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Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèles génétiquement modifiés
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.
Impact sur les animaux
Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.
Evaluation de la fonctionnalité et de la stabilité de substituts de peau greffés chez la souris Nude
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
600 souris Nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Sous anesthésie, une plaie cutanée est créée puis recouverte d'un substitut de peau issu de cellules souches embryonnaires humaines, et chaque souris est ensuite isolée en cage individuelle de deux semaines à six mois pour éviter l'arrachage du greffon. Le porteur reconnaît que cet isolement prolongé est une source de stress par privation de contacts sociaux. Il décrit un objectif de production, sécuriser le lancement de lots cliniques de substituts cutanés, les souris étant tuées à quatre échéances pour analyser les greffes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés développés selon différentes méthodes de fabrication, en utilisant des banques de cellules dérivées de cellules souches embryonnaires humaines cultivées sur une matrice biologique, amplifiées et différenciées. Trois milieux de culture différents sont utilisés, qualifiés dans des tests in vitro de reconstruction épidermique, pour produire ces produits de thérapie innovante dans de nouveaux dispositifs médicaux afin d’obtenir des substituts cutanés de plus grande taille que dans des plaques de culture commerciale et en évaluant la stabilité des unités thérapeutiques produites au cours du temps, selon les normes concernant les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain et les lignes directrices de l’Agence Européenne du Médicament pour les médicaments à base de cellules souches. Un maximum de 30 substituts cutanés ainsi préparés selon différentes conditions expérimentales et sélectionnés sur la base d’essais préalables in vitro de stabilité et de fonctionnalité, seront greffés chez la souris Nude pour éviter un rejet. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions de fabrication optimales pour la production des lots de transfert de substituts cutanés et de sécuriser le lancement d’une production de lots cliniques dédiés à la production des unités thérapeutiques qui iront chez le patient.
Bénéfices attendus
Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes où donneur et receveur sont la même personne, sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limitée de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes où donneur et receveur sont de même espèce ou d'espèces différentes peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau mais avec de forts risques de rejet, douleurs, infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés biosynthétiques sont aujourd’hui disponibles, constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de protéines et facteurs de croissance nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité, et des substituts cutanés à partir de cellules souches embryonnaires humaines sont produits par ingénierie tissulaire. Ils sont envisagés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions de fabrication optimales pour la production des lots de transfert de substituts cutanés et de sécuriser le lancement d’une production de lots cliniques dédiés à la production des unités thérapeutiques qui iront chez le patient.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour la réalisation des greffes de substituts cutanés. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau sera effectué avant la réalisation de la greffe de substitut cutané à cet emplacement. Un traitement analgésique des souris Nude greffées sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes cutanées seront protégées et elles seront observées régulièrement tout au long de l’expérimentation. Un suivi quotidien des souris greffées sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané. La durée de cet hébergement en cage individuelle sera variable, de 2 semaines à 6 mois pour la durée la plus longue.
Impact sur les animaux
L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation. Le processus cicatriciel est en effet long, passant par différentes phases, inflammation, néovascularisation, épithélialisation et surtout remodelage. La peau néoformée à partir d’un substitut cutané est une peau très fragile jusqu’à la finalisation du remodelage qui peut nécessiter plusieurs semaines voire plusieurs mois pour être finalisé. Cet hébergement en cage individuelle des souris peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris de voire au moins une de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de substitut cutané et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 600 souris Nude greffées seront mises à mort à 4 temps différents après réalisation de la greffe cutanée, 2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois après, avec 5 souris par temps de prélèvement, afin de réaliser un ensemble d'analyses sur les prélèvements cutanés qui seront effectués.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de vaisseaux sanguins, régénération de la surface cutanée…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes et selon les recommandations internationales en vigueur. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée avec l'utilisation d'analgésique. Les animaux seront ensuite observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation. Une grille de score sera mise en place avec l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel conduisant si nécessaire à la mise à mort des animaux dans des conditions éthiques afin d'arrêter toute souffrance. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme, et la souris Nude est une souris avec un système immunitaire très rudimentaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger telle que des substituts cutanés préparés à partir de cellules embryonnaires humaines. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).
Elevage en insectarium de lignées de moustiques tropicaux et européens, transmetteurs potentiels de virus.
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- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Anesthésiées jusqu'à une fois par semaine pendant quarante minutes, elles sont posées par deux sur des cages de moustiques pour servir de repas sanguin vivant destiné à maintenir six populations de moustiques en élevage. Le porteur décrit une réaction immunitaire à la salive des insectes et une anémie liée aux piqûres, surveillées par une pesée hebdomadaire. Il qualifie l'usage des souris de "gold standard" et affirme que les poches de sang ne produisent pas d'œufs en quantité et qualité acceptables.
Objectifs
Afin de pouvoir étudier la capacité de transmission de virus par différentes populations de moustiques, nous devons pouvoir maintenir en élevage ces insectes sur plusieurs générations. L’obtention d’œufs de moustiques et le développement ultérieur de ces œufs en larves, puis en nymphes et ensuite en adultes repose sur le prélèvement régulier de sang de mammifères par les moustiques femelles adultes (hématophages). La prise d’un repas sanguin leur est indispensable pour pouvoir pondre leurs œufs. Un moustique femelle prélève environ de deux à quatre microlitres de sang. Après un délai de 48 à 72 h, la femelle pond une cinquantaine d’œufs. Ces œufs peuvent ou ne peuvent pas, selon les espèces, être conservés un certain temps à sec avant d’être mis à éclore pour générer de nouveaux adultes.
Bénéfices attendus
Tous les projets de recherche de notre unité ont pour base l’étude de la capacité de certaines populations de moustiques à s’infecter, ou non, et transmettre des virus pathogènes pour l’homme ou des animaux. La compréhension de ces systèmes permet d’évaluer et d’anticiper la survenue d’épidémie. Notre époque, avec les dérèglements climatiques, la pollution, les déforestations, l’utilisations de pesticides et d’insecticides, entrainent des modifications qui impactent fortement les insectes et augmentent les risques d’émergence de virus. L’utilisation des souris comme source de sang pour les moustiques est un « gold standard » pour produire suffisamment d’œufs qui seront destinés aux études des systèmes vectoriels. En effet, chaque combinaison moustique-virus varie selon l’origine géographique de la population de moustiques et du génotype/sérotype de virus. La connaissance de l’efficacité de chaque combinaison est importante pour mesurer le risque épidémique. Même si une espèce de moustique a une distribution très large englobant la ceinture tropicale et parfois tempérée, chaque population géographique peut présenter une réceptivité différente vis à vis d’un même virus. De façon similaire, un virus existe sous forme de différents sérotypes et génotypes et tous ne présentent pas la même efficacité à infecter une même espèce de moustique. Donc la combinaison moustique-virus est unique. En général, les moustiques à l’origine des épidémies sont minoritaires (moins de 15% des 3500 espèces de moustiques) mais sont omniprésents dans l’environnement urbain. Ces moustiques sont des espèces invasives fortement adaptés à l’homme et qui voyagent avec l’homme et les marchandises. Ils ont la propriété de pouvoir se reproduire en cage et se nourrir en captivité sur animaux dont les souris. Ces caractéristiques ont permis des avancées majeures dans la connaissance des maladies vectorielles affectant la santé de l’homme (dengue, chikungunya, fièvre jaune et Zika) et de ce fait, il a été possible d’élaborer des stratégies de contrôle efficace.
Procédures
Les souris seront anesthésiées au maximum une fois/semaine pendant 40 min par injection d’un mélange de Xylazine + Ketamine, puis seront placés sur des cages de moustiques d’élevage pendant 30 min. Une injection de solution de chlorure de sodium 0,9% sera pratiquée après chaque anesthésie.
Impact sur les animaux
Les souris sont anesthésiées avant d’être positionnées sur les cages d’insectes dans l’insectarium à 25 ou 28°C, selon l’espèce. La piqure par les femelles de moustiques engendre une légère réaction immunitaire due au contact de la salive injectée par l’insecte au moment de la prise de sang. Il n’y a pas de démangeaison cutanée constatée. A son réveil, les souris ne se grattent pas et ont un comportement normal. L’anémie due au prélèvement du sang (2 à 4 µL / moustique) est prise en compte en limitant le temps de contact et donc le nombre de piqure. Une pesée hebdomadaire des animaux, au moment du change, permet de détecter une éventuelle perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Les moustiques femelles étant hématophages, il est impossible de les maintenir en élevage sans avoir recours à du sang. Le sang apporte les substances nutritives indispensables à la fabrication des œufs. Dans la nature, les sources de sang sont des vertébrés (oiseaux, mammifères ou humains) avec lesquels les moustiques cohabitent. Au sein du laboratoire, les sources de sang les plus biologiquement pertinentes sont les souris ou les lapins de laboratoire. Dans le présent projet visant à maintenir des populations de moustiques sains en élevage, les souris de laboratoire ont été identifiées comme des sources régulières de sang. Le recours à l’animal est nécessaire car l’utilisation d’autres sources de sang (poche de sang, globules rouges lyophilisés) ne permet pas la production d’œufs de qualité et en quantité acceptables pour les infections réalisées ultérieurement.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulement du projet tient compte : - des six espèces de moustiques de différentes origines à maintenir en élevage ; - des nuisances occasionnées par les piqures des moustiques femelles (anémie, réaction immunitaire à la salive) et par des anesthésies répétées. Dix cages de six souris femelles IOPS maintenues et renouvelées quatre fois/an est selon notre expérience la quantité minimale d’animaux pour un préjudice moindre. Il faut toujours mettre deux souris anesthésiées sur une cage pour laisser le « choix » de l’animal aux femelles (préférences d’attractivité) et diminuer le nombre de piqure par animal. Il y a en moyenne toujours 6 à 8 populations de moustiques en élevage. Un lot de six souris ne sera anesthésié qu’une fois par semaine. La présence de six lots permet un temps de récupération indispensable au bien-être des animaux.
Raffinement
Les souris sont déposées sur les cages une fois anesthésiées, toujours par deux, quel que soit la taille de la cage et le nombre de moustiques femelles, pendant un temps de contact variable, allant de cinq minutes à quinze minutes. Le temps de contact est décidé en fonction du nombre d’insectes par cage, de leur âge et de leur espèce (comportement de piqûre différent). Nos connaissances en entomologie nous permettent d’apprécier ces différents paramètres. Un même binôme de souris peut être déposé successivement sur deux cages au plus, soit trente minutes d’exposition maximum. La pommade Ocry-gel, un produit de soin oculaire destiné à la lubrification des yeux des animaux sera appliquée aux yeux des souris anesthésiées. Un volume de 0,15 mL d’une solution de chlorure de sodium à 0,9% sera injecté en sous cutané pour prévenir la baisse volumique. Ensuite, les souris sont placées dans une cage posée sur un tapis chauffant, avant leur réveil pour compenser la baisse de température de l’animal due à l’anesthésie. Les souris réveillées sont ensuite remises dans leurs cages. Il n’a jamais été observé de démangeaison chez les rongeurs mais l’application d’une crème apaisante type Quotane 0,5% sur les régions exposées sera faite si nécessaire,. Les animaux (marquage par traits sur la queue) seront pesés chaque semaine, au moment de leur change, afin de détecter une éventuelle perte de poids signe de mauvaise santé. Les cages d’hébergement sont pourvues d’enrichissement, avec eau et nourriture à volonté.
Choix des espèces
Le choix des souris est justifié par leur facilité d’approvisionnement, leur qualité sanitaire, l’absence de démangeaison (aucune observation de grattage des parties exposées) après piqûre par les moustiques, leur petite taille qui rend possible : - leur stabulation en nombre suffisant ; - leur mise en contact des insectes sur les cages. Les femelles sont âgées de 4 à 5 semaines et ont un poids de 20/22g à leur arrivée. Après la période d’acclimatation elles atteignent 30g, poids à partir duquel on peut les anesthésier et les présenter aux moustiques.
Etude des effets de la caféine sur le connectome cérébral dans un modèle de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
126 souris génétiquement modifiées pour développer une pathologie de type Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont exposées à la caféine in utero ou à l'âge adulte, puis suivies pendant douze mois par IRM sous anesthésie, tests comportementaux (labyrinthe surélevé, reconnaissance d'objets), frottis vaginaux et prélèvements sanguins, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme des atteintes possibles comme des blessures entre mâles après rasage du flanc et une défaillance cardio-respiratoire sous anesthésie. Il affirme le recours à l'animal "incontournable" et sans "alternative", et renvoie l'application chez l'humain au long terme.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer, plus fréquente cause de démence est responsable d’une morbidité et mortalité importante avec un impact économique majeur sur le système de santé. Les patients ayant la maladie présentent une altération du connectome cérébral qui est la cartographie de l’ensemble des connexions existant entre les différentes aires du cerveau, et généralement établie à partir de méthodes d’IRM. A ce jour, il n’existe pas de traitement préventif. De récents travaux chez la souris suggèrent qu’une exposition anténatale à la caféine constituerait un facteur de risque dans l’apparition précoce des déficits cognitifs. En revanche, administrée quotidiennement à de faibles doses à l’âge adulte, la caféine pourrait retarder ou réduire le risque d’apparition des déficits cognitifs. Notre objectif est d’étudier les effets de la caféine sur la connectivité cérébrale dans la maladie d’Alzheimer et de vérifier si les éventuels changements de connectivité sont corrélés aux performances cognitives. Afin de comprendre l’impact de la caféine sur le cerveau dans la maladie d’Alzheimer, nous caractériserons pendant 12 mois l’évolution des connectomes structural et fonctionnel chez des souris mâles et femelles génétiquement modiées de type Alzheimer. Les souris seront exposées à la caféine soit in utero, soit à l’âge adulte (dès 3 mois). Elles seront suivies par IRM fonctionnelle à l’état de repos et imagerie du tenseur de diffusion sous anesthésie générale légère et sédation. Nous comparerons les connectomes de ces souris à ceux de souris contrôles grâce à une approche classique de traitement des données d’IRM fonctionnelle de repos. Des études comportementales précéderont les explorations IRM. Elles permettront d’établir d’éventuelles corrélations entre modifications du connectome et performance cognitive sous les effets de la maladie et de la caféine. Une approche personnalisée se fera grâce à la plateforme neuroinformatique « The Virtual Mouse Brain ». Le connectome fonctionnel de chaque souris sera prédit à partir du connectome structural acquis en imagerie du tenseur de diffusion et comparé au connectome fonctionnel obtenu expérimentalement par IRM fonctionnelle de repos. Cela permettra, si les prédictions sont avérées, de prédire l’évolution de la maladie d’Alzheimer et l’efficacité des thérapies. L’approche par virtualisation permettra d’optimiser la plateforme sur le modèle étudié et de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans des études futures.
Bénéfices attendus
Cette étude repose sur un modèle animal d’Alzheimer. Elle s’appuie aussi sur des méthodes avancées de neuroimagerie (IRM) transposables à l’homme qui permettent l’exploration non-invasive du cerveau. Ce travail investigue l’effet de la caféine sur la connectivité cérébrale et fournira des informations détaillées sur le développement de la pathologie dans le modèle expérimental étudié et éventuellement sa régression avec le traitement à la caféine. Nous nous attendons à identifier des biomarqueurs prédictifs de la détérioration, régression ou amélioration de la maladie d’Alzheimer. L’approche par virtualisation du cerveau de chaque souris grâce à la plateforme neuroinformatique nous permettra d’effectuer des prédictions du connectome fonctionnel pour chaque temps donné, ce qui sera vérifié expérimentalement au travers des acquisitions d'IRM fonctionnelle à l'état de repos qui seront effectuées et de l’évaluation cognitive de chaque animal. Ceci pourra à long terme être utilisé chez l’homme étant donné que la plateforme a été initialement développée chez l’homme. On pourra alors prédire en fonction du stade de prise en charge de la maladie d’Alzheimer, son évolution ainsi que l’impact des thérapies mises en œuvre.
Procédures
Exposition à la caféine des reproducteurs, des embryons, des fœtus via le cordon ombilical et des petits de la portée via le lait maternel : les parents reproducteurs seront exposés à la caféine par l’eau de boisson deux semaines avant l’accouplement. Les reproductrices seront exposées à la caféine durant toute la gestation et par conséquent, les embryons et les fœtus in utero. Après la mise-bas, les petits seront exposés jusqu’au 15ème jour postnatal par la prise du lait maternel. Exposition à la caféine à l’âge adulte : Un groupe de souris sera exposé à la caféine par l’eau de boisson après 3 mois de vie et de manière chronique jusqu’à 12 mois. Tests comportementaux : Le comportement sera étudié sur des animaux contrôles, exposés à la caféine soit in utero, soit à l’âge adulte. Chaque animal sera soumis à 2 tests différents avec des intervalles de récupération entre les tests. Le test du labyrinthe en croix surélevé dure en moyenne 5 min. Le test de substitution et de reconnaissance d’objets dure 35 minutes en moyenne par animal. Chaque test sera réalisé 4 fois sur un même animal (3, 6, 9 et 12 mois). Prélèvement vaginal : Le frottis vaginal sera réalisé sur des souris vigiles. Chaque femelle de l’étude aura 4 frottis au total sur une durée de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois). Les cellules seront prélevées en quelques secondes par lavage vaginal dans l’eau stérile contenue dans une fine pipette. Prélèvement sanguin : Il sera réalisé en quelques secondes sur des souris anesthésiées en vue de l’IRM. Chaque souris de l’étude aura 4 prélèvements sanguins au total au niveau de la veine saphène latérale ou de la veine submandibulaire sur une durée de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois). IRM : Les animaux seront explorés sous anesthésie générale légère et sédation. La durée de l’examen sera d’environ 1h30. Les animaux contrôles et les animaux exposés à la caféine in utero ou à l’âge adulte (dès 3mois) subiront 4 examens au total sur une période de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois).
Impact sur les animaux
Les souris traitées à la caféine peuvent présenter une baisse de la consommation de l’eau de boisson les deux premiers jours d’exposition. Les souris exposées à la caféine in utero par le biais de leurs mères peuvent avoir un poids plus faible à la naissance que les contrôles. Cependant, à l’âge adulte, leur poids n’est plus différent de celui des souris naïves. L’exposition in utero à la caféine a un effet délétère sur le cerveau. Les animaux seront soumis à 2 tests comportementaux différents et pourraient être plus anxieux lors du second test réalisé le lendemain du premier. L’effet indésirable lors des frottis vaginaux est de provoquer une stimulation induisant une pseudo-gestation. Bien que ce risque soit mineur chez les souris à l’inverse des rates, nous avons envisagé les dispositions permettant de minimiser cette éventualité (utilisation d’une micropipette et espacement des prélèvements de 3 mois). Les animaux seront aussi examinés par IRM tous les 3 mois (m3 à m12). A chaque IRM, ils seront rasés au niveau du flanc droit sur les faces dorsale et ventrale afin de faciliter le monitoring de la saturation en oxygène pendant l’examen. Ce geste est indispensable pour avoir des valeurs fiables sur les souris de notre étude car l’oxymètre étant associé à un capteur infrarouge, son pouvoir absorbant est atténué par leur pelage noir. Cependant, du fait du dos rasé, les souris mâles peuvent se blesser plus facilement lors des luttes entre congénères. Ils seront alors surveillés et nettoyés avec de la vétédine au besoin. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Après la dernière IRM, les descendants des triades seront soumis à une perfusion intracardiaque en vue de prélèvements destinés à des analyses neuroanatomiques et immunihistochimiques. Les reproducteurs seront mis à mort à 12 mois du fait de leur âge et parce qu’ils ne seront plus réutilisés pour générer des colonies à la fin de l’étude.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de la connectivité cérébrale au cours de la vie nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative. De nombreuses études montrent que les dynamiques cérébrales globales sont analogues chez les mammifères, et le modèle de souris Alzheimer qui sera utilisé est très pertinent pour apporter de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux et mieux appréhender cette maladie.
Réduction
Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives en IRM permettant le suivi longitudinal d’un même animal. Nous ne disposons pas de données préliminaires sur l’effet de la caféine sur les métriques IRM dans notre modèle de souris Alzheimer. Il ne nous est donc pas possible d’utiliser de tests statistiques pour évaluer la taille des groupes. En tenant compte des aléas possibles dans la mise en œuvre du projet et sur la base de notre expérience en IRM préclinique, nous avons donc réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique.
Raffinement
Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Un délai d'acclimatation minimum de 10 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés lors de l’arrivée des animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés en vue de l’IRM. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie légère avec sédation afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitoring physiologique continu avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les études comportementales seront effectuées sous la conduite d’un opérateur expérimenté et les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication seront appliqués.
Choix des espèces
Ce projet utilise des souris génétiquement modifiées comme modèle animal de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle est considéré comme pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine (lésions de type plaques amyloïdes, neuroinflammation, propagation de protéines tau et déficits cognitifs). Nous utiliserons des reproducteurs âgés de 6 à 8 semaines, exposés ou non à la caféine. Les descendants seront soit : exposés à la caféine in utero et pendant les 15 premiers jours de vie par le lait maternel ; soit non exposés pendant la gestation mais exposés de manière chronique à la caféine à l’âge adulte (de 3 à 12 mois) ; soit, jamais exposés à la caféine au cours de leur vie. Les différentes interventions se feront tous les 3 mois sur les souris adultes (à partir de 3 mois jusqu’à 12 mois). Cette étude permettra d’étudier les modifications induites par la maladie, la caféine et le vieillissement sur le connectome cérébral.
Projet pilote : Modèle de mouvements anormaux après privation en oxygène chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont privés d'oxygène pendant 1 à 30 minutes, dont 40 sans anesthésie et maintenus par contention, pour mettre au point un modèle de myoclonies reproduisant le syndrome de Lance-Adams humain. Le porteur décrit une possible détresse respiratoire, des secousses musculaires gênant déplacement et alimentation, et reconnaît que la mort pendant l'anoxie est une "possibilité expérimentale". Il s'agit d'une étude "pilote" visant à caler les paramètres d'un futur modèle, et il revendique la "nécessité" d'expériences animales au motif qu'on ne peut provoquer ces atteintes chez l'humain.
Objectifs
Chez l’homme, l’arrêt de l'oxygénation du cerveau (ou anoxie cérébrale) peut être liée à des causes variées : arrêt cardiaque, crise d’asthme ou infection des poumons très sévère, noyade, pendaison, etc. Elle entraîne chez les survivants des maladies neurologiques chroniques comme le syndrome de Lance-Adams (LAS). Le LAS apparait dans les jours ou semaines suivant le manque d'oxygène, après retour des patients à un état de conscience normal. Le LAS est caractérisé par des secousses musculaires involontaires (appelées myoclonies) très importantes. Ces secousses musculaires, non qualifiées comme douloureuses par les patients, apparaissent spontanément ou sont induites par les mouvements ou des sons par exemple. Elles rendent impossible la réalisation de nombreux gestes de la vie quotidienne : marcher, s’alimenter, se laver ou aller aux toilettes. Les patients sont le plus souvent traités par de multiples médicaments qui exposent à de nombreux effets secondaires et aux risques d’interactions entre médicaments. Dans le LAS, l'efficacité de ces médicaments est souvent insuffisante. Les mécanismes à l'origine du LAS restent peu connus. A ce jour, deux modèles de LAS ont été développés chez le rat, soit par arrêt des contractions cardiaques après une injection de toxiques dans le coeur, soit par arrêt de la circulation sanguine par compression des gros vaisseaux sanguins situés dans le thorax à la sortie du coeur. Cependant, ces deux modèles présentent plusieurs limites, notamment une approche expérimentale lourde, un taux de mortalité élevé et l’induction de lésions cérébrales par ischémie (interruption brutale du flux sanguin) et non pas par anoxie (manque pur d'oxygène). L’objectif de notre projet pilote est donc de mettre au point un nouveau modèle animal de myoclonies après un manque d'oxygène reproduisant le phénotype de LAS chez l’humain. Avec une procédure expérimentale plus simple, moins invasive et plus représentative du mécanisme de LAS chez l’humain, nous souhaitons identifier les divers paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un modèle fiable et reproductible tout en limitant la mortalité et la douleur chez l’animal, indispensable pour vérifier nos hypothèses concernant les mécanismes à l'origine du LAS.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints de LAS est aujourd’hui limitée avec des traitements à l’efficacité assez faible dans cette pathologie. L’amélioration de la prise en charge des patients passe avant tout par une meilleure compréhension des mécanismes aboutissant aux secousses involontaires (appelées myoclonies) du LAS. Cela repose donc notamment par l’exploitation des modèles animaux qui reproduisent cette pathologie. Comme évoqué précédemment, les modèles déjà publiés de LAS ont des points faibles. Nous souhaitons donc développer ce nouveau modèle de LAS chez le rongeur pour ensuite l’explorer finement afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes pathologiques du LAS. Les études animales déjà réalisées donnent des résultats assez hétérogènes. Chez l’homme, les études cliniques semblent indiquer que les secousses des patients avec un LAS pourraient provenir de l'écorce du cerveau appelée cortex. Dans notre groupe de patients atteints de LAS, les premiers résultats sont très en faveur d’une atteinte du cortex pouvant être à l'origine des secousses. Par ailleurs, certains neurones spécifiques du cortex sont très consommateurs d'oxygène. Le manque d'oxygène pourrait donc en priorité affecter le fonctionnement de ces neurones-là. Nous faisons donc l’hypothèse que les secousses musculaires du LAS sont, au moins en partie, dues à un souffrance de ces neurones au sein du cortex responsable des mouvements. A court terme, cette étude pilote permettra d’établir les différents paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un nouveau modèle animal de LAS. A long terme, le bénéfice de la mise en place de ce nouveau modèle sera d’approfondir, dans un projet ultérieur, les connaissances déjà acquises sur le LAS, en particulier par des méthodes électrophysiologiques et immunohistochimiques afin de tester notre hypothèse.
Procédures
Le protocole d'anoxie transitoire sera réalisé à une seule reprise sur les 50 rats. Sur un premier groupe de 10 rats (groupe 1), cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale. Pour les 4 autres groupes de rats (de 10 rats chacun), cette procédure sera réalisée sans anesthésie. Le protocole d’anoxie durera entre 1 et 30 minutes. Pour chacun des rats, des électrodes sous-cutanées de surveillance ECG et une pince oxymètre de pouls de surveillance de la saturation en oxygène seront placées avant la procédure d’anoxie et seront retirées ensuite. De plus, une voie veineuse sera posée dans la veine caudale. Pendant cette procédure d’anoxie transitoire sur le groupe 1, le risque anesthésique est à prendre en compte. Par ailleurs, pour les animaux non anesthésiés (groupes 2, 3, 4 et 5) pour la procédure d’anoxie transitoire, le système de contention pourra représenter une nuisance pour l’animal car cela va nettement restreindre sa mobilité. Au cours de la procédure d’évaluation de la survenue des myoclonies, des injections de molécules anti-épileptiques (durée d’injection et temps de maintien : 1 minute) seront réalisées une fois pour chaque animal par voie intra-péritonéale. Pour tous les animaux, le phénotype induit sera surveillé très attentivement du fait de la possibilité de perte de motricité et d’apparition de myoclonies et de crises d’épilepsie. Enfin, les animaux seront euthanasiés par une méthode de mise à mort réglementaire.
Impact sur les animaux
Ce projet pilote va permettre d’évaluer les différents effets indésirables possibles de ce protocole expérimental. La phase de manque d'oxygène pourra être à l’origine d’un stress pour les animaux du fait de potentielles difficultés à respirer. Cette privation d'oxygène sera réalisée dans une cage contenant un système de contention permettant d’immobiliser l’animal, pendant 1 à 30 minutes. Certains animaux seront endormis pour la réalisation de cette procédure par l'utilisation de médicaments anethésiques, donc le risque de l'anesthésie est également à prendre en considération. La mort des animaux au cours du manque d'oxygène est une possibilité expérimentale. Les secousses musculaires involontaires engendrées par le manque d'oxygène pourront entrainer des difficultés de déplacement pour les animaux ainsi que des difficultés d’alimentation. Il nous semble également important de rappeler que, chez l’humain, les secousses musculaires ne sont pas considérées comme étant douloureuses.
Devenir
Les mêmes animaux sont impliqués dans les manipulations d’anoxie et d’évaluation des myoclonies/suivi du phénotype dommageable. A l’issue de ces manipulations, les animaux seront euthanasiés par une méthode de mise à mort réglementaire, l’euthanasie étant requise pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que de nombreuses procédures alternatives existent, ni les processus aboutissant à la mort des neurones ni les processus favorisant l'apparition de crises d'épilepsie ou de secousses musculaires involontaires (appelées myoclonies) ne peuvent être légitimement bien étudiés chez l’homme ou dans d’autres modèles non animaux. De plus, il n’est pas légitime de provoquer une crise d’épilepsie ou des myoclonies chez un patient pour des études scientifiques. Enfin, lors des expériences sur les animaux, l’environnement est mieux contrôlé et la qualité des données est nettement supérieure.
Réduction
Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cette objectif que nous conduisons cette étude pilote afin d’établir les paramètres du protocole permettant de réduire au maximum la mortalité du protocole donc le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire (50) pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable. Afin de réduire ce nombre d’animaux, nous réaliserons la procédure d’anoxie sur un premier groupe d’animaux qui seront anesthésiés afin de bien définir les paramètres techniques (design intérieur des cages d’induction, paramètres physiologiques limites, temps d’exposition critique à de faibles % en oxygène, débit de gaz nécessaire).
Raffinement
Une période d’acclimatation, d’une semaine minimum, à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage, bruit et espace ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, d’alimentation et soins si nécessaire, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). Une période, d’une semaine minimum, d’habituation à la manipulation humaine et à tous les outils utilisés pendant nos procédures expérimentales est respectée avant la réalisation de nos procédures. Avant le début de chaque expérience, une période d’acclimatation de 30 minutes sera observée au cours de laquelle les animaux, laissés dans leur cage, ne seront pas manipulés. Cela leur permettra de s’habituer à leur nouvel environnement et éviter toute forme de stress. Les animaux bénéficieront alors de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de tunnels. Pendant la procédure d’anoxie, les paramètres physiologiques (électrocardiogramme et saturation en oxygène) seront surveillés constamment.
Choix des espèces
Notre projet s’intègre dans la thématique du laboratoire qui s’intéresse aux processus physiopathologiques d’épileptogenèse et d’ictogénèse. Le rat est l’espèce choisie pour ce projet. Les méthodes d’investigations électrophysiologiques et immunohistochimiques (qui seront utilisées dans un deuxième temps au cours d’un projet ultérieur) sont maîtrisées au laboratoire et ont déjà permis la publication d’études sur d’autres modèles d’anoxie et d'épilepsie réalisées sur des rats adultes. Par ailleurs, les études déjà publiées sur les modèles animaux de LAS précédemment citées ont été faites chez le rat. Nous allons utiliser des rats adultes à 8 semaines de vie. Le LAS chez l’humain est en effet décrit uniquement chez des adultes. Par ailleurs, les études électrophysiologiques d’anoxie cérébrale et d’épilepsie réalisées dans l’équipe dans d’autres projets ont été faites chez des rats adultes. Ces mêmes techniques seront utilisées dans un deuxième temps sur un projet ultérieur.
Etude des potentiels effets indésirables d’une vésiculothérapie CD146 dans l’athérosclérose
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des vésicules extracellulaires portant la molécule CD146 sous anesthésie gazeuse, subissent une mesure du temps de saignement à la queue, avant mise à mort pour prélever la moelle osseuse. Le porteur indique attendre un stress physique ou thermique et une douleur légère, et présente l'étude comme la vérification des effets indésirables d'une thérapie déjà jugée efficace contre l'athérosclérose. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'évaluer les effets hors cible d'une thérapie sur l'organisme.
Objectifs
Ce projet permettra d'étudier les effets indésirables d'une thérapie constituée de vésicules portant une molécule d'adhésion ; le CD146. En effet, un protocole précédemment accepté a testé le bénéfice d'une nouvelle thérapie dans l'atherosclérose. : l'apport de CD146 sur les macrophages de la plaque d'athérosclérose par des vésicules extracellulaires. Nos études en cours montrent un effet significatif des ces vésicules dans la régréssion de la maladie athéromateuse. Les vésicules extracellulaires étant décrites comme pouvant être pro-coagulantes ou pro-inflammatoires, il est essentiel de vérifier que la vésiculothérapie proposée n'entraîne pas de phénomènes de coagulation ou d'inflammation qui pourraient être délétères dans l'athérosclérose. Ainsi, nous allons étudier l'effet de ces vésicules sur le phénotype inflammatoire des macrophages qui sont leurs cellules cibles privilégiées. Nous étudierons également le temps de saignement des modèles expérimentaux soumis à cette thérapie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique dans la lutte contre l'athérosclérose.
Procédures
1/ injection dans la veine de vésicules extracellulaires après anesthésie gazeuse 2/Temps de saignement : Prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue après anesthésie gazeuse 3/Extraction des cellules de la moelle osseuse sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
L'animal subit une injection, une anesthésie ainsi qu'une biopsie de la queue. Cela pourra entrainer par exemple : un stress physique léger, un stress thermique ou une douleur légère chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, en effet il est necessaire d'avoir un animal euthanasié pour récolter la moelle osseuse des tibias et des péronés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle murin pour tester le bénéfice global d'une thérapie dans l'athéroslérose, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.
Réduction
Les souris seront observées avant d’initier le protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, deux protocoles différents seront testés sur le même animal sans que cela ne perturbe les données scientifiques. Ainsi, les souris qui seront soumises à un test de saignement pour évaluer l'effet de la thérapie sur l'hémostase, seront ré-utilisées pour leur extraction de moelle osseuse afin d'isoler et de mettre en cuture les macrophages in vitro.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages contenant de l'enrichissement. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection, ils seront écartés des protocoles. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration d'un médicament anti-inflammatoire tant que les signes de douleur persistent.
Choix des espèces
La meilleure façon d'appréhender les effets indésirables et 'hors cibles' d'une nouvelle stratégie thérapeutique est de l'étudier dans un modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, seul le modèle murin adulte développe des plaques d'athérosclérose semblables à celle de l'homme.
Moduler l’expression des gènes dans le tissu adipeux des souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vecteurs viraux ciblant le tissu adipeux, par injection intrapéritonéale ou par chirurgie, certaines étant rendues lipodystrophiques par le tamoxifène ou obèses par un régime gras, puis subissent échographies, mesures de glycémie et tests de tolérance mensuels. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque d'infection et que les prélèvements répétés à la queue causent une douleur légère. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" pour observer les réponses physiologiques intégrées, les cibles ayant été identifiées en culture cellulaire.
Objectifs
L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que des altérations de la fonction du tissu gras dit tissus adipeux jouent un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. En effet, chez l'obèse, le tissus adipeux a dépassé sa capacité de stocker du gras, et ce gras va aller se déposer dans différents organes comme le coeur et le foie. Le tissu gras est composé de cellules spécialisées appelées les adipocytes. Notre équipe cherche à décrire les mécanismes qui font qu'un adipocyte en bonne santé devient malade. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé des adipocytes. Afin de moduler l’expression de ces cibles dans le tissu adipeux (TA) nous collaborons avec une équipe américaine qui a développé des vecteurs viraux spécifiques du tissu adipeux.
Bénéfices attendus
Le premier but de ce projet est de tester si les vecteurs viraux spécifiques du TA sont des bons moyens pour exprimer des protéines d’intérêt dans le TA dans une visée thérapeutique. D'autre part, plusieurs travaux s'intéresse à des structures qui se trouve dans les adipocytes et qui participe à la comunication intra cellules. Ces structures sont des points de contact entre deux organelles cellulaires majeurs, les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Ces structures sont appellées les MAM. Nous émettons l'hypothése que ces structures sont noeuds de comunications importants qui contôlent l'état de santé des adipocytes. Ainsi, le deuxième but est de savoir si la modulation des MAM peut être une cible thérapeutique contre les dysfonction métaboliques associées à l’obésité.
Procédures
La lipodystrophie partielle est induite par 5 jours d’injection intrapéritonéale d'un agent pharmaceutique, le tamoxiféne. Pour les souris HFD nous commençons à nourrir des C57bl6 avec un régime gras à l’âge de 8 semaines. Nous nourrissons les souris pendant 1 mois puis nous démarrons les interventions génétiques. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, 100 µl d’une solution d’AAV sera injectée en intrapéritonéal. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, l’injection se fait directement dans le dépôt par une chirurgie. Cette procédure a lieu1 fois pendant et dure 20 minutes Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Pour l'induction de la lipodystrophie partielle, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour les souris HDFD, le régime gras entraîne une prise de poids mais n’a pas d’effet néfaste sur le bien être des souris. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, la chirurgie comporte un risque du fait des infections possibles. Pour les test de tolérance, les prélèvements multiples à la queue entraine une douleur légère. L'administration du glucose par gavage oral qui entrainne un léger stress sur les souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir le rôle physiopathologique des acteurs étudiés.
Remplacement
Le but de notre projet est de valider l’importance de certains acteurs protéiques dans le maintien de la bonne santé du tissu adipeux et de la bonne santé métabolique de l’animal au niveau systémique. Ces cibles ont été identifiées in vitro et ce travail est parallèle à des études cellulaires complémentaires. Cependant, une validation in vivo est indispensable, notamment pour l’étude des conséquences de la modulation de l’état du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les cibles testées ici ont toutes étaient identifier par des expériences réalisées sur des lignées de cellules. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement tester dans des lignées cellulaires. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 1120 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests non paramétriques de Mann and whitney pour tester la valeur statistique de nos données.
Raffinement
Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se feront avec des anesthésiques, des analgésiques et en condition de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.
Choix des espèces
Les 3 modèles murins utilisés sont bien maîtrisés au laboratoire et ont été largement étudiés. Notamment, ces modèles permettent d’étudier les conséquences de la dysfonction adipocytaires sur d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Pour les BSCL2K0, nous utiliserons des souris de 8 semaines, âge auquel elles sont déjà sévèrement lipodystrophiques. Pour les iATSKO, nous utiliserons des souris de 8 semaines lors de l’induction de la délétion par le tamoxifène en accord avec nos résultats précédents. Pour les souris HFD, des souris sauvages seront mises sous régime gras à l’âge de 8 semaines.
Etude de la signalisation insulinique cérébrale dans un modèle animal diabétique : le rat Goto Kakizaki
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Diabétiques de la lignée Goto-Kakizaki ou témoins Wistar, ils subissent une chirurgie stéréotaxique unique pour injecter de l'insuline ou son véhicule dans un ventricule cérébral, restent quinze minutes sous isoflurane puis sont mis à mort aussitôt. Le porteur décrit une craniotomie sous anesthésie locale et analgésie, et affirme n'attendre "pas" de souffrance liée à la procédure. Il présente le rat GK comme un modèle de diabète de type 2 "impossible" à remplacer par des systèmes in vitro ou in silico pour étudier la réponse à l'insuline.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une pathologie due à l'altération du métabolisme glucidique et dont la prévalence mondiale augmente de façon alarmante. Il est caractérisé par une hyperglycémie chronique due à un défaut de sécrétion d'insuline par les cellule beta du pancréas et à une résistance à l'action de cette hormone au niveau de ses tissus cibles périphériques : le muscle, le foie et le tissu adipeux. L'objectif de notre projet est d'élucider, dans un modèle animal de diabète de type 2 le rat GK , si la résistance à l’insuline est aussi présente dans le cerveau. Pour cela nous allons étudier dans cet organe les mécanismes moléculaires de la signalisation de l'insuline suite à une administration d'insuline ou de sérum physiologique ( véhicule) par injection stéreotaxique dans le ventricule latéral du cerveau. Pour cette étude, qui portera sur les animaux des deux sexes, 40 rats diabétiques GK et 40 rats Wistar sains seront nécessaires.
Bénéfices attendus
Le diabète est associé à de nombreuses comorbidités, dont des troubles neurocognitifs tels que la maladie d’Alzheimer. Dans la littérature, une altération de la signalisation insulinique dans le cerveau est proposée comme un mécanisme participant au développement des maladies neurodégénératives. Ainsi, en recherchant dans ce projet si le rat diabétique GK possède une insulinorésistance en central comme en périphérie, il serait intéressant d’agir sur ce mécanisme en thérapeutique d’autant plus qu’il n’existe toujours pas de traitement curatif pour le diabète et les maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux vont subir une chirurgie unique par stéréotaxie afin d' injecter dans le ventricule latéral une solution d'insuline ou de son véhicule . Cette opération dure 20 minutes. A la fin de l'injection, une petite goutte de sang de 10 microL, obtenue à l'extrémité de la queue en piquant avec une petite aiguille 26G, est prélevée pour contrôler la glycémie.
Impact sur les animaux
Les animaux sont anesthésiés à l'isoflurane, la tête est fixée sur un cadre stéréotaxique, le crâne est desinfecté et rasé , une incision longitudinale de la peau du crâne est effectuée à l’aide d’un ciseau fin. L’os du crâne est perforé à l’aide d’une fraise. Le volume injecté grâce à une seringue hamilton munie d'une aiguille 26G est de 5 μL à un débit de 1 μL/minute pendant 5 minutes. Il n'est pas attendu de souffrance dans le cadre de la procédure chirurgicale, nous procédons à une injection en sous cutané d'anesthésique local composée de lidocaïne (2%) diluée à 0.5% (à la dose de 7mg/kg) associée à un analgésique la Buprénorphine à la dose de 0,01mg/kg 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la procédure, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Nous surveillons les paramètres vitaux, la respiration, le pouls et la température corporelle.
Devenir
Il n'y a qu'une seule procédure dans ce projet. Après l'injection stéréotaxique dans le cerveau, les 80 rats restent sous anesthésie à l'isoflurane pendant les 15 minutes nécessaires à l'action de l'insuline puis sont immédiatement mis à mort.
Remplacement
L’étude de la réponse à l’administration de l'insuline ne peut être réalisée que sur animaux vivants et l’avantage du rat GK réside dans le fait que c’est un modèle de DT2 sans manipulation génétique et mimant la chronologie d’évolution du diabète humain. Ainsi, sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant au mieux la différence entre les groupes .En fonction de la procédure expérimentale, des variables étudiées et du nombre d’effectifs, nous utiliserons principalement des tests paramétriques, et si nécessaire des tests non paramétriques.
Raffinement
Pendant la procédure la respiration, l'obstruction des voies respiratoires, le pouls et la température corporelle seront surveillés. Afin de raffiner la procédure et réduire au mieux l’apparition éventuelle de douleur, nous prendrons toutes les précautions nécessaires (Une injection en sous cutané d'anesthésique local composée de lidocaïne (2%) diluée à 0.5% (à la dose de 7mg/kg) associée à un analgésique la Buprénorphine à la dose de 0,01mg/kg, sera effectuée 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la procédure, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Le choix du protocole expérimental impliquant les 8 groupes d'animaux, nous permet d'assurer une fiabilité à cette étude.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes mâles et femelles de 4 mois, ce qui nous garantit aussi une stabilisation du diabète chez les GK.
Comprendre le rôle du CD36 intestinal dans l’apparition des maladies métaboliques et de l’inflammation associée : utilisation de « faux lipides » bio-sourcés et dérivés d’acides gras naturels.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée va du sans réveil au modéré, 128 individus étant menés sans réveil. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer le récepteur CD36 intestinal, elles reçoivent par gavage des agonistes et de l'huile après une mise à jeun de douze heures, avant prélèvement sanguin sous anesthésie et mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur cherche à établir le rôle du CD36 intestinal dans l'obésité et présente ce récepteur comme une éventuelle cible thérapeutique. Il affirme le remplacement "impossible" au motif que l'étude met en jeu plusieurs organes.
Objectifs
L’obésité est associée à une inflammation de faible intensité ainsi qu’aux maladies cardiovasculaires et au diabète. L’obésité peut notamment s’expliquer par une consommation excessive de lipides. L’intestin et plus précisément le récepteur CD36 intestinal pourrait jouer un rôle central dans le développement de l’obésité et de l’inflammation associée. Une consommation excessive de lipides pourrait, via le dysfonctionnement de CD36, altérer les paramètres postprandiaux associés à l’obésité. Ces données ont été obtenues chez des souris totalement déficientes en CD36. La contribution physiologique spécifique de CD36 intestinal n’a donc pas été prouvée. De plus, les voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation de CD36 n’ont pas encore complètement été identifiées. Ce projet a donc un objectif double : 1) Évaluer la contribution effective du CD36 intestinal dans les perturbations physiologiques associées au développement de l'obésité. 2) Comprendre le fonctionnement du récepteur CD36 au niveau intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires induites par son activation. Pour ce projet, nous utiliserons des souris wild-type et génétiquement modifiées, n’exprimant pas le récepteur CD36 spécifiquement au niveau intestinal, et des souris contrôles correspondantes, exprimant le récepteur CD36 au niveau intestinal. Nous utiliserons des molécules ciblant CD36. Ce sont des molécules dérivées d’acides gras naturels et ayant la caractéristique d’activer spécifiquement le récepteur CD36. Nous disposons de deux agonistes différents pour réaliser ces expériences (nommé A et B pour des raisons de confidentialité). Si nos hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait être une cible thérapeutique pour limiter l’obésité.
Bénéfices attendus
Si les hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait in fine être une cible thérapeutique et/ou nutritionnelle dans le traitement des pathologies liées à un excès de lipides, comme l’obésité, le diabète de type 2 ou encore les maladies cardiovasculaires. L’identification des voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation du récepteur CD36 permettrait de mieux comprendre le fonctionnement de ce récepteur, ses impacts physiologiques et donc de faciliter une potentielle utilisation de ce récepteur comme une cible thérapeutique. De plus, si les agonistes montrent des effets bénéfiques sur les paramètres postprandiaux alors ils pourraient eux aussi être très utilisés comme éventuelle molécules thérapeutiques pour optimiser l’absorption intestinale des lipides, réduire l’hypertriglycéridémie postprandiale, réduire l’endotoxémie postprandiale et donc l’inflammation au sens large. Ces agonistes pourraient donc, via le récepteur CD36, permettre de lutter contre l’épidémie inquiétante d’obésité et des maladies associées.
Procédures
L’administration des agonistes et de l’huile se fait par voie orale (gavage). Chaque souris est gavée une ou deux fois. C’est un geste légèrement invasif mais indolore qui ne dure pas plus de 4 ou 5 secondes. La souris est de suite reposée dans sa cage de vie. Les souris sont ensuite anesthésiées pour prélèvement sanguin( 30 secondes maximum), puis euthanasiées par dislocation cervicale, sous anesthésie, pour réaliser des prélèvements de tissus d’intérêt.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 12 heures ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Celui-ci est diminué par le fait que pendant cette période les souris sont laissées dans leur cage avec un enrichissement supplémentaire de leur mileu de vie (frisons en carton, petits abris en carton ou en plastique).
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure. Pour la procédure 1 nous avons besoin de récupérer du sang et des tissus pour réaliser des dosages plasmatiques et des mesures d’expression protéique/génique tissulaire. Pour la procédure 2, nous travaillons sur des segments isolés d’intestin, nous avons donc besoin de prélever l’intestin et donc d’euthanasier les souris au cours de la procédure.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques, sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.
Etude de traçage des voies neuronales chez les cichlidés Amatitlania nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 260 cichlidés de trois espèces vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Ils subissent une craniotomie d'environ une heure pour un traçage neuronal, puis sont maintenus un à cinq jours avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur décrit une étude d'anatomie cérébrale visant à comprendre comment des cerveaux de poissons produisent des comportements complexes, et écarte le poisson zèbre et le médaka dont le cerveau est trop petit pour la chirurgie. Il affirme que ces trois espèces de cichlidés, aux comportements et cerveaux différents, sont "indispensables".
Objectifs
Certains poissons téléostéens comme les Labres et les Cichlidés présentent des comportements semblables à ceux de l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la pensée logique telle que l’inférence transitive, la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés, en particulier les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. Pour mieux comprendre leur organisation cérébrale, nous réaliserons un traçage neuronal sur le cerveau de cichlidé afin de visualiser les connexions neuronales entre les différentes structures. Mieux connaître la connectivité neuronale du cerveau de poisson téléostéen permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des téléostéens ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Bénéfices attendus
Les cichlidés présentent des comportements assez complexes incluant certaines capacités cognitives dites de « haut niveau ». Cependant, les réseaux neuronaux des cerveaux de poissons téléostéens demeurent méconnus. Afin d’expliquer comment les cerveaux des poissons traitent l'information, des études de traçage des voies neuronales sont nécessaires, afin d’établir la connectivité du cerveau de téléostéen. Nos études précédentes montrent que l'organisation globale du cerveau de poissons téléostéens est très différente de celle des tétrapodes. Cette étude permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Procédures
Procédures chirurgicales durant environ une heure. Les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement du cerveau 1-5 jours après la chirurgie. Le nombre des animaux utilisés au cours des 5 ans du projet est de 1260 au total.
Impact sur les animaux
En plus de l'intervention chirurgicale, deux nuisances post opératoires potentielles sont attendues, soit dues à l'effet de l’anesthésie, soit dues à l’effet de la chirurgie elle-même. Chaque poisson sera isolé dans un aquarium "hôpital" où la température restera stable à 25°C et où l’eau sera bien oxygénée par un bulleur d'air. Nous allons surveiller si le poisson se déplace normalement le jour même de la chirurgie, et vérifier s'il s’alimente le lendemain. Si un quelconque effet de mal-être est observé, une grille de points limites déterminera la marche à suivre concernant le devenir du poisson (soins vétérinaires, ou euthanasie).
Devenir
L'euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces qui ont un grand cerveau avec des capacités cognitives de haut niveau. Le but à long terme est d'associer les données anatomiques avec des tests comportementaux qui ne peuvent pas être réalisé chez les modèles téléostéens conventionnels comme le poisson zèbre ou le médaka et nécessitent donc l’utilisation de cichlidés. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques non-paramétriques (Mann Whitney U test, Kruskal Wallis, Wilcoxon) qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études précédemment publiées chez les téléostéens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. La température de la pièce ainsi que son taux d’humidité seront surveillés. Lors de la chirurgie, après l'induction de l'anesthésie, une injection de lidocaïne (à 1mg/kg) est pratiquée dans les muscles entourant la boite crânienne, afin d'analgésier localement la zone avant la craniotomie (attendre 2 minutes avant incision). Après la chirurgie cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé par des expérimentateurs compétents jusqu'à l’euthanasie des animaux (1-5 jours après la chirurgie). Aussi, une communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs permettra un suivi adéquat des animaux. Pour surveiller la santé des animaux, des points limites (voir grille de points limites jointe) seront utilisés, prenant en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie par balnéation (5mg de lidocaïne par litre d’eau), ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. L’analgésie par balnéation plutôt que par injection en post opératoire a été choisi pour réduire le stress de l’animal, puisqu’une injection demanderait la manipulation du poisson (sortie de son aquarium, anesthésie, puis injection), ce qui produirait un stress trop important pour un poisson déjà en souffrance. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement avant l'opération chirurgicale pour fournir de l'enrichissement. En revanche, aucun enrichissement n'est prévu au niveau de l'hébergement pour des raisons de sécurité lors de la récupération post-opératoire. En effet, les enrichissements traditionnels (tubes, cachettes), pourraient être utilisés par les poissons après leur chirurgie pour se frotter ou essayer de "gratter" le site de la chirurgie. Dans ce cas, le risque serait présent d'une réouverture de la plaie.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude neuroanatomique de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser les chirurgies nécessaires à ce projet. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet la chirurgie, semble donc toute indiquée. Nous travaillerons sur des jeunes adultes (taille du corps à partir de 3 cm) car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Diabète gestationnel et épigénétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras obésogène, toutes subissant des tests métaboliques hebdomadaires avec injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins répétés à la queue, un bolus d'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie. Le porteur cherche à établir que le diabète gestationnel modifie par voie épigénétique l'expression des gènes hypothalamiques de la descendance, prédisposant à l'obésité. Il affirme que ces mécanismes multi-organes ne peuvent être reproduits qu'avec la souris, jugée "indispensable" faute d'échantillons humains.
Objectifs
Notre corps est optimisé pour stocker tout apport énergétique qui dépasse les besoins de l'organisme. En effet, l’évolution a permis aux humains de traverser des périodes de famine. Cependant, ce mode de fonctionnement n’est pas compatible avec notre style de vie sédentaire d'aujourd'hui. Il en résulte l'émergence de la pandémie d'obésité et de diabète, qui survient de plus en plus fréquemment dès l'enfance et l'adolescence. Bien que des études de génétique humaine à grande échelle aient été menées avec succès, l'héritabilité de traits aussi complexes reste difficile à déterminer. De plus en plus d’études scientifiques suggèrent que la suralimentation dans des conditions telles que le diabète gestationnel (DG), peut entrainer un métabolisme altéré à travers les générations. Ces mécanismes impliquent des changements héréditaires dans l'expression des gènes qui se produisent plutôt par le biais d'une régulation épigénétique altérée. Les études chez l’animal suggèrent que le stress nutritionnel affecte le développement de l'hypothalamus et prédispose la descendance à l'obésité. En effet, l'hypothalamus orchestre un ensemble complexe de processus pour réguler l'apport et la dépense énergétiques. Par conséquent, l'hyperphagie et la réduction de la satiété représentent des caractéristiques précoces chez les enfants sujets à l'obésité. Cependant, une analyse complète du profil épigénétique de l'hypothalamus dans le contexte du DG fait largement défaut jusqu'à présent. Ainsi, nous cherchons à mettre en évidence que le DG a un impact sur l'expression des gènes hypothalamiques par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène tout au long de la vie.
Bénéfices attendus
Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Nous supposons que le DG a un impact sur l'expression des gènes de l'hypothalamus par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène qui dure toute la vie. Les données récentes du laboratoire avec lequel nous collaborons pour ce projet suggèrent l'existence d'un nouveau code épigénétique qui pourrait jouer un rôle majeur dans la différenciation cellulaire et le développement de maladies. Ainsi, nous sommes convaincus que ce projet permettra de mieux comprendre l'impact de la suralimentation sur la prédisposition au diabète.
Procédures
168 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Par ailleurs, tous les animaux (336) seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le test de tolérance au glucose nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Parrallèlement, 4x 40μL de sang sont prélevés (durée 1min) à l'aide d'un capillaire pour mesurer l'insulinémie par le même site de prélèvement. Le test de sensibilité à l'insuline nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le traitement hormonal nécessite 2 injection IP ( durée 10 sec)
Impact sur les animaux
Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène, le traitement hormonal pour favoriser la reproduction et le test de tolérance au glucose peuvent créer un inconfort chez les souris. La sensibilité à l'insuline nécessite l'injection d'un bolus d'insuline qui peut entrainer une hypoglycémie chez la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leur tissus seront prélevés pour determiner le profil épigénétique.
Remplacement
La nature transitoire du diabète gestationnel (la maladie n'existe que pendant la grossesse), la rareté des échantillons de tissus humain post mortem, la cause du décès... etc rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. De plus, la disponibilité des échantillons humains est limitée au sang, au cordon ombilical. Pour ces raisons, les modèles animaux constituent une alternative indispensable pour étudier ces mécanismes.
Réduction
Nous utiliserons un total de 336 animaux. Le nombre d’animaux testé dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.
Raffinement
Les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Le recours aux analgésiques et anesthésiques sera systématique pour éviter toute souffrance ou douleur chez l'animal.
Choix des espèces
L'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, pancréas (ilots de Langerhans) , muscles, tissus adipeux, intestin, cerveau) . Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Le modèle murin ne peut donc pas être remplacé dans notre cas. De plus, la nature transitoire du DG et la rareté des échantillons de tissus en dehors du sang et du cordon ombilical rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. Les animaux seront soumis à une diète riche en gras dès l'âge de 5 semaines, âge idéal pour permettre une prise de poids suffisante.
Traitements ciblant EZH2 dans l’initiation et le développement de la leucémie aiguë promyélocytaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 170 individus étant classés en sévère. Elles reçoivent une irradiation sublétale aux rayons X, une greffe de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis des traitements par acide rétinoïque et épidrogues, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que la leucémie et les traitements peuvent entraîner perte de poids et dégradation de l'état, et fixe un point limite à 20 % de cellules leucémiques circulantes. Il reconnaît avoir déjà montré in vitro l'effet de l'association testée, mais affirme que le microenvironnement médullaire rend le modèle murin "nécessaire".
Objectifs
Une proportion rare de leucémies aiguës promyélocytaires (APL) présente un réarrangement chromosomique entraînant la juxtaposition des gènes RARA (récepteur de l’acide rétinoïque alpha) et PLZF (Promyelocytic leukaemia zinc finger protein), avec production d’une oncoprotéine hybride à l’origine du développement de la maladie. Dans ce cas particulier de fusion PLZF-RARA, le traitement conventionnel par l’acide rétinoïque (ATRA, qui permet une rémission dans les autres types d’APL) se heurte à une résistance des cellules leucémiques et une rechute chez les patients. Nos travaux précédents ont mis en évidence dans une lignée de leucémie myéloïde aiguë une nouvelle interaction au mécanisme original entre PLZF et EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2), un facteur responsable de la réduction d'activité de nombreux gènes. Or, l'implication d'EZH2 dans le développement d'hémopathies malignes a été mise en évidence dans de nombreuses études et EZH2 est une cible thérapeutique pour laquelle des inhibiteurs sont actuellement en développement. Nous souhaiterions donc nous intéresser au rôle de cette interaction entre PLZF et EZH2 dans l'initiation et le développement de l'APL exprimant la fusion PLZF-RARA. Nous avons obtenu des résultats préliminaires in vitro encourageants, montrant que l'inhibition d'EZH2 était associée à une moindre capacité de prolifération dans une lignée cellulaire exprimant PLZF-RARA. Nous souhaitons donc tester maintenant l’effet d'inhibiteurs d'EZH2 (épidrogues) sur le développement tumoral d'APL PLZF-RARA traitées à l'acide rétinoïque (ATRA, traitement conventionnel des APL), afin de déterminer si l'association d'une épidrogue au traitement conventionnel permet de contourner la résistance et de réduire la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet qu'il révèle de nouvelles pistes pour déterminer si l'association de différentes épidrogues au traitement classique par l'acide rétinoïque permet de contourner les résistances et de réduire la progression tumorale des APL.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation sub-léthale réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 2 minutes. La greffe de cellules leucémiques qui s'ensuit par injection intraveineuse est réalisée sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles l'injection des cellules, effectuée en quelques secondes, est réalisée. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par des injections intrapéritonéales nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation sub-léthale et une greffe de cellules leucémiques par injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par injections intrapéritonéales. Le développement de la maladie et les traitements étant susceptibles d’entraîner une perte de poids et une dégradation de leur état, les animaux seront soumis à une observation quotidienne et à des évaluations à l'aide de la grille de score, permettant de prévenir les effets délétères et gérer la douleur. Nous serons vigilants sur l’altération du bon fonctionnement des cellules sanguines de l'animal qui pourrait survenir du fait du développement de la leucémie, et notamment une possible baisse de l’hématocrite. C'est pourquoi nous réaliserons un suivi précoce et prédictif grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire de notre laboratoire, en quantifiant la proportion de cellules leucémiques dans le sang. Cette mesure nous permet, grâce à notre expérience de ce modèle, de fixer un point limite de 20% de cellules leucémiques circulantes afin de rester en-deçà de l'apparition d'une formule sanguine anormale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures, afin de prélever les moelles qui seront regreffées et utilisées pour réaliser les analyses moléculaires et cellulaires.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre les processus de régulation de l’hématopoïèse pathologique, l'hématopoîèse étant définie comme le processus de production de toutes les cellules sanguines dans la moelle osseuse. Cette régulation implique des mécanismes intrinsèques aux cellules, mais aussi une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux de la moelle osseuse (facteurs extrinsèques). Ces deux types de mécanismes sont entièrement imbriqués du fait d’un dialogue permanent entre les cellules hématopoïétiques et leur microenvironnement. Il est donc nécessaire de replacer la cellule dans son contexte et d’avoir recours aux modèles murins. Cependant, nous avons pu récemment utiliser des modèles in vitro pour montrer les effets bénéfiques de l’association d'une épidrogue avec l’acide rétinoïque sur les cellules leucémiques. Nous souhaitons donc tester l'hypothèse d'un bénéfice de cette association in vivo, aux doses recommandées dans la littérature.
Réduction
Bien que le recours aux modèles murins soit rendu nécessaire par l’existence reconnue de mécanismes de régulation des cellules hématopoïétiques par le microenvironnement, nous limiterons au maximum le nombre d'animaux. Pour cela, nous nous baserons sur les résultats obtenus in vitro afin d'optimiser les combinaisons de drogues à tester et nous utiliserons les techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre projet nécessitera 200 souris NSG, permettant d'évaluer l'action potentiellement bénéfique d'une association d'épidrogues au traitement conventionnel par l'ATRA. Le nombre d’animaux a été optimisé grâce à notre expérience du modèle : nous avons ajusté le nombre d'animaux au minimum requis pour l'obtention du nombre de cellules suffisantes pour réaliser les analyses moléculaires, et permettant également d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
Raffinement
Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment la détermination de la quantité de cellules leucémiques dans le sang par des mesures en cytométrie d'un rapporteur permettant de distinguer l'origine des cellules (celllules leucémiques PLZF-RARA ou cellules sanguines des souris NSG). Les prélèvements sont réalisés sous anesthésie gazeuse par du personnel compétent. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage.
Choix des espèces
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, notamment pathologique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, agées de 7 à 10 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures, et qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe des cellules leucémiques.