Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
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- Système urogénital
Facteurs impliqués dans la leucémogenèse B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
585 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules ou sont suivies dix à douze mois pour laisser survenir une leucémie qui se manifeste par des tumeurs palpables, pour analyser quatre facteurs de la leucémogenèse B. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements et prévoit une mise à mort avant que la tumeur ne dépasse une taille définie. Il affirme que ces processus ne peuvent être étudiés dans des lignées cellulaires et conclut que la génétique connue de la souris "impose" son choix.
Objectifs
Les cellules B jouent un rôle crucial dans notre système immunitaire grâce notamment à leur capacité à produire des anticorps. Dans certains contextes encore mal compris, de rares cellules B peuvent devenir cancéreuses. Ce processus pathologique peut survenir à différents stades du développement des cellules B. En général, la leucémie touche des cellules B aux stades précoces ou immatures de leur développement, alors que les lymphomes ou myélome ciblent des cellules B plus matures. Malgré d’intenses efforts et d’importantes avancées, les mécanismes et les facteurs qui déclenchent le processus tumoral à des stades déterminés du développement des cellules B et favorisent l’expansion des rares cellules cancéreuses initiales, ou au contraire leur blocage, restent obscurs. Ceci est en grande partie dû à l’absence de modèles animaux appropriés qui miment la situation chez l’Humain. Notre projet est à visée biomédicale et a pour objectif d’analyser le rôle de 4 facteurs, connus pour jouer un rôle important dans le développement des cellules B, dans la survenue de la leucémie. Ces 4 facteurs seront étudiés dans un modèle de leucémie chez la souris. Nos travaux relèvent de la recherche publique et sont réalisés au sein d'une unité mixte de recherche.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de 4 facteurs dans la prolifération tumorale, ou au contraire dans son inhibition, au cours de la leucémie B. A court et moyen termes, la réalisation du projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes en jeu lors de la prolifération tumorale. Mais au-delà de cet aspect fondamental, le projet a des implications pour la santé humaine dans la mesure où la leucémie B reste un problème de santé majeur, en particulier en raison des problèmes récurrents de rémission observés chez les patients, chez qui les conséquences sont souvent fatales. Cette étude devrait donc apporter une contribution originale et importante aux efforts déployés par différentes équipes pour la compréhension des mécanismes de la leucémogenèse en particulier et des différents cancers touchant les cellules B en général (lymphome, myélome, etc). A plus long terme, les résultats obtenus devraient ouvrir la voie à des approches thérapeutiques, notamment par des criblages pharmacologiques et des essais d’immunothérapie, ciblant les facteurs qui se révéleront les plus prometteurs.
Procédures
Dans une procédure, les souris subiront une injection de cellules et d’un suivi de la survenue de la leucémie. A la fin de la procédure, les souris seront mises à mort et certains de leurs organes prélevés pour analyse. Dans une deuxième procédure, aucune intervention n’est prévue. Les souris seront suivies pendant 10-12 mois pour vérifier la survenue de la leucémie, qui se manifeste par l’apparition de tumeurs d’abord palpables à la main lors des examens réguliers, puis visibles à l’œil nu. A la fin de la procédure, les souris seront euthanasiées et certains de leurs organes prélevés pour analyse.
Impact sur les animaux
Deux types de nuisance ou d’effets indésirables sont attendus dans le cas du protocole rapide : l’injection intraveineuse est relativement douloureuse pour les souris. L’injection se fera au niveau des queues des souris. Les souris seront d’abord mises sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). Une anesthésie locale sera en plus réalisée en appliquant une pommade sur la zone de piqure. Par ailleurs, en cas de survenue de leucémie, l’apparition de tumeurs peut gêner le mouvement des souris (voir point 3 : Raffinement). Dans le protocole standard, aucune injection n’est prévue et les nuisances ou effets indésirables sont ceux liés à l’apparition des tumeurs, i.e., mobilité réduite. Dans tous les cas, nous adopterons en plus des critères généraux d’arrêt par rapport à la souffrance (arrêt d’alimentation, amaigrissement, poil hérissé, prostration durable) un critère lié à la taille de la tumeur (< 5 mm). Avant ce point limite, les souris seront mises à mort pour analyse.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse.
Remplacement
La nature des travaux que nous menons, et qui concernent la physio-pathologie du développement des cellules B, impose le choix de la souris dans la mesure où sa génétique est bien connue. En effet, les processus développementaux que nous étudions ne peuvent être abordés dans leur complexité physio-pathologique (développement, interactions avec d’autres molécules et cellules, vieillissement, etc) dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro. Néanmoins, aussi souvent que possible, dans le respect du principe de remplacement, nous utilisons des lignées cellulaires ou d’autres systèmes de culture cellulaire. Enfin, notre démarche inclut également la responsabilisation de tous les membres de l’équipe amenés à faire de l’expérimentation animale grâce notamment à des formations spécifiques et au strict respect des règles en vigueur.
Réduction
Dans toute notre démarche, de l’hébergement des souris à l’expérimentation, nous nous faisons un devoir de respecter la règle des 3R (Réduction, Remplacement, Raffinement). En étroite interaction avec les animalier(e)s, le nombre des souris est réduit au strict nécessaire permettant de réaliser nos expériences en tenant compte de la reproductibilité et de la significativité statistique. Ci-dessous, nous présentons le nombre de souris prévues dans les 2 cas de figures : 1) succès du protocole rapide, 2) échec du protocole rapide, impliquant le recours au protocole standard. A noter que les nombres totaux de souris sont donnés pour la durée globale du projet. En pratique, les expériences seront échelonnées dans le temps et conditionnées par les résultats de l’étude pilote. 1. Succès du protocole rapide : Dans un premier temps, nous procèderons à une étude pilote dans laquelle nous nous focaliserons sur un seul facteur (sur la base des données de la littérature). Nous utiliserons donc 3 lignées de souris : une pouvant développer à terme la leucémie, une correspond au facteur cible (et contrôle négatif), et une qui permettra l’étude de l’effet du facteur étudié sur la survenue de la leucémie (amplification ou inhibition) (45 souris au total). En cas de succès de l’étude pilote, l’étude défintive, réalisée une fois, sera étendue aux 4 facteurs. Dans ce cas le nombre de souris prévu (incluant tous les contrôles) est de 540 souris. 2. échec du protocole rapide : En cas d’échec de l’étude pilote, nous adopterons une procédure consistant en un suivi à long terme des lignées. Dans ce cas, le nombre total de souris est de 360 souris, dont la moitié sera hébérgée en zone stérile et l’autre moitié en quarantaine.
Raffinement
Le raffinement inclut d’un côté les conditions d’élevage et d’hébergement qui sont optimisées par les animalier(e)s (nombre de souris ne dépassant pas 5/cage, inclusion de différents objets dans les cages, nourriture au sol en cas de mobilité réduite, etc), et d’un autre côté le choix des méthodologies induisant le moins de souffrance. Notre souci premier dans ce contexte est la prévention de souffrances inutiles, incluant notamment l’observation régulière tous les 2 jours, grille de scoring (établie par la SBEA, structure du bien-être animal), respect des nouvelles règlementations mises en place, etc. Pour ce qui est de la grille de scoring, elle est basée sur 3 critères majeurs : I. Aspect (état corporel, état du pelage et de la peau, écoulement, yeux, bouche) II. Fonctions corporelles (surtout respiration) III. Comportement (interaction sociale, posture et mobilité, comportements indésirables) La grille comporte une échelle de 0 à 3 à renseigner pour chaque souris à chaque observation : 0 (normal), 1 (légère altération), 2 (altération forte), 3 (altération très forte). Le score final se décline comme suit : Score total de 0-3: Normal Score total de 4-7: Observer attentivement, envisager l'utilisation d'un antalgique Score total de 8-11: Souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement. Demander un 2ème avis. Considérer l'euthanasie Score total de 12-15: Souffrance sévère. Fin de la procèdure par l'euthanasie de l'animal (sachant que la procédure est impérativement arrêtée lorque le total de point atteint 12).
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle d'étude est justifié à plusieurs titres : 1) sa génétique est bien connue permettant une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu, 4) son ontogénie est bien connue de sorte que les lymphocytes B peuvent être prélevés à des stades précis du développement, 5) il existe une grande panoplie d'anticorps spécifiques et de banques de séquences très utiles à nos travaux et projets.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
184 souris vont être utilisées, 120 tuées à l'issue et 64 réutilisées ou écartées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par un régime riche en graisses, elles subissent des gavages quotidiens pendant quatre semaines et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec coupure de la queue et injections, pour évaluer des bactéries et un métabolite comme futur complément alimentaire. Le porteur indique un stress lié à l'isolement en cage individuelle et aux contentions répétées, et fixe une perte de poids de 20 % comme point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de souches bactériennes commensales du groupe Streptococcus salivarius inactivées par la chaleur, et d’un métabolite dérivé de la sérine (sécrété par les bactéries et les plantes) dans un modèle murin de prédiabète (définit pas une glycémie à jeun > 1.26g/L) induit par un régime riche en graisse. L’objectif de notre projet est de déterminer les mécanismes par lesquels ces souches bactériennes naturellement présentes dans l’intestin et ce métabolite exercent cet effet anti-hyperglycémiant dans un modèle de souris pré-diabètique . Le prédiabète désigne une glycémie, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang, plus élevée que la normale. Il est réversible s’il est traité avant son évolution vers le diabète qui lui est un état irréversible. Pour ce faire, plusieurs souches bactériennes ainsi que ce métabolite dérivé de la sérine seront administrées à un modèle de souris rendues prédiabétiques via un régime riche en graisse.
Bénéfices attendus
L’objectif final de ces recherches est de déterminer si les bactéries commensales étudiées et le métabolite bactérien dérivé de la sérine permettent la réversion du prédiabète c’est à dire de réduire l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance induites par des régimes déséquilibrés. Si tel est le cas, ceux-ci pourraient servir de traitements pour prévenir le développement du diabète de type 2 chez l’homme. En effet, ce projet de maturation vise à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir des bactéries et/ou de ce métabolite.
Procédures
Les animaux seront soumis à une contention régulière nécessaire lors des gavages quotidiens (quelques secondes) sur une période de 4 semaines et au cours des tests de tolérance au glucose et de tolérance à l’insuline. Pour ces deux tests (réalisés deux fois sur chaque animaux) les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes) et à une piqûre (5 secondes) lors de l’injection de l’insuline en intrapéritonéal . Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure 2 avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure et à un stress au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des prélèvements et des injections quotidiens sur une période de 4 semaines D’après les résultats préliminaires du laboratoire, le gavage des souris avec ces différents composés tests, n’induit pas de perte de poids ni d’effets négatifs sur les souris. La prise de poids associée au régime riche en graisses et la période de jeune necessaire au test de tolérance oral au glucose (OGTT) et au test de tolérance à l'insuline (ITT) génèreront des stress faibles à modérés.
Devenir
En procédure 1 environ 64 souris non répondeuses au régime seront euthanasiées ou mutualisées et 120 souris seront utilisées pour la procédure 2. A la fin de la procédure 2 les 120 souris seront euthanasiées pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus endocrines (stimulation de la sécrétion d’insuline) et intestinaux (tissus producteurs d’incrétine) ainsi que des organes impliqués dans la régulation de cette homéostasie glucidique (foie et muscle).
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que ce nombre est nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés deux fois par semaine (surveillance visuelle) au moment de la mesure du poids et le prise alimenaire mesurée (par pesée de l’aliment) une fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de trois jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie . Au moment du test de tolérance oral au glucose (OGTT) et du test de tolérance à l'insuline (ITT), les animaux seront placés dans la salle d’expérimentation (differente de celle d’élevage) 1h avant le test afin de limiter le stress dû à un environnement nouveau.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et ce travail fait suite à des travaux conduits depuis 2018 sur ce modèle. Nous avons choisi de travailler sur des animauxde 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.
Validation d’un nouvel outil diagnostic et thérapeutique pour le traitement des microthromboses dans l’accident vasculaire cérébral ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Elles subissent trois modèles d'accident vasculaire cérébral ischémique puis un suivi par IRM, pour tester un agent de contraste censé diagnostiquer et traiter les microcaillots. Le porteur indique que ces modèles peuvent provoquer des douleurs postopératoires, des déficits moteurs et cognitifs et une perte de poids, les souris perdant plus de 20 % de leur poids ou dépassant un score de douleur défini étant alors tuées. Il répète que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.
Objectifs
L’enjeu de ce projet est d’améliorer la prise en charge des microthrombi (petits caillots sanguins) résiduels dans les accidents vasculaires cérébraux (AVC) de type ischémique. Pour cela, nous avons développé un nouvel agent de contraste (PHySIOMICS). Ce dernier, peut être combiné à différentes molécules et semble doté de propriétés anti-inflammatoires. Ainsi, dans un premier temps, nous combinerons cet agent de contraste à des molécules favorisant la thrombolyse des thrombi (par exemple l’activateur tissulaire du plasminogène). Ensuite, nous évaluerons l’effet des PHySIOMICS sur la réponse inflammatoire associée dans le parenchyme cérébral. Nous développerons ainsi un outil théranostique qui vectorisera un traitement thérapeutique spécifiquement au niveau des microthrombi tout en assurant leur diagnostic. L’IRM moléculaire permettra de suivre l’apport thérapeutique des PHySIOMICS couplés ou non sur le traitement des microthrombi chez la souris.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic et le traitement des AVC chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un potentiel traitement ischémique et inflammatoire ainsi que la caractérisation de l'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 modèles d'AVC ischémique différents, le modèle thrombine d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 1); le modèle chlorure de fer (application d'une compresse imbibée de chlorure de fer sur l'artère cérébrale moyenne permettant la formation d'un caillot) d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 2); le modèle sténoses en tandem : c'est à dire la formation de plaques d'athérome au niveau de l'artère carotide commune puis les faire migrer au niveau du parenchyme pour une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 3) et 1 modèle de neuro-inflammation d'une durée moyenne de 20 minutes (cf procédure 4). Tous les animaux auront un suivi à l'IRM d'une durée moyenne de 45 minutes à J0 (après avoir induit un AVC ischémique (procédure 1 à 3) ou une neuroinflammation (procédure 4)) et un second suivi allant de 6h à 7 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : *Pour le modèle thrombine (cf procédure 1): - perte de poids - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Pour le modèle chlorure de fer (cf procédure 2): - perte de poids - douleurs post opératoires - stress – déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle de sténose en tandem (cf procédure 3): - diabète – douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle de neuroinflammation (cf procédure 4) : - diabète - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le suivi à l'IRM : -stress. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observations des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
Les animaux issus des procédures d'AVC ishcémique et de neuroinflammation seront mis à mort par perfusion intra-cardiaque afin de prélever les organes.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine grave touchant une part importante de la population. De plus, les méthodes in vitro de ce projet aident à la réduction du nombre d’animaux. La technique des microfluidiques nous permettra l’étude de la fixation des PHySIOMICS couplés au TPA et/ou la NAC aux caillots et de visualiser leur dégradation. Ainsi l’efficacité de ce couplage sera déjà évaluée et validée avant d’avoir recours aux animaux limitant ainsi leurs nombres.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquations avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur le modèle.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permet de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée par rapport au poids initial et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel utilisé dans cette procédure expérimentale est neuf (pour les consommables, comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyé et désinfecté pour les réutilisables (pinces métalliques).
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'inflammation cérébrale. Le stade de développement des animaux est de 8 semaines pour les souris des procédures 1; 2 et 4 pour un poids compris entre 35 et 40g. Ce choix a été fait fait suivant les données de la litérrature employant les mêmes modèles expérimentaux. Enfin, pour la procédure 3, le modèle d'AVC ischémique sténose en tandem sera réalisé sur des souris de 12 semaines car il est nécessaire d'induire un régime de "high-fat diet" pendant 6 semaines (après sevrage qui est à 6 seamines) afin d'obtenir des animaux diabétiques.
Caractérisation des effets de l’invalidation spécifique dans le foie ou l’intestin du récepteur PXR sur le phénotype métabolique des souris mâles et femelles nourries avec un régime standard ou riche en gras et en sucres
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles sont soumises à un régime riche en gras et en sucres, à des prélèvements sanguins répétés à la queue puis terminaux à l'œil, et pour les femelles à une ovariectomie et à la pose d'un implant d'estrogènes, pour étudier le rôle du récepteur PXR dans la résistance à l'obésité. Le porteur décrit des effets modérés et transitoires liés aux chirurgies, aux jeûnes et aux gavages. Il affirme que les mécanismes en jeu sont trop multifactoriels pour être reproduits en culture cellulaire ou in silico.
Objectifs
L’obésité et les maladies métaboliques associées comme le diabète de type 2 sont en pleine expansion et il est important d’en comprendre les mécanismes pour proposer des solutions thérapeutiques efficaces. L’obésité entraîne des modifications du fonctionnement du foie et de l’intestin. Ces 2 organes qui communiquent activement sont essentiels à la bonne santé de l’organisme, par exemple pour s’opposer à l’accumulation des lipides dans le foie (maladie du foie gras ou stéatose hépatique) et maintenir un bon équilibre de la flore intestinale. Il a été montré que le récepteur PXR essentiellement produit par le foie et l’intestin jouait un rôle important. En effet, si des souris sont soumises à une diète riche en sucres et en gras alors elles prennent du poids, le foie accumule des lipides (stéatose) et la flore intestinale est déséquilibrée entraînant une inflammation. En revanche, si les souris n’expriment plus PXR dans aucun tissu (manipulation génétique) et qu’elles sont nourries avec une nourriture riche en gras et en sucres, elles ne prennent pas de poids, le foie n’est pas stéatosé et il n’y a pas d’inflammation intestinale. On parle de résistance à l’obésité qui est observée chez les mâles davantage que chez les femelles, suggérant un effet dépendant des estrogènes. L’objectif original est de comprendre les mécanismes reliant l’expression de PXR dans le foie et l’intestin et la résistance à l’obésité chez les mâles et les femelles. Les modalités techniques reposent sur des études de chirurgie et de nutrition pour étudier l'expression des gènes. Un total maximal de 384 souris sera utilisé sur 5 ans. Chaque souris sera suivie individuellement afin de collecter un maximum de données biologiques et limiter la quantité totale de souris pour l’obtention de données statistiques fiables et interprétables.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de PXR présent dans les hépatocytes (foie) et les cellules intestinales dans l'observation de la résistance à l’obésité chez les souris présentant une absence complète d’expression de PXR et le rôle des estrogènes de par la réalisation à la fois de l’ovariectomie bilatérale et de la supplémentation en estradiol. Les analyses d’expression de gènes sur les tissus métaboliques d’intérêt (foie, intestin, tissu adipeux) viseront à comprendre les mécanismes de compensation et les cibles. En effet, le foie et l’intestin expriment de nombreux récepteurs dont certains ont des fonctions qui se recoupent et l’absence de PXR pourrait être compensée par une expression plus importante d’autres récepteurs et ceci pourrait être différent selon les sexes. Ce travail pourra déboucher sur la réalisation d’autres projets impliquant une exposition à des polluants alimentaires puisque PXR outre sa fonction dans les mécanismes pouvant entraîner une obésité est également impliqué dans l'assimilation des médicaments et des polluants alimentaires.
Procédures
Dans les 3 procédures, les interventions sont nutritionnelles (exposition à un régime riche en gras et en sucres). Dans les 3 procédures, les interventions incluent des prélèvements sur des animaux vigiles après mise à jeun de 6 heures. Il s’agit de prélèvements de sang à la queue afin de suivre l’état métabolique de la souris comme le taux de sucre dans le sang ou des lipides en réponse à une injection soit de glucose (sucre) "ou d’insuline" (modification avril 2022), ou en réponse à un gavage d’huile. Les tests métaboliques sont espacés d’une semaine. La durée totale des tests est de 90 minutes avec 5 prélèvements pour les mesures de sucre dans le sang et de 4h avec 4 prélèvements pour le dosage des lipides. Les interventions incluent également le prélèvement terminal de sang à l’œil (après dépôt d’un analgésique). Chaque prélèvement en lui-même ne dure que quelques secondes. Les interventions sont également chirurgicales dans les 2éme et 3éme procédures qui ne concernent que les femelles. Il y a anesthésie profonde puis ovariectomie (les ovaires sont enlevés) ou pseudo-opération (l’animal est ouvert mais les ovaires ne sont pas enlevés) ; puis réalisation de 4 points de suture par souris. L’opération de l’animal anesthésié est de moins de 5 minutes. Dans la procédure 3, 3 semaines après l’ovariectomie, les femelles sont à nouveau anesthésiées pour la pose d’un implant contenant des estrogènes ou de l’huile. Ces implants sont glissés sous la peau (petite incision au niveau du coup entre les épaules) après anesthésie profonde. L’intervention avec les 2 points de suture à la fin dure moins de 5 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont de classe modérée. Ils sont transitoires. Il peut s'agir d'un inconfort transitoire en suite des actes de chirurgie (ouverture du flanc, suture des plans musculaires et cutanés) jusqu'à cicatrisation. Il peut s'agir de la mise à jeun ( limitée à 6h) n'ayant pas de conséquence sur l'état général. Cela peut aussi concerner les gavages (contention maitrisée), les injections intra-péritonéales de glucose "ou d'insuline" (modification avril 2022) et l'incision très fine au niveau de la queue (pour récupération limitée de sang).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort après anesthésie.
Remplacement
Le travail sur l’animal permet de démontrer un effet causal, direct ou indirect, de la non-expression de PXR et de l’interaction avec l’alimentation hypercalorique sur les paramètres métaboliques étudiés. De plus, ce projet s’intéresse à la dépendance des effets avec le sexe en comparant mâles et femelles. En conséquence, ce projet implique trop de mécanismes susceptibles d’interagir en même temps, les conséquences sont multifactorielles et ne peuvent donc pas être remplacées par des cultures cellulaires ou in silico.
Réduction
Le projet est original au sens où il n’a encore jamais été mené. Le nombre de souris est calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximale. Dans chaque procédure en lien avec l’obtention à la fois de souris sauvages et invalidées spécifiquement pour PXR dans le foie ou l’intestin, les études sont réalisées avec un nombre minimal de 6 souris et maximal de 12 souris par groupe. Plusieurs considérations sont sous-jacentes. (1) L’utilisation à la fois des mâles et des femelles élimine la phase de mise à mort des femelles. Il n’y a pas en effet de modification du sex-ratio à la naissance pour ces lignées. (2) il est impossible de travailler correctement avec plus de 48 animaux en parallèle que ce soit pour la réalisation des tests métaboliques ou la mise à mort et les prélèvements post-mortem. Les animaux étant mis à jeun 6 h avant la mise à mort, un nombre maximal de 12 souris peuvent être mis à mort et disséqués par après-midi. (3) Si les observations sont statistiquement significatives avec un n=6, alors seulement 6 souris par groupe expérimental seront utilisées. Enfin, les procédures qui ne requièrent que des femelles seront développées autant que faire se peut en même temps que les procédures développées au laboratoire sur les souris mâles de ces mêmes lignées afin d’éviter les reproductions inutiles de ces souris.
Raffinement
Pour la réalisation des tests métaboliques qui nécessitent soit une incision à la queue pour la mesure de la glycémie, une injection de glucose, dinsuline ou un gavage de lipides, les points limites concernent la possibilité d'un stress/anxiété ou douleur liés au geste. Ils sont limités car pratiqués par du personnel compétent. De plus, les animaux sont mis dans une cage et les tests sont réalisés dans une pièce calme. "Lors de la réalisation du test de sensibilité à l’insuline, il peut arriver qu’une souris soit en hypoglycémie (baisse trop importante du taux de sucre dans le sang). Dans ces conditions, une injection de glucose est immédiatement réalisée et la souris est installée sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie (froid)." (modification avril 2022). Pour les opérations chirurgicales, les opérations se font le matin, pour démarrer une surveillance en début d’après-midi. L’anesthésie est profonde. Les 2 flancs sont rasés sur une petite surface pour éviter l’introduction de poils dans la plaie puis désinfectés. Après l’enlèvement des ovaires, la fermeture des plans musculaire puis cutané sont refermés l’un après l’autre à l’aide d’un fil résorbable (4 points au total). Pour les maintenir au chaud jusqu’à leur réveil, les souris seront déposées à raison de 3 à 4 souris par cage avec de la sciure propre, sur des carrés de coton préalablement stérilisés et recouvertes d’autres carrés de coton.
Choix des espèces
La physiologie de la souris est « proche » de celle de l’homme. Le projet vise à étudier le rôle de PXR en particulier dans le foie et l’intestin. La génération de souris n’exprimant pas PXR dans le foie ou l’intestin est donc le modèle optimal pour répondre à l’objectif. Ces souris sont de fond génétique C57Bl6J qui est propice à l’étude de l’obésité (prise de poids, diabète, désordres métaboliques, stéatose hépatique) qui mime la mise en place et le développement des désordres métaboliques chez l’homme dans sa globalité. Les animaux utilisés sont juvéniles de sorte à étudier le développement jusqu'au stade adulte.
Création de lignées transgéniques murines pour des gènes impliqués dans l’infertilité humaine
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
960 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 90 réutilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les femelles reçoivent des stimulations hormonales puis sont tuées pour prélever leurs ovocytes, les mâles subissent une vasectomie chirurgicale et les femelles pseudo-gestantes une réimplantation embryonnaire, pour créer des lignées reproduisant des mutations liées à l'infertilité humaine. Le porteur indique que la préhension, les chirurgies et la mise à mort génèrent du stress et que les lignées au phénotype dommageable seront euthanasiées. Il affirme qu'aucune culture in vitro ne permet d'obtenir des gamètes matures et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L'infertilité touche 186 millions de personnes dans le monde (48 millions de couple) et représente donc un problème de santé majeur. Cette infertilité peut etre causée par une déficience au niveau des gamètes aussi bien chez l'homme que chez la femme. Trouver les gènes causals impliqués dans cette infertilité est donc une nécessité afin de pouvoir mieux comprendre leurs mécanismes d'action et proposer des thérapies. L'étude de cohortes de patient(e)s infertiles permet de pointer des gènes potentiellements impliqués. L'objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes ou reproduisant les mutations identifées afin de valider les gènes candidats.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de générer des souris déficientes pour les gènes identifiés par séquencage exomique des cohortes de patient(e)s infertiles et donc de valider les gènes candidats. A court terme, les gènes pourront être utilisés comme facteurs diagnostiques. A plus long terme, selon le phénotype occassionné, une thérapie ciblée pourra être proposée au patient.
Procédures
Injection pour les stimulations hormonales (2 par souris femelles). Chirurgie sur les males pour la vasectomisation (30 minutes par souris, une chirurgie par souris). Chirurgie pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes (20 minutes par souris, 1 par souris).
Impact sur les animaux
Stress au moment de la préhension pour les injections et pour la mise à mort. Stress engendré par la chirurgie, meme si réalisée sous analgésie et anesthésie. Les males vasectomisés et les femelles réimplantées pourront perdre du poids et une inflammation pourra apparaitre au niveau de la plaie.
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons soit d'euthanasier la lignée.
Remplacement
L'étude de la fertilité nécessite l'utilisation d'animaux reproduisant les phénotypes observés chez l'homme. Il est donc compliqué de les remplacer. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male).
Réduction
Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an.
Raffinement
Les souris seront placées en conditions de température régulée, nourriture et eau ad libitum. Les animaux seront maintenus le moins de temps possible afin d'injecter les hormones nécessaires à la stimulation ovarienne et aux injections d'analgésiant/anesthésiant. La mise à mort des animaux sera effectuée dans une pièce différente de celle de l'hébergement. La chirurgie des mâles est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les femelles ont leurs ovocytes prélevés après euthanasie. Suite à la chirurgie, en cas d'inflammation de la plaie, un traitement antibiotique sera mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour générer des animaux transgéniques. Les souris femelles seront utilisées dès 3 semaines pré-puberts et pas au delà de 12 semaines pour la récupération d'ovocytes. En effet, après 12 semaines, les souris répondent moins bien à la stimuation hormonale et le nombre d'ovocytes récoltés décroit. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines.
Etude de l’intérêt de la greffe de cellules cardiaques produites in vitro et issues de cellules souches humaines chez un modèle porcin d’insuffisance cardiaque.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
22 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures pour provoquer un trouble du rythme et implanter un pacemaker, puis une greffe de cellules cardiaques issues de cellules souches humaines, avant un mois de surveillance. Le porteur indique que les tirs de radiofréquence ou un dysfonctionnement du pacemaker peuvent tuer l'animal en cours de procédure. Il reconnaît que les organoïdes permettent des études in vitro mais conclut que ce système ne sera jamais aussi représentatif que le modèle porcin.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde. Elles se manifestent par un dysfonctionnement du cœur au niveau circulatoire mais aussi au niveau électrique. Notre projet porte sur le dysfonctionnement du noeud sino-atrial (NSA - ensemble de cellules dans l'oreillette droite) qui est le principal stimulateur cardiaque qui contrôle la fréquence cardiaque tout au long de la vie. Son mauvais fonctionnement en raison d'une maladie congénitale ou du vieillissement, entraîne un ralentissement de la fréquence cardiaque et une circulation sanguine inefficace, ce qui nécessite un traitement par l'implantation d'un stimulateur cardiaque électronique. Or ces équipements présentent plusieurs inconvénients, notamment un risque d'infection, une durée de vie de batterie limitée et l'incapacité de s'adapter aux changements de taille du cœur chez les patients. Notre laboratoire a développé ces dernières années une technique capable de générer des cellules cardiaques contractiles in vitro (appelées hiPSC-CMs), dérivées de cellules de patients, et qui pourraient offrir une thérapie alternative de stimulateur biologique dans laquelle le NSA défaillant serait remplacé par greffe cellulaire. Dans ce contexte, nous souhaitons étudier l’impact d'une telle greffe chez un modèle porcin souffrant de troubles du rythme cardiaque.
Bénéfices attendus
Le dysfonctionnement du NSA est fréquent et considéré comme facteur de risque cardio-vasculaire. Il engendre des frais d’hospitalisation majeurs pouvant être réduits par une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques liés au traitement (ici un pacemaker biologique). Si la greffe de cellules souches permettait la reprise de l’activité cardiaque, cela offrirait une opportunité exceptionnelle d'étudier le développement et la fonction d'un pacemaker cardiaque humain, de modéliser des maladies qui affectent cette sous-population de cellules cardiaques et de concevoir la médecine régénératrice pour les patients souffrant d'insuffisance cardiaque.
Procédures
Au cours de cette procédure, les animaux subiront une chirurgie de deux heures maximum pour induire un trouble cardiaque et implanter un pacemaker. Une semaine après la pose du pacemaker, ils bénéficieront d'une greffe de cardiomyocytes et seront surveillés quotidiennement pendant un mois. A la fin de la procédure, ils seront mis à mort et des tissus seront prélevés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour l'animal sont plus liées au modèle lui même qu'à la présence d'une douleur pour laquelle les procédures de prise en charge sont bien maîtrisées (injection d'un morphinique au cours de l'intervention, administration post-opératoire d'anti-douleurs et anti-inflammatoires). En effet, la création de ce modèle pourrait entraîner la mort de l'animal à plusieurs moments : soit en cours d'intervention à cause des tirs de radiofréquence avant la pose du pacemaker, cette situation n'est pas anticipable et sera dépendante des individus ; soit pendant la phase de surveillance des animaux, ce qui pourrait être lié à un dysfonctionnement du pacemaker. Un rejet de greffe est envisageable mais au vu de la petite quantité et du lieu d'injection des cellules, nous nous attendons à une réaction inflammatoire locale sans effet sur l'état général de l'animal. Au cours des phases de surveillance, et au delà des soins apportés pour une bonne cicatrisation suite à l'opération, la surveillance des animaux sera très rigoureuse, notamment par l'évaluation quotidienne du comportement de l'animal et de son état de conscience évalué par une grille de score.
Devenir
Tous les animaux seront mis en mort en fin de procédure pour réaliser des prélèvements tissulaires.
Remplacement
Le but de l'étude sera d'approcher au maximum du modèle humain en déterminant les conditions de greffe d’un pacemaker biologique issus d'organoïde de hiPSC-CMs, permettant à l'avenir de remplacer les pacemakers électroniques. Bien que les organoïdes représentent une avancée significative pour la recherche en permettant de réaliser des études in vitro pour comprendre la toxicité et l’action d’une molécule pharmacologique, ou pour mieux comprendre la complexité du vivant, ce système ne pourra jamais être aussi complet et représentatif que le modèle animal. C'est pourquoi, malgré notre volonté permanente de respecter les 3Rs, nous avons choisi de poursuivre nos recherches sur le modèle porcin. Sa taille, son anatomie et les exigences requises pour la réalisation du protocole en font le modèle expérimental le plus pertinent pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum, défini sur les données d'une étude précédente, ainsi que sur une évaluation statistique permettant de calculer le nombre nécessaire pour obtenir une différence significative entre plusieurs groupes. La reprise de l’activité cardiaque suite à une ablation du nœud auriculo-ventriculaire sera étudiée dans le temps par un test satistique.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les gestes interventionnels (ablation par radiofréquence, implantation du pacemaker, greffe, exploration terminale) seront toujours réalisés sous anesthésie générale associée à la gestion de la douleur per-opératoire et post-opératoire par l'administration d'anti-inflammatoires. La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille. De même la mise à mort sera réalisée en fin de procédure alors que les animaux sont anesthésiés. Pendant la phase post-opératoire immédiate, une grille d'évaluation sera utilisée pour s'assurer du bon réveil de l'animal. Pendant la période de surveillance, notre vigilance sera accrue. Une grille de score sera utilisée pour évaluer l'état clinique des animaux, portant sur des critères d'absence d'infection ou d'hématome, sur des points généraux de comportement et des signes d'inconfort ou de douleur, et sur l'état de conscience de l'animal en lien direct avec le modèle. Cette grille aidera à la prise de décision en cas d'atteinte des points limites.
Choix des espèces
L'objectif de l'étude est d’évaluer la réponse à une thérapeutique (greffe de pacemaker biologique issu de cellules souches) sur un modèle le plus proche possible de l’humain. Le modèle porcin, de par sa taille et les exigences requises pour la réalisation du protocole, est le modèle expérimental le plus pertinent pour cette étude. Ce modèle de porc anesthésié, intubé et ventilé devrait permettre d'obtenir des résultats histologiques cardiaques, après euthanasie, extrapolables au patient de cardiologie ou de médecine de ville. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois environ, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 30 et 35 kg) et pour des raisons de coût d'autre part.
Bacteroides fragilis : un probiotique de nouvelle génération pour lutter contre Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
405 poussins vont être utilisés, tous tués entre le 6e et le 34e jour pour prélever leurs caeca, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie orale une souche de Salmonella puis un probiotique administré jusqu'à quinze fois sur 34 jours, pour tester une stratégie de réduction de la contamination dans la filière du poulet de chair. Le porteur indique que l'infection reste souvent asymptomatique mais que les inoculations répétées peuvent stresser les animaux. Il présente le projet comme une réponse aux attentes des industriels de l'alimentation animale et qualifie la validation in vivo de "nécessaire" après les essais in vitro.
Objectifs
La salmonellose, représente la deuxième cause d’infection humaine d’origine alimentaire en Europe. Cette infection, est une maladie qui peut être transmise à l’Homme tout au long de la chaine alimentaire, mais plus généralement par le biais d'aliments d'origine animale contaminés. Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. L’objectif principal de ce projet est de réduire la présence de Salmonella, prédominante dans cette filière par l’ajout d’un probiotique comme source de molécules bioactives. Par ailleurs, au cours d’un précédent travail, l’inhibition du passage de la barrière intestinale de différents sérotypes de Salmonella (S. Typhimurium, S. Senftenberg), a été mis en évidence in vitro. Cet essai permettra de valider les effets bénéfiques obtenus in vitro, en vérifiant en animalerie expérimentale l’effet inhibiteur sur Salmonella de B. fragilis. La réduction du portage de Salmonella sera mesurée au niveau intestinal, au sein des caeca, de sa diffusion dans le sang et par la réponse immunitaire. L’impact de B. fragilis sur le microbiote digestif en présence de Salmonella sera également considéré. Développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage permettra de réduire la charge qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des industriels de l’alimentation animale et des différents acteurs de la filière avicole dont la priorité est d’assurer l’innocuité de leurs produits auprès des consommateurs.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de valider les effets bénéfiques du probiotique B. fragilis observés in vitro sur la colonisation de Salmonella. Ces données sont nécessaires pour l’acquisition de connaissance, et pour le développement d’une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage. Cela permettrait de limiter à terme, l’usage d’antibiotiques en cas de salmonelloses animales, de réduire la charge bactérienne qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des industriels de l’alimentation animale et des différents acteurs de la filière avicole dont la priorité est d’assurer l’innocuité de leurs produits auprès des consommateurs. Par ailleurs, cette étude nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo dans l'objectif de réduire le recours à l’expérimentation animale lors de futures études.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation par voie orale de Salmonella spp. et du probiotique B. fragilis. Les prélèvements de caeca et de sang auront lieu après mises à mort des animaux (J6, J13, J20, J27 et J34). Dès la mise en place (J0), 400 poussins tout venant de 1 jour de l’espèce Gallus gallus de souche commerciale de chair (type ROSS PM3), seront inoculés par voie orale avec 100 µL de B. fragilis pour le Lot 1, Lot 4 et Lot 7, et 100 µL de Tryptone Sel pour le Lot 2, Lot 3, Lot 5, Lot 6 et Lot 8. L’inoculation par voie orale, à la pipette, (d’une durée maximale d’une minute par animal) sera réalisée au maximum tous les 2 jours (hors week-end) sur une période de 34 jours, pour un maximum de 15 inoculations. A J0, il y aura aussi une mise à mort de 5 poussins pour prélèvements de vésicules vitellines afin de vérifier le statut indemne des animaux en Salmonella. Le lendemain de la mise en place (à J1), tous les animaux seront pesés et les poussins inoculés recevront 100 µL de la suspension de Salmonella adequate (S. Typhimurium ou S. Senftenberg) par voie orale à la pipette, à une dose de 10^5 UFC/ml (Lot 3, Lot 4, Lot 5, Lot 6, Lot 7 et Lot 8) et 100 µL de Tryptone Sel pour le Lot 1 et Lot 2. A partir de J2 jusqu’au J20 le Lot 1, Lot 4 et Lot 7 recevrons 100 µL de B. fragilis tous les deux jours, tandis que le Lot 2, Lot 3, Lot 5, Lot 6 et Lot 8 recevront 100 µL de Tryptone Sel. A J20 le Lot 1, Lot 2, Lot 4, Lot 5, Lot 7 et Lot 8 recevrons 100 µL de B. fragilis tous les deux jours, tandis que les Lot 3 et Lot 6 recevront 100 µL de Tryptone Sel.
Impact sur les animaux
Les infections à Salmonella chez les volailles passent généralement inaperçues. Principalement asymptomatiques, elles peuvent provoquer parfois une réduction des performances de ponte chez les poules, une perte d’appétit, de la prostration et des diarrhées liquides. Les salmonelles se multiplient dans le tube digestif des oiseaux et peuvent être excrétées en grande quantité dans les déjections. Toutefois, les souches de S. Typhimurium et S. Senftenberg utilisées dans cette étude ont déjà fait l’objet d’essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Il n’est pas attendu d’effet indésirable tout au long de cet essai. La souche de B. fragilis utilisée est considéré comme un probiotique. Toutefois, l’apport d’une solution de probiotiques ou de tryptone sel, par voie orale, tous les 2 jours peut conduire à une situation de stress pour les poulets de chair.
Devenir
Les prélèvements de caeca nécessitent la mise à mort des animaux.
Remplacement
La volaille et notamment le poulet de chair représente une source importante de salmonellose pour l’Homme. Ainsi, il est nécessaire de contribuer au développement d’un moyen de lutte contre Salmonella dans la filière avicole afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Salmonella. Des essais préliminaires, réalisés in vitro sur des cellules humaines, montrent un effet bénéfique de B. fragilis en inhibant le passage de Salmonella au travers de la muqueuse intestinale. Toutefois, ces essais ont été réalisés en présence de cellules humaines en absence de lignée cellulaire intestinale de poulet disponible. Il est par conséquent necessaire de valider ses résultats lors d’un essai sur le poulet de chair. Cette validation nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo afin de réduire par la suite le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En raison de la variabilité interindividuelle importante des niveaux de colonisation par les bactéries étudiées et de la variabilité du microbiote au cours du temps, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe (8) était nécessaire pour chaque temps donné (5) afin d’assurer la robustesse des tests statistiques. Ainsi, 405 animaux seront nécessaires à cette étude (5 animaux seront utilisés au début de l’étude pour vérifier l’absence de contamination par Salmonella et 400 pour observer l'effet de B. Fragilis sur la contamination par Salmonella).
Raffinement
L’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Bien qu'aucun effet indésirable ne soit attendu au cours de cet essai, les animaux seront observés quotidiennement. Le raffinement des conditions d’hébergement vise à assurer l’inconfort des animaux. Les paramètres d’ambiance utilisés en animaleries sont ceux préconisés pour les élevages de poulets de chair. Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol sur une litière composée de copeaux de bois (qui servira d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). De plus, des alvéoles en carton seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie. Tout au long de l'essai, les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment spécifique à leur âge et leur espèce.
Choix des espèces
Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. Ce projet à pour pbjectif de développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage afin de réduire la charge qui arrive sur la chaine alimentaire. Par conséquent, le poulet de chair est l’espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 34 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre l’effet de l’ajout du probiotique B. fragilis sur la colonisation de Salmonella, la modulation du microbiote et l’influence sur des marqueurs de l’immunité.
Développement d’un modèle d’arthrite chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
990 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent dans l'articulation de la cheville une ou deux injections de cristaux d'urate ou de carraghénine pour déclencher une crise de goutte, puis le composé à tester, la douleur étant mesurée par le test de von Frey, pour évaluer de nouveaux candidats médicaments d'un partenaire industriel. Le porteur indique que l'arthrite induite peut provoquer une inflammation locale douloureuse, un défaut de toilettage et une baisse de la prise alimentaire. Il affirme que la culture cellulaire ne peut pas explorer ces mécanismes et que la preuve d'efficacité exige un "organisme entier", et revendique le rat comme le plus petit animal permettant une injection articulaire fiable.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer un modèle d’arthrite chez le rat afin de tester de futurs candidats médicaments dans la prise en charge de cette pathologie. Dans cette étude, nous évaluerons la pharmacocinétique d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation aiguë de l'articulation de la cheville. Ce travail cherche à améliorer le traitement des arthrites, en particulier de la crise de goutte, une maladie inflammatoire touchant les articulations. Les crises, souvent très douloureuses, se caractérisent par un échauffement et un gonflement de l'articulation et peuvent durer plusieurs jours. La complexité de ces maladies, dont la composante est multicellulaire, nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme entier comme l’animal. Cette étude se fosalise sur le développement de nouvelles formes d’administration d’un principe actif en utilisant des techniques de délivrance locale prolongée du médicament. Nous utiliserons un modèle d’inflammation goutteuse induite par des cristaux d’urate (Monosodium Urate MSU) ou de la carraghénine chez le rat. Un seul inducteur de l'inflammation (MSU ou carraghénine) sera utilisé par étude mais ces 2 agents inflammatoires pourront être testés lors d'études indépendantes. La pharmacocinétique du traitement administré sera déterminée de manière locale (niveau articulaire) mais également de manière systémique (sang). La douleur sera évaluée grâce au test de von Frey. L’utilisation du rat est tout indiquée dans cette étude, et se fera en accord avec la règle des 3R. Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort des rats seront mis en place dans chaque expérience et tous les animaux seront pesés et leur comportement surveillé afin de veiller à leur bien-être. Ce projet de recherche nécessitera l'utilisation de 99 rats par étude (15 rats pour l’étude pilote et 84 rats pour l’étude principale). A raison de deux études par an, nous utiliserons 990 rats pour la durée totale du projet. Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole étant classées à un grade sévère, elles feront l'objet d'une évaluation rétrospective.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'évaluer de nouveaux candidats médicament dans le processus inflammatoire de l'arthrite afin d'améliorer la prise en charge des patients et de les traiter de manière durable.
Procédures
Les animaux recevront une ou deux (selon la demande du partenaire industriel) injections intra-articulaire dans l'articulation de la cheville pour induire l'arthrite et une injection intra-articulaire avec le composé à tester. Les injections intra-articulaires durent 30 secondes et se font sous anesthésie isoflurane. Pour évaluer la douleur, les animaux seront soumis à un test qui consiste à appliquer de manière successive des filaments au niveau de la patte de l’animal. Les animaux sont acclimatés au set-up durant 30 minutes suivi par le test de Von Frey pendant 15 minutes. Enfin, sur animal euthanasié, un prélèvement en point final de sang sera effectué au niveau caudal. Un lavage intra-articulaire, et un prélèvement d'organes auront lieu après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo. L'ensemble de ces prélèvement se feront dans les 5 minutes suivant la mise à mort de l'animal.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables induits par un modèle d'arthrite chez le rat sont le développement d'une réaction inflammatoire au niveau local, une douleur locale pouvant entraîner un manque de toilette (poils ébouriffés), un comportement altéré (vivacité réduite) et une diminution de la prise alimentaire si l'animal a des difficultés à se redresser sur ses pattes. C'est pourquoi les rats seront surveillés quotidiennement post-induction pendant toute la durée de l'étude. L'aspect général et le poids des rats seront évalués post-induction sous la forme d’un score prédictif de la douleur. Des granulés seront déposés dans la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux.
Devenir
A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet et la pharmacocinétique du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.
Remplacement
Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire permettra de valider le modèle d’arthrite induite. L’étude principale ne sera conduite seulement si les résultats de cette étude pilote confirment la robustesse du modèle permettant ainsi de réduire le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux. Le nombre de rats nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Le nombre de 8 animaux par condition test correspond à la quantité minimale nécessaire pour cet objectif.
Raffinement
Les rats seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 3 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (tunnel, buchette) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal. Des granulés seront déposés dans la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux. Enfin, l'ensemble des injections intra-articulaires se feront sous anesthésie isoflurane 3%.
Choix des espèces
Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis et ceux à deux reprises dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines afin d'avoir des sujets adultes avec un système immunitaire mature pour se conformer à l’objectif de l’étude visant à appliquer ces futurs composés sur une population adulte.
Comprendre le rôle de MKP1 dans les troubles de l’humeur induits par le stress et la douleur chronique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Elles subissent une chirurgie ou des séances de stress répété allant jusqu'à une heure par jour pendant 21 jours, suivies de tests comportementaux dont le porteur ne précise pas la nature, pour évaluer le rôle d'une protéine dans la dépression. Le porteur indique que les symptômes anxiodépressifs et la sensibilité mécanique induits ne seront pas soulagés parce qu'ils sont l'objet de l'étude. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut reproduire ce modèle intégré et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Affectant approximativement entre 8% et 20% de la population mondiale, la dépression est l’un des plus grands enjeux de ce siècle en matière de santé publique. Récemment, plusieurs études chez l’Homme et chez l’animal ont suggéré que la protéine MKP1 pourrait jouer un rôle dans la dépression. Grâce à ce projet, nous pourrons évaluer l’implication de cette protéine dans le développement de la dépression dans les deux sexes dans différents modèles de dépression et déterminer si cette protéine pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour de futurs traitements personnalisés des troubles dépressifs.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est double : 1) étudier l’implication de la protéine MKP1 dans l’établissement de la dépression dans 3 modèles de dépression d’étiologies différentes et 2) comparer le rôle de cette protéine chez les mâles et les femelles, qui ne sont pas égaux face au développement de symptômes dépressifs. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de déterminer si MKP1 est impliqué dans le développement de la dépression quel que soit les facteurs conduisant à cette pathologie. De plus, nous pourrons déterminer si MKP1 est un mécanisme commun dans le développement de la dépression à la fois chez les mâles et les femelles. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques de la dépression, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle et selon l’origine des symptômes dépressifs.
Procédures
Les animaux seront uniquement soumis à l'induction du modèle et aux différents tests comportementaux. Un groupe d'animaux subira une procédure chirurgicale de 15min + 4 tests comportementaux (répartis sur 2 semaines), un autre groupe subira 1h de stress par jour sur 21 jours + 5 tests comportementaux (3 de 5 min, 1 de 6 min et 1 de 24h) et un dernier groupe subira 10 min de stress par jour sur 5 jours + 3 tests comportementaux ( 2 de 5 min chacun, 1 de 10 min).
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer des symptômes anxiodépressifs que nous ne pouvons pas soulager puisqu’il s’agit de l’objet de l’étude. À la suite de la procédure chirurgicale, les animaux présenteront une sensibilité mécanique qui ne peut être soulagée puisqu'il s'agit de l'objet de l'étude, ainsi qu'une légère difficulté de déplacement qui disparaitra en 48-72h.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, afin de prélever leur cerveau pour effectuer les analyses moléculaires d'intérêt.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress et la douleur chronique chez l’animal, comme modèles de pathologie psychiatrique humaine, est un processus intégré et repose sur l’observation du comportement de l’animal vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par modèle et condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Pour cela, nous réalisons plusieurs types d’études sur la même cohorte d’animaux. Les expériences seront également réalisées par petit groupes d’animaux afin qu’elles puissent être stoppées dès l’obtention de résultats statistiquement fiables et robustes. Ainsi, le nombre d'animaux indiqué par groupe ne correspond pas au nombre total d’animaux réellement utilisés mais à un nombre maximum.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage collective afin de respecter leurs besoins sociaux. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et analgésie (sans que l'animal ne ressente de la douleur). En post-chirurgie, les animaux seront quotidiennement surveillés afin de contrôler leur bien-être et de mettre en place une analgésie si besoin. A chaque étape de l'étude, nous avons établi des points limites nous permettant de soustraire l'animal à la souffrance. Si de nouvelles approches bénéfiques pour le bien-être de l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la Structure chargée du bien-être animal de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Les modèles utilisés ne sont caractérisés que chez la souris, c'est pourquoi nous utilisons cette espèce. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (critères: début des procédures à au moins 7 semaines, poids supérieur à 20g pour les mâles et 15g pour les femelles). En se référant aux précédentes expériences réalisées au laboratoire, nous ne réaliserons pas ces modèles sur des souris âgées de plus de 6 mois.
Etude de l’impact de l’âge et du déclin des tissus adipeux sur les flux métaboliques à l’échelle de l’organisme EU1/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles sont soumises à des régimes gras, à des restrictions alimentaires ou à des températures de 4 à 30 °C, reçoivent des substrats marqués et subissent une chirurgie d'une à deux heures pour poser un cathéter veineux. Le porteur indique que les effets attendus sont une perte de poids et des douleurs liées à la chirurgie. Il affirme que le recours à l'animal reste "indispensable" pour étudier les échanges de métabolites entre organes au cours du vieillissement.
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. Le vieillissement se caractérise par une diminution de la capacité de l’organisme à répondre aux facteurs de stress auquel il est soumis et à maintenir l'homéostasie. L’altération du métabolisme cellulaire, tissulaire et de l’organisme entier serait un des facteurs déterminants dans les pertes de fonction liées à l’âge. L’homéostasie énergétique est un état d’équilibre dynamique entre les dépenses et les apports d’énergie, qui est fondamental pour le maintien de la stabilité du milieu intérieur d’un organisme et des constantes vitales. Le contrôle de l’homéostasie énergétique repose sur la coopération métabolique entre plusieurs organes ce qui permet à l’organisme de s’adapter aux différents stress métaboliques auquel il est soumis toute au long de la vie. Cependant, des arguments de la littérature suggèrent que cette coopération métabolique est altérée avec l’âge et que ceci pourrait contribuer à la mise en place de désordres métaboliques. Parmi les organes impliqués dans le maintien de l’homéostasie énergétique et impactés de manière précoce au cours du vieillissement, les tissus adipeux (blancs, bruns, beiges), dont la complexité cellulaire, l’hétérogénéité et la plasticité sont aujourd’hui de mieux en mieux décrits, jouent un rôle déterminant. Nous pensons que le déclin de ces tissus adipeux au cours de l’âge pourrait contribuer à la perte de la flexibilité métabolique de l’organisme et pourrait induire une modification des flux métaboliques à l’échelle de l’organisme. Cette redistribution des flux métaboliques pourrait avoir des conséquences notables sur le métabolisme et le fonctionnement de différents organes, ainsi que sur l’homéostasie énergétique de l’organisme entier. Afin de caractériser ces flux de substrats in vivo, nous utiliserons des approches de traçage isotopique. Ceci correspond à l’injection chez la souris de substrats marqués par des isotopes lourds stables non radioactifs (13C, 15N, 2H, etc…). L’analyse de l’incorporation des carbones C13 par exemple dans les différents organes sera réalisée par des approches de spectrométrie de masse et de résonance magnétique nucléaire (RMN). Ceci permettra de déterminer le devenir métabolique du substrat injecté et de calculer les flux de métabolites à l’échelle de l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir des données de métabolomique et de fluxomique à l’échelle de l’organisme dans un contexte de vieillissement et d’établir une cartographie des flux métaboliques au sein de différents organes au cours de l’âge. Il permettra également d’étudier le rôle des tissus adipeux dans les modifications des flux métaboliques systémiques. Ces données permettront de mieux comprendre les processus métaboliques qui contribuent à la perte de flexibilité métabolique de l’organisme au cours l’âge et de mettre en évidence des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques d’intérêt afin de vieillir en bonne santé.
Procédures
Les souris seront soit soumises à une régime riche en graisse pendant 10 semaines, soit soumises à un régime riche en graisse (10 semaines) suivi d'un accès restreint dans le temps à la nourriture pendant 2 mois, soit hébergées à une température de 30°C pendant 2 mois, soit hébergées à une température de 4°C pendant 10 jours puis des substrats leur seront injectés à l'aide d'une seringue sous forme de bolus (injection unique en intrapéritonéal ou en intraveineux au niveau de la veine caudale) ou par perfusion lente pendant 3 heures. Pendant la perfusion nous procéderons à des prélèvements sanguins réguliers au niveau de la queue (20 à 30 secondes par prélèvement) sans dépasser un volume de 200μl pour une souris de 25g. Les souris perfusées subiront au préalable une chirurgie (1 à 2 heures d'intervention) sous anesthésie et traitement analgésique afin de poser un cathéter au niveau d'une veine et relier ce cathéter à un dispositif positionné sur le dos.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiel seront une perte de poids et des douleurs lièes à la chirurgie réalisée pour poser un cathéter au niveau d'une veine.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort au terme de chaque procédure afin de prélever le sang, les organes et tissus.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier les flux de substrats entre différents tissus. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus ayant des spécificités bien distinctes. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Au regard de la bibliographie, 6 souris par condition pour des études de devenir de substrats marqués sont classiquement utilisées. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le devenir de ces substrats au sein des tissus et organes mais aussi pour des analyses d'expression des gènes et biochimiques (mesures d’activités enzymatiques par exemple). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours au cours des différentes procédures par les personnels de la zootechnie et 2 fois par semaine par une personne impliquée sur le projet, ceci permettant de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience. Pour les procédures impliquant la pose d'un cathéter, un protocole médicamenteux (solution réhydratante, analgésique et anti-inflammatoire) sera mis en place avant, pendant et après l'opération afin d'éviter la perte de poids et les douleurs. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage après l'opération grâce à un dispositif empêchant les souris d'abimer le cathéter ou de s'automutiler. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris, favorisant le bien-être de l’animal.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce présente des souches possédant des profils métaboliques différents et qui nous paraissent tout à fait appropriées pour le développement du projet scientifique. La souris représente l'espèce animale pour laquelle l’exploration fonctionnelle métabolique est la plus aboutie. Nous avons aussi une grande expertise dans la manipulation de cette espèce et aussi l’accès à des modèles génétiques de souris invalidées pour des transporteurs de métabolites ou des enzymes clés du métabolisme. Enfin, nous travaillons sur le vieillissement, la souris permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) comparée au Rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons uniquement des souris mâles (des résultats d’expériences préliminaires n’ont pas montré de différences significatives entre les deux sexes) à différents âges (2, 12 et 24 mois correspondant aux âges jeune, adulte, âgé) afin de caractériser les flux métaboliques au cours du vieillissement. Pour les approches nutritionnelles (régime riche en graisse et restriction calorique), elles seront réalisées chez des souris de 2 et de 12 mois, afin de déterminer si l’âge affecte la plasticité métabolique et la redistribution des flux métabolique suite à ces stress. Il en sera de même pour les souris exposées au froid. La thermo-neutralité sera réalisée uniquement sur des souris de 2 mois pour minimiser le nombre d’animaux.
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans le modèle d’ischémie thrombotique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque un AVC par application de chlorure de fer sur une artère cérébrale, suivi d'une IRM sous anesthésie, de tests comportementaux non détaillés et d'une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que le modèle entraîne un déficit sensorimoteur et des lésions cérébrales, avec pertes d'équilibre et faiblesse musculaire possibles. Il juge "indispensable" de développer de nouvelles stratégies face à un traitement actuel inefficace sur les caillots riches en plaquettes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos quatre stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC thrombotique chez la souris par administration intrapéritonéale (i.p), par administration intra veineuse ou bien par voie orale (per-os), pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 3 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit moteur ainsi que du volume lésionnel.
Bénéfices attendus
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Cependant, le tPA n’a aucune efficacité sur un caillot riche en plaquettes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes visant à traiter efficacement cette pathologie. L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques par 3 voies d’administrations différentes afin d’étudier la diminution des volumes lésionnels ainsi que l’augmentation de la récupération fonctionnelle après un AVC. Ces stratégies thérapeutiques sons susceptibles d’agir sur la lyse d’un caillot riche en plaquettes. Nous utiliserons donc un modèle d’infarctus cérébral thrombotique qui reproduit au mieux la physiopathologie de l’AVC permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir appliquer une solution de chlorure de fer (FeCl3 ; 20 %), provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire pour l’infusion des traitements. Une moyenne de 5 minutes est à prévoir pour cette pose. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Un total de 56 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme : l’animal peut continuer à s’alimenter, s’abreuver ou encore se fabriquer un nid.Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Aucune nuisances n'est attendues concernant l'administration des traitements, les test comportementaux ainsi que pour l'examen IRM.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 12. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, à une désinfection et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil,de l'oxygène sera administré pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 5. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC thrombotique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS et de 25g pour les C57BL6J. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Mécanismes moléculaires du vieillissement des cellules souches hématopoïétiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à deux reprises puis reçoivent une transplantation de moelle osseuse et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le vieillissement des cellules souches du sang. Le porteur indique que l'irradiation et la greffe peuvent provoquer des infections et un rejet se traduisant par prostration et grande fatigue. Il affirme qu'aucun système in vitro comparable au corps du mammifère n'existe pour étudier l'hématopoïèse.
Objectifs
Le vieillissement de la population, en particulier au sein de la population occidentale, est aujourd’hui l’un des principaux problèmes socio-économiques. Le vieillissement du système sanguin et en partie de la population de cellules capables de former toutes les cellules du sang, appelée cellules souches hématopoïétiques ou CSH, entraîne un dysfonctionnement de la formation de sang. Ceci accroit le risque de développer diverses maladies malignes du sang telles que la myélodysplasie, un ensemble de maladies caractérisées par une production insuffisante de cellules sanguines matures saines par la moelle osseuse, la leucémie ou encore le lymphome. Au sein de notre laboratoire, nous supposons que le vieillissement "sain" ou "physiologique" est une succession de moments de stress, c’est-à-dire une pression ou contrainte de l’environnement. Nous avons déjà montré que les CSH dépourvues d'une protéine spécifique de la réponse des CSH sont moins activées ; c’est-à-dire qu’elles présentent des défauts dans leur division, et nous pensons donc que ces cellules mutées peuvent conserver leurs caractéristiques de jeunesse. Notre hypothèse est donc de vérifier si des signaux de stress provoquent des changements dans l’ADN ou les ARNm constituant ainsi une signature du vieillissement des CSH.
Bénéfices attendus
L'objectif de cette étude est d’identifier de futures cibles thérapeutiques qui permettront de développer de nouvelles thérapies dans le but d’améliorer la qualité de vie de la population vieillissante.
Procédures
Les souris seront injectées en intra-veineux une, deux ou trois fois (15s environ par injection). Les souris seront irradiées 2 fois à 4 à 6 heures d'intervalle pour une durée de 5 minutes et une irradiation de 5 et 4,5Gy respectivement. Les souris seront également soumises à des transplantation (une par souris receveuse, injection des cellules de 15s environ), et à des prélèvements sanguins (prélèvement de 15s environ, 3 prélèvements sanguins par souris à 4, 8 et 12 semaines post-transplantation).
Impact sur les animaux
Les injections en intra-veineux peuvent induire des rougeurs et des gonflements. La diminution du système immunitaire des souris receveuses de transplantation peut entrainer des infections par une diminution de l’efficacité du système immunitaire. La transplantation peut induire un rejet de greffe qui se traduit par une absence de système immunitaire (donc des infections), une prostration des animaux et une grande fatigue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin d’isoler et d’étudier les cellules souches hématopoïetiques.
Remplacement
Nous avons envisagé la possibilité de modéliser les mêmes processus in vitro. Cependant, il n'existe pas de système in vitro approprié pour étudier l'hématopoïèse, qui soit comparable au corps du mammifère. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les tests d'unités de formation de colonies, que nous allons mettre en place. Par conséquent, les expériences in vivo utilisant des souris sont essentielles.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est importante. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Concretement dans notre étude, et afin d'obtenir des résultats solides, même en cas d'échec de la prise de greffe (environ 5% de rejet de greffe attendus), nous aurons besoin de 3 répliquats biologiques (donneurs)*3 expériences indépendantes = 9 animaux par condition et par âge. La moelle osseuse isolée de chaque animal donneur sera ensuite injectée dans 3 souris de type sauvage irradiées (receveurs).
Raffinement
Afin de prévenir les infections bactériennes, les souris transplantées recevront un traitement antibiotique dans l'eau de boisson. Lors des prélèvements sanguins une pression sera appliquée sur le site de prélevement pour arrêter l'hémorragie. Les souris seront surveillées pour détecter tout signe d'inconfort 10 à 15 minutes après la procédure. Un manque de soin ou un isolement de l’animal entrainera une surveillance quotidienne. Un deplacement anormal nécessitera l’administration d’eau gélifée et de nourriture directement dans la cage. Une respiration haletante entrainera une surveillance quotidienne. L’animal sera mis à mort dans tous les cas si les symptomes persistent plus de 3 jours. Une perte de poids de plus de 10% sans récupération sur 2 semaines entrainera une vigilance accrue des autres paramètres. Une perte de poids supérieure à 20% entrainera la mise à mort de l’animal. Des rougeurs ou gonflements au niveau des sites de prélèvement ou d’injection entraineront l’utilisation quotidienne de solution antiseptique non colorée. Les animaux seront mis à mort s’il n’y a pas d’amélioration après 3 jours.
Choix des espèces
La souris est le système idéal pour étudier l'hématopoïèse car le système hématopoïétique est hautement conservé entre la souris et l'humain. En outre, le vieillissement du système hématopoïétique est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre les humains et les souris est connue. Enfin, la capacité d'isoler les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la souris est bien définie et les CSH peuvent être préservées dans un système normal où elles sont situées dans leur niche et peuvent donc conserver leur quiescence (état de repos). Les procédures telles que la transplantation sont également réalisables chez la souris puisque des protocoles sont en place et utilisés en routine. Les animaux utilisés pour les expériences de vieillissement seront jeunes (6-12 semaines), d'âge moyen (10-14 mois), ou âgés (18-24 mois) ces âges simulant respectivement les systèmes humains jeunes, d'âge moyen et âgés. Les souris receveuses de la transplantation seront quant à elles toutes agées de 3 mois (âge idéal pour une transplantation optimisée). Une attention particulière sera portée aux groupes, afin d'équilibrer autant que possible les âges dans chaque expérience.