Recherche fondamentale

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique de vecteur viral AAV par voie intraveineuse ou intramusculaire sous anesthésie, un prélèvement sanguin et des séances hebdomadaires d'imagerie par bioluminescence, pour tester des capsides modifiées ciblant le foie. Le porteur indique n'attendre qu'une légère douleur au point d'injection. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo, une réduction des doses chez le patient étant renvoyée au conditionnel.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, plusieurs facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène proviennent de la large biodistribution des AVV après injection mais également de la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur pouvant engendrer la destruction des cellules transduites. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Ces limites nécessitent d’injecter de fortes doses chez le patient. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel de la chimie organique pour améliorer « l’activité spécifique » et « l’index thérapeutique » d'une particule AAV recombinante choisie. Ces améliorations, non explorées jusqu'à présent, vont être obtenues par l’emploi de ligands ayant des propriétés de ciblage. Ces modifications chimiques accentueront le ciblage vers un organe ou un tissu spécifique, comme le foie, ce qui en retour permettra une réduction de la quantité d’AAV à administrer au patient. Différents ligands ayant un ciblage spécifique des hépatocytes présents au niveau du foie, seront couplés sur la surface de la capside d’AAV. Au-delà de l’augmentation du tropisme cellulaire, ces capsides modifiées chimiquement pourraient également diminuer l’effet de la réponse immunitaire. Ces mêmes vecteurs chimiquement modifiés seront également injectés en intramusculaire afin d’évaluer le pouvoir de diffusion de ces vecteurs. Cette voie d’injection pourrait permettre le développement de futurs vaccins utilisant ce mode d’administration.

Bénéfices attendus

Les modifications apportées à ces vecteurs pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées par voie chimique pourraient favoriser la transduction spécifique du foie et celle du muscle. Cette dernière propriété, s’il elle était démontrée, ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées.

Procédures

Les souris recevront une injection unique de PBS ou d’AAV en Intra Veineuse ou en Intra musculaire. Les animaux seront anesthésiés. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Un prélèvement sanguin sera réalisé la semaine avant les injections. Les animaux seront anesthésiés. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. L’imageur photon utilisé pour réaliser les imageries par bioluminescence nous permettra de réaliser des images sur 5 souris simultanément. Les animaux seront injectés en Intrapéritonéale avec de la luciférine. Au bout de 5 mn, les souris seront anesthésiées. Le temps d’acquisition est de 1 minute. L’imagerie de bioluminescence sera réalisée une fois par semaine sur 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique. Pour les injections en intra veineuse, en intra musculaire et le prélèvement sanguin, la souris sera sous anesthésie gazeuse. Une légère douleur au point de prélèvement due à la piqure peut être ressentie après le réveil. L’injection en intra péritonéale engendre une légère douleur due à la piqure. Pour l’euthanasie, les souris seront sous anesthésie gazeuse que ce soit pour la dislocation des cervicales (point limite) ou la décapitation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo et rendent donc difficile la reproductibilité de ces résultats in vivo. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer la biodistribution de ces vecteurs une fois injectés ainsi que la possible réponse immunitaire.

Réduction

Des premiers tests d’efficacité seront effectués in vitro sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur, le nombre d’animaux à utiliser en sera donc réduit. La technique de l’imagerie par bioluminescence nous permettra d’avoir rapidement de premiers résultats. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé pourra être réduit si certains résultats se montrent négatifs, notamment dans les groupes avec injections en IM.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.).

Choix des espèces

Comme dans la majorité des études portant sur la thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par l'existence de plusieurs modèles murins ainsi que par la possibilité de constituer des groupes d'animaux suffisamment larges (n=5 par groupe) pour pouvoir effectuer des calcul statistiques (test statistique non paramétrique Mann-Whitney). Le modèle murin envisagé (Balb-c) est couramment utilisé dans le domaine de la thérapie génique et plus particulièrement dans celui des AAVr. Il s’agit d’un modèle souvent utilisé pour étudier la biodistribution de différents vecteurs. Ce modèle nous apparaît donc comme étant pertinent pour ce projet. Nous évaluerons nos vecteurs sur des animaux ayant fini leurs croissances. Afin d’être en corrélation avec des études similaires, notre protocole démarrera donc chez des souris adultes âgées de 8 semaines.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée puis suivie par imagerie répétée sous anesthésie, jusqu'à 39 manipulations par animal, une plateforme réalisant ces études "à la demande de chercheurs extérieurs". Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et une gêne respiratoire, et que les organes sont prélevés après la mort "à la demande du client". Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" et écarte le poisson zèbre, jugé peu adapté à ses appareils d'imagerie.

Objectifs

Au niveau mondial, le cancer pulmonaire représente le type de cancer avec la plus forte mortalité. Parmi les sous-types de cancer du poumon, le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (ou CPNPC) représente 87% des cas de cancer du poumon avec un pronostic des plus sombres parmi tous les cas de cancers pulmonaires. La majorité des patients avec ce type de cancer sont malheureusement diagnostiqués à un stade avancé, voire très avancé. Notre lanoratoire est une plateforme de services et de R&D spécialisée dans l'imagerie préclinique. Sa mission est de répondre aux besoins d'imagerie de la communauté scientifique, particulièrement dans le domaine de l'oncologie expérimentale. Ce projet a pour but de réaliser, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des études sur des modèles murins de cancer pulmonaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

En fonction des études clients, les bénéfices attendus sont: - Une meilleure connaissance des cancers pulmonaires. - L'étude de nouveaux traitements contre le cancer pulmonaire.

Procédures

Dans le cas des souris induites en sous-cutanée (procédure 1) : Les animaux seront anesthésiés lors de l’induction par piqure d’aiguille. Ensuite, chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence suivi d’une mesure au pied à coulisse de la tumeur et d’une imagerie échographique. (soit 3 manipulations/sem x 12 semaines = 36 manipulations). Les autres imageries (photoacoustique, radioisotopique) pourront être mises en oeuvre ponctuellement en fonction des résultats obtenus en cours d'étude soit 3 manipulations supplémentaires. Au maximun 1 souris sera soumise à 39 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines. Dans le cas des souris induites par dépôt pulmonaire, les inductions se font sous anesthésie chimique et sur animal vigile pour l’induction par voie intraveineuse (Procédure 2). Chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence auquel peut s'ajouter 2 scanners espacés de minimum 2 semaines, 2 imageries radioisotopiques espacés de minimum 2 semaines. ((soit 2 manipulations/sem x 12 semaines) +4 =28 manipulations sur 12 semaines)12 BLI + 2+2 = 16 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines Procédure 1 et 2 : Dans le cas où il faudrait injecter des candidats médicaments, suivant la voie d’administration il y aura au maximum 5 traitements par semaine sur souris vigiles (pour IP IV, SC, per Os) ou anesthésiées (pour intranasale ou intratrachéale) sur 12 semaines d’étude Ces administrations seront réalisées par du personnel formé et entraîné Nous pourrons être amené à prélever du sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire: du sang sera prélevé 3 fois en 24h.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont: - La perte de poids. - La gène respiratoire occasionnée par les tumeurs se développant au niveau de la trachée.

Devenir

Procédure 1: Modèle sous-cutané: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs sous cutanées ainsi que différents organes seront prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie. Procédure 2: Modèle orthotopique: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs pulmonaires ainsi que différents organes pourront être prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer pulmonaire en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris. Nombre d’animaux utilisé dans ce projet : Sur 5 ans nous prévoyons 20 études qui seront réparties ainsi : -Pour le modèle sous-cutanée (procédure 1), 10 études, 800 souris sur 5 ans. -Pour le modèle orthotopique (procédure 2): 10 études, soit par induction en intraveineuse, soit par dépôt pulmonaire 800 souris sur 5 ans. Soit un total de 1600 animaux pour ce projet sur 5 ans. Ce nombre pourra être revu à la baisse en fonction des études clients.

Raffinement

Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’étude comportementale des animaux. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront suivies par inspection visuelle chaque jour de la semaine et les critères comportementaux, et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du palier de douleur. Lorsqu’un des points limites est atteint, l’animal est mise à mort afin d’arrêter sa souffrance car elle ne peut être ni diminuer ni stopper. Ces point limites sont présentés dans chacune des procédures. Les animaux seront étudiés par imagerie in vivo non invasive qui n'induit pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille et permet de réduire le stress infligé au cours de l’expérimentation puisque les animaux sont anesthésiés durant les examens d'imagerie.

Choix des espèces

Les modèles de cancer humain et murins sont classiquement mis en oeuvre chez la souris pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique. Les modèles orthotopiques de carcinome pulmonaire H460, LL-2, A549, 4T1 et mélanome B16 sont uniquement disponibles chez cette espèce animale. Le modèle zebrafish utilisé en cancérologie pour les xénogreffes pourrait être intéressant car de moindre degré de douleur mais le poisson reste peu adapté aux modalités d'imagerie mises en oeuvre dans notre établissement qui ne dispose pas d'un agrément pour ce modèle . Par ailleurs, la transplantation orthotopique n'est pas possible chez le poisson pour des cellules issues de cancer du poumon et du sein. (Raby et al., "Bulletin du cancer", Vol 107, janv 2020) Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale. Ce modèle est validé au laboratoire depuis 10 ans.

144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis pendant six mois à des régimes incluant des arrêts de nourriture de trois jours, à des tests de tolérance au glucose avec ponctions répétées de la queue et à des IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter dans la veine caudale, pour évaluer les effets du jeûne sur le cœur. Le porteur indique que les ponctions et la pose du cathéter peuvent provoquer stress, douleur et risque d'infection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe et que l'expérimentation animale est "nécessaire" pour valider son hypothèse de cardioprotection.

Objectifs

Le jeûne est une méthode d’alimentation consistant à ingérer peu ou aucune nourriture sur une période allant de 12h à plusieurs semaines chez l’Homme. Cette coutume ancestrale est pratiquée par de nombreuses religions et, plus récemment, a reçu une attention croissante pour d’autres raisons de santé, économique et écologique. On distingue le jeûne intermittent, qui consiste à se priver de nourriture pendant une période de 14h sur une journée, le jeûne intermittent prolongé (3 – 5 jours) et le jeûne thérapeutique (1 à 3 semaines). En France, jeûner n’est pas proposé dans un cadre médicalisé. Pourtant, il a été prouvé que le jeûne retarde les processus liés à l’âge (stress oxydant, inflammation…), protège le cerveau des maladies neurodégénératives et diminue la croissance tumorale. Le jeûne intermittent prévient et réverse tous les aspects du syndrome métabolique chez le rongeur et chez l’Homme. En cardiologie, des études précliniques sur des rats mâles ont démontré une diminution de la fibrose myocardique liée à l’âge en prévenant l’inflammation et en maintenant les antioxydants. De plus, le jeûne intermittent diminue l’apoptose et l’inflammation puis prévient le remodelage du myocarde sur modèles d’infarctus du myocarde. Plusieurs jours de jeûne améliorent la diffusion de l’oxygène du capillaire à la mitochondrie de myocarde murin suggérant une amélioration de l’énergie cellulaire. Les objectifs de cette étude sont de caractériser les effets du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique sur le cœur de rat et de déterminer si ces derniers sont protecteurs lors d’un stress aigu induit par un épisode d’ischémie-reperfusion et dans un modèle de cardiomyopathie prédiabétique (induit par un régime riche en graisse et en sucre). Plus précisément, nous souhaitons caractériser le profil cardiométabolique du jeûne, notamment le métabolisme énergétique et le profil lipidique myocardiques. Notre hypothèse est que les changements physiologiques et métaboliques induits par le jeûne intermittent et/ou thérapeutique seraient cardioprotecteurs. Enfin, nous souhaitons déterminer s’il y a un effet du genre et comparer les mécanismes du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux caractériser les effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la fonction cardiaque, le métabolisme énergétique et le remodelage du profil lipidique. Nous souhaitons savoir si ces méthodes sont cardioprotectrices envers un stress aigu (ischémie/reperfusion) et chronique (modèle de prédiabètes induit par le régime riche en graisse et en sucre). Enfin, nous évaluerons l’effet du genre de ces régimes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents régimes décrits ci-après : régime normal pendant 6 mois ; régime normal pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux pendant 3 mois ; - régime normal pendant 3 mois avec deux arrêts de la nourriture pendant 3 jours (à 4.5 et à 6 mois) ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux avec le même régime pendant 3 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois avec 2 arrêts de la nourriture pendant 3 jours à 4.5 et 6 mois. Tous les animaux seront soumis à trois tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Celui-ci comprend une injection intrapéritonéale et 6 prélèvements de gouttes de sang dans la queue de l’animal (mesure de glycémie). Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois. Tous les animaux seront soumis à trois examens d’imagerie IRM avec insertion d’un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie générale. Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois.

Impact sur les animaux

La procédure sur la mise en place des régimes peut entrainer un léger stress chez les animaux mais ne doit pas entrainer d'effet indésirable notable et a déjà fait l’objet de nombreuses publications au niveau international. L'eau quant à elle restera à disposition ad libitum. Le test de tolérance au glucose fait l’objet d’injection en intrapéritonéale et de ponctions répétées au bout de la queue de l’animal pour mesure de la glycémie pouvant générer un stress pour l’animal et un risque d’infection. Les animaux réagissent et cicatrisent bien, notre groupe a l’habitude de travailler avec ces mesures et fera le nécessaire pour surveiller tout évènement indésirable (stress, infection). Les anesthésies et les examens d’imagerie in vivo par IRM sont également des nuisances pour les animaux mais l’imagerie reste l’exploration la moins invasive de nos jours. Enfin, la pose d’un cathéter se fera sous anesthésie pou diminuer le stress de l’animal, cela peut augmenter la douleur après réveil ainsi que le risque d’infection que nous surveillerons quotidiennement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (après l'IRM à 9 mois) pour pouvoir prélever le cœur et réaliser des expériences ex vivo en cœur isolé afin de caractériser le métabolisme énergétique et le profil lipidique cardiaque par spectroscopie par résonance magnétique.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la physiologie et le métabolisme cardiaque. De plus, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider notre hypothèse de cardioprotection de ces régimes face à des stress aigu et chronique selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie/ spectroscopie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.

Réduction

Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, l'étude in vivo permettra de réaliser un suivi longitudinal de l’animal sans sacrifice et l'étude ex vivo sera réalisée sur le même animal. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Nous souhaitons obtenir un effectif final de n=10 par groupe et nous envisageons 20% de perte de données (problème technique d’imagerie et de spectroscopie, problème de prélèvement du cœur pour l’expérience ex-vivo). Nous prévoyons donc 10 + 2 (20% de perte) = 12 rats par groupes. L’effectif de 10 animaux par groupe est déterminé à l’aide d’une analyse statistique (Statistica) prévoyant, pour un risque alpha de 5% et un risque béta de 10%, une amélioration de 25% de la fonction cardiaque dans nos modèles animaux pathologiques pour revenir à des valeurs physiologiques observées chez des animaux contrôles.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 14 jours avant le début de l'étude. La procédure sur la mise en place des régimes ne doit pas entrainer d'effets indésirables. Les durées et fréquences sont déterminées en fonction des données de la littérature (1 jour sur 2 pour le jeûne intermittent et 3 jours de jeûne thérapeutique). L'eau sera mise à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tout au long des régimes et du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. Un animalier ou un chercheur contrôlera le bien-être des animaux tous les jours. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée, une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la Vétédine. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. Pour la procédure d'IRM in vivo, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (Vetflurane 2%) et d’oxygène (1L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sera assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Durant les anesthésies, les yeux seront hydratés (Ocrygel) et la température maintenue à 37°C par couverture chauffante et monitoring par sonde rectale. Durant l'IRM, une injection d'adénosine (poudre chez Sigma Aldrich) à 0.33 mg/kg/min diluée en solution de chlorure de Sodiul à 0.9% à usage vétérinaire (B.Braun) sera réalisée via un cathéter disposé dans la veine caudale, le volume maximal est de 3 ml pendant 10 minutes maximun. La respiration et l'ECG seront surveillés pendant toute la durée de l'examen. Le comportement des animaux sera étroitement surveillé et une grille d'évaluation de la douleur sera remplie et le point limite déterminé en fonction des principes de Morton et Griffiths. Enfin, pour la procédure ex vivo sur le coeur isolé perfusé, nous réaliserons une euthanasie par injection d'euthasol (140mk/mg, IP) avant de prélever le cœur afin de ne pas faire souffrir l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de rat soumis à ces régimes a été choisi car des études des jeûnes ont été réalisé sur cette espèce. De plus, nous souhaitons comparer nos résultats de cardioprotection avec ce qui a déjà été fait dans le laboratoire dans un souci de respect des 3R. Nous souhaitons également tester la cardioprotection des jeûnes sur le modèle de rat nourri avec un régime HFS qui permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le coeur. Le modèle HFS a été récemment décrit par notre équipe pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard 28 jours après la lésion pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage de tamoxifène puis, sous anesthésie, des injections de chlorure de baryum dans les muscles pour provoquer une lésion et étudier la régénération musculaire. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur, tout en fixant des points limites comme la paralysie ou la nécrose de la patte qui déclenchent la mise à mort. Sur le remplacement, il indique avoir mené des études préliminaires sur des lignées cellulaires mais conclut que l'étude au sein d'un "organisme dans son ensemble" reste nécessaire.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables : il présente un développement et une croissance prodigieuse et possède de grandes capacités régénératrices. Ces capacités de croissance et de régénération font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. Ces cellules sont mises en place au cours du développement. Le développement et le maintien de ces cellules par cet environnement est crucial à l’équilibre et à la régénération musculaire et déterminé par les gènes Hira, Pax3 et Pax7. Nous souhaitons étudier la fonction spécifique de chacun de ces gènes dans les cellules satellites pendant la régénération musculaire. Dans un but de suivre le principe des 3R et de réduire et remplacer l’utilisation excessive d’animaux impliqués dans les expériences in vivo, nous avons établi des lignées cellulaires dérivées de muscles pour les expériences préliminaires. Nous avons caractérisé et étudié ces lignées in vitro pour cibler les expériences les plus pertinentes à développer chez la souris pour la validation in vivo. Les deux procédures principales visent à analyser et caractériser les fonctions d’Hira, Pax3 et Pax7 au cours de la régénération musculaire. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après la procédure d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux qui peuvent présenter une mobilité réduite pendant cette période. Notre étude fera appel à un maximum de 400 souris au total reparties sur 2 procédures expérimentales.

Bénéfices attendus

Il a été récemment montré que l’absence de la protéine Hira dans les cellules souches musculaires adultes (cellules progénitrices, caractérisées par expression du gène Pax7) a pour conséquence une inhibition de la régénération musculaire. De plus, il a été démontré que Hira est un facteur clé pour garder l’identité myogénique des cellules satellites pendant la régénération du muscle. Ce projet permettra de comprendre si cette cascade régulatrice est spécifique des cellules satellites ou bien à un rôle général dans le maintien de l’identité cellulaire d’autres types cellulaires composant du muscle squelettique nous proposons de développer ce projet.

Procédures

Pour la procédure 1, 240 de la totalité des animaux (400) seront soumis au gavage de tamoxifène 2 fois avec un intervalle d’une semaine. Le geste de gavage ne prend que quelques secondes. Pour la procédure 2, 300 de la totalité des animaux (400) seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Les 100 autres animaux seront analysés en homéostasie, donc non-soumis à des injections.

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte des génotypes utilisés, du traitement de tamoxifène par gavage ou de la lésion musculaires. Les animaux des differents génotypes sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. Donc, à ce jour, nous ne nous attendons pas à un phénotype associé à ces procédures.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire pour prélèvement des tissues nécessaires à l’analyse.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Par conséquence, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 10 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.

Raffinement

Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 8 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude qui presente l’allèle CreErt2. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de la régénération musculaire.

256 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine porte, pour certaines couplée à la suppression d'une voie nerveuse spinale, puis une perfusion de solution sucrée sur 24 heures, avant la mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie et de troubles de la motilité intestinale liés à la chirurgie. Il étudie comment l'intestin signale le glucose au cerveau et affirme que ces dialogues entre organes ne peuvent s'étudier sur cellules ou organoïdes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de glucose (sucre) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. En effet, le glucose sécrété dans la veine porte (localisée à la sortie de l’intestin) induit un signal nerveux - appelé signal « glucose-portal » - qui cible les régions du cerveau du contrôle de la prise alimentaire et de la dépense énergétique. Différents circuits nerveux entourent la veine porte et permettent la détection des informations nutritionnelles et leur transmission au cerveau. La détection du glucose dans la veine porte pourrait impliquer les nerfs qui utilisent le transmetteur CGRP (Calcitonin gene related protein). Une partie de ces nerfs passe par une chaine ganglionnaires qui longe la colonne vertébrale pour apporter les informations au cerveau (voie nerveuse spinale). Les objectifs de ce projet sont de déterminer comment la détection du glucose est réalisée dans la veine porte et quelle est la voie nerveuse impliquée. Plus précisément, l’objectif de ce projet est de déterminer : 1/ Le rôle du neurotransmetteur CGRP dans la transmission du signal depuis la veine porte jusqu’au cerveau 2/ L’implication de la voie nerveuse spinale dans cette transmission Pour cela, nous étudierons si une augmentation de glucose dans la veine porte chez des souris transgéniques invalidées pour le neurotransmetteur CGRP, ou chez des souris non transgéniques dont la voie nerveuse spinale est altérée, active les zones du cerveau connues pour réguler la prise alimentaire ou l’équilibre de la glycémie.

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques sur l’obésité, le contrôle glycémique et l’accumulation de graisses dans le foie ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. Ce projet nous permettra d’identifier comment la production intestinale de glucose active le cerveau. Trouver des agents agissant sur ces mécanismes pourrait représenter une cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

- A l’âge de 12 semaines, 32 souris recevront un régime enrichi en protéines et seront mise à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, 64 souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte sous anesthésie et analgésie. Après une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris recevra une perfusion de solution sucrée et l'autre une perfusion de solution physiologique pendant 24 heures à l'état vigile. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, un groupe de 32 souris subira une chirurgie sous anesthésie et analgésie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte et une suppression de la voie nerveuse spinale. Un autre groupe de 32 souris subira une chirurgie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte et une intervention semblable mais qui ne touche pas la voie nerveuse spinale. Après au moins une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris de chaque groupe recevra une perfusion de solution sucré et l'autre une perfusion de solution physiologique pendant 24 heures, à l'état vigile. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Il est possible de rencontrer des difficultés lors de la pose des cathéters en veine porte. Les souris subissant cette chirurgie pourront présenter une détérioration du vaisseau ou l’apparition d’une hémorragie. La suppression d'une partie de la voie spinale peut conduire à une altération de la motilité intestinale et des sécrétions et provoquer plus de défécation.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort dans le but de mesurer l’expression des transporteurs de glucose dans la veine porte en utilisant plusieurs techniques d’imagerie et de quantification. Pour déterminer comment les informations nutritionnelles issues de la veine porte activent le cerveau, l’activation du cerveau sera mesurée par des marquages spécifiques sur des coupes histologiques de cerveaux fixés, obtenus après mis à mort d’animaux profondément anesthésiés.

Remplacement

Le glucose produit par l’intestin est détecté par des senseurs de glucose dans le circuit sanguin situé entre l'intestin et le foie (veine porte). Cette détection va être transmise par un signal nerveux de la veine porte vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux vers la périphérie pour contrôler l'équilibre énergétique. La production de glucose par l'intestin et la détection du glucose dans la veine porte ont donc des impacts sur l’ensemble du métabolisme et impliquent des dialogues entre organes. Pour comprendre comment ces fonctions régulent l'organisme, les étude ne peuvent donc pas être réalisées sur cellules ou organoïdes. Pour comprendre précisément le rôle du signal nerveux entre intestin et cerveau, les études seront réalisées in vivo dans des modèles de souris transgéniques ciblant un neurotransmetteur.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit au maximum 16 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus Au total, ce projet nécessitera au maximum 256 souris mâles transgéniques et contrôles.

Raffinement

Les souris contrôles C57BL6J seront commandées à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. L’implantation du cathéter dans la veine porte pour la perfusion de glucose sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Les animaux seront observés et pesés régulièrement. L’apport de nourriture et d’eau sera particulièrement suivi et adapté pour palier à un excès éventuel de défécation, qui pourrait être induit par la suppression du système nerveux spinal. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.

Choix des espèces

Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Deplus, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un télétransmetteur implanté sous la peau, sont isolées en cage individuelle trois semaines pour l'enregistrement de l'électrocardiogramme, puis subissent une exploration électrophysiologique par voie transœsophagienne sous anesthésie avant d'être tuées sans réveil, pour étudier les effets de la suralimentation postnatale sur le cœur. Le porteur classe l'isolement en cage individuelle comme une atteinte modérée. Il affirme que ce projet, reposant sur des échanges entre plusieurs organes, doit être conduit sur un animal entier.

Objectifs

Les maladies liées au surpoids sont en constante augmentation non seulement dans nos sociétés occidentales mais aussi dans les pays émergeants. Ces pathologies associent des désordres cardiovasculaires (hypertension artérielle, athérosclérose, coronaropathies, néphropathies) à des anomalies métaboliques majeures (dyslipidémies, diabète). Leurs origines, plurifactorielles, sont bien entendu à rechercher dans une inadaptation de notre patrimoine génétique aux modifications profondes de l’alimentation et du niveau d’activité physique, liées aux changements de nos sociétés. Des travaux récents tendent à montrer que des altérations précoces de l’environnement, notamment nutritionnel, pourraient infléchir durablement l’orientation pondérale, métabolique et cardiovasculaire des individus et participer à l'augmentation du risque cardiovasculaire observée dans les pays développés. Préciser et comprendre les mécanismes responsables de la survenue de ces altérations cardiovasculaires et métaboliques induites par des modifications précoces de l’alimentation, et mieux comprendre l’origine de cette plus grande susceptibilité du cœur à ces situations pathologiques permettraient d'améliorer les actions de prévention et même de prise en charge de ces pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but une meilleure connaissance des conséquences cardiaques des modifications précoces de prise alimentaire et d'éventuelles altérations des interactions neuro-cardiaques issues de ces troubles alimentaires. Les laboratoires impliqués dans ce projet procéderont ultérieurement en fonction de leurs résultats à l'identification de cibles thérapeutiques potentielles et tenteront une stratégie de traitement (prévention des altérations neuro-cardiaques).

Procédures

L'ensemble des animaux sera soumis à 2 interventions successives : l'implantation de télétransmetteurs en position sous-cutané pour mesurer l'électrocardiogramme, puis l'exploration électrophysiologique transoesophagienne pour tester la vulnérabilité du coeur à faire des arythmies cardiaques. L'ensemble des expérimentations est réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront équipés du dispositifs de mesure de l'électrocardiogramme pendant 3 semaines, durée de leur mise en cage unique.

Impact sur les animaux

La caractérisation fonctionnelle des animaux repose d'une part sur l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Ces animaux implantés devront être isolés en cage unique pour des raisons techniques et de bien-être afin d'éviter les blessures entre animaux. L'implantation du holter en sous cutanée est bien maitrisée et aucune nuisance supérieure à une sévérité légère n'est attendue par l'acte chirurgical (implantation sous-cutanée necessitant seulement 3 petites incisions de la peau). L'isolement sera pris en compte pour le suivi journalier de l'animal et est classé comme sévérité modérée. L'exploration électrophysiologique trans-oesophagienne a été choisie car elle est réalisée sous anesthésie générale de l'animal et ne nécessite pas de chirurgie, à l'inverse de l'exploration intracardiaque et, n'induit pas de lésion ni de douleur. L'animal ne se révveille pas suite à cette expérimentation.

Devenir

Après avoir effectué l'enregistrement ECG par télémétrie, puis effectuer l'exploration électrophysiologique trans-oesophagienne, les animaux seront mis à mort sous anesthésie gazeuse (sans réveil).

Remplacement

Ce projet de recherche, qui repose sur des interactions entre différents organes (tissu adipeux, cerveau, foie, cœur et vaisseaux) ne peut pas être approché par des techniques reposant sur la culture cellulaire et les modèles in silico. Il nécessite d’être conduit sur un animal entier, de sa naissance à sa maturité.

Réduction

N’existant pas de méthode substitutive qui puisse éviter de recourir à l’usage d’animaux, cette étude sera réalisée en accord avec le principe des 3R avec notamment le but de réduire le nombre d’animaux (utilisation d'un même animal pour plusieurs mesures). Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, transoesophagien), compatibles entre elles permettant de réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'informations sur chaque animal. Au niveau statistique, le nombre d’animaux a été déterminé par le logiciel G*Power avec un risque Alpha de 0.05 et une puissance de 0.95 ( avec une différence absolue attendue de 20 à 30% entre les groupes). Les résultats seront comparés entre les souris des 2 groupes (alimentation normale / suralimentation) par un test de comparaison de pourcentages et tests de comparaison de moyennes. Un nombre de 24 animaux maximum par groupe sera utilisé, soit 48 animaux au total.

Raffinement

L'ensemble de la procédure d'implantation du capteur de télémétrie sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. L'animal est monitoré jusqu’à son réveil complet puis placé dans une couveuse en cage unique pour récupérer. Le jour de la procédure, des visites régulières sont effectuées. Des soins per- et postopératoires appropriés serontégalement réalisés: analgésie locale puis injection d'analgésique avant le réveil pour prévenir la douleur. Une injection d'analgésique sera effectuée si un signe de douleur persiste dans les 2 jours suivant l’implantation. Une grille d'évaluation clinique de l'animal permettra son suivi et le respect des points limites. Les animaux seront hébergés en présence d'outils de raffinement (nid en cellulose et carré de cellulose).

Choix des espèces

Notre équipe de recherche a une longue expérience de projets expérimentaux conduits chez la souris. Nos appareils de mesure sont adaptés à la souris. La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. Les animaux que nous utiliserons auront un âge de 6 mois, stade d'âge avancé, où la suralimentation devrait générer des troubles fonctionnels cardiaques.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris normales ou myopathes, elles subissent une blessure musculaire aiguë et des injections sous-cutanées, intrapéritonéales puis intramusculaires, avant le prélèvement du tissu musculaire. Le porteur reconnaît que le cumul des actes induit un stress et une douleur transitoire. Il indique tester in vivo une molécule anti-inflammatoire déjà jugée bénéfique in vitro, censée à terme accélérer la régénération du muscle.

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis dans certaines conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies). Les mécanismes cellulaires qui contrôlent la régénération musculaire sont bien connus, mais les effecteurs moléculaires sont encore peu nombreux à avoir été identifiés. Des travaux précédents ont montré qu'une molécule joue un rôle important au cours de la régénération musculaire en contrôlant les cellules de l'immunité (en stimulant les cellules souches musculaires qui permettent la régénération des fibres musculaires). Ces résultats ont été montrés grâce à une stratégie d'inhibition. L'objectif de l'étude est de réaliser une approche gain de fonction, en ajoutant la molécule dans le muscle au cours de la régénération musculaire. Le projet se base sur des travaux in vitro montrant un rôle bénéfique de la molécule. Le projet prévoit l'utilisation de souris normales qui subissent une blessure musculaire aigue, et des souris myopathes, qui présentent une régénération musculaire permanente. A terme, l'utilisation de cette molécule pourrait être envisagée pour un traitement permettant d'accélérer le processus de régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace, peut être ralenti ou empêché dans différentes conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies, etc). La connaissance des déterminants moléculaires du processus de régénération pourrait ouvrir des voies thérapeutiques afin d'aider ce processus en cas de défaillance. L'ajout de la molécule pourrait être bénéfique pour le muscle. Le projet vise à valider cette hypothèse in vivo, après que des expériences in vitro ont montré son bénéfice.

Procédures

Les souris subiront des injections de faible volume en sous cutanée (1 maximum) ; en intraperitoneal (5 au maximum), puis 3 semaines plus tard, des injections intramusculaires (4 au maximum). La durée de ces injections est d'environ 10 secondes (contention totale 30 secondes).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, injections im, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur transitoire. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables des différentes substances injectées.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

Cette étude arrive à la fin d'une série d'analyses qui a montré in vitro les effets bénéfiques de la molécule anti-inflammatoire sur les cellules de l'inflammation et des vaisseaux. L'analyse finale nécessite de valider le rôle bénéfique de cette molécule au sein de l'organe, et de l'organisme entier, donc in vivo, de façon intégrée.

Réduction

L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Le nombre de souris est diminué par deux car les deux pattes des animaux sont utilisées. Les analyses sont réalisées de manière séquentielle, sur des petits groupes d'animaux, ce qui permet d'ajuster les points d’étude et de réduire potentiellement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Après chaque injection intramusculaire, les animaux font l'objet d'une surveillance accrue le jour même et le lendemain, afin de vérifier l'absence d'évènement indésirable au site d'injection, et plus généralement sur le comportement de l'animal. Un traitement antalgique est administré après induction de la lésion musculaire. Des points limites définis permettent d’éviter toute souffrance chez les animaux

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme . Les animaux sont utilisés entre 10 et 12 semaines, à l'âge adulte.