est utilisé en clinique, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection et le cancer.
Procédures
Deux gavages (durée 2 minutes) sont réalisés sur animal vigile, 2 ou 3 injections (durée 1 minute chacune) sont réalisées sur animal anesthésié pendant une période qui varie entre 7 jours et 3 semaines. Sur quelques animaux anesthésiés une prise de sang et effectuée (durée 2-3 minutes).
Impact sur les animaux
Le gavage au tamoxifène dans l’huile de colza, l’injection de cellules et du fingolimod dans la cavité abdominale et le prélèvement sanguin nécessite une contention source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes. Les injections de cellules par voie intraveineuse, intradermique et souscutanée se font sous anesthésie générale gazeuse, ce qui nécessite également une contention de courte durée. Aucun geste n’est répétitif. Il n’y pas de phénotypes dommageable des modifications génétiques. Les produits administrés n’ont pas un effet de nuisance (irritation, douleurs autres, changement de comportement.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet à des fins de recherche fondamentale.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant l’entrée des cellules immunitaires dans le ganglion lymphatique et leur sortie sont complexes et ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Nous avons identifié des données dans la littérature scientifique (par exemple la quantité des produits à administrer) permettent une meilleure réussite de l’expérience et ainsi de réduire le nombre de souris. Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car leur drainage se fait de façon quasi exclusive par les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Les données entre les différents groupes sont analysées par la méthode statistique adaptés.
Raffinement
Les animaux adultes sont habitués à la contention ce qui contribue à réduire le stress lié aux gavages et aux injections dans la cavité abdominales des gestes réalisés sur animal vigil. Les injections intraveineuses, intradermiques et sous-cutanées et le prélèvement sanguin sur animal âgé d’en mois 2 semaines sont effectuées sur l’animal endormi par une anesthésie gazeuse et placé sur une plaque chauffante thermostatée pour assurer le maitien de sa température corporelle tout au long de la procédure. . L’injection intraveineuse est suivie par un analgésique local, appliqué sur l’œil, pour limiter la souffrance suite au réveil de l’animal. Un temps de récupération de l’animal entre les gestes réalisés sur l’animal est accordé (minimum 18h). Le bien-être de l’animal est évaluée par un personnel expérimenté, prenant en compte une surveillance des lieux de d’injection, le poids, l’apparence, le comportement, hydratation, respiration et l’aspect des fèces. Les critères sont notés. Lorsque qu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. A l’aggravation, la structure en charge du Bien-Être des Animaux est contacté et des mesures conseillées appliquées. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages : tunnel et abris, matériel de nidification et buches à ranger. Les souriceaux sont rapidement retournés à la mère après gavage.
Choix des espèces
La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques chez l’homme et la souris. Il existe des moyens chez la souris d’invalider des gènes de manière spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques ce qui permet d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires régulant l’entrée et la sortie les lymphocytes du ganglion lymphatique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) afin de garantir un système immunitaire mature. Des nouveaux nées seront également utilisées, puisque le développement du ganglion lymphatique est lié à l’entrée et la sortie des lymphocytes ce qui apportera des connaissances sur organisation de l’organe.
Rôle du métabolisme des cellules dendritiques dans le développement du psoriasis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections répétées, une greffe de moelle osseuse après conditionnement et un psoriasis induit sur la peau, avec suivi quotidien d'un score de sévérité, avant mise à mort pour prélever les organes. Le porteur étudie le rôle du métabolisme des cellules immunitaires dans le psoriasis, avec de nouvelles pistes de traitement présentées comme possibles. Il décrit une technique d'édition génétique remplaçant "partiellement" les modèles murins mais juge le modèle animal "indispensable" pour rendre compte de la complexité de la maladie.
Objectifs
Le psoriasis est une pathologie inflammatoire cutanée affectant 2 à 3 pourcent de la population. Elle résulte d'interactions complexes entre des facteurs génétiques, environnementaux, des atteintes de la barrière cutanée et un dysfonctionnement du système immunitaire. Outre la gêne physique, le psoriasis exerce un fort impact psychosocial. De manière surprenante, de nombreuses études cliniques ont fait état d'une forte association non seulement avec l'arthrite, une autre pathologie inflammatoire, mais aussi avec l'athérosclérose, le diabète de type 2 et le syndrome métabolique qui, prises dans leur ensemble, représentent la première cause de mortalité dans les pays industrialisés. Notre projet de recherche vise à comprendre l'association entre le psoriasis et le métabolisme. Le but de ce projet est donc de déterminer de quelle manière les altérations du métabolisme cellulaire affectent les cellules immunitaires lors du développement du psoriasis.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle du métabolisme des cellules immunitaires, dans le développement du psoriasis et son exacerbation par les acides gras. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement visant à moduler le développement du psoriasis via une approche métabolique.
Procédures
Toutes les injections se font sur animal vigile. Au début et avant la mise à mort le sang sera prélevé au niveau de la veine mandibulaire. Des injections intrapéritonéales se feront pendant 2 jours consécutifs en alternant les sites d’injections. Elles seront suivies d’une injection intraveineuse au niveau de la queue, les souris seront mises à mort 7 semaines après. Un autre groupe de souris receveront des injections intrapéritonéales tous les jours pendant 7 jours en alternant les sites d’injections et seront mises à mort 24 après la derniére injection. Concernant les souris qui receveront les injections en sous cutannées : Un groupe de souris recevera une seule injection sous cutanée 3 jours avant la mise à mort. Un autre groupe recevera deux injections sous cutanée de 72h d’intervalle, les souris seront mises à mort 16h après la derniére injection. Nous ne nous attendons pas à une douleur ou souffrance de l'animal suite à ces injections, ce sont des pratiques maitrisées par l'équipe.
Impact sur les animaux
Concernant les injections, si elles doivent se faire par voie intraperitonéales répétés les sites d’injections seront alternés pour éviter une réaction cutannée. Les sites d’injections seront surveillés quotidiennement. En cas de réaction cutanée due à l’injection, une désinfection avec un antiseptique incolore sera réalisée une fois par jour pendant 3 jours. Si le point d’injection s’infecte ou que l’animal est prostré, une mise à mort sera nécessaire. Concernant la transplantation de la moelle osseuse, un échec de reconstitution de la moelle osseuse entrainera une immuno- déficience et une anémie dans un délai de 10 jours. Pour éviter la survenue de ce problème, l’efficacité de la greffe sera évaluée au bout d’une semaine par prise de sang. En absence de reconstitution du système hématopoïétique, l’animal sera sacrifié. Le régime HFD donne au poil des souris un aspect gras, ce qui n'a pas d'incidence sur leur bienêtre. En revanche, la texture molle des croquettes HFD peut entrainer un allongement des dents. Par conséquent, des buchettes de bois seront ajoutées dans la cage des animaux afin de répondre à leur besoin naturel de ronger. Si, malgré cela, les dents des animaux deviennent trop longues, elles seront raccourcies à l'aide d'un ciseau. Pour limiter l’angoisse, les souris seront placées en groupe de 6 par cage avec des abris et du matériel de nidification. Des croquettes et eau gélifiées seront mises à disposition au fond de la cage en cas de perte de poids de plus 10 pourcent. Nous ne nous attendons pas à une douleur ou souffrance de l'animal suite à ces injections, ce sont des pratiques métrisées par l'équipe
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure par la suite, nous récupérerons les organes d’interêts afin de pouvoir analyser les tissus par cytométrie en flux, microscopie, RNAseq, effectuer de la culture de cellules primaires
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Toutefois, nous avons mis en place une approche utilisant la technologie d’édition génétique permettant de remplacer partiellement ces modèles murins. Ces cellules seront modifiées in vitro puis réimplantées dans des souris receveuses lors d’une procédure de greffe de moelle osseuse. Cette technique couramment utilisée permet de remplacer les cellules immunitaires de la souris receveuse par celles de la souris donneuse. Auparavant, nous aurions dû maintenir une colonie de souris supplémentaires et donc générer plusieurs centaines d’animaux au cours du projet. L'utilisation de modèles murins précliniques est indispensable afin de répondre à notre hypothèse de travail. En effet, bien que le psoriasis se manifeste au niveau cutané, le système immunitaire entre en jeu lors du développement de cette pathologie, notamment au niveau des ganglions lymphatiques. Un modèle murin est donc indispensable afin de prendre en compte la complexité de la pathologie.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous estimerons le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Nous inclurons dans notre étude les facteurs sexe et âge en utilisant les souris mâles, et ce peu importe leur âge. L’élevage de nos souris se fait de manière à générer des souris correspondant à nos besoins expérimentaux et peu d'animaux surnuméraires. En cas de besoin, des animaux wild-type seront commandés chez des fournisseurs agréés.
Raffinement
Les expérimentateurs disposent de l'expérience et du savoir-faire adéquat afin de réaliser ces procédures tout en privilégiant le bien-être animal. Nous n’avons précédemment observé aucune incidence sur le bien être des souris en termes de poids, prise alimentaire, ou quelque forme de détresse. Pour chaque procédure, nous avons prévu des mesures adaptées permettant la gestion de la souffrance, l'angoisse et la douleur pour nos animaux. Ils auront libre accès à de l’eau et de la nourriture. Les souris seront placées en groupe de 6 par cage avec des abris et du matériel de nidification. Les sites d’injection seront surveillés quotidiennement et alternés, en cas de réaction cutanée due à l’injection, une désinfection avec un antiseptique incolore sera réalisée tous les jours. Si le point d’injection s’infecte ou que l’animal est prostré, un sacrifice sera nécessaire. Un échec de reconstitution de la moelle osseuse entrainera une immuno- déficience et une anémie dans un délai de 10 jours. Pour éviter la survenue de ce problème, l’efficacité de la greffe sera évaluée au bout d’une semaine par prise de sang. En absence de reconstitution du système hématopoïétique, l’animal sera mis à mort.Le régime HFD donne au poil des souris un aspect gras, ce qui n'a pas d'incidence sur leur bienêtre. En revanche, la texture molle des croquettes HFD peut entrainer un allongement des dents, des buchettes de bois seront ajoutées dans la cage. Si, malgré cela, les dents deviennent trop longues, elles seront raccourcies à l'aide d'un ciseau.Un des effets secondaires de l’imiquimod (IMQ) est la déshydratation. Ainsi, en cas de signe visuel de déshydratation cutanée accompagné d’un test manuel appelé test du pli cutané, les deux dernières applications de l’IMQ sont accompagnées d’une injection intrapéritonéale de 500 μl de solution de NaCl 0,15M. Les applications d’IMQ étant quotidiennes, un suivi est assuré tous les jours. Un score PASI sera réaliser pour mesurer quantitativement la sévérité du psoriasis quotidiennement Pour limiter l’angoisse.En cas de perte de poids de plus de 10%, des croquettes et eau gélifiées seront mises à disposition au fond de la cage.Une intervention sera mise en place si l’animal est en souffrance mais le traitement ne dure que 5 jours, nous ne nous attendons pas à un psoriasis sévère nécessitant la mise a mort de l’animal.Si les animaux ont du mal à marcher à cause de l'inflammation du CFA et qu'ils montrent un signe de souffrance ils seront mis à mort
Choix des espèces
1) Nous avons choisi le modèle murin car c'est un modèle standard, bien reconnu dans le domaine scientifique pour l'investigation de manipulations génétiques 2) Les souris nous permettront de répondre au mieux aux objectifs de notre projet, de plus qu’ils sont déjà disponibles dans notre élevage. 3) Le modèle murin présente plusieurs avantages par rapport à d'autres espèces : cycle de vie court, natalité importante, élevage à faible cout Les souris d'élevage seront maintenues pour une période de six mois correspondant à leur capacité de reproduction. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 5 semaines et au maximum à l’âge de 16 semaines, ce qui correspond à un développement suffisant des animaux pour nos procédures. A la fin des expériences, elles seront mises à mort par dislocation cervicale.
Les oligosaccharides, nouvelle cible pour le traitement des tauopathies, tels que la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris exprimant une forme humaine mutée de la protéine tau reçoivent des injections intrapéritonéales ou orales deux fois par semaine pendant deux mois, avant mise à mort pour analyser le cerveau. Le porteur teste des sucres complexes censés freiner les tauopathies comme la maladie d'Alzheimer, dont il affirme déjà qu'ils "se révèlent utiles". Il présente la souris comme "la seule espèce mammifère" modifiée pour exprimer la tau humaine mutée et juge la confirmation in vivo "nécessaire".
Objectifs
Les tauopathies, auxquelles appartiennent la maladie d’Alzheimer et les démences fronto-temporales, se caractérisent par une perte neuronale due à l’accumulation de la protéine tau sous une forme anormale (=tauopathie) dans le cerveau des patients. À ce jour, aucun traitement curatif de ces pathologies n’existe sur le marché. Dans le but de développer un traitement pour ces pathologies, notre laboratoire étudie le rôle de certains sucres complexes (=oligosaccharides), sur la modification anomale de la protéine tau. Il a notamment été montré que certains sucres complexes sont critiques pour le développement et l’évolution de la maladie d’Alzheimer. La forme anormale de tau dans les cellules neuronales résulte de l’interaction de la protéine avec ces oligosaccharides complexes internalisées dans les neurones des sujets malades. Enfin des études préliminaires ont montré la capacité d'un oligosaccharide mimétique à diminuer le développement des tauopathies en rentrant en compétition avec les sucres complexes de la membrane cellulaire et en diminuant la propagation de la tauopathie. Les oligosaccharides mimétiques se révèlent dès lors être utiles dans le traitement des tauopathies, et tout particulièrement dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Notre objectif va être de démontrer qu'il est possible en utilisant nos oligosaccharides mimétiques de diminuer le développement de la tauopathie dans un modèle murin exprimant la protéine Tau humaine mutée responsable du développement de la maladie. Ainsi en poursuivant l’étude de ces molécules dans ce modèle, sélectionné pour sa capacité à reproduire plusieurs aspects de la maladie (modification de la tau, mort des neurones et troubles cognitifs aux âges avancé…), nous espérons avoir des preuves solides de l’efficacité de cette stratégie thérapeutique pour débuter de premières études chez l’homme. En effet, il est nécessaire d'un point de vue réglementaire de démontrer que notre concept est efficace dans un modèle se rapprochant de l'homme pour débuter des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Actuellement les traitements sur le marché sont uniquement symptomatiques et ont un bénéfice clinique limité pour les patients. Il est ainsi important de développer un traitement capable de stopper ou ralentir les mécanismes impliqués dans le développement de la maldie d'Alzheimer. Ce projet consiste donc à caractériser l'effet d'une nouvelle classe de molécules thérapeutiques ciblant un mécanisme impliqué dans l'agrégation anormale de la protéine Tau, qui mène aux troubles cognitifs de la maladie.
Procédures
Les procédures 1 et 2 consistent en des traitements 2 fois par semaine (les matinées du lundi et jeudi) pendant 2 mois par injection intra-péritonéale ou administration par voie orale des molécules d'intérêt (max 0,1 ml/souris) ou des mises à mort afin de récupérer le tissu cérébrale en vue d'analyses. Pour un groupe d’animaux (6 animaux par cage) il faut environ 10 min par traitement. Cela comprend la pesée et l’injection intra-péritonéale (ou administration par voie orale) des 6 animaux du même groupe.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux dans nos procédures sont liés à l’élevage en captivité des animaux sur plusieurs mois et la manipulation des animaux (contention, change). Pour information, les animaux sont utilisés à des âges inférieurs à 5 mois, c'est-à-dire avant le début des signes cliniques moteurs modérés induits par la tauopathie dans ce modèle. Nos deux procédures sont classées modérées et les nuisances et effets indésirables attendus sont liés à la contention et à l'insertion répétée de l'aiguille en intra-péritonéale même si le site d'injection est alterné (droite et gauche). Pour information l'analyse toxicologique de nos molécules faite chez la souris C57BL6 par un laboratoire pharmaceutique n'a pas montré de toxicité même à forte dose (500 mg/kg) pour la voie orale. Les effets indésirables pourront également être évalués lors des études de biodisponibilité des produits qui seront réalisées par la même société en amont de cette partie expérimentale. Par ailleurs de précédentes études utilisant nos molécules n'ont pas mis en évidence de potentiels effets toxiques de la molécule aux doses utilisées (voie intra-péritonéale, 2 mois, 2x/semaine, 25 mg/kg).
Devenir
Les animaux de l'ensemble des procédures seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les analyses nécessaires à la quantification de nos paramètres biologiques dans le cerveau.
Remplacement
La tauopathie est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine Tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie caractéristique de la maladie d'Alzheimer. Des résultats antérieurs obtenus sur des cellules primaires issues de ce modèle de souris montrent des effets prometteurs de notre molécule d'intérêt. La confirmation dans un modèle murin est maintenant nécessaire.
Réduction
Pour les études chez l'animal, nous avons optimisé le nombre d’animaux par groupe (12 souris / groupe pour la procédure 1 et 20 souris / groupe pour la procédure 2) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et réaliser des analyses avec un nombre d’animaux réduit au strict nécessaire. Pour chaque animale, différentes régions du cerveau seront étudiés afin de caractériser l'évolution de la pathologie. Ainsi chaque groupe sera subdivisé en sous-groupe de 12 ou 20 animaux, selon leur âge, qui seront maintenus vivants dans les conditions standard d’animalerie pendant 2 et 4 mois. Aux temps correspondants, les différents groupes d’animaux seront mis à mort afin d’étudier l’évolution de la maladie dans le cerveau ainsi que sa corrélation avec notre cible. Pour répondre à ces objectifs au maximum, 256 souris seront nécessaires (sur 5 ans). Les différentes lignées de souris utilisées dans le projet seront disponibles par un élevage en interne. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux dans le cadre de la sélection de la dose optimale, la biodisponibilité des molécules les plus efficaces a été réalisée en externe par un laboratoire pharmaceutique.
Raffinement
Afin de détecter et de limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux, nous surveillerons leur état général et leur comportement. Une liste de vérifications contenant l’ensemble de points définis pour identifier la douleur ou la détresse de l’animal est établie : -L’évolution du poids de la souris -L’état de ses poils : poil hérissé -Sa posture, sa démarche et comportement : dos voûté, léthargie ou réticence à se déplacer, état défensif, grattage ou morsure. -On explore son environnement : absence de toilettage, redressement sur ses pattes arrière, diminution de la quantité de nourriture et d’eau ingérée. L’ensemble permet d’identifier si les animaux souffrent. Les animaux sont observés 2 fois/jour jusqu’à leur mise à mort (sacrifice). En cas de douleur : Les souris souffrantes seront transportées dans des cages isolées. Une injection d'un anti-douleur sera réalisée pour un effet antalgique et l’état de l’animal sera suivi. Durant la période d’hébergement, l’eau de boisson sera changée chaque jour et un régime alimentaire normal sera fourni. En cas de non-récupération observée nous allons consulter le personnel vétérinaire du laboratoire afin d’obtenir leur expertise en matière de signes cliniques de la douleur ou de la détresse.
Choix des espèces
Notre objectif est de valider l’importance de certains sucres complexes, dans un modèle mammifère de tauopathie. L’expérimentation sur le rongeur reste une étape indispensable avant toute expérimentation sur des modèles plus proche de l’homme (primate). Les rongeurs sont adaptés aux études scientifiques : 98% des gènes partagés avec l’homme, faibles tailles, grandes fécondités, courtes durées de vie, accessibilité et disponibilité d’outils biologiques. De plus, la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie (modèle reconnu par la communauté scientifique). Les souris qui développent la tauopathie sont utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois et jusqu'à 4,5 mois (mise à mort à 4 et 4,5 mois), c’est -à-dire de l'âge où la tauopathie commence à se développer (2 mois) et sacrifiées avant l'apparition des signes cliniques moteurs (8 mois). Les souris « contrôle » de même fond génétique ne possédant pas la mutation, servant de référence à ces études sont utilisées aux mêmes âges. Les organes périphériques des souris traitées avec les molécules seront également utilisés pour étudier les effets secondaires périphériques possibles des molécules. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte (2-4 mois).
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire, étude pharmacologique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour implanter une mini-pompe diffusant dans le cerveau une substance bloquant la réaction inflammatoire, puis leur comportement alimentaire est mesuré sous régime standard puis gras. Le porteur étudie le rôle de l'inflammation cérébrale après un repas sur la satiété, avec un lien aux troubles alimentaires humains présenté comme une perspective. Il indique que l'implantation de la pompe empêche toute réutilisation, ce qui justifie selon lui la mise à mort de toutes les souris.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire après un repas (PIR) sans fièvre ni douleur est bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs pro-inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Dans les cellules, les nutriments activent un senseur moléculaire. Ce senseur active la caspase1, une enzyme qui transforme la pro-interleukine 1β (pro-IL-1β) en sa forme active l’interleukine 1β (IL-1β). Tant qu’elle n’est pas chronique, la production d’IL-1β semble exercer un rôle positif sur le contrôle glycémique périphérique, stimulant la sécrétion d’insuline et l’utilisation de glucose). Cependant, le rôle de la PIR dans un contexte physiologique reste mal compris. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, en particulier dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. La PIR est faible et presque indétectable après un repas standard, mais elle devient visible après un repas riche en graisses. La PIR cérébrale pourrait constituer une réponse physiologique en favorisant le maintien de l’homéostasie énergétique. Dans l’hypothalamus, elle serait impliquée dans le contrôle de la prise alimentaire et favoriserait la sensation de satiété, freinant ainsi la consommation de calories en excès lors d’un repas gras. Le projet de recherche consistera à bloquer la PIR au niveau central chez la souris puis à étudier les effets de cette inhibition sur le comportement alimentaire. Nous pourrons ainsi évaluer si la PIR modifie la fréquence et/ou la taille des repas, dans différentes conditions nutritionnelles (alimentation standard ou grasse/hypercalorique). Il s’agira d’administrer dans le cerveau, une substance empêchant la formation du senseur moléculaire, ou une substance bloquant l’action de l’IL-1β sur les cellules cibles, ou un inhibiteur de l’enzyme produisant l’IL-1β. L’étude prévoit 162 souris.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de définir pour la première fois le rôle de l’inflammation cérébrale transitoire postprandiale sur le comportement alimentaire. En particulier nous définirons le rôle de certains acteurs moléculaires de la réaction inflammatoire : un complexe protéique, une enzyme et un composé B activé par cette enzyme. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse en présence d’analgésique et d'antiinflammatoire. Cette chirurgie devrait durer ½ heure par animal.
Impact sur les animaux
Les animaux des groupes « traitement » subiront une chirurgie stéréotaxique et un traitement pharmacologique qui devraient impacter le comportement alimentaire en comparaison avec les groupes « témoin » subissant la chirurgie mais ne recevant pas les antagonistes. Nos travaux précédents conduisent à l’hypothèse selon lequel les animaux traités auront un comportement alimentaire non modifié sur alimentation standard équilibrée (mesurée pendant 3 jours) mais présenteront une hyperphagie par perte de satiété sur alimentation HFD (mesurée pendant 3 jours). Aucune anorexie et/ou anhédonie ne sont attendues en réponse à la chirurgie, aux différents traitements pharmacologique, ou à l’individualisation.
Devenir
Les 162 souris ayant subi une chirurgie mettant en place une mini pompe osmotique ne pourront être utilisés dans un autre projet. C’est pourquoi ils seront tous mis à mort.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La procédure décrite, ainsi que la stratégie expérimentale, ont été optimisées, standardisées et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. De plus, les animaux seront leur propre témoins en étant exposés au régime standard puis au régime enrichi, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet également de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. En l’absence de données dans la littérature, les expériences pharmacologiques à mener imposent de tester différentes doses de différents agents pharmacologiques. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet, les concentrations les plus faibles pour chaque agent pharmacologique seront étudiées en premier. Si celles-ci s’avèrent suffisantes pour conclure quant à l’implication de la voie de signalisation antagonisée (différence significative par rapport au lot contrôle), les autres concentrations ne seront pas testées.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et de carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Du matériel stérilisé sera utilisé. Un traitement analgésique et antiinflammatoire sera donné en pré-opératoire, ce qui réduit la douleur post-opératoire. Une voie anesthésiante locale sera réalisée avant incision. Un traitement analgésique et antiinflammatoire post-chirurgical sera donné pendant 2 jours après chirurgie. La chirurgie sera réalisée en maintenant la température corporelle (tapis chauffant). Un gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement des yeux pendant l’opération. Le champ opératoire sera filmé avec un microscope et l’opération sera suivie sur un écran afin d’augmenter la précision des gestes chirurgicaux. Des lampes froides seront utilisées pour éclairer le champ opératoire. Une injection de liquide physiologique sera administrée dans la cavité abdominale en fin d’opération pour réhydrater les animaux et favoriser l’élimination des toxines. Après opération, les animaux seront allongés dans des cages de réveil chauffées puis transférés dans leur cage individuelle standard avec enrichissement du milieu (dôme de nidation et coton). Des croquettes humides seront disposées sur la litière. Habituellement, cette chirurgie n’entraine pas de mortalité postopératoire et montre un retour au poids normal après 2 jours. L’équipe maîtrise la chirurgie stéréotaxique chez le rongeur, comme en attestent des publications depuis plus de 20 ans, et elle a installé un environnement technique dédié qui fait référence (vidéo-monitoring, développement de masque anesthésique spécifique, gestion de la douleur, etc). Ce savoir-faire accroît le raffinement des procédures. Une surveillance particulière quotidienne (2x par jour, avec inspection approfondie) sera faite pour s’assurer du bien-être de chaque individu.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris C57BL/6J jeunes adultes, âgées de 8 à 12 semaines. Cet âge correspond aux coordonnées fournies par l’atlas stéréotaxique de la souris.
Caractérisation de molécules spécifiques des lymphocytes T régulateurs associés à la tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
373 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les groupes, elles sont irradiées, greffées de cellules tumorales sous la peau et traitées par injections répétées, avec des prélèvements sanguins, les tumeurs étant mesurées jusqu'à la mise à mort pour analyses. Le porteur cherche des marqueurs propres aux lymphocytes T régulateurs de la tumeur pour une thérapie ciblée du cancer, présentée comme une alternative aux traitements actuels. Il affirme que l'étape in vivo est "indispensable" pour tester l'efficacité et la toxicité avant toute application humaine.
Objectifs
Le cancer est une maladie complexe et les cellules tumorales sont détectées notamment par les cellules du système immunitaire pour essayer de les contrôler et les éliminer. Le système immunitaire est composé de nombreux types de cellules dont les lymphocytes T qui eux-mêmes regroupent à la fois des cellules T à fonction plutôt positive et d’autres à fonction plutôt négative. Les cellules T effectrices (Teffs) contribuent à l’élimination de pathogènes ou à la diminution de tumeurs, tandis que les cellules T régulatrices (Tregs) ont une fonction suppressive qui inhibe la prolifération et inhibe l’activité des cellules T effectrices (Teffs). Par conséquent, les Tregs ont un effet délétère qui participe au développement de la tumeur et diminue l’effet des traitements. En parallèle, les Tregs ont aussi un effet bénéfique pour éviter la stimulation permanente du système immunitaire et limiter l’auto-immunité. Les Tregs constituent donc de bons candidats pour le développement d’un traitement ciblé contre le cancer à condition d’impacter uniquement les Tregs présents dans la tumeur, c’est pourquoi le challenge actuel est l’identification de marqueurs spécifiques aux Tregs de la tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour une stratégie ciblant les cellules T régulatrices de la tumeur uniquement. Une telle thérapie améliorerait la réponse anti-tumeur des lymphocytes T ; tout en conservant les Tregs dans le reste de l’organisme, essentielles au maintien d’un système immunitaire contrôlé en situation normale et éviter l’auto-immunité. Cette approche innovante fournirait une alternative aux traitements actuels, qui restent insuffisamment efficaces, et pourrait être combinée à d’autres thérapies existantes. De plus, ce projet fournira des informations inédites sur les marqueurs des Tregs de la tumeur. Le projet présente donc aussi un intérêt scientifique pour la compréhension du fonctionnement des Tregs, cellules complexes mais essentielles à notre système immunitaire.
Procédures
Dans une première procédure, des cellules tumorales sont injectées par voie sous-cutanée aux animaux vigiles (1 fois par expérience) (durée du geste 10 sec). Dans une 2ème procédure, les souris vigiles seront irradiées (durée geste < 5min) puis injectées par voie intraveineuse (1 fois par expérience) (durée du geste 10 sec). Des prélèvements de sang seront réalisés toutes les 2 semaines pendant 6 à 10 semaines (durée du geste 10 sec). Dans certaines de ces souris, des cellules tumorales seront également injectées par voie sous-cutanée aux animaux vigiles (1 fois par expérience) (durée du geste 10 sec) et d’autres ne recevront pas de tumeurs Dans une 3ème procédure, les souris seront traitées 3 fois par semaine pendant 3 semaines. Les administrations seront réalisées par des injections directement dans l’abdomen (voie intrapéritonéale) ou par administration per os (gavage oral). Ces administrations seront réalisées sur animaux vigiles (durée du geste 10 sec). Des prélèvements de sang seront réalisés 1x par semaine, pendant 3 semaines (durée du geste 10 sec). Dans une 4ème procédure, les souris vigiles seront traitées par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée du geste 10 sec). Certains des animaux seront ensuite injectés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée (1 fois par expérience) animaux vigiles, durée du geste 10 sec). Un prélèvement de sang sera réalisé sur l’ensemble des animaux (durée du geste 10 sec). Dans une 5ème procédure, les souris vigiles recevront 1 injection par voie intraveineuse (1 fois par expérience) (durée du geste 10 sec). Un prélèvement de sang sera réalisé 2 fois au cours de l’expérience (durée du geste 10 sec). Dans une 6ème, les souris vigiles seront injectées par voie sous-cutanée (1 fois par expérience) (durée du geste 10 sec) puis elles recevront une injection par voie intraveineuse (1 fois par expérience) (durée du geste 10 sec). Un prélèvement de sang sera réalisé 2 fois au cours de l’expérience (durée du geste 10 sec). Dans une 7ème procédure les souris vigiles seront injectées par voie sous-cutanée (1 fois par expérience) (durée du geste 10 sec) puis elles recevront une injection par voie intraveineuse (1 fois par expérience) (durée du geste 10 sec).
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les animaux peuvent également subir une perte de poids. Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules par voie intraveineuse ou sous cutanée seront celles liées à l’injection. Une légère douleur de très courte durée est attendue lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Ce projet est basé sur des expérimentations in vitro utilisant des cellules provenant de l’homme. Les études in vitro permettent d’obtenir des résultats fiables et cohérents avec le but du projet qui est de caractériser des molécules spécifiques aux Tregs de la tumeur chez l’humain et de vérifier leur intérêt pour le contrôle de la réponse immune. L'évaluation pré-clinique des traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris et ceci permettra de valider la rationalité des molécules choisies comme cible thérapeutique. L’expérimentation in vivo nous permettra de conclure sur le rôle des molécules sélectionnées et d’évaluer une stratégie thérapeutique qui les ciblerait. Cette étape est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement avant d'envisager une application clinique chez l'Homme.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Le nombre d'animaux à inclure par groupe a été défini à l'aide d'outils statistiques
Raffinement
Les souris sont hébergées dans les conditions réglementaires et il n’est pas attendu spécialement de douleur dans les effets indésirables potentiels. Les souris sont surveillées régulièrement et elles sont mises à mort lorsque les points limites sont atteints tels qu’énoncés dans une grille de score mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies anti-tumorales, notamment car la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées ou immunodéficientes. De plus, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs humaines qui peuvent être maintenues dans les souris pour les étudier. Les souris seront utilisées à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire adulte.
Nouvelle étude du rôle de l’estérification du cholestérol sur la mise en place de la dysfonction adipocytaire et des complications cardiométaboliques au cours de l’obésité chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris génétiquement modifiées sont soumises à un régime riche en cholestérol ou en graisses pendant quatre à six mois pour induire une obésité et un diabète, avec des tests métaboliques, des gavages de glucose et des prélèvements sanguins répétés, avant mise à mort pour prélever les organes. Le porteur étudie le rôle de l'estérification du cholestérol dans le tissu adipeux, avec des applications thérapeutiques renvoyées au moyen terme. Il indique disposer de modèles in vitro, adipocytes en culture et biopsies humaines, mais présente le modèle animal comme "l'unique moyen" d'observer les effets systémiques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer les conséquences locales et systémiques de la délétion adipocytaire de la capacité d’estérification du cholestérol sur les complications métaboliques de l'obésité induites par des aliments riches en graisses.
Bénéfices attendus
Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux maladies métaboliques, l'homéostasie du tissu adipeux a été largement étudiée dans une multitude de contextes physiopathologiques. Cependant, le rôle du cholestérol et particulièrement de son estérification dans la fonction adipocytaire sont n’a quasiment jamais été explorée. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer. Nos résultats préliminaires obtenus chez des patients, dans des modèles précliniques et in vitro montrent pour la première fois que l'accumulation de cholestérol libre dans les adipocytes est un déclencheur de la dysfonction adipocytaire et des complications métaboliques qui y sont liées. A court terme, notre projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeu et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler le contenu en cholestérol libre dans l'adipocyte par l'induction de son estérification, ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer le risque métabolique de l'obésité. Une telle approche sera bénéfique pour les patients obèses souffrant de complications mais aussi pour la population générale en promulguant des recommandations pour les personnes à risque.
Procédures
Les souris transgéniques dont la capacité d'estérification du cholestérol dans l'adipocyte est délété seront dans un premier temps phénotypées métaboliquement sans stimulus alimentaire obésogène ou diabétogène. Nous suivrons la glycémie par prise de sang à la queue (5 secondes) mensuellement entre 1 et 6 mois d’âge. Ces souris seront dans un second temps exposé à une alimentation riche en cholestérol (4 mois de régime) ou une alimentation riche en triglycérides (6 mois de régime). Ces expériences seront répétées 5 fois pour évaluer différents aspects de la perturbation de l’homéostasie adipocytaire. Au cours de la première répétition nous réaliserons mensuellement des tests métaboliques dynamiques pour déterminer la sensibilité à l'insuline (injection d'insuline par voie intra péritonéale - durée de l'injection 5 secondes) et la tolérance au glucose (gavage avec une solution riche en glucose - temps de gavage 10 secondes) en suivant la glycémie (prise de sang au niveau caudal à la suite de ces stimuli métaboliques - 5 secondes par prélevement). Au cours de la seconde répétition la sensibilité tissulaire à l'insuline sera évaluée après l'euthanasie des animaux 5 minutes post injection d'insuline par voie intraveineuse (temps d'injection : 5 secondes). Au cours de la répétition finale, la capacité d'internalisation du cholestérol dans les adipocytes sera testée en délivrant du cholestérol marqué par voie orale (gavage - temps de gavage : 10 secondes) et veineuse aux animaux transgéniques trois jours avant euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Le protocole d'induction de l'obésité et de diabète avec les régimes riches en cholestérol ou en graisses est de classe modérée. La délétion adipocytaire de la capacité d'estérification du cholestérol pourrait contribuer à rendre le tissu adipeux moins capable de tamponner l'excès énergétique des régimes riche en cholestérol ou en graisses et donc de potentialiser le diabète induit par ces régimes. Les souris transgéniques devraient présenter une insulinémie et une glycémie plus marquée que les animaux de type sauvage.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'interet pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.
Remplacement
Le projet global dans laquelle la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des adipocytes en culture différentiés à partir de fibroblastes murins 3T3-L1 ainsi que des biopsies tissu adipeux de patients bénéficiant de chirurgies bariatrique. Ces modèles ont permis de remplacer les modèles animaux dans la détermination du rôle du cholestérol dans la dysfonction adipocytaire et ils permettent également de déterminer quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires protecteurs de l'estérification du cholestérol dans l'adipocyte.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 528 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à chaque procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate).
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques (obésité, diabète de type 2 et dysfonction adipocytaire pour ce projet) utilisés ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (délétion adipocytaire de la capacité d’estérification du cholestérol). Pour tous les animaux débuterons la supplémentation orale à 8 semaines de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet d’un stress métabolique sur le tissu adipeux au cours du développement de l’organisme. L’homéostasie du tissu adipeux est très fortement influencé par le genre. De façon à déterminer si la délétion adipocytaire de l’estérification du cholestérol au cours d’un stress métabolique à des effets délétères dépendamment du sexe nous utiliserons des souris mâles et femelles pour l’ensemble de ce projet.
Etude de la regeneration musculaire normale et pathologique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intramusculaire d'un composé myotoxique sous anesthésie pour léser le muscle, certaines des injections de tamoxifène et un suivi par imagerie, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et perfusion d'un fixateur. Le porteur étudie la régénération musculaire et les dépôts fibro-adipeux des myopathies, avec des retombées thérapeutiques présentées comme potentielles. Il décrit des méthodes in vitro de réduction, cellules immortalisées et mini-muscles humains, mais conclut qu'une validation in vivo reste "indispensable".
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes impliqués dans le processus de régénération du muscle squeletique sain ou pathologique chez la souris. Le muscle adulte est capable de régénérer suite à des lésions, grâce aux cellules souches musculaires (cellules satellites), ainsi qu’à l’action coordonnée des plusieurs autres cellules, parmi lesquels les macrophages, les vaisseaux sanguins, et des cellules que nous appelons « progéniteurs fibro-adipogéniques » (ou FAPs), composants clés du tissus-conjonctif musculaire. Chez un individu adulte sain, ce processus permet de maintenir la masse musculaire en réparant les microlésions liées à l’activité musculaire normale ou les lésions aigues induites par des blessures physiques. Le processus de régénération est dysfonctionnel dans divers pathologies du muscle, conduisant à une fonte musculaire accompagnée d'infiltrations de tissus fibreux et adipeux. Ces infiltrations résultent d’un comportement anormal des FAPs, qui prolifèrent en exces et se transforment en fibrose ou en adipocytes. Cette multiplication des FAPs et la transformation fibroadipeuse sont normalement inhibées dans un muscle sain, et cette protection est perdue dans certaines myopathies (comme la dystrophie Duchenne, ou la dystrophie facioscapulohumérale (FSHD)). Nous cherchons à identifier les molécules participant à cette protection naturelle. Partie 1 : Nous explorerons la contribution à ce processus du gène FAT1, dont nous avons précédemment identifié l’influence clé sur la croissance et la forme de sous-groupes de muscles pendant l’embryogénèse, et dont nous avons montré que le dysfonctionnement se produisait dans la FSHD. Nous examinerons comment l’inactivation du gène FAT1 dans les FAPs chez la souris perturbe la régénération musculaire induite par une lésion, et evaluerons si elle conduit à l’apparition de dépots fibro-adipeux. Partie 2 : Grace à une recherche de candidats basée sur des données publiées issues de modèles humains et murins de dystrophies musculaires, nous avons identifié des molécules caractéristiques des FAPs, produites en quantité augmentées ou réduites dans les pathologies musculaires avec infiltrations fibro-graisseuse. La liste de candidats sera complétée avec les résultats de la partie 1. Nous testerons l’implication de ces candidats dans les formations fibro-adipeuses, en etudiant leurs fonctions a) in vitro dans des cultures primaires de FAPs de souris ; puis b) in vivo chez la souris.
Bénéfices attendus
L’apparition de dépots fibro-adipeux dans les myopathies marque un stade de non-réversibilité des symptomes. Ces dépots changent les propriétés physiques du muscle, et compromettent l’efficacité du processus régénératif, non seulement spontanné, mais aussi thérapeutique, en empêchant de nouvelles fibres de s’intégrer ou même de se contracter. Ainsi, il est essentiel d’identifier les moyens de bloquer l’apparition ou la progression des dépots fibro-adipeux, afin de retarder l’évolution des symptomes chez les patients, et leur permettre de bénéficier de thérapies inovantes. Partie 1 : L’identification d’un gène tel que FAT1, régulant le développement et la régénération des muscles, et dont nous suspectons que le dysfonctionnement participe à l’apparition des symptomes de la FSHD, a fourni une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Divers éléments permettent d’anticiper que l’inhibition de FAT1 dans les FAPs sera détrimentaire au fonctionnement normal des FAPs, pourrait empecher une bonne régénération et favoriser l’apparition de dépots fibro-adipeux dans les muscles lésés. En confirmant cette hypothèse et clarifiant les mecanismes, nos résultats feront émerger de nouvelles options thérapeutiques qui pourraient à terme, bénéficier aux patients. Partie 2 : Le projet permettra d’identifier, parmi les protéines présentes dans les FAPs et produites en quantités anormales dans les pathologies avec dépots fibro-adipeux, ceux qui sont responsables de la formation de tels dépots. Nous obtiendrons dans un premier temps la preuve de principe que reproduire un changement observé dans les pathologies est suffisant pour induire ces dépots. Dans un deuxieme temps, nous déterminerons si corriger une ou plusieurs anomalies dans les modèles de pathologies (in vitro, puis in vivo) est suffisant pour empêcher, retarder ou ralentir la formation des dépots fibro-adipeux. Pour toute molécule remplissant ces deux critères, la correction (deuxième étape) est susceptible d’améliorer les symptomes musculaires chez les patients, et de maintenir les muscles dans un état leur perméttant de bénéficier de thérapies innovantes favorisant la formation de nouvelles fibres saines et fonctionnelles.
Procédures
Le projet comporte 3 procédures, impliquant de 2 à 4 étapes. La procédure de lésion par injection intramusculaire (concerne toutes les souris) est une chirurgie faite sous anésthésie générale, et permettant une injection intramusculaire ciblée d'un composé myotoxique. Elle dure environ une heure, et ne sera effectuée qu'une seule fois pour chaque animal, sur tous les animaux impliqués dans le projet. Etapes ne concernent que des sous-groupes d'animaux. - injection en IP de Tamoxifen (modèles inductibles), une à 5 injection par animal, une fois tous les 2 jours (ou une seule injection lorsque pratiquée à P1). - suivi longitudinal par imagerie non invasive (étape sous anesthésie, procédure 3, répétée 3 à 5 fois pour chaque animal), - Mise à mort par surdose d’anesthésique suivi d’une perfusion intracardiaque de PFA : procédure sans réveil faite sous anesthésie profonde, une seule fois par animal. Gestes visant à réduire la souffrance : Anesthésie (injection IP), injection sous-cutanée d’antalgiques ou d’anesthésie locale. Ces gestes sont pratiqués en préparation de la chirurgie/Lésion, ainsi qu’avant la procédure de mise à mort par perfusion.
Impact sur les animaux
L’injection dans le muscle de composés myotoxiques induit une blessure limitée dans le temps et restreinte au seul muscle injecté. Pendant 3-4 jours, une inflammation (nécessaire pour la cicatrisation) se produit au niveau du site d’injection, puis s'estompe d'elle même. L'expérience a un impact limité sur les conditions de vie de la souris, même lorsque les modifications génétiques étudiées compromettent l'efficacité de la réparation. Dès le lendemain, les souris ont récupéré une activité/locomotion normales. Le fait d'utiliser des modèles génétiques dits « inductibles » (déclenchement par le Tamoxifen) evite que les effets des modifications étudiées commencent avant le demarrage de la procédure expérimentale. Toutes les lignées nécessaires au projet sont élevées dans notre animalerie, et les cohortes expérimentales sont produites par croisements. Les lignées utilisées ne présentent aucun phénotype dommageable lorsque maintenues séparément. Lorsque ces lignées sont combinées : 1) les lignées utilisées pour visualiser les cellules mutantes (grace à un marquage par une protéine fluorescente) ou pour rendre les cellules modifiables par les adenovirus, n’ont pas d’effets dommageables car les protéines introduites n’ont pas de cibles naturelles chez la souris. 2) L’utilisation des systemes inductibles par le Tamoxiden permet que la modification génétique désirée ne commence qu’au démarrage de l’expérience. Il n'y a donc ni douleur ni souffrance avant la procédure expérimentale. L’expérience est terminée en maximum 3 semaines (les douleurs locales étant limitées aux 3 premiers jours), et est écourtée en cas de problemes inattendus. Nous n’attendons pas d’anomalies majeures ailleurs que dans le muscle. 3) Certaines souris utilisées présentent de légères anomalies de forme de certains muscles, non-dommageables car les muscles affectés ne sont pas vitaux (le diaphragme n’est pas touché). Ces souris ont une durée de vie normale, et ne présentent aucun signe de souffrance. 4) Le modèle de souris FSHD a été choisi pour son caractère inductible, limitant la toxicité de la proteine DUX4 (agent causal de la FSHD), à la durée de l’expérience. Même le Tamoxifen devait déclencher dans ces souris des anomalies en dehors du muscle, cela se produira dans le temps de l’expérience, et nous veillerons à écouter le suivi longitudinal si nécessaire, et les expériences effectuées pourraient (de par leur objectif) identifier un moyen de diminuer ces anomalies.
Devenir
La procédure se termine par une mise à mort des animaux visant à prélever les tissus (muscle lésé, ainsi que certains organes supplémentaires). Ces tissus sont soit fixés pour de l'histologie, soit dissociés afin de mettre les cellules en culture. En conséquence tous les animaux utilisés pour ce projet sont mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
1) Afin d'éviter des expériences inutiles chez l'animal, nous commençons par exploiter des données publiques déjà disponibles (analyses déjà publiées de biopsies de patients ou de modèles « souris ») pour identifier des mecanismes potentiellement responsables du remplacement de la masse musculaire par des dépots fibro-adipeux dans les pathologies musculaires. 2) Le projet implique une étape basée sur des cultures de cellules isolées à partir de souris. Afin de limiter au maximum l’étape d’isolement à partir de souris, nous développons une méthode alternative utilisant des cellules « souches » humaines (lignées déja établies par d'autres laboratoires), dont le caractère « souche » permet une utilisation répétée/prolongée. En mimant in vitro les étapes du développement du muscle, nous induirons la formation de « mini-mucles » reproduisant autant que possible le contexte physiologique. Une fois optimisée, cette approche sera une alternative efficace pour remplacer les cellules de souris et pour toutes les études-pilotes concernants la compréhension des mécanismes en jeu. 3) Une fois que nous aurons identifié in vitro des molécules susceptibles d’être responsables de l’apparition des dépots fibro-adipeux dans les muscles malades, et que nous aurons montré avec succès que contrer leur action a un effet thérapeutique, il sera néanmoins nécessaire de valider ces résultats in vivo, en passant par un modèle animal. En effet, les modèles in vitro (cellules de souris ou mini-muscles humains), aussi puissants soient ils, ne reproduisent pas l’ensemble des événements mis en jeu dans la réparation musculaire normale ou pathologique. Il est difficile par exemple de reproduire le contexte de la blessure, de l’inflammation, de l’irrigation sanguine, et l’influence du métabolisme des individus malades. Ainsi, un mécanisme efficace in vitro pourrait s’avérer inefficace chez l’animal ou chez l’homme. Il est donc indispensable de déterminer, parmi les approches validées in vitro, lesquelles sont les plus susceptibles d’être efficaces chez l’homme en passant par une étape en modèle animal. Cette validation ne portera cependant que sur des cas pour lesquels nous aurons obtenu une preuve de principe in vitro, limitant largement l’ordre de grandeur des tests in vivo.
Réduction
1) La manière dont nous procédons pour l’histologie (partie 1) permet qu’un même échantillon soit réutilisé pour plusieurs analyses, réduisant ainsi le nombre d'animaux. En effet les tissus prélevés (muscles) sont divisés en plusieurs fragments congelés/stockés séparéments. Sur chaque fragment de tissus, nous réalisons des coupes alternées sur plusieurs séries de lames histologiques. Nous réalisons une base de données permettant l’optimisation de l’utilisation de ces échantillons/lames. Ainsi, un seul muscle d’un seul animal peut servir à des dizaines de tests différents. Une seule cohorte d’animaux (comprenants les souris étudiées et les controles adequats) suffit pour réaliser l’ensemble de l’étude pour un stade donné d’analyse. Les nombres d’animaux dans chaque cohorte (5-10 souris par lot (incluant males et femelles)) sont nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement robustes (tests statistiques considérés significatifs si p
Raffinement
1) Les souris sont hébergées en cages ventilées, avec enrichissement (dôme ou rouleau de carton + baton de papier ou carré de coton pour nidification). Elles sont suivies quotidiennement pour vérifier la nouriture et l'eau, ainsi que leur état de santé et leur bien être. 2) Pour la chirurgie, les souris sont anesthésiées par injection intra-péritonéale. Au préalable, elles recoivent des prémédications visant un effet antalgique (30 minutes avant l'anesthésie) at une anesthésie locale. La peau au niveau de la zone à opérer est rasée et aseptisée par application de solution antiseptique. 3) Nous avons défini des points limites nécessitant interruption anticipée d'une procédure: Une perte de poids dépassant 20% par rapport au poids de reference (poids à l'entrée dans la procédure) est considérée comme limite au dela de laquelle l'expérience est interrompue et l'animal est euthanasié. Par ailleurs, comme un des produits utilisés peut, dans de rares cas, liés au lot ou à la préparation, s’avérer toxique et déclencher une inflammation dans le foie, nous surveillerons le poid des animaux après injection, et fixons à 15% de perte par rapport au poids initiale la limite au dela de laquelle ces effets secondaires sont susceptibles d’interférer avec l’expérience. Dans ce cas, les animaux seront exclus de la cohorte et mis à mort. D'autres parametres d'exclusion sont: pelage hérissé; infection de la cicatrice; immobilité et indifférence à l'environnement, tremblements. 4) Nous utiliserons des tests statistiques adequats pour les comparaisons entre cohortes d’animaux (cohortes test et controles appropriés, males/femelles, differentes approches) avec 5 à 10 souris par cohorte et par stade d’analyse.
Choix des espèces
La souris est un modèle particulièrement adapté à l'étude de la regeneration du muscle. La dynamique du processus est bien connue suite à différents modèles de lésions (cardiotoxine, brulure au froid, glycerol, barium, ces modèles différant légèrement les uns des autres). La regeneration est rapide, et complete en 3 semaines, sans séquelles dans des souris sauvages. La souris permet l'utilisation de modèles génétiquement modifiés élaborés de telle sorte qu'il soit possible de definir précisément le type cellulaire dans lequel un gène est modifié et le moment à partir duquel cette modification est déclenchée. Ceci permet de limiter le dommage au seul organe/tissus considéré. L'utilisation des modèles génétiquements modifiés ainsi que des vecteurs adénoviraux permet d'explorer les mécanismes génétiques et de tester l'effet de nouvelles modifications génétiques, et d'evaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Aucun modèle cellulaire/ex-vivo humain ne reconstitue l’environnement du muscle suffisamment pour valider la pertinence in vivo d'un mécanisme ou d'une option thérapeutique. Stades d’utilisation : 1) L’Induction par le Tamoxifen (modèles inductibles) est faite soit 1 jour après la naissance (P1), soit au stade adulte, un peu avant et juste après la lésion. Pour obtenir une meilleure efficacité de recombinaison, il est justifié d'acriver la CRE au moment coincidant à un pic d'expression (nombre de cellules et intensité) de la lignée CRE utilisée, basée sur le territoire d’expression du gène PDGFRA. PDGFRA est fortement exprimé pendant la première semaine après la naissance. Chez l’adulte, PDGFRA est produit par les FAPs, mais ces derniers sont « dormants », et en faible nombre. La lésion provoque une augmentation de l’intensité d’expression, et active fortement la multiplication des FAPs. En conséquence, le meilleur moment pour activer la lignée avec le Tamoxifen est juste au moment de la lésion. 2) injection intra-musculaire (lésion/Adenovirus) : Souris Adultes (3 à 6 mois). 3) Suivi longitudinal de la lésion (par imagerie bioluminescence), à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions, pour suivre l'évolution de la régénération musculaire dans une fenetre correspondant aux résultats de la litérature, et pour évaluer l'impact des conditions expérimentales sur l'apparition d'infiltrations fibro-adipeuses. 4) mise à mort (à l’issue du suivi longitudinal ou à un stage post-lésion donné (à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions