Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Impact de polluants anthropiques sur le comportement et la cognition chez les jeunes poissons cichlides
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
576 jeunes poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour mesurer l'effet de polluants sonores et chimiques sur leur comportement et leur cognition. Les alevins sont exposés quatre semaines à du bruit ou à des contaminants avant une batterie de tests. Sur les procédures infligées, le RNT se limite à mentionner une "manipulation des animaux pour les tests comportementaux pouvant engendrer un stress", sans préciser davantage. Après anesthésie et mise à mort, cerveau et corps sont prélevés pour analyse.
Objectifs
Les animaux évoluent dans des environnements riches en signaux sensoriels d’origine abiotiques (lumière, température, courants, vibrations, champs géomagnétiques) et biotiques (signaux visuels, acoustiques, chimiques, tactiles ou électriques). La capacité à distinguer les informations pertinentes de celles qui ne le sont pas est essentielle à leur survie et à leur reproduction. Toutefois, l’intensification des activités humaines introduit de nouveaux signaux anthropiques, tels que les polluants chimiques et le bruit, qui peuvent masquer ou perturber les signaux biologiquement importants et provoquer des réponses de stress affectant la croissance, la reproduction, le comportement et la survie des organismes. La majorité de ces travaux portent sur des périodes courtes (stress aigü) et sur les individus adultes. Les effets chroniques de ces pollutions acoustique et/ ou chimique durant les jeunes stades de vie ou du développment restent encore peu étudiés. Pour aborder cette question, nous développons au sein du laboratoire une approche expérimentale et pluridisciplinaire sur une espèce de poisson Cichlidé (Maylandia zebra) endémique du lac Malawi, mêlant neurophysiologie et éthologie. Cette espèce, étudiée depuis plusieurs années au sein du laboratoire, utilise plusieurs canaux sensoriels pour communiquer, dont les canaux acoustique et olfactif, et possède des comportements très stéréotypés dans différents contextes comme par exemple la défense du territoire . De plus, l’incubation des oeufs, jusqu’au stade alevin, est réalisée dans la bouche de la mère pendant 21 jours, ce qui permet, en laboratoire, outre un contrôle des naissances, de suivre très précisémenent le développement et le devenir des couvées en environnement contrôlé. L’objectif du projet présenté ici, est d’évaluer les capacités cognitives et de mémorisation de jeunes alevins de poissons cichlidés soumis ou non à des polluants chimique et/ou sonore. Le niveau d'activité, le comportement exploratoire, les interactions sociales, les traits comportementaux ainsi que les capacités d’apprentissage et de mémorisation des animaux seront estimés à l’aide de tests éthologiques classiques ainsi que des tests de conditionnement.
Bénéfices attendus
Ces dernières années les études sur la pollution sonore se sont largement développées et nous savons qu'il existe des effets sur les comportements, la communication, la physiologie des populations aquatiques (poisson, invertébrés..). Toutefois, les études plus fines au niveau de l'individu et notamment au niveau des capacités cognitives ou de mémorisation des poissons sont rares et commencent à émerger. Ce projet vise également à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination durant premiers stades de vie. Enfin, très peu d’études aujourd’hui concerne l’impact couplé de deux facteurs polluants anthropogéniques, c’est-à-dire liés à l’activité humaine.
Procédures
Manipulation des animaux pour les tests comportementaux pouvant engendrer un stress
Impact sur les animaux
L’environnement bruité ou le conditionnement pavlovien pourraient engendrer un stress pour l'animal : le comportement des animaux sera suivi (et enregistré) pendant toute la durée de l'expérimentation. Si un comportement anormal est observé l'expérience sera immédiatement stoppée. Un comportement anormal peut être: arrêt total de la nage (le poisson reste prostré dans un coin); nage en surface bouche ouverte; nage saccadée.... Concernant l’impact sur les poissons aux stades embryo-larvaires, compte tenu du peu de connaissance, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité a été observée.
Devenir
Après anesthésie et mise à mort des prélèvements tissulaires seront effectués pour histologie
Remplacement
L’évaluation de l’impact des facteurs polluants sur les capacités cognitives et de mémorisation reposent sur des techniques d'apprentissage suivi de l'observation de séquences comportementales : l'animal ne peut pas être remplacé.
Réduction
Les analyses statistiques envisagées seront des analyses de variances et des modèles linéaires à effets mixtes. De plus, nous souhaitons avoir des données comportementales indépendantes (et non pas des mesures répétées) afin d’avoir des données plus facilement exploitables statistiquement et d’améliorer le bien-être des poissons : un individu donné ne sera soumis qu’à un seul test comportemental. Pour ce faire nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux testés (12 par test comportemental). A partir d’un individu, plusieurs tissus seront prélevés (cerveau, corps) afin de réaliser l’analyse transcriptomique et la mesure du stress oxydatif.
Raffinement
Afin d’optimiser le bien-être des animaux, les aquariums seront enrichis avec du sable et des abris adaptés (utilisation de galets). Les densités utilisées dans les aquariums respecteront les règles sanitaires (soit 6 juveniles de 1,5cm dans un aquarium de 10 litres). Enfin, les conditions de température, lumière, pH et Nitrates seront contrôlées et se rapprocheront au mieux de l'environnement dans le milieu naturel garantissant la qualité de l'habitat et le suivi des animaux (présence de filtration, chauffage, oxygénation, fréquence et type de nourriture adaptée aux jeunes poissons). Si une de ces conditions devient inadaptée des changement d'eau seront envisagés. D'autre part ltous les animaux seront anesthésiés avant la mise à mort et les points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.
Choix des espèces
Notre modèle est un poisson cichlidé social, grégaire présentant une forte hiérachie. En contexte de défense du territoire et de parade nuptiale, ce poisson communique via les canaux visuels, acoustique et olfactif, ce qui en fait un modèle de choix pour l'étude des interactions sociales et de lacommunication multimodale. De plus, l'incubation des oeufs se fait dans la bouche de la femelle, ce qui facilite l'étude de l'effet de paramètres environnementaux au cours du développement embryonnaire. Il est étudié au laboratoire depuis plus de 15 ans : les comportements de ce poisson, dans différents contextes, sont bien connus de l'équipe : toute modification comportementale liée à l'envoi de stimuli sonores (bruits de bateaux) ou chimiques sera donc facilement identifiable. L'objectif de cette étude est de mesurer l'impact de la pollution sonore et/ou chimique sur le comportement, les capacités cognitives et de mémorisation chez les poissons pendant les premiers stades de vie. Après la sortie de l’incubation buccale de la mère, les juvéniles seront soumis pendant 4 semaines à une pollution sonore et/ou chimique. Ensuite les juvéniles âgés de 1 mois (ils mesurent alors environ 2cm de long) seront soumis à des tests comportementaux.
Evaluation par imagerie des malformations cardiaques dans des lignées mutantes de poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Issues de lignées mutantes et transgéniques, 2 000 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées sous anesthésie sans réveil, dans une étude par imagerie du développement cardiaque. L'invalidation des gènes ciblés peut perturber la formation du cœur, le RNT notant qu'à ce stade la larve survit sans système cardiovasculaire fonctionnel. Certaines subissent aussi un choc thermique lors de leur immobilisation à 37 °C. Le porteur retient le poisson zèbre pour la transparence de ses larves, qui rend l'imagerie possible sans chirurgie.
Objectifs
Notre projet consiste à effectuer de l'imagerie sur des larves anesthésiées issues de lignées transgéniques et mutantes afin d'étudier le développement cardiaque normal et pathologique. Notre équipe s'intéresse au développement normal et pathologique du cœur. Dans ce contexte, nous recherchons la nature des gènes impliqués dans le développement cardiaque et les mutations qui pourraient conduire à des cardiopathies congénitales. Le développement cardiaque du poisson-zèbre est hautement similaire au développement cardiaque humain et présente l'avantage d'être observable du fait de son développement externe. De plus, la transparence des larves et la rapidité du développement du poisson-zèbre nous offrent la possibilité d'effecteur de l'imagerie in vivo permettant des analyses morphologiques et fonctionnelles rapides de l'organe.
Bénéfices attendus
Les cardiopathies congénitales sont une cause majeure de morbidité infantile mais leur nature génétique reste encore mal connue. A court terme, ce projet permettra d’analyser le rôle de gènes spécifiques sur la morphologie et la fonction cardiaques. A long terme, ce projet devrait bénéficier à la santé humaine en identifiant les gènes/processus nécessaires au développement cardiaque normal et pathologique.
Procédures
Tous les animaux seront anesthésiés et seront imagés en microscopie photonique ou bi-photonique.
Impact sur les animaux
La mise en contact avec l’anesthétique peut potentiellement générer un stress transitoire chez les larves. L’invalidation des gènes candidats au sein des lignées utilisées peut potentiellement avoir un rôle délétère sur le développement cardiaque mais à ce stade de développement, le poisson-zèbre peut survivre sans système cardio-vasculaire fonctionnel. Enfin, la larve peut subir un choc thermique lors de son immobilisation à 37ºC mais les larves sont déjà sous anesthésie générale lors de cette variation température.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort (classe sans réveil)
Remplacement
Les mécanismes du développement cardiaque sont très complexes, impliquant la participation de nombreux types cellulaires différents. Le développement des techniques alternatives d’organoïdes actuelles ne permettent ni d'étudier le développement d'un organe en son entier et de ses structures complexes (ex: valves, cavités, trabéculation, etc) ni d’explorer la fonction de l’organe dans un contexte physiologique ou physiopathologique. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant d’étudier la morphologie et la fonction de l’organe cardiaque.
Réduction
L’évaluation du nombre d’animaux s’appuie sur nos précédents travaux publiés et des tests statistiques qui nous ont permis de définir un nombre minimum d’animaux nécessaires pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Afin de limiter aux maximum les contraintes sur les animaux, nous travaillons sur des stades très précoces (à 7 jours post fécondation, jpf). De plus, l’ensemble de la procédure est réalisé sous anesthésie. Les techniques d’imagerie mise en œuvre reposent sur une méthode non-invasive, permettant l’acquisition de données grâce à la transparence du stade larvaire des animaux.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre présente 85% d’homologie avec l’homme pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines. Le développement cardiaque du poisson-zèbre étant très proche de celui observé chez l'homme, cet animal se présente comme un modèle de choix pour identifier rapidement les gènes potentiellement responsables de malformations cardiaques congénitales. De plus, le développement rapide et externe de l'animal associé à la relative transparence des larves nous permet d'effectuer de l'imagerie cardiaque en temps réel. Les animaux sont utilisés à 5 ou 7jpf. A 5 jpf, le développement cardiaque est assez avancé pour effectuer des analyses fonctionnelles et étudier les performances cardiaques. Par exemple, la trabéculation du myocarde n'est clairement développée qu’à 5 jpf. La valve aortique n'est quant à elle pas formée avant 7 jpf.
Rôle d’un métabolite (D-sérine) produit par l’intestin et le microbiote dans le dialogue intestin–cerveau au cours des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumises à une inflammation intestinale induite, à un gavage quotidien et à une distension colorectale répétée, 1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le RNT classe le test de la nage forcée comme sévère et décrit une inflammation pouvant provoquer perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles. Ce travail de recherche fondamentale explore le rôle d'un métabolite dans le dialogue intestin-cerveau, les perspectives thérapeutiques étant repoussées au "long terme". Toutes les souris sont mises à mort pour le prélèvement de tissus.
Objectifs
La finalité de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’inflammation intestinale et les douleurs abdominales associées, dans le cadre de l’axe reliant le microbiote intestinal et le fonctionnement de l’organisme. Ce travail relève de la recherche fondamentale. Il vise à identifier comment certaines bactéries intestinales et certaines molécules naturellement présentes dans le corps peuvent influencer l’inflammation et la sensibilité de l’intestin. À court terme, le projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes biologiques impliqués dans l’apparition et le maintien de l’inflammation intestinale et des douleurs associées. À moyen terme, il permettra d’évaluer le potentiel de certaines bactéries dites « probiotiques » pour moduler l’inflammation et limiter les douleurs dans un modèle expérimental. À long terme, ces résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote intestinal afin d’améliorer la prise en charge des maladies inflammatoires intestinales et des douleurs abdominales chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances fondamentales sur les mécanismes de communication entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau, en identifiant le rôle spécifique du métabolisme de la D-sérine et des acides aminés de configuration D dans les troubles inflammatoires intestinaux. Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des liens entre inflammation intestinale, dysbiose du microbiote et altérations des fonctions cérébrales associées (comportements anxio-dépressifs et troubles cognitifs). Ce projet fournira également des données translationales originales issues de modèles animaux et d’échantillons de patients, susceptibles d’identifier de nouveaux biomarqueurs liés au métabolisme de la D-sérine dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Enfin, l’évaluation de stratégies innovantes de modulation du métabolisme intestinal de la D-sérine, notamment via l’utilisation de probiotiques ciblés, ouvrira des perspectives thérapeutiques nouvelles pour la prise en charge des troubles intestinaux et de leurs comorbidités neuropsychiques.
Procédures
Les animaux peuvent être soumis aux interventions suivantes : Administration d’une substance dans l’eau de boisson afin d’induire une inflammation intestinale temporaire. Administration quotidienne par gavage oral d’une préparation probiotique pendant 7 jours. Réalisation de tests comportementaux (test de la nage forcée et test du labyrinthe en croix surélevé). Mesure de la sensibilité intestinale par distension colorectale. Prélèvements de selles. Mise à mort réglementaire en fin de procédure suivie du prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
Inflammation intestinale induite : nuisance modérée, pouvant entraîner perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles pendant quelques jours (durée limitée à la période d’exposition). Gavage oral quotidien : nuisance légère à modérée, correspondant à un stress transitoire lié à la manipulation (quelques minutes par jour pendant 7 jours). Test du labyrinthe en croix surélevé : nuisance modérée, liée à un stress et une anxiété transitoires (durée du test : quelques minutes). Test de la nage forcée : procédure classée sévère, induisant un stress aigu lors de l’exposition à l’eau (durée limitée au temps du test). Distension colorectale : nuisance modérée à sévère, correspondant à un inconfort intestinal bref et répété (quelques secondes à quelques minutes lors de la mesure). Prélèvements de selles : nuisance faible, car réalisés sans geste invasif.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser différents prélèvements de tissus.
Remplacement
Les mécanismes étudiés impliquent des interactions complexes entre l’intestin, le microbiote et l’organisme entier. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble de ces interactions dans un modèle in vitro ou informatique. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Les différentes analyses sont réalisées sur les mêmes animaux afin d’éviter la constitution de cohortes supplémentaires.
Raffinement
Les procédures ont été conçues pour limiter le stress et l’inconfort. Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation, d’un suivi clinique régulier et de points limites prédictifs permettant l’arrêt immédiat de la procédure si nécessaire. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et expérimenté.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) afin d’être mature sexuellement. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition à l’âge adulte sur le développement des fonctions intestinale et métabolique et immunitaire
Nouvelles thérapies antitumorales médiées par le système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 920 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à huit injections et un suivi de la tumeur au pied à coulisse deux à trois fois par semaine. Les tumeurs peuvent provoquer douleurs locales, perte d'appétit et baisse de température corporelle. Le projet vise à confirmer in vivo des composés déjà repérés in vitro pour activer une réponse immunitaire antitumorale. Les bénéfices pour les patients, des chimiothérapies "plus efficaces", sont annoncés à long terme, quand la mise à mort des 3 920 souris pour analyse post-mortem, elle, est certaine.
Objectifs
La chimiothérapie est aujourd’hui le traitement de référence pour la majorité des cancers. Un certain nombre limité d’agents tels que les anthracyclines (Mitoxantrone) ont la capacité de déclencher des signaux de stress qui induisent la mort cellulaire immunogène (MCI). Cette dernière permet le recrutement des cellules dendritiques, qui va induire la stimulation d’une réponse immunitaire antitumorale immédiate, et créer une protection à long terme. Nous avons donc réalisé, in vitro, des tests sur un grand nombre de molécules afin de mettre en lumière de nouveaux composés capable d’induire cette MCI. A présent, nous souhaitons vérifier in vivo que ces molécules ont un effet antitumorale, que cet effet est bien lié au système immunitaire et que cette protection anti-cancéreuse est conservée sur le long terme.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de mettre en lumière de nouveaux composés antitumoraux activateur du système immunitaire. A long terme, il permettra ainsi de proposer de nouvelles chimiothérapies plus efficaces pour les patients.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis deux à 8 injections sous anesthésie locale (vigile,
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements par injection, par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse 2 à 3 fois par semaine (tous les trois jours). Ces différentes manipulations pouvant entraîner du stress chez l’animal. Les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et légères, et un eperte d'appétit modérée. Les traitements médicamenteux peuvent entraîner une perte d’appétit modérée ou des diarrhées et donc une perte de poids chez la souris. Il est aussi possible d’observer une baisse de la température corporelle de l’animal.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse post-mortem des tumeurs et du système immunitaire.
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude sur la souris est nécessaire car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire et son effet sur la croissance tumorale.
Réduction
La première procédure nous permettant de voir quels composés (et à quelle concentration) induisent une baisse de la croissance tumorale et si la combinaison avec du Cisplatine peut la potentialiser, nous le strict minimum de souris par groupe (procédure go/no go). Et nous ne réaliserons les combinaisons de traintements que sur les conditions qui induisent une baisse de la croissance tumorale. Puis, pour les autres procédures, une analyse statistique nous a permis de déterminer un nombre minimum de souris par groupe. Pour prendre en compte de possibles exclusions, une souris supplémentaire a été ajoutée au calcul par groupe (cause possible d'exclusion. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale ne conforte pas l’hypothèse de travail. Nous réaliserons toutes les expériences avec des mâles et des femelles car il a été prouvé que le sexe influence l’immunité adaptative et innée.
Raffinement
Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un sytème immunitaire mature.
Analyse, chez la souris, d’un gène responsable de maladie auto-immune chez l’Homme 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Pour analyser un gène associé à une maladie auto-immune humaine, 360 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent prélèvements sanguins, injections et vaccinations, et passent sept jours isolées en cage métabolique, une contrainte que le RNT classe lui-même comme stress modéré. Les retombées thérapeutiques sont renvoyées à un éventuel "à terme", l'objectif immédiat restant l'avancée de connaissances fondamentales. Toutes les souris sont mises à mort pour le prélèvement des tissus.
Objectifs
Nous avons identifié chez des patients des mutations d’un gène associé à l’actine, une protéine majeure de la structure et de l’activité cellulaire. Ces patients présentent des manifestations pathologies immunitaires précoces et sévères. Les mécanismes sont complexes et les pistes thérapeutiques sont limitées. Dans un modèle de délétion génétiques de ce gène chez la souris nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes de ces pathologies afin d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles efficaces.Ce projet est multisite et se déroulera dans deux EU.
Bénéfices attendus
L’analyse de ce modèle de souris permettra d’étudier le rôle de la délétion d'un gène impliqué dans des maladies métaboliques et immunitaires. Ce projet permettra l'avancée des connaissances fondamentales. Et, à terme ce projet pourrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les patients porteurs de mutation ou présentant des maladies similaires.
Procédures
Prélèvement de sang (de 6 à 10 x 30secondes), Injections (de 3 à 5 x 30 secondes), vaccinations (4x 1 minute), prélèvement urinaire et fèces en cage métabolique (pendant 7 jours).
Impact sur les animaux
Le transfert des animaux entre les deux EU peut entrainer un léger stress. Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements de sang causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les vaccinations sont une source de stress modéré chez la souris avec une douleur légère de courte durée. L’isolation des souris en cage métabolique pendant 7 jours est la source d’un stress modéré chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est justifié par l’impossibilité de modéliser la complexité du système immunitaire, du métabolisme énergétique et des comportements associées. Il est nécessaire de comprendre l’organisation et la coopération de différents tissus métaboliquement actifs.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées. Le nombre de souris par groupe a été déterminé pour permettre de détecter des différences statistiquement significatives.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des expériences pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Des grilles de score et des points limites strict et spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les gestes décrits dans les procédures se font sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les mécanismes immunitaires et métaboliques sont similaires entre l'homme et la souris, qui représente donc un modèle pertinent pour mimer ce qui survient chez des patients présentant des maladies avec des effets sur le métabolisme. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes, à partir de 6-8 semaines pour lesquelles le système immunitaire est mature.
Étude d’un modèle murin d’infection à Tropheryma whipplei et du rôle du facteur de transcription FoxP1 dans la réponse immunitaire
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour comprendre pourquoi certaines personnes développent la maladie de Whipple, 60 souris porteuses d'une mutation d'un gène immunitaire sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par voie orale par la bactérie Tropheryma whipplei, après un prélèvement de sang et une habituation à boire une solution sucrée à la micropipette. Le porteur attend des effets modérés et transitoires, perte de poids et baisse d'activité, sans mortalité liée à l'infection. Toutes les souris sont tuées pour prélever fluides et organes, l'étude comparant des animaux mutés à des témoins.
Objectifs
Tropheryma whipplei est l’agent responsable de la maladie de Whipple, une maladie chronique rare pouvant être grave en l’absence de traitement. Bien que cette bactérie soit relativement fréquente dans la population générale et souvent portée sans symptôme, seule une minorité de personnes développe la maladie. Cela suggère l’existence de facteurs individuels de susceptibilité. Des études récentes ont mis en évidence l’implication possible d’un gène, FOXP1, qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, notamment dans certaines cellules impliquées dans la défense contre les infections. Toutefois, son rôle précis dans la réponse immunitaire contre Tropheryma whipplei reste encore mal compris. Nous faisons l’hypothèse qu’une altération de ce gène pourrait perturber la réponse immunitaire et favoriser l’installation ou la persistance de l’infection. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cette altération génétique sur les mécanismes de défense de l’organisme à l’aide d’un modèle expérimental d’infection. Cette approche repose sur l’identification de variations rares de ce gène chez des patients atteints de la maladie de Whipple. Nous analyserons le développement de l’infection, son évolution dans le temps ainsi que les différentes étapes de la réponse immunitaire, en comparant des modèles porteurs de cette altération génétique à des modèles témoins. L’utilisation de ce type de modèle est essentielle pour étudier de manière intégrée la complexité des interactions immunitaires et la dynamique de l’infection à l’échelle de l’organisme, ce qui ne peut être reproduit par des systèmes simplifiés. Ce projet vise ainsi à mieux comprendre le rôle de FOXP1 dans l’immunité contre Tropheryma whipplei et à éclairer les mécanismes expliquant la susceptibilité à la maladie de Whipple.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place et la physiopathologie de la maladie de Whipple. Il permettra également de développer des outils diagnostiques et de prise en charge des patients atteints de maladie de Whipple. Les résultats de ce projet permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans l’infection à T. whipplei et du rôle de FoxP1 dans la régulation de la réponse immunitaire. Ces données pourraient contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques associés aux infections chroniques et aux dysfonctionnements de la réponse immunitaire.
Procédures
Un prélèvement sub mandibulaire sera effectué une seule fois avant l’infection sur souris vigile à l'aide d'une lancette (Golden Rod4MM). Quelques gouttes (100 microlitres environ) de sang sera prélevé sans dépasser le rapport volume/ poids réglementaire. D'autres prélèvements seront réalisés sur animaux morts. La durée de ce geste par le personnel formé et expérimenté n’excèdera pas 1 minute. Le gavage et le MDA font partis des nuisances possibles bien que nous ne pratiquerons le gavage qu’en cas de problème d’habituation à la méthode MDA « Micropipette-guided Drug Administration ». L’habituation au MDA consiste à présenter la solution sucrée à la souris (500microL) le jour 1 en état de contention. La durée de la prise de ce petit volume et la mise sous contention (maintien par le cou) ne devrait pas excéder 1 minute. Le deuxième jour, la souris est légèrement immobilisée en lui maintenant la queue et en lui présentant la boisson. La durée peut être légèrement variable d’un animal à l’autre. L’estimation est de 1 à 2 minutes maximum. A J3, d’après les auteurs de ce processus, la souris boit sans contrainte la boisson. La durée dépendra de chaque souris comme précédemment mais ne devrait pas excéder 2 minutes. Chaque souris se verra proposer seulement le jour de l’infection, cette eau de boisson avec soit du PBS soit la bactérie T. whipplei.
Impact sur les animaux
L’infection orogastrique par T. whipplei est susceptible d’induire des effets indésirables faibles à modérés chez les animaux. Les effets attendus incluent principalement une altération transitoire de l’état général, une légère perte de poids ou un ralentissement de la prise de poids, ainsi qu’une baisse temporaire de l’activité. Des effets digestifs légers, tels qu’une modification transitoire du transit, peuvent également être observés. Ces effets sont généralement modérés, transitoires et réversibles. Aucun effet indésirable sévère n’est attendu, notamment en termes de douleur intense, de détresse respiratoire, de signes neurologiques ou de mortalité liée à l’infection. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière afin de détecter précocement tout signe de souffrance et de mettre en œuvre, si nécessaire, des mesures adaptées. En cas de signes de douleur, de souffrance ou d’angoisse suite à l’infection, un analgésique (buprenorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 0.2 mg/kg de poids corporel.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements de fluides et organes.
Remplacement
Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle murin afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de l’infection par T. whipplei et de comprendre les mécanismes immunitaires sous-jacents, dans le but de fournir des pistes diagnostiques et thérapeutiques pour la prise en charge des patients. En particulier, ce modèle permet d’évaluer l’impact d’une perte de fonction hétérozygote de Foxp1 sur l’installation de l’infection, sa persistance et la qualité de la réponse immunitaire au niveau de l’organisme entier. À ce jour, aucune lignée cellulaire ni modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité des interactions entre T. whipplei et les différentes populations immunitaires, notamment les cellules T CD4+ et les macrophages, ni leur coordination dans le contrôle de l’infection. Les approches in vitro ne permettent pas non plus d’étudier la cinétique de l’infection, sa dissémination tissulaire, ni les mécanismes intégrés impliquant plusieurs organes et compartiments immunitaires. De plus, FOXP1 étant un facteur de transcription impliqué dans la régulation de multiples types cellulaires, son rôle ne peut être pleinement compris qu’à l’échelle d’un organisme intact. Le modèle murin constitue donc une approche indispensable et complémentaire aux études génétiques humaines ayant identifié FOXP1 comme gène de susceptibilité à la maladie de Whipple. Il permet de valider fonctionnellement ces observations, d’établir un lien de causalité entre le déficit en Foxp1 et l’altération de l’immunité anti-T. whipplei, et d’identifier les mécanismes impliqués. Ces données sont essentielles pour améliorer l’identification des individus à risque et orienter le développement de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, du fait de notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminé que 10 animaux/groupe/temps sont nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes (p < 0.05) avec une puissance au moins supérieure à 80%.
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, les animaux seront hébergés en respectant le nombre maximum d’individus par cage, dans des cages équipées afin d’offrir un environnement enrichi et approprié. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint un point limite, la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire.L’étude de l’infection à Tropheryma whipplei implique des interactions complexes entre l’agent infectieux, le système immunitaire et différents tissus, qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des méthodes alternatives in vitro ou in silico. Le recours à un modèle animal est indispensable pour étudier la dynamique de l’infection, la dissémination bactérienne et la réponse immunitaire dans un organisme entier. La souris a été choisie en raison : • de la disponibilité de modèles génétiques pertinents, notamment les souris porteuses d’une mutation hétérozygote perte de fonction du gène FoxP1, • de la bonne caractérisation de son système immunitaire, • de l’existence de données bibliographiques soutenant son utilisation dans l’étude des infections bactériennes. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.
Caractérisation d’un modèle humanisé de myopathie myotubulaire liée à l’X
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris mâles malades atteignent un point limite entre sept et huit semaines, marqué par une paralysie des membres postérieurs et une forte perte de poids. 94 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des mesures hebdomadaires de force, puis un test contractile final sous anesthésie sans réveil, pour caractériser un nouveau modèle humanisé de myopathie myotubulaire. Le porteur reconnaît que les animaux issus du croisement pourraient présenter un phénotype encore inconnu, traité par précaution comme dommageable.
Objectifs
La myopathie myotubulaire liée à l’X (XLMTM) appartient à un groupe de maladies génétiques appelées les myopathies centronucléaires (CNM), caractérisées par une altération sévère de la fonction des muscles squelettiques, touchant exclusivement les individus de sexe masculin. Cette pathologie entraîne une atteinte sévère de la qualité de vie des patients, avec un décès prématuré avant l’âge de 18 mois dans environ la moitié des cas, ou plus tardivement au cours de la petite enfance. À ce jour, aucune thérapie curative n’est disponible. Des travaux antérieurs ont mis en évidence deux variations génétiques susceptibles d’être ciblées, présentes chez près de 70 % des patients atteints de myopathies centronucléaires, dont la myopathie myotubulaire. L’objectif de ce projet est de générer un nouveau modèle murin humanisé de la myopathie XLMTM, porteur de ces variations génétiques humaines, afin de permettre le développement ultérieur d’une stratégie thérapeutique applicable chez l’homme. Ce modèle constituerait un outil pertinent pour l’évaluation préclinique de thérapies géniques dans un contexte de souris humanisée présentant la pathologie.
Bénéfices attendus
La progéniture de ce croisement permettra d’évaluer une preuve de concept thérapeutique ciblant les variations génétiques humaines chez plus de 70 % des patients atteints de CNM, notamment les formes sévères. Ce modèle permettra de valider une approche applicable à diverses formes de CNM.
Procédures
Le projet est divisé en 2 groupes d’animaux : (Groupe 1) : Évaluation de la surexpression d’un gène d’intérêt sur la survie des souris. Un suivi non invasif des souris sera mis en place avec la mesure de la force du corps durant 3 fois 1 minute réalisé une fois par semaine, un test de mesure de la force des pattes durant 3 fois 1 minute réalisé une fois par semaines et une pesée régulière, une fois par semaine de 2 à 4 semaines d’âge, tous les 2 à 3 jours à partir de 4 semaines d’âge et tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines. Ensuite, (Groupe 2) Évaluation de la surexpression d’un gène d’intérêt sur la force des souris : Chaque semaine, deux tests seront effectués : un test non invasif de la force du corps et un test non invasif de la force des pattes. Ces tests dureront 3 fois 1 minute et seront répétés une fois par semaine, de la 4ᵉ à la 7ᵉ semaine. Chaque semaine, une mesure de la coordination motrice sera répétée de la 4e à la 7e semaine. Pour finir, un test de mesure contractile du muscle, réalisé une fois sous anesthésie générale à la fin de l’étude, durant au maximum 1 heure. Une pesée régulière sera mise en place une fois par semaine, de 2 à 4 semaines d’âge, puis tous les 2 à 3 jours à partir de 4 semaines d’âge, et tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines d’âge. Le test de mesure de la force contractile est une procédure chirurgicale sans réveil, au terme de laquelle les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques humanisée utilisées pour ce croisement ne présentent pas de phénotype dommageable. En revanche, les souris mâles atteintes du modèle de la maladie développent une atteinte locomotrice progressive à partir de 4 à 5 semaines de vie et atteignent généralement un point limite entre 7 et 8 semaines. Cette atteinte se traduit notamment par une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids importante. Les souris issues du nouveau croisement pourraient présenter un phénotype encore inconnu. Par précaution, ces animaux seront considérés comme potentiellement dommageables dans l’attente des premières données expérimentales et feront l’objet du même protocole de surveillance et des mêmes critères de point limite que les souris malades du modèle. Les nuisances associées aux tests phénotypiques pourront inclure la peur de la chute lors du test de mesure de la force du corps, le stress lié à la contention ainsi qu’une douleur potentielle lors des injections nécessaires à certaines mesures expérimentales (mesure de la force des pattes et de la coordination motrice). Les souris malades présentent des difficultés locomotrices à partir de 4 semaines, entraînant une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids vers 7 à 8 semaines. Il n’est pas exclu que les animaux puissent ressentir de la douleur liée à des problèmes musculaires (comme des crampes). Les nuisances liées aux tests incluent du stress lors des différents tests pour évaluer le phénotype musculaire, et lors de la contention durant les injections, ainsi qu’une douleur lors de l’insertion de l’aiguille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les muscles et organes nécessaires aux études histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le modèle murin est physiologiquement et structurellement proche de l’Homme, ce qui nous permettra d’étudier, d’une part, la physiopathologie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne suffirait pas à elle seule, car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossibles à mesurer.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi sur la base des données de la littérature, afin de détecter une différence statistiquement significative entre les différents groupes d’animaux (malades, sains, etc.). Lorsque cela est possible, des animaux de la procédure 2 pourront être utilisés pour réduire le nombre nécessaire à la procédure 3. Les tests de mesure de la force du corps, de la force des pattes et de la coordination motrice sont non invasifs ; ils permettent de réutiliser les mêmes animaux à chaque point dans le temps, et un même animal pourra donc produire des données de force globale et contractile, ainsi que des données histologiques et moléculaires.
Raffinement
Pour prévenir toute malnutrition qui pourrait être due à des difficultés locomotrices, de la nourriture hydratée en gelée sera placée dans la cage dès l’apparition des premiers symptômes à 4 semaines. Lors du test sous anesthésie générale, la température corporelle de l’animal sera maintenue à l’aide d’une plaque chauffante. Pour les nouveau-nés, leur capacité à se mouvoir et le comportement maternel seront observés quotidiennement durant la première semaine de vie À partir de l’âge de 2 semaines, les animaux seront pesés de manière hebdomadaire. La fréquence de pesée sera augmentée à tous les 2 à 3 jours dès l’âge de 4 semaines, correspondant au début d’apparition du phénotype, puis à tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines en raison de l’aggravation progressive du phénotype. En cas d'infection importante, à la suite d’une bagarre par exemple, les animaux seront euthanasiés sur avis vétérinaire.
Choix des espèces
Le modèle de souris récapitule fidèlement le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et constitue donc un bon modèle pour l’étude des mécanismes pathologiques et l’évaluation de thérapies. La maladie affectant les hommes, seuls les animaux mâles seront étudiés. Les défauts locomoteurs apparaissent à 4 semaines et progressent jusqu’à 8 semaines. Le suivi longitudinal de force globale sera donc effectué à partir de 4 semaines, avec un test contractile final à 7 semaines, précédant la paralysie des membres postérieurs, dans le cas du groupe 2. Pour les études de survie (groupe 1), le suivi de la force est prolongé jusqu'à atteinte d'un point limite. Tous les animaux sont pesés régulièrement dès 2 semaines d'âge pour détecter toute détresse animale au plus vite
Modulation thérapeutique de l’architecture nucléaire par AAV dans un modèle murin de myopathie centronucléaire et wild type
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Atteintes d'une forme grave de myopathie qui les tue spontanément vers six ou sept semaines, une partie des 224 souris de ce projet développe faiblesse musculaire et perte de poids indépendamment du traitement. Le niveau de souffrance déclaré va de modéré à sévère, et toutes les souris, malades comme témoins, sont tuées en fin d'expérience pour analyse des muscles. Elles reçoivent une injection unique de thérapie génique par virus sous anesthésie légère, puis des tests de force et de marche. Seuls des mâles sont utilisés, la maladie étant liée au chromosome X.
Objectifs
Ce projet a pour but de tester si l’injection d’un traitement génétique peut améliorer le phénotype musculaire de souris atteintes d’une forme grave de myopathie rare. Cette maladie ne dispose actuellement d’aucun traitement curatif. Pour cela, on utilisera des virus inoffensifs capables de transporter soit de petites molécules destinées à bloquer certains gènes susceptibles d’aggraver la maladie, soit des copies complètes de ces mêmes gènes, afin d’en étudier les effets dans des souris contrôles et dans des souris malades. Le traitement sera administré après la naissance afin de corriger le fonctionnement des muscles altérés ou d’analyser les conséquences de cette modulation génétique dans un contexte musculaire sain et pathologique. En complément de ces approches, une étude pilote sera réalisée à l’aide d’une autre méthode de blocage génétique. Cette technique vise à bloquer spécifiquement une molécule d’ARN soupçonnée de jouer un rôle dans la maladie. Ce traitement sera injecté localement dans le muscle afin d’en évaluer l’efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait démontrer qu’il est possible de corriger certains défauts musculaires en ciblant des gènes spécifiques, ou que l’augmentation de l’expression de certains gènes a un effet positif ou négatif sur la fonction musculaire. À terme, cela pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies musculaires génétiques sévères qui ne disposent aujourd’hui d’aucun traitement curatif. Ce projet permettra aussi d’identifier des gènes à privilégier ou à éviter dans une approche thérapeutique.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique par voie systémique ou intramusculaire sous anesthésie légère. L’injection durera moins de cinq minutes par animal. Aucun geste chirurgical lourd ne sera réalisé. Des tests fonctionnels non invasifs (force de préhension, analyse de la démarche, test d’endurance) seront effectués pour évaluer l’effet des traitements. À la fin de l’expérience, après anesthésie et euthanasie, des prélèvements musculaires seront réalisés pour analyses histologiques et moléculaires.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent entraîner un léger inconfort transitoire au point d’injection (rougeur, légère inflammation) ou un stress momentané lié à la manipulation. Chez les souris malades, des signes cliniques sévères sont attendus indépendamment du traitement, en lien avec la maladie : perte de poids progressive, faiblesse musculaire marquée, réduction de la mobilité, difficultés d’alimentation et mortalité spontanée entre 6 et 7 semaines d’âge. Chez les animaux sains comme chez les animaux malades, la diminution ou l’augmentation de l’expression de certains gènes candidats pourrait entraîner une faiblesse musculaire, une baisse d’activité, une altération de la marche ou une aggravation du phénotype musculaire. Ces effets, difficiles à prédire, feront l’objet d’une surveillance attentive.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience afin de permettre l’analyse détaillée des muscles et d’autres organes aux niveaux histologique, cellulaire et moléculaire. Ces analyses post-mortem sont indispensables pour évaluer précisément l’effet des traitements et comprendre les mécanismes biologiques impliqués. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance.
Remplacement
Il n’est pas possible d’utiliser uniquement des cellules en culture à la place des souris, car les phénomènes étudiés (comme la position des noyaux, la force musculaire ou les effets généraux d’une modification de l’expression de certains gènes) nécessitent un organisme entier pour être correctement observés.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour être le plus faible possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Des méthodes statistiques seront utilisées pour s’assurer que ce nombre est suffisant, y compris pour les groupes recevant une augmentation de l’expression de certains gènes. Des tests fonctionnels complémentaires (force de préhension, tapis roulant, analyse de la démarche et évaluation de la fonction musculaire) contribueront également à l’évaluation globale des effets du traitement.
Raffinement
Les procédures susceptibles de provoquer de la douleur ou du stress sont réalisées sous anesthésie afin de limiter au maximum la souffrance. Les cages sont enrichies (abris, nourriture en gel facilement accessible) et les animaux sont surveillés régulièrement. Des critères précis ont été définis pour repérer rapidement tout signe de souffrance. Si nécessaire, la procédure est interrompue et l’animal est euthanasié sans délai afin d’éviter toute souffrance excessive.
Choix des espèces
Le modèle choisi reproduit de manière pertinente la maladie humaine étudiée (une forme grave de myopathie) : les souris présentent des noyaux mal positionnés dans leurs muscles (au centre plutôt qu’en périphérie), une faiblesse musculaire et une mort précoce, ce qui permet d’étudier la maladie dans des conditions réalistes. Seuls les mâles seront utilisés car cette maladie génétique touche principalement les mâles (elle est liée au chromosome X). L’utilisation de femelles n’aurait donc pas d’intérêt scientifique dans cette étude. Les souris seront traitées entre 2 et 5 semaines d’âge, ce qui correspond à une période où les muscles sont encore en cours de développement. Cela permet une bonne efficacité du traitement. Les souris malades ne vivent généralement que jusqu’à 6 ou 7 semaines ; il est donc important d’intervenir tôt pour évaluer les effets du traitement avant que la maladie ne soit trop avancée. Les souris contrôles (WT), y compris celles recevant des vecteurs de surexpression, suivront le même protocole d’injection afin que les groupes soient comparables.
Prévention de l’épilepsie dans un modèle de souris. MODIFICATION
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue sur les souriceaux, injections répétées, chirurgie de quarante-cinq minutes sur des femelles gestantes, injection sur les embryons, puis induction de crises d'épilepsie : 4 084 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 672 en gravité sévère. Le test d'induction de l'épilepsie provoque une détresse chez l'animal, et la biopsie une douleur modérée. Une partie des souris est gardée vivante pour la reproduction, dont cinquante-deux femelles réengagées dans une autre procédure, le reste étant tué pour prélèvement. Le projet teste une protéine censée réduire la sévérité de l'épilepsie, avec des objectifs décrits en deux phrases très brèves.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement de crise d’épilepsies. Nous voulons également tester un nouveau traitement potentiel pour protéger des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de tester un nouveau traitement contre l’épilepsie et d’étendre nos connaissances sur le rôle de nos cellules neuronales d’intérêt sur leur survenance. En outre la modification apportée à cette demande vise à tester une protéine en particulier dans sa capacité à rèduire la sévérité de l'épilepsie.
Procédures
- Les souriceaux, immobilisés pendant quelques secondes, subiront une biopsie à la queue (moins d'une seconde). - Les femelles gestantes subiront une injection d’une durée de 5 secondes une fois par jour pendant 3 jours et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale. - Les embryons subiront une injection d'une durée de 5 secondes. - Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une injection pendant 20 minutes. - Des animaux subiront une intervention chirurgicale de 1 heure sous anesthésie générale et des points de sutures. - Des animaux subiront une injection (1x10 sec). Des animaux subiront 7 injections intrapéritonéales pendant 2 semaines (7 x 10sec).
Impact sur les animaux
- La biopsie à la queue provoque une douleur modérée. - Les injections peuvent induire une douleur légére et brève. - Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal. - Le test d’induction de l’épilepsie peut provoquer une détresse chez l’animal.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 sont gardés en vie pour des accouplements ultérieurs et 52 femelles subiront la Procédure4. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. Le développement cérébral et l’épilepsie ne peuvent être étudiés qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors des chirurgies, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'antidouleurs avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. L’application stricte des points limites spécifiques aux expériences réalisées conduira à une prise en charge de la souffrance éventuelle des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. Pour la biopsie, les souriceaux ont entre 4 et 7 jours ce qui permet de connaitre leur génotype avant le sevrage et le traitement commençant au 10ème jour. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.
Etude de la modulation des circuits du cortex piriforme et des performances olfactives par les projections du télencéphale basal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées du crâne sous anesthésie pendant une à deux heures pour recevoir une injection virale, 1 410 souris génétiquement modifiées sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, quarante d'entre elles tuées sans réveil. Un dispositif est implanté sur le crâne, puis les animaux réalisent une tâche olfactive jusqu'à trois heures par jour pendant six à sept semaines. Pour les motiver, le porteur impose une restriction d'accès à l'eau pouvant entraîner une déshydratation modérée et une perte de poids. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélèvement, l'étude portant sur le filtrage des odeurs par le cerveau.
Objectifs
Notre cerveau est capable de détecter des milliers d’odeurs, mais il ne traite pas toutes ces informations de la même façon. Par exemple, quand nous avons faim, l’odeur d’un plat cuisiné devient bien plus attrayante que lorsque nous sortons d’un bon repas. Un autre exemple est celui de certaines odeurs que nous ne "sentons" pas mais qui deviennent détectables si nous y prêtons attention. Comment le cerveau fait-il pour "mettre en avant" certaines odeurs plutôt que d’autres ? Nous pensons qu’une région cérébrale appelée télencéphale basal joue un rôle clé dans ce processus. Elle envoie des signaux chimiques vers une autre zone, le cortex piriforme, qui est le "centre de traitement" des odeurs. Ces signaux agiraient comme un filtre : ils renforcent la perception des odeurs importantes dans un contexte donné (comme la faim ou l’attention) et atténuent celle des autres. Pour vérifier cette hypothèse nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées. Grâce à des techniques de pointe, nous pourrons activer ou désactiver spécifiquement les neurones du télencéphale basal et observer comment cela influence la perception des odeurs. Nous enregistrerons aussi l’activité cérébrale des souris pendant qu’elles réalisent des tâches olfactives, pour comprendre l’impact de ces signaux sur le fonctionnement de leur cerveau. L’ensemble de notre projet sera mis en œuvre dans l’application des 3 Rs et le nombre d’animaux utilisé sera le plus faible possible.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre l'organisation et la fonction des interactions entre deux régions du cerveau, le télencéphale basal et le cortex olfactif. Il nous permettra aussi de mieux comprendre quand et comment le télencéphale basal est mis en jeux et communique avec le cortex olfactif pour moduler la perception des odeurs. Par ailleurs, ce projet examine pour la première fois deux voies issues du télencéphale basal. Elles utilisent des messagers chimiques différents mais pourraient agir ensemble pour moduler notre odorat. Comprendre les interactions entre ces deux voies permettrait d’éclairer les mécanismes cérébraux de l’attention. Chez l’humain, la récente épidémie de Covid nous a rappelé combien les troubles de l'olfaction peuvent affecter notre vie quotidienne. Ces troubles sont aussi parmi les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer et d'autres neuropathologies dégénératives. Pourtant, le lien entre odorat et ces pathologies n’est pas clairement établi. Il y a en revanche un consensus sur le fait que les voies issues du télencéphale basal qui modulensont parmi les premières touchées dans les maladies neurodégénératives comme Alzheimer. En étudiant ces voies chez l’animal, nous pourrions mieux détecter et comprendre l'origine des troubles de l'olfaction chez l’humain.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale (durée 1 à 2 heures) réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde. Certains animaux réaliseront une tâche comportementale de détection olfactive 3 semaines après la chirurgie. Cette tâche dure au maximum 3h/jour pendant au maximum 6 à 7 semaines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement observés sont principalement liés aux chirurgies réalisées sous anesthésie. Les chirurgies peuvent induire des douleurs aigües, inflammations, hypothermies, sécheresses oculaires et déshydratations. De faibles pertes de poids peuvent survenir les jours suivants la chirurgie. Les souris auront un dispositif implanté sur le crâne pendant qu'elles réalisent un test comportemental. Cela n’est pas douloureux mais peut être une source de stress pour l’animal et nécessite une phase d’habituation au dispositif. Afin de garantir une motivation comportementale indispensable à l’apprentissage des tests olfactifs, les animaux concernés subiront des périodes de restriction hydrique. Une déshydratation modérée peut survenir et avoir un léger impact sur la prise alimentaire et entrainer une perte de poids.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement
Remplacement
Notre étude porte sur des circuits cérébraux complexes impliqués dans la perception des odeurs. Malheureusement, il n’existe aujourd’hui aucune alternative (comme des cultures cellulaires ou des modèles informatiques) capable de reproduire fidèlement ces mécanismes et ces circuits. Notre projet inclut aussi des tests comportementaux (comme la réaction des souris à des odeurs dans différents contextes). Ces expériences ne peuvent être réalisées que sur des animaux vigiles et actifs, afin d’étudier leurs performances olfactives et comment leur cerveau traite les informations olfactives en temps réel. Les souris sont le meilleur modèle pour notre recherche, car les outils d’ingénierie génétique y sont les plus avancés, ce qui nous permet de cibler précisément les circuits cérébraux à étudier. De plus, les découvertes faites chez la souris ont déjà démontré leur pertinence pour comprendre des mécanismes similaires chez l’humain, notamment en neurosciences.
Réduction
Même si nous ne pouvons pas remplacer totalement les souris par des modèles artificiels, nous faisons tout pour réduire leur nombre au maximum. Dans notre projet, le nombre d’animaux utilisés a été soigneusement déterminé pour concilier rigueur scientifique, validité statistique et respect du bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été estimé à partir de protocoles similaires déjà validés dans nos travaux antérieurs, de façon à atteindre des résultats statistiquement fiables, sans excès. Nous utilisons des individus mâles et femelles pour limiter la production globale d’animaux tout en tenant compte des variations biologiques. Comme nous explorons des circuits cérébraux qui n’ont jamais été décrits, le nombre exact d’expériences dépendra des résultats obtenus. Nous ne pouvons pas prédire statistiquement ces découvertes, mais les expériences seront arrêtées dès qu’un résultat significatif et original est obtenu, pour éviter d’utiliser des animaux inutiles. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour confirmer que nos résultats sont fiables. Enfin, grâce à des techniques de pointe qui nous permettent de manipuler uniquement les neurones et circuits cérébraux d’intérêt, nous réduisons de moitié le nombre d’animaux nécessaires par rapport à des méthodes classiques qui stimulent à l’aveugle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (avec bâton à ronger, matériaux de nidification, tube de change). Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants, leurs yeux sont protégés avec du gel, et les conditions d’anesthésie générale avec analgésiques sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Après les chirurgies, les animaux retourneront dans leur cage avec leurs congénères sauf dérogation pour les animaux destinés aux tests comportementaux. En phase post-opératoire, de la nourriture sous forme de gel est placée dans les cages afin de minimiser les efforts des animaux pour se nourrir et accélérer leur convalescence. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec la vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Être des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour une prise en charge adaptée des animaux. Les animaux devant effectuer une tâche comportementale ont des phases de récupération de minimum 3 semaines après la chirurgie. Ils sont progressivement habitués à être manipulés par l’expérimentateur, à la pièce et au dispositif expérimental. Cette phase d’habituation vise à minimiser la peur et les réactions émotionnelles des animaux. La restriction à l’accès à l’eau, avec habituation progressive, n’affectera pas leur santé ou leur bien-être, car les animaux auront accès à l’eau deux fois dans la journée (pendant les tests, puis après les tests pendant 1-2h) pour compenser leurs besoins.
Choix des espèces
La diversité neuronale est telle dans le cerveau que les souris transgéniques sont nécessaires pour identifier et manipuler des populations neuronales spécifiques. Les lignées de souris qui seront utilisées dans ce projet permettent ces expériences sur des populations de neurones déterminées. L'utilisation de ces modèles transgéniques simplifie l'interprétation des résultats et permet in fine de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les animaux utilisés dans ce projet entreront en procédure à un âge minimum de 2 mois et maximum de 4 mois. A cet âge le développement est terminé et la souris est considérée comme adulte. La fin de la procédure sera au maximum à 6-7 mois.
Fonctionnement, développement et évolution des circuits neuronaux chez la larve du poisson zèbre et Astyanax mexicanus
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Autres poissons : 3060
Pour étudier le développement et l'évolution des circuits neuronaux, 6 120 larves de poisson zèbre et d'Astyanax mexicanus sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées à l'issue. La plupart des séances consistent en imagerie sur larve éveillée mais immobilisée dans un gel, avec des stimulations visuelles, mécaniques, électriques ou optogénétiques. Certaines procédures invasives suppriment de manière ciblée des neurones, par laser ou chirurgie, sous anesthésie. Le porteur classe ces travaux en recherche fondamentale destinée à la connaissance et à la vulgarisation, les applications médicales n'étant évoquées qu'à long terme.
Objectifs
Le projet a pour but de réaliser des expériences de recherche fondamentale afin de mieux comprendre le fonctionnement du système nerveux, en particulier le développement et l’évolution des circuits neuronaux. L’équipe cherche à comprendre comment le cerveau assure les fonctions cognitives et contrôle le comportement animal. Pour cela, le projet s’appuie sur deux modèles animaux, le poisson zèbre et Astyanax mexicanus. Ces espèces présentent des avantages génétiques, comportementaux et méthodologiques, notamment pour les approches d’imagerie. Leur génome bien caractérisé en fait des modèles particulièrement adaptés à l’utilisation de techniques génétiques avancées, telles que l’optogénétique, permettant de moduler l’activité de certains neurones à l’aide de la lumière. Dans ce cadre, des larves transgéniques exprimant des protéines fluorescentes sensibles à l’activité cellulaire sont utilisées, ce qui permet de visualiser et d’enregistrer l’activité de larges populations neuronales à l’échelle cellulaire, ainsi que d’étudier de manière ciblée certains circuits neuronaux. Astyanax mexicanus constitue par ailleurs un modèle précieux pour étudier l’évolution, car il existe des morphes de surface et cavernicoles au sein de la même espèce. Certaines populations se sont adaptées à la vie en cavernes sans lumière, tandis que les populations de surface ont conservé des traits ancestraux. Cette comparaison permet d’analyser comment des pressions environnementales différentes conduisent à des adaptations des circuits neuronaux et des comportements associés. Ainsi, la combinaison de ces deux modèles permettent d’aborder les questions centrales du projet, notamment l’apparition et l’évolution de l’activité spontanée du cerveau au cours du développement et de l’évolution, son rôle biologique, et la manière dont le cerveau traite les informations provenant de l’environnement.
Bénéfices attendus
Ce projet comporte exclusivement des travaux de recherche fondamentale, dont l’objectif est d’améliorer les connaissances sur le fonctionnement du cerveau et de les diffuser auprès du grand public. Cet objectif est poursuivi à travers des actions de communication et de vulgarisation scientifiques. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à ouvrir la voie au développement de nouvelles approches pour la réparation du cerveau après un traumatisme ou dans le cadre de maladies neurodégénératives, comme la maladie de Parkinson. Elles pourraient également aider à mieux comprendre les mécanismes permettant d’améliorer les capacités cognitives et l’adaptation aux changements rapides de l'environnement
Procédures
Les larves sont soumises à différentes procédures expérimentales, classées en procédures non invasives et invasives. La majorité des procédures réalisées sont non invasives. Elles consistent en des sessions d’observation et d’enregistrement de l’activité cérébrale à l’aide de techniques d’imagerie, ainsi qu’en des tests comportementaux en nage libre. Ces sessions durent au maximum deux heures, à raison d’une session par jour pendant quatre jours consécutifs au maximum. Pendant les expériences d’imagerie, les larves sont éveillées mais temporairement immobilisées dans un gel adapté afin de permettre les enregistrements. Des stimulations sensorielles peuvent être appliquées afin d’évaluer les réponses des animaux. Elles incluent des stimulations visuelles, auditives, mécaniques ou d’origine optogénétique, d’une durée d’un seconde et répétées un nombre limité de fois. Des stimulations électriques très brèves et faibles peuvent également être utilisées pour déclencher des réponses comportementales de sursaut. Un traitement pharmacologique par immersion peut être appliqué pendant une durée maximale d’une heure. Ces traitements visent à moduler temporairement l’activité nerveuse ou sensorielle, de manière réversible. Les procédures invasives correspondent à des interventions visant à supprimer ou réduire de manière ciblée l’activité de certaines neurones ou structures, réalisées soit par des approches génétiques, soit par exposition de quelques secondes au laser, ou chirurgie réalisée avant le stade de larve autonome. Dans tous les cas, pour les procédures invasives, les larves sont anesthésiées.
Impact sur les animaux
Les poissons utilisés dans ce projet sont maintenus éveillés pendant la majorité des procédures, sans recours systématique à l’anesthésie. Pour certaines procédures d’imagerie, les poissons peuvent être temporairement immobilisés, ce qui peut entraîner un stress de courte durée lié à la restriction de leurs mouvements. Certaines interventions chirurgicaux, même si réalisés sous anesthésie, pourraient éventuellement provoquer un stress ou un inconfort temporaire. Les observations réalisées dans des études précédentes indiquent que, sur la période suivie après ce type d’intervention, les poissons ne présentent pas de modification notable de leur comportement de nage ni de leur capacité à s’alimenter, et semblent s’adapter à ces conditions et peuvent bien interagir avec leur environnement.
Devenir
À l’issue des procédures, toutes les larves sont euthanasiées. Les larves utilisées étant génétiquement modifiées, elles ne peuvent pas être replacées en dehors du laboratoire. De plus, certaines études nécessitent des analyses réalisées après la fin de l’expérience, directement sur les animaux post-mortem, afin d’obtenir des informations complémentaires.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment l’activité du cerveau est liée aux informations sensorielles et au comportement. Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre de nombreux neurones, qui ne peuvent pas être reproduites de manière réaliste à l’aide de modèles informatiques ou de cultures de cellules isolées. L’étude nécessite donc l’utilisation d’un organisme vivant, dans lequel il est possible d’observer simultanément l’activité cérébrale et le comportement. Les larves de poisson zèbre et d’Astyanax mexicanus constituent à ce jour les modèles vertébrés les plus adaptés pour répondre à ces questions. Leur transparence permet l’observation directe de l’activité du cerveau à l’aide de techniques de microscopie non invasives, tout en limitant fortement les interventions sur l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est strictement limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques, tout en garantissant des résultats fiables. Les poissons adultes des deux espèces, poisson zèbre et Astyanax mexicanus, sont uniquement utilisés pour produire des embryons et pas pour l’expérimentation. Ils vivent en groupe, ce qui est essentiel pour leur bien-être, et leur nombre est maintenu aussi bas que possible tout en assurant de bonnes conditions de vie. Sur toute la durée du projet, environ 6120 larves seront utilisées, soit environ 136 larves par chercheur et par an. Ces estimations reposent sur l’expérience acquise au laboratoire afin d’utiliser uniquement le nombre d’animaux réellement nécessaire. Pour chaque type de procédure, le nombre de larves est adapté en fonction de l’ampleur attendue des différences entre groupes expérimentaux. Lorsque ces différences sont plus nettes, un nombre réduit de larves (environ 3 à 5 par groupe) est suffisant. À l’inverse, lorsque les différences attendues sont plus modestes, un nombre légèrement plus élevé est requis (environ 6 à 10 larves par groupe). Cette approche permet d’identifier des effets biologiquement pertinents sans augmenter inutilement le nombre d’animaux. Afin d’éviter de produire trop d’animaux, seuls les embryons réellement utiles aux expériences sont conservés. De plus, un même animal peut parfois être utilisé pour plusieurs types d’analyses complémentaires, ce qui permet de limiter encore le nombre total d’animaux utilisés. L’ensemble de ces mesures vise à réduire au maximum le recours aux animaux tout en permettant de faire avancer les connaissances scientifiques.
Raffinement
Toutes les mesures possibles sont mises en œuvre afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance, le stress ou les dommages durables chez les animaux. Les larves sont maintenues dans des conditions d’élevage adaptées à chaque espèce (28 degrés Celsius pour le poisson zèbre, 24 degrés Celsius pour A. mexicanus), en groupes. Elles sont nourries deux fois par jour avec une solution de paramécies afin de maintenir un état physiologique optimal et de stimuler des comportements naturels, notamment la chasse. Un suivi quotidien est assuré lors des nourrissages, et une surveillance est également mise en place les week-ends par un prestataire spécialisé. La plupart des expériences utilisent des méthodes non invasives, c’est-à-dire qu’elles ne nécessitent pas d’intervention lourde sur les animaux. Par exemple, des techniques de microscopie permettent d’observer l’activité des neurones chez des larves sans les endommager. Après les expériences, les larves restent en bonne santé, ne présentent pas de troubles du comportement et peuvent continuer à se développer normalement jusqu’à l’âge adulte, comme cela a déjà été constaté dans des études précédentes. Pour des procédures plus invasives, les larves sont d’abord anesthésiées par refroidissement, puis avec une solution anesthésiante. Elles sont ensuite maintenues immobiles dans une substance gélifiée qui aide à limiter les saignements et favorise la cicatrisation. Une attention particulière est portée au bien-être des animaux tout au long des procédures et une quantité de nourriture plus importante est prévue pour compenser les éventuelles perturbations sensorielles liées aux interventions. Si, au cours d’une expérience, une larve présente des signes de détérioration de son état de santé ou de souffrance, l’expérience est immédiatement arrêtée et l’animal est euthanasié, afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les larves du poisson zèbre et d’A. mexicanus possèdent une peau transparente, ce qui permet d’observer directement, chez l’animal intact, l’activité de grands réseaux de neurones grâce à des techniques de microscopie. Leur génome bien connu en fait des candidats idéaux dans l’utilisation de nouvelles techniques de génétique, tels que l’optogénétique, qui permettent de contrôler l’activité de certains neurones à l’aide de la lumière. Dans ce cadre, des larves transgéniques exprimant des protéines fluorescentes qui émettent un signal en réponse à l’activité cellulaire dans des neurones spécifiques ou dans les cellules gliales sont utilisées, permettant de visualiser et d’enregistrer l’activité de dizaines de milliers de cellules, ainsi que de manipuler de manière ciblée certains circuits neuronaux. De plus, ces deux espèces présentent une riche variété de comportements moteurs, facilitant l’étude des liens entre activité cérébrale et comportement. A. mexicanus constitue par ailleurs un modèle précieux pour étudier l’évolution, car il existe des morphes de surface et cavernicoles de la même espèce; donc certains s’étant adaptés à la vie en cavernes sans lumière tandis que les populations de surface ont conservé des traits ancestraux . Cette comparaison permet d’analyser comment des pressions environnementales différentes conduisent à des adaptations rapides des circuits neuronaux et des comportements associés. Les expériences sont réalisées principalement entre 2 et 9 jours après la fécondation, période durant laquelle les larves respirent directement à travers leur peau, ce qui permet de les immobiliser sans risque. Pour des stades plus avancés (10 à 30 jours), des dispositifs assurant un apport en oxygène sont utilisés afin de maintenir des conditions compatibles avec l’enregistrement de l’activité neuronale.
Étude des mécanismes de contrôle des tumeurs dans le cadre d’immunothérapies innovantes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 612 souris vont être utilisées dans ce projet sur les cellules CAR T, chacune recevant d'abord une greffe de cellules tumorales. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées en fin de protocole, sans réutilisation ni adoption possibles puisqu'elles portent une tumeur. Une partie subit la pose chirurgicale d'une fenêtre d'observation, puis des séances d'imagerie sous anesthésie de deux à huit heures. Le porteur présente l'imagerie sur animal vivant comme un moyen de réduire les effectifs, argument qui coexiste avec un total de plus de six mille souris.
Objectifs
Le cancer est une maladie qui touche de nombreuses personnes et dont certains types restent très difficiles à traiter. Ces dernières années, un nouveau type de traitement a été développé : les immunothérapies. Plutôt que d’agir uniquement sur la tumeur, ces traitements aident le système immunitaire du patient à reconnaître et à éliminer les cellules cancéreuses. Parmi ces traitements, les cellules CAR T sont une approche prometteuse. Il s’agit de cellules du système immunitaire du patient, modifiées en laboratoire pour mieux cibler la tumeur. Elles ont déjà permis de soigner certains cancers du sang, mais leur efficacité est encore limitée. L’objectif de notre projet est donc de mieux comprendre comment ces cellules CAR T agissent et pourquoi elles ne fonctionnent pas toujours de manière optimale. Pour ce faire, nous comparerons l’efficacité des cellules CAR T dans des modèles de tumeurs liquides répondant à ce traitement, par rapport à celle obtenue dans des modèles de tumeur solides. En particulier, nous allons étudier : - Par quels mécanismes ces cellules CAR T impactent-elles la croissance des tumeurs ? - Quels sont les obstacles qui empêchent les cellules CAR T d’éliminer efficacement les cellules cancéreuses ? - Comment optimiser ces traitements en favorisant une coopération des cellules CAR T et le système immunitaire du patient Pour répondre à ces questions, nous devons observer en temps réel ce qui se passe dans la tumeur lorsque l’on administre le traitement, et comment le système immunitaire est recruté au site tumoral. Comme c’est impossible chez l’humain, nous utilisons des modèles animaux, en particulier la souris, dont le système immunitaire fonctionne de manière très similaire au nôtre. Nous avons recours à des techniques d’imagerie avancée qui nous permettent de suivre le comportement des cellules dans la durée en minimisant les perturbations pour l’animal et en diminuant le nombre de souris nécessaires aux expériences. En comprenant mieux ces mécanismes, notre objectif est d’améliorer ces thérapies, en les rendant plus efficaces et plus accessibles aux patients, tout en respectant au maximum le bien-être animal, et en limitant l’utilisation d’animaux aux expériences strictement nécessaires.
Bénéfices attendus
Le développement des immunothérapies a profondément transformé la prise en charge du cancer, offrant de nouvelles perspectives aux patients pour lesquels les traitements conventionnels sont inefficaces. Cependant, malgré des succès notables, ces thérapies présentent encore des limites, en particulier dans le traitement des tumeurs solides. Notre projet vise à lever ces freins en approfondissant la compréhension des mécanismes d’action de certaines cellules et en explorant des stratégies pour améliorer leur efficacité. Les bénéfices scientifiques et médicaux attendus sont multiples : 1. Améliorer la compréhension des mécanismes par lesquels ces cellules limitent la progression tumorale : en étudiant à la fois leur capacité à détruire les cellules cancéreuses et leur potentiel à stopper la croissance tumorale, nous pourrons mieux anticiper les mécanismes de résistance et identifier des leviers pour renforcer l’action thérapeutique de ces cellules. 2. Développer des stratégies innovantes pour mobiliser le système immunitaire naturel : nous chercherons à exploiter la capacité de ces cellules à recruter et activer d’autres cellules immunitaires pour amplifier leur efficacité. 3. Identifier des biomarqueurs prédictifs de réponse au traitement : en mettant en lumière de nouveaux mécanismes de contrôle tumoraux et en précisant leur contribution relative, nous pourrons identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité de ces cellules. Sur le plan clinique, ces avancées pourraient contribuer à accélérer l’intégration des nouvelles immunothérapies en clinique, en fournissant des données précises sur leur fonctionnement et en optimisant leur utilisation pour un plus grand nombre de patients. En outre, notre étude vise à proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques basées sur le mode d’action des cellules que nous allons explorer. À terme, il pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces, mieux tolérées et accessibles pour un plus large éventail de patients atteints de cancers résistants aux traitements actuels. .
Procédures
Les animaux recevront au début du protocole une injection de quelques secondes pour implanter la tumeur. Ils seront ensuite manipulés trois fois par semaine pendant moins de cinq minutes pour mesurer la taille de la tumeur dans le cas des tumeurs solides. Les animaux seront observés tous les jours pour évaluer leur état général. Certains animaux recevront une injection de traitement d’une durée de quelques secondes, réalisée une à plusieurs fois selon le protocole. Pour les études nécessitant une observation en temps réel, certains animaux subiront une intervention chirurgicale d’environ 30 minutes à 1 heure afin de poser une fenêtre d’observation. Les animaux concernés par les séances d’imagerie seront anesthésiés puis maintenus endormis entre deux et huit heures selon la durée d’acquisition. Cette séance d’imagerie sera sans réveil pour la plupart des animaux hormis ceux ayant une fenêtre d’observation. Dans les études de tumeurs liquides, certains animaux recevront une injection intraveineuse ou intrapéritonéale de quelques secondes pour transférer les cellules tumorales ou les cellules thérapeutiques ou les autres thérapies. Ces animaux seront ensuite manipulés brièvement une à deux fois par semaine pour un suivi clinique. En fin de protocole, tous les animaux feront l’objet d’une euthanasie d’une durée de quelques minutes pour permettre les analyses cellulaires, protéiques ou génomiques prévues.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être exposés à divers effets indésirables liés aux tumeurs, aux traitements administrés et aux procédures expérimentales. Si on se base sur la définition des libertés individuelles de l’animal, les effets indésirables pourraient être les suivants : Faim, soif, malnutrition : certaines tumeurs solides peuvent induire une perte de poids progressive lors d’un développement tumoral avancé, et la fatigue des animaux peut occasionner des difficultés d’accès à la nourriture. Peur, détresse : les manipulations, la contention, constituent des sources potentielles de stress et de détresse. Douleur, lésions, maladie : la croissance tumorale peut être à l’origine de douleurs, notamment en cas de rupture
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.
Remplacement
Les hypothèses seront validées préalablement sur des modèles in vitro avant toute expérimentation animale. En outre, les différentes doses de traitement seront testées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Nous utiliserons la littérature scientifique et les bases de données existantes pour optimiser la conception des expériences et réduire la nécessité d’expérimentations in vivo. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. Par exemple, la composition du microenvironnement de chaque organe est très différente et peut difficilement être reproduit in vitro. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.
Réduction
L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, plusieurs analyses seront effectuées sur les mêmes animaux. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront de tirer des conclusions scientifiques robustes pouvant directement bénéficier le développement thérapeutique en clinique. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables avec des effets attendus plus ou moins forts. En fonction de notre question le nombre de groupes peut être variables. Ils sont optimisés et réduits au maximum tout en conservant une forte puissance statistique. Nous pourrons donc obtenir des résultats significatifs tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux de ce projet ne seront pas réutilisés car ils ont reçu de la tumeur.
Raffinement
Des points limites précoces seront appliqués afin de détecter rapidement toute altération de l’état général (baisse d’activité, début de déshydratation, diminution de prise alimentaire, taille de la tumeur). Dès l’apparition de ces signes, des mesures de soutien simples seront mises en place : - Mise à disposition précoce de gel hydrique et de nourriture humide, pour faciliter l’hydratation et l’alimentation des animaux. - Regroupement des manipulations pour réduire la fréquence de contention et limiter le stress associé. - Réhydratation par injection lors des anesthésies profondes prolongées, notamment lors des procédures d’imagerie intravitale - Maintien thermique systématique lors des anesthésies et des procédures d’imagerie pour éviter les variations de température. - Litière douce et soins si ulcération des tumeurs Ces mesures permettront de limiter la douleur et l’inconfort et d’améliorer la qualité de vie des animaux tout au long du protocole.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus adapté à notre étude, car son système immunitaire est proche de l’humain et permet d’évaluer l’efficacité des cellules étudiées dans un environnement tumoral réaliste. Par ailleurs, c’est un modèle très utilisé ce qui permet d’avoir une bibliographie importante. Contrairement aux modèles in vitro, le modèle murin permet d’analyser les dynamiques cellulaires en temps réel. Les interactions entre cellules évoluent au fil du temps, et ces changements ne peuvent pas être reproduits en culture. De plus, nous étudions le recrutement du système immunitaire par certaines cellules, un processus impliquant de nombreuses cellules et signaux provenant d'autres organes qui ne peuvent pas être reproduit en dehors d’un organisme vivant. Enfin, le modèle murin permet d’utiliser des techniques d’imagerie intravitale, qui offrent une observation directe, précise et longitudinale, ce qui réduit ainsi le nombre d’animaux nécessaires en maximisant les données obtenues par individu. Toutes les souris utilisées seront d’âge adulte entre 6 et 16 semaines afin d’étudier un système immunitaire mature et proche de la réponse immunitaire humaine.