Recherche fondamentale

Pour reproduire chez le rat la neuropathie douloureuse provoquée par les chimiothérapies anticancéreuses, 192 rats reçoivent huit injections intraveineuses d'anticancéreux sur vingt-cinq jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils développent au fil des injections une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, évaluée chaque semaine par des tests tactiles et thermiques. Le porteur qualifie cette induction de nuisance "indispensable à la conduite de l'étude". Un prélèvement sanguin final précède la mise à mort, destinée à des analyses sanguines et tissulaires.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques utilisés dans le cancer du sein, le cancer colorectal, le cancer du poumon. Cette neuropathie se manifeste par des désordres sensitifs dans les mains et les pieds (fourmillements, picotements et douleur), altérant la qualité de vie des patients et pouvant persister longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique reste très limitée, avec notamment aucun traitement préventif, et des traitements peu efficaces pour traiter les douleurs associées. Des travaux récents menés au sein de notre équipe de recherche ont mis en évidence l’activation de processus inflammatoires dans nos modèles animaux de neuropathie chimio-induite, et l’identification de potentielles cibles thérapeutiques pour atténuer les douleurs associées à cette neuropathie. Néanmoins, il reste difficile à ce stade d’identifier des anomalies inflammatoires communes à l’ensemble de ces modèles de neuropathie (différents types d’anticancéreux neurotoxiques), ce qui limite l’identification de cibles thérapeutiques robustes. L’objectif général de ce projet sera donc d’approfondir ces résultats préliminaires en explorant la neuroinflammation dans le contexte des neuropathies périphériques chimio-induites, à l’aide de modèles animaux harmonisés (en particulier en termes de durée de traitement) et validés, dans la perspective d’identifier et d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier la neuroinflammation dans les neuropathies périphériques chimio-induites chez l'animal dans la perspective d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques permettant de prévenir oui traiter les neuropathies périphériques chimio-induites. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des neuropathies périphériques chimio-induites est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et seule un médicament avec un niveau de recommandation modérée pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathies périphériques chimio-induites.

Procédures

Tous les animaux des modèles de neuropathie périphérique chimio-induite recevront des injections intraveineuses (anticancéreux ou véhicule de l’anticancéreux) sous sédation légère. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, et pour une durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront en moyenne 5 à 10 min par animal. Il n’y aura aucun prélèvement sanguin durant les procédures. Un seul prélèvement sanguin total sera réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde (isoflurane à 4%) et avec analgésie, à la suite de quoi les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie périphérique chimio-induite chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Les injections intraveineuses d’anticancéreux seront réalisées avec une sédation légère. La neuropathie périphérique chimio-induite sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (test mesurant l’allodynie tactile et thermique) et qui se développeront au fur et à mesure des injections d’anticancéreux. L’allodynie est une réponse douloureuse à un stimulus qui ne l’est pas en condition normale. L’allodynie est mesurée grâce à un stimulus non douloureux tactile (von frey électronique) ou thermique (immersion de la patte à 10°C) et qui sera perçu comme douloureux. La mesure de l’allodynie offre un critère de jugement plus éthique que l’hyperalgésie (application d’un stimulus douloureux, ex : pression de la patte ou application de température nociceptive à 0 ou 4°C). De plus, l’allodynie est caractéristique de la douleur neuropathique en clinique chez l’homme. Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une réduction du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bi-hebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux aux anticancéreux. Comme la douleur neuropathique est étudiée dans ce projet, il ne sera pas possible de mettre en place une analgésie continue chez l’animal. Les réponses nociceptives sont objectivables chez l’animal lors des tests nociceptifs (ici de l’allodynie), mais les animaux ne présentent habituellement pas de réponses douloureuses spontanées ou lors de la manipulation des animaux. Il est important de rappeler que, pour ce type d’étude avec des tests comportementaux, les animaux doivent conserver un très bon état général (activité spontanée, comportement), car des altérations sévères de l’état général biaiseraient la qualité des résultats obtenues avec les tests comportementaux.

Devenir

Les expérimentations conduiront à la mise à mort des animaux pour permettre des analyses biologiques sanguines et tissulaires afin d'optimiser l'emploi des animaux à des fins de recherche

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie des neuropathie périphérique chimio-induite, qui n'est-elle-même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par l’intermédiaire de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité à 12 par groupe et par sexe, afin de respecter le principe de réduction tout en garantissant la robustesse scientifique de l’étude. Dans ce type d’étude exploratoire, une diminution plus importante du nombre d’animaux ferait courir un risque élevé de ne pas pouvoir conclure, ce qui entraînerait une perte de valeur scientifique et une utilisation inutile des animaux. Le nombre retenu permet de réaliser des analyses statistiques fiables, fondées sur des tailles d’effet attendues suffisamment larges pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes.

Raffinement

Les tests comportementaux ont été choisis car d’une part ils sont les moins douloureux pour les animaux, et d’autre part, ils sont plus proches de la clinique humaine. Ensuite une surveillance renforcée et des points limites précis, ont été établis sur la base d’une solide expérience sur de nos modèles animaux, dans l’objectif de maintenir leur bien-être animal tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Le choix du rat plutôt que la souris se justifie d’abord par sa taille, qui permet de prélever une quantité plus importante de matériel biologique par individu et donc de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en répondant aux objectifs scientifiques. La souche Sprague-Dawley, connue pour son comportement calme et sa bonne maniabilité, est particulièrement adaptée aux tests comportementaux de la douleur, contrairement à des souches plus actives comme Lou ou Wistar qui peuvent introduire davantage de variabilité dans les mesures. L’utilisation de cette souche s’appuie également sur l’expertise existante et des données antérieures au sein du laboratoire, ce qui renforce la robustesse et la comparabilité des résultats. Les animaux seront utilisés à un âge correspondant à de jeunes adultes (environ 9 semaines), ce qui est cohérent avec la plupart des études publiées et facilite la comparaison avec la littérature ainsi qu’avec les données internes. Des mâles et des femelles seront inclus afin de refléter la réalité clinique des traitements par paclitaxel, administrés aussi bien chez les hommes que chez les femmes, et de prendre en compte d’éventuelles différences liées au sexe dans les réponses aux traitements.

Pour tester une protéine présentée comme "anti-âge" et son "potentiel thérapeutique" contre la maladie d'Alzheimer, 24 prosimiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal subit une injection de la molécule directement dans le cerveau par chirurgie, puis des tests de mémoire répétés. Le sang et les tissus sont prélevés après la mise à mort, pour des analyses moléculaires. Les bénéfices annoncés visent une "utilisation future chez l'être humain", quand l'atteinte portée à ces petits primates est immédiate.

Objectifs

Le projet vise à étudier le rôle d'un complexe de protéines anti‑âge dans le système nerveux central de petits primates et son potentiel thérapeutique pour le traitement des pathologies associées au vieillissement et à la neurodégénérescence chez l’être humain. Ce complexe protéique additionne les actions anti-sénescentes et neuroprotectrices, anti-inflammatoires et favorise un environnement neurovasculaire plus sain afin de cibler trois aspects essentiels du vieillissement physiologique et de la maladie d’Alzheimer. Nous souhaitons vérifier si l’augmentation de la production de ce complexe protéique dans le cerveau a des effets bénéfiques chez des animaux âgés, afin de confirmer son potentiel thérapeutique en vue d’une utilisation future chez l’être humain. Les animaux seront soumis à plusieurs tests de mémoire qui nous permettront de quantifier l’évolution des performances mnésiques au cours du projet et d’évaluer l’efficacité du traitement au niveau cognitif et cérébral. Les tissus seront prélevés pour analyse moléculaire ultérieure.

Bénéfices attendus

Il est reconnu que les modèles murins présentent des limites importantes lorsqu’il s’agit d’étudier le vieillissement cérébral et les fonctions cognitives. Ainsi, les effets observés sur la protéine d'intérêt chez la souris (un vieillissement plus sain et une augmentation de l’espérance de vie) ne permettent pas, à eux seuls, de procéder à une extrapolation fiable à l'être humain. Conformément aux directives réglementaires, une validation sur un modèle plus proche de l'homme est nécessaire avant toute application clinique. Cette étape est essentielle pour réduire le risque d'échec lors des essais cliniques ultérieurs, pour caractériser plus précisément les effets indésirables potentiels dans un système plus comparable à celui de l'être humain, et pour confirmer la reproductibilité et la robustesse des résultats observés. Cette étude permettra de confirmer le potentiel thérapeutique de la protéine d'intérêt en vue d’une utilisation future chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests comportementaux qui durent de 25 à 50 minutes maximum. Les tests seront espacés de 2 jours au moins. Les animaux auront 1 injection ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l analgésie suivie d'une chirurgie cérébrale (durée 20 à 30 minutes) pour l'injection de la molécule d'intéret dans le cerveau. En fin de procédure le sang sera prélevé sous anesthésie et analgésie et après mise à mort, les tissus seront prélevés.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent engendrer un stress mais les animaux étant observés en libre circulation dans l'arène et étant habitués à être manipulés, le stress est très faible. Les injections peuvent être responsables d'un stress léger lors de la contention. La chirurgie cérébrale sous anesthésie et analgésie peut engendrer des gènes post-opératoires ou un stress de l'animal.

Devenir

les animaux seront euthanasiés pour récupération de sang et tissus pour analyse moléculaire ultérieure

Remplacement

Aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du vieillissement cérébral in vivo. L'effet du traitement sur la mémoire nécessite un suivi comportemental longitudinal chez des animaux vivants. Cette espèce présente une variabilité individuelle proche de celle de l'homme, facilitant la comparaison des effets du vieillissement.

Réduction

Sur la base de l’expérience acquise, une stratégie de réduction a été mise en œuvre en privilégiant un suivi expérimental longitudinal avec mesures répétées. Chaque animal est évalué avant et après administration des deux vecteurs viraux, permettant ainsi à chaque individu de constituer son propre contrôle. Ce choix méthodologique permet de prendre en compte la variabilité interindividuelle, d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre total d’animaux nécessaires, sans compromettre la validité scientifique du projet. Pour chaque groupe (vecteur vide et vecteur exprimant la protéine d'intérêt), le caractère et le profil cognitif des animaux sont précisément caractérisés avant traitement, puis suivis au cours du temps afin d’évaluer leur évolution. Cette approche maximise l’information obtenue par animal tout en limitant l’effectif utilisé.

Raffinement

Les animaux en élevage évoluent en volière enrichie avec des branches et des nichoirs et des tubes pour se cacher. L’observation des signes cliniques relatifs au bien-être des animaux sera réalisée quotidiennement. Les indicateurs privilégiés sont l’absence de variation anormale du poids corporel et l’état de forme générale (prostration, réactivité, agressivité). Les animaux ont 1 séance d'habituation avant de commencer les tests de comportement et sont récompensés par des friandises après chaque test. Pour la chirurgie cérébrale, les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie. Les effets post opératoires seront traités par analgésique. Lors de l’euthanasie, pour éviter toute douleur avant la prise de sang intracardiaque et prélèvement de tissus, une analgésie et anesthésie sont réalisées.

Choix des espèces

Bien que les résultats obtenus chez la souris soient prometteurs, les modèles murins présentent des limites majeures pour l’étude du vieillissement cérébral et des fonctions cognitives complexes. En effet, des différences importantes existent entre rongeurs et primates en termes d’organisation et de complexité cérébrale, de dynamique du vieillissement, et mécanismes impliqués dans les fonctions cognitives supérieures. Le recours à un modèle de primate non humain, plus proche de l’Homme, est indispensable avant toute application clinique. Ce primate de petite taille présente des similarités structurelles et fonctionnelles avec les primates supérieurs. Par ailleurs, son vieillissement relativement rapide permet d’accéder à des individus âgés (5-6 ans, stade adulte avancé) dans des délais compatibles avec les objectifs expérimentaux, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté à l’étude du vieillissement cérébral. De plus ce petit primate peut présenter des lésions cérébrales de type Alzheimer. En captivité l'espérance de vie des animaux est de 7-8 ans en moyenne et sa longévité maximale 12 ans.

Une heure d'anesthésie deux fois par semaine pendant six à huit semaines : 320 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson est mis à jeun douze heures avant chaque séance d'imagerie du cerveau, destinée à suivre des cellules souches neurales. Le RNT relève un stress lors des premières séances, qu'il estime s'atténuer après trois ou quatre passages. Tous les poissons sont mis à mort pour le prélèvement du cerveau.

Objectifs

Notre projet a pour but de comprendre comment les cellules souches neurales du cerveau adulte chez les vertébrés s’organisent en une hiérarchie qui permet à la fois une augmentation globale du nombre de cellules souches et la production de neurones.

Bénéfices attendus

La population de cellules souches neurales du cerveau antérieur adulte chez les vertébrés est composée de trois sous-populations imbriquées. Ce projet permettra de caractériser de façon différentielle le comportement de ces trois sous-populations de cellules souches neurales, et de déterminer quels paramètres peuvent prédire leurs comportements. Il permettra de comprendre comment la combinaison des trois sous-populations souches et la coordination de leurs dynamiques individuelles assure à la fois le maintien de cellules souches et la production de neurones tout au long de la vie. Comprendre les mécanismes de maintien contrôlé des cellules souches neurales à l’intérieur du cerveau adulte est absolument crucial puisque, chez l’homme et l’animal, la perte de ces cellules corrèle avec des déficits cognitifs ou émotionnels, et à l’inverse leur amplification crée un terrain favorable au développement de tumeurs.

Procédures

Anesthésie pour Imagerie durant 1 heure, 2 fois par semaine, pendant 6 à 8 semaines.

Impact sur les animaux

Nous prévoyons un stress léger lors des premières sessions d’imagerie au moment où les poissons seront prélevés dans leur aquarium pour anesthésie. Ce stress dure quelques dizaines de secondes au maximum jusqu’à ce que l’animal s’endorme. D’expérience, il s’ensuit rapidement une habituation et aucun stress n’est visible chez l’animal au bout de 3-4 sessions d’imagerie. L’anesthésie elle-même, d’une durée d’une heure au maximum, peut être suivie d’effets indésirables légers de courte durée. Enfin, l’animal est mis en jeûne la veille de chaque session d’imagerie, pour une durée de 12 heures, jusqu’à la fin de la session d’imagerie du lendemain. Si un effet indésirable inattendu apparaissait, nous arrêtons cette expérience et mettrons a mort les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau pour analyses ex vivo.

Remplacement

Nous souhaitons comprendre un aspect fondamental de la biologie des cellules souches neurales (CSNs), à savoir comment ces cellules s’organisent en sous-populations coordonnées dans le temps et l’espace. Le travail sur cellules souches neurales en culture, bien que techniquement possible, a révélé que les cellules souches neurales isolées montraient des comportements aberrants jamais observés in vivo, notamment concernant leur mode et leur fréquence de division. Par ailleurs, toute mise en culture détruira l’organisation spatiale entre cellules au sein de leur niche, donc leur coordination spatio-temporelle, et les relations de voisinage sont l’un des paramètres que nous souhaitons mesurer. Il n’est donc pas possible de travailler en culture pour ce projet.

Réduction

Nous limiterons précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses, et ces besoins ont été calculés précisément avec un biostatisticien. De plus, les poissons seront imagés par groupe de 10, et les films seront analysés avant de passer au groupe suivant. Ceci permettra d’adapter nos besoins : lorsqu’un nombre suffisant de cellules souches d’un groupe d’intérêt aura été filmé pour conduire des analyses statistiques, l’expérience pourra être interrompue. Enfin, notre procédure de suivi direct des cellules souches par imagerie au cours du temps permet également en elle-même de limiter le nombre d’animaux utilisés, puisqu’un seul poisson sert pour analyser les cellules à différents points de temps.

Raffinement

Nous limiterons précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses, et ces besoins ont été calculés précisément avec un biostatisticien. De plus, les poissons seront imagés par groupe de 10, et les films seront analysés avant de passer au groupe suivant. Ceci permettra d’adapter nos besoins : lorsqu’un nombre suffisant de cellules souches d’un groupe d’intérêt aura été filmé pour conduire des analyses statistiques, l’expérience pourra être interrompue. Enfin, notre procédure de suivi direct des cellules souches par imagerie au cours du temps permet également en elle-même de limiter le nombre d’animaux utilisés, puisqu’un seul poisson sert pour analyser les cellules à différents points de temps.

Choix des espèces

Nous avons choisi le poisson Danio rerio. Le cerveau adulte de Danio rerio, à la différence des modèles « classiques » mammifères, maintient un grand nombre de cellules souches neurales. Utiliser cette espèce permet donc d’avoir accès à un beaucoup plus grand nombre de cellules souches neurales par animal. Ces cellules sont également organisées en une monocouche superficielle au lieu d’être profondes, permettant des approches d’imagerie sans chirurgie. Ces deux points répondent au principe de « réduction ». Par ailleurs, les cellules souches neurales de Danio rerio sont identiques aux cellules souches des mammifères (cellules gliales, quiescentes, capables d’auto-renouvellement et de multipotence, et dont l’état d’activation est contrôlé par les même voies moléculaires). Les résultats obtenus seront donc directement transposables aux mammifères. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune (3 mois post-fécondation [mpf]), car nous travaillons sur la biologie des cellules souches neurales adultes. Les premiers signes de ralentissement de l’activité des cellules souches neurales sont observés in vivo à environ 5-6 mpf, et il est important également de nous placer avant ce stade.

Pour tester une radiothérapie interne ciblée sur deux modèles de glioblastome, 660 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection de cellules tumorales cérébrales puis un suivi par IRM jusqu'à six fois, la tumeur pouvant entraîner la mort en une trentaine de jours sans traitement. Le RNT annonce un bénéfice pour l'humain formulé au conditionnel et repoussé "ultérieurement". Toutes les souris sont mises à mort, une issue présentée comme évitant la souffrance liée à la croissance de la tumeur.

Objectifs

Le projet consiste à mettre en place une nouvelle stratégie thérapeutique basée sur une molécule qui a déjà été testé en clinique et qui mérite une attention particulière pour des développements thérapeutiques pertinents. Il s’agit d’une molécule ayant une faible pénétration dans les tissus, ce qui permettrait de proposer une thérapie plus précise dont la toxicité auprès des tissus sains serait moindre. L’objectif sera de tester cette nouvelle stratégie thérapeutique sur 2 souches de souris différentes.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées (durées d'environ 30 minutes) telles que l'injection de cellules tumorales, de thérapies spécifiques, de suivi par imagerie IRM. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Le nombre d'IRM maximal réalisé sur un même animal est de 6.

Impact sur les animaux

L’administration des traitements peut entraîner une certaine fatigue et un affaiblissement rapidement réversible (environ deux jours) de l'animal. L'induction d'une tumeur par injection de cellules entraîne en l'absence de traitement une détoriation de l'état général de l'animal pouvant entraîner la mort au bout de 30 jours. Il n'y a pas d'autres nuisances ou d'effet indésirables attendus sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovante sur tumeur en place pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des cellules tumorales) et celle d’élimination (traitements sur tumeur en place), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernières validations dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces cellules tumorales ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans un environnement favorable à leur bien-être, par ailleurs vérifié par le SBEA local. Pour chaque protocole, un suivi quotidien du comportement, de la perte de poids de l'animal et de sa cicatrisation est effectué. Un suivi IRM est également réalisé de manière hebdomadaire pour surveiller la progression du volume tumoral dans le cerveau de l'animal. Les animaux bénéficient d’une surveillance accrue jusqu’à leur réveil afin de détecter précocement toute forme de souffrance. Ils bénéficient de soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur avec analgésique, conditions d'hébergement optimale, enrichissement du milieu. Les animaux seront hébergés dans un environnement dont la température, l’humidité, le renouvellement de l’air ainsi que le cycle d’éclairage sont contrôlés selon les normes légales en vigueur. Un enrichissement du milieu avec des petites maison et tunnel ainsi que des frisotis est mis en place du début à la fin. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Une anesthésie gazeuse sera appliquée aux animaux lors du suivi IRM hebdomadaire.

Choix des espèces

La raison pour laquelle il est envisagé d’utiliser deux types de cellules dans deux souches différentes de souris est de pouvoir réaliser les tests sur des cellules humaines de glioblastome dans un cas et dans l'autre cas de pouvoir étudier le rôle de l’immunité.

Anesthésiées trois heures pour une première chirurgie de l'oreille interne, puis à nouveau trente minutes pour un prélèvement, 27 brebis vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'étude compare deux méthodes de diffusion d'un produit dans l'oreille interne, chaque brebis servant de son propre témoin. Cette version modifiée ajoute quatre animaux pour valider une nouvelle sonde. Les brebis sont mises à mort parce que l'intervention leur laisse une surdité irréversible, des vertiges et une paralysie faciale qui empêche de s'alimenter normalement.

Objectifs

L'objetif principal de notre projet vise à étudier la diffusion de molécules de gadolinium au sein de l'oreille interne en comparant les injections transtympaniques classiques versus l'utilisation d'ultrasons. Les objectifs secondaires sont de vérifier l'absence de retentissement sur la fonction auditive après la réalisation des séances de ces techniques et à distance (J7 de la délivrance), une conservation de l'quilibre et de la symétrie du visage, et l'absence d'altération de la composition des liquides de l'oreille interne suite à ces procédures.

Bénéfices attendus

Si les résultats du projet sont démontrés, c'est-à-dire une amélioration de la diffusion du gadolinium à l'oreille interne par sonoporation (avec ou sans microbulles chargées) avec absence d'effets indésirables à court et long terme, cela permettra de proposer un nouveau mode de diffusion chez l'Homme. Cette méthode permettrait d'obtenir une meilleure diffusion le long de la cochlée et des concentrations plus élevées d'agents thérapeutiques au sein de la cochlée. Par la suite, il sera nécessaire de développer une sonde spécifique pour l'Homme, de réaliser de nouvelles expérimentation avec d'autres molécules. Cependant, cette étape préliminaire reste indispensable à la poursuite du projet. Cette voie de délivrance par sonoporation à l'oreille interne pourrait par la suite avoir un rôle thérapeutique notamment pour traiter certaines atteintes de l'oreille interne comme la surdité brusque, la maladie de Menière où actuellement les injections transtympaniques sont privilégiées. Il pourrait aussi s'agir d'une voie de délivrance dans le cadre de la thérapie génique pour les surdités d'origine génétique.

Procédures

La majorité des actes auront lieu sous anesthésie générale, il s'agit de la mesure des seuils auditifs, de l'abord chirurgical avec la délivrance de molécule, de l'imagerie et du prélèvement de liquide de l'oreille interne. La durée de la première anesthésie générale sera de 3H (1H de chirurgie et 2 H d'imagerie). La seconde anesthésie générale durera 30 minutes, il sera effecué le prélèvement de liquide de l'oreille interne au cours de cette chirurgie.

Impact sur les animaux

Les brebis incluses subiront deux anesthésies générales. Lors de la première, il sera effectué une mastoïdectomie avec délivrance de molécules. Lors de la seconde, il sera effectué un prélèvement de périlymphe. La contention effectuée pour l'induction des 2 anesthésies peut engendrer du stress pour l’animal, et l'injection de produit anesthésiant par voie intraveineuse à la jugulaire peut provoquer un hématome.

Devenir

L'ensemble des brebis seront euthanasiées suites aux procédures compte tenu de la perte de la fonction auditive irréversible, de vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale et d'une paralysie faciale empêchant une alimentation normale. Ainsi ces pertes de fonctions auront un retentissement majeur dans la vie quotidienne des brebis.

Remplacement

Des études pré-cliniques chez l'animal sont nécessaires afin de s'assurer de la bonne diffusion des molécules utilisées suite à la sonoporation au sein de l'oreille interne. L'utilisation de modèles animaux autorise aussi la vérification de l'absence d'évènements indésirables, et le prélèvement de liquide de l'oreille interne. Cette étude permettra de s'assurer de la supériorité de la sonoporation pour la diffusion du gadolinium au sein de l'oreille interne et de vérifier l'absence de déficit (auditif, vestibulaire ou de la fonction faciale). Le modèle animal ne peut être substitué par un modèle in-vitro ou in silico à ce jour.

Réduction

Sur la base d'une étude statistique et bibliographique, notre étude nécessite l'inclusion de 27 animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque brebis sera son propre témoin avec un côté où il sera effectué une délivrance de gadolinium par sonoporation et un autre une délivrance par injection en regard de la fenêtre ronde pour vérifier l'hypothèse d'une meilleure diffusion par sonoporation. L'hypothèse d'une amélioration de la diffusion de 60% +/- 30 % du gadolinium par la sonoporation sera vérifiée par un test statistique approprié, ainsi que l'absence de baisse des seuils auditifs. Le calcul d'effectif indique qu'un groupe de 6 sera suffisant pour confirmer cette hypothèse. En métabolomique (pour l'analyse de la périlymphe), il n'existe pas de recommandation sur le nombre minimum de sujets. Cependant nos précédentes études sur le sujet ont montré que l'inclusion de 6 sujets avait permis de faire ressortir des groupes statistiquement différents en utilisant des analyses statistiques adaptées. Notre expérience, sur le prélèvement de périlymphe, nous a permis de le réaliser systématiquement sur une oreille normale jamais opérée. La principale contrainte était le faible volume prélevé qui a été résolu par validation de la technique d'analyse. Ainsi, nous estimons que 12 brebis incluses au total serait raisonnnable pour ne pas augmentrer le nombre d'animaux tout en ayant des résultats si nos hypothèses se vérifient. 2 animaux supplémentaires seront prévus en cas de problème. 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES SONT DEMANDES POUR VALIDER LA NOUVELLE SONDE DEVELOPPEE SPECIFIQUEMENT POUR CE PROTOCOLE, D'UN DIAMETRE INFERIEUR (3 MM VS 15 MM).

Raffinement

Anesthésie : les animaux arriveront la veille de la 1ère anesthésie, et seront mis à jeun 15h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène et de gaz anesthésiant pour obtenir un relachement musculaire suffisant avant intubation. Chirurgie et Per-imagerie - Anesthésie : Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Les animaux sont logés en cases collectives sur paille, et manipulés dans le calme. Le monitoring des constantes sera effectué lors de l'anesthésie générale afin de détecter une douleur peropératoire nécessitant une adaptation de l'analgésie et/ou de la profondeur de l'anesthésie. La réalisation d'une anesthésie locale permettra de minimiser la douleur per opératoire. Ces injections seront renouvelées en cas de douleur de l'animal . Une table chauffante sera utilisée pendant la durée de l'anesthésie générale pour éviter tout épisode d'hypothermie. La douleur post-opératoire sera aussi monitorée avec l'échelle visuelle en pièce jointe et l'analgésie revue en cas de douleur.

Choix des espèces

La brebis est l'animal que nous désirons utiliser pour ces recherches sur l'oreille interne car elle présente un spectre auditif comparable à l'Homme et une anatomie de l'oreille interne semblable à l'Homme en terme d'anatomie et de dimensions. La chirurgie de la brebis est comparable à celle de l'homme pour l'accès à l'oreille interne. Le sexe féminin est à privilégier compte tenu des difficulté d'accès à l'oreille interne chez le bélier. En effet, l'épaisseur de la corticale du bélier rend le fraisage difficile et très long. Enfin, le volume de liquide endocochléaire prélevé chez la brebis est comparable au volume qu'il est possible de prélever chez l'Homme rendant possible les études en métabolomique sur ce liquide. Les animaux utilisés seront âgés de plus d'un an car à cet âge, la maturation du système auditif est atteinte. Afin de constituer un groupe homogène, les brebis seront âgées de 2 à 3 ans.