Recherche fondamentale

Une colite est provoquée chez 832 souris par un agent chimique irritant administré dans l'eau de boisson ou par voie intra-rectale, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré. Le RNT décrit pourtant une perte de poids supérieure à 10 pour cent, des diarrhées, une prostration et des signes de douleur au plus fort de l'inflammation. Toutes les souris seront tuées par dislocation cervicale pour prélèvements, certaines plus tôt si les points limites sont atteints. Le projet teste des molécules censées activer la résolution de l'inflammation, un essai chez l'humain restant une perspective lointaine.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité préclinique de molécules ciblant les voies de la résolution de l’inflammation, tout en limitant l’inflammation persistante et la fibrose, dans des pathologies caractérisées par un déficit de ces mécanismes. Depuis quelques années, il a été démontré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, telles que les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), sont liées à un échec de la résolution de l’inflammation. Les traitements actuels (corticoïdes, immunomodulateurs) agissent principalement en bloquant l’initiation de l’inflammation, ce qui entraîne des effets secondaires importants. De plus, près de 60 % des patients présentent un échappement primaire ou secondaire à ces traitements, soulignant la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients résistants ou en échec. Chez les patients atteints de MICI l’absence de résolution de l’inflammation en dépit des traitements existant est la première cause d’échec thérapeutique, ce qui entraine une persistance de l’inflammation, un développement de fibrose et à des symptômes invalidants comme la douleur, les diarrhées chroniques ou un impact sur la qualité de vie et la santé mentale. Notre projet vise à tester, chez la souris, des molécules innovantes capables d’activer ces voies de résolution lorsque celles-ci sont défaillantes, tout en réduisant l’inflammation chronique et en limitant la fibrose, qui constitue une complication majeure des MICI et d’autres pathologies inflammatoires. Les molécules sélectionnées auront été validées in vitro au préalable. Nous comparerons ensuite nos traitements à des références établies dans chaque modèle, où l’efficacité sera mesurée par une accélération de la résolution de l’inflammation, une réduction des lésions tissulaires et une diminution des marqueurs de fibrose, par rapport à un groupe contrôle. 832 animaux pourront être utilisés, ce qui garantit une puissance statistique tout en limitant le nombre d’animaux conformément aux principes des 3R.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont actuellement traitées principalement par trois types de médicaments : les corticoïdes, les traitements qui diminuent l’activité du système immunitaire et des thérapies ciblées plus récentes. Les corticoïdes permettent de réduire rapidement l’inflammation, mais leur utilisation prolongée peut entraîner des effets indésirables importants, tels qu’une prise de poids, une augmentation de la pression artérielle, des perturbations hormonales et des troubles du métabolisme du sucre. Les traitements immunosuppresseurs, qui réduisent de façon globale les défenses immunitaires, exposent quant à eux les patients à un risque accru d’infections. Les thérapies ciblées, utilisées lorsque les traitements précédents ne sont plus efficaces, agissent sur des mécanismes précis de l’inflammation intestinale et permettent de ralentir l’évolution de la maladie. Toutefois, environ six patients sur dix ne répondent pas durablement à ces approches, un phénomène également observé dans les modèles animaux. De plus, ces traitements peuvent eux aussi augmenter la sensibilité aux infections. Afin de répondre à ces limites, nous avons développé une nouvelle molécule innovante visant à stimuler les mécanismes naturels de résolution de l’inflammation plutôt qu’à inhiber globalement le système immunitaire. Dans des modèles expérimentaux de colite chez l’animal, nous espérons observer une récupération plus rapide du poids, une amélioration des symptômes digestifs, ainsi qu’une amélioration de l’aspect du côlon, indicateur d’une inflammation réduite. L’objectif est de restaurer une morphologie intestinale proche de la normale. Si ces résultats sont confirmés chez l’animal, nous envisageons à terme un essai clinique chez l’Homme, destiné aux patients pour lesquels les traitements actuels ne sont plus efficaces, afin de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique.

Procédures

Chirurgie : Pas de chirurgie ni sutures. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés à J0 pour induire le modèle (protocole 3) par injection intra-rectale à raison d’un maximum de 280 souris. Un prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire sur des animaux vigiles à hauteur d'une fois par semaine maximum pourra être envisagé (50µL par prélèvement). Cette procédure peut concerner l’ensemble des animaux à savoir un maximum de 832 souris. Les traitements

Impact sur les animaux

Modèle 1 : colite induite par un polysaccharide administré dans l’eau de boisson L’administration orale d’un agent chimique irritant entraîne une augmentation de la perméabilité de la paroi du tube digestif, provoquant une inflammation localisée du côlon, comparable à la rectocolite hémorragique observée chez l’Homme. Ce modèle se traduit par une perte de poids et l’apparition de diarrhée, évaluée à l’aide d’un score compris entre 0 et 4. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant la phase aiguë de l’inflammation, puis tous les deux jours par la suite. Lorsque le score de diarrhée atteint 3, celle‑ci s’accompagne généralement d’une prostration, d’une diminution de l’activité et de signes de douleur. Ces manifestations cliniques, associées à la perte de poids, apparaissent généralement entre le septième et le dixième jour après le début de l’induction, avant une récupération rapide, les animaux retrouvant leur poids initial vers le vingtième jour. Le score de diarrhée égal à 3 correspond à un épisode transitoire, observé sur une courte période, avec une amélioration progressive. Durant la phase la plus sévère, les animaux sont suivis quotidiennement et un traitement analgésique est administré afin de limiter la souffrance. Modèle 2 : colite induite par administration locale d’un agent inflammatoire L’administration locale d’un agent inflammatoire associé à un solvant provoque une augmentation de la perméabilité de la paroi colique et un recrutement important de cellules immunitaires. Ce modèle induit une perte de poids supérieure à 10 % ainsi qu’une diarrhée modérée. Les symptômes apparaissent dès le lendemain de l’administration et s’améliorent rapidement à partir du troisième jour. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’étude et un traitement analgésique est administré du jour de l’induction jusqu’au troisième jour afin de limiter la douleur.

Devenir

L’ensemble des 832 souris seront mis à mort par dislocation cervicale en fin d’expérimentation pour effectuer des prélèvements biologiques à des fin d’analyse cellulaire ou tissulaire. Au cours d’une des procédures décrites ci-dessus il se peut également que des animaux soient mis à mort précocement si des points limites sont atteints, que ce soit lié à la pathologie elle-même ou aux traitements si leur efficacité s’avère futile.

Remplacement

Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal. Les études pilotes sur un nombre restreintes d’animaux et sans traitements thérapeutiques permette de valider la mise en place du modèle dans les conditions d’hébergement de l’animalerie. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons tout d'abord déterminé la différence attendue entre le groupe contrôle et le groupe traité ainsi que l'écart-type des échantillons grâce à des expériences précédentes. Ceci nous a permis d'obtenir la variante d= 0.79. Pour un test statistique bilatéral n=22 animaux sont nécessaires pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences.

Raffinement

Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. Les protocoles sont planifiés afin d’éviter le stress à l’animal et les points limites définis sont bien intégrés afin d’anticiper toute souffrance inutile. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de la buprénorphine dans l’eau de biberon (0.003mg/mL). Lorsque les points limites seront atteint, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie par un mélange d’air/isoflurane 4%. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrit pour chaque modèle, limitant leur souffrance. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton. Pour finir, si des animaux montrent des difficultés pour s'alimenter, des croquettes mouillées seront mise au fond de la cage.

Choix des espèces

Afin d’étudier différents mécanismes de l’inflammation chez l’animal vivant, nous utiliserons des souris appartenant à plusieurs lignées connues pour leur sensibilité aux modèles de colite induite chimiquement. Ces lignées présentent des niveaux d’inflammation plus ou moins marqués, ce qui permet d’adapter la sévérité du modèle aux objectifs de l’étude. Le choix de la lignée dépend également du traitement testé, certains agissant uniquement chez des animaux exprimant la cible biologique concernée. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

Après une à deux craniotomies de deux heures, 440 souris subissent des auto-microstimulations du circuit de la récompense pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet étudie comment le cerveau apprend à rechercher des récompenses et adapte ses décisions. Les chirurgies peuvent provoquer douleurs et infections aux sutures, la stimulation des troubles locomoteurs. Le porteur annonce des tests comportementaux sur trois semaines sans préciser lesquels, et les cerveaux sont prélevés après mise à mort.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau apprend à rechercher des récompenses et à adapter ses décisions en fonction de l’expérience. Il s’intéresse à la manière dont les régions impliquées dans la motivation et la réflexion travaillent ensemble pour guider nos comportements. En étudiant ces interactions, ce travail vise à mieux comprendre comment nous planifions nos actions, changeons de stratégie et nous adaptons aux situations nouvelles.

Bénéfices attendus

Ce projet nous apportera des informations concernant le rôle des structures cibles du système de la récompense dans les comportements de prise de décision et d’apprentissage d’association.

Procédures

Les souris seront soumises à un maximum de 2 opérations chirurgicales sous anesthésie (de durée de 2h maximum chacune). Le temps de récupération entre 2 chirurgies sera de 4 semaines (220 souris seront soumises à 1 opération et un maximum de 220 souris seront soumises à 2 opérations). Les animaux passeront ensuite des tests comportementaux pendant 3 semaines environ, (10 minutes par jour pour chaque animal) où ils recevront des auto-microstimulations du circuit de la récompense (au maximum 440 animaux seront donc étudiés). Des enregistrements in vivo pourront aussi être mis en place pour étudier l'activité des neurones pendant le comportement. Enfin, une modulation de leur activité neuronale pourra être effectuée pendant le test comportemental.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures (modérée, quelques jours). Certaines infections au niveau des sutures pourraient éventuellement survenir (moderée, quelques jours). Certains effets indésirables liés à la microstimulation électrique ou modulation des neurones peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice (modérée, pendnat quelques minutes).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue de toutes les procédures pour permettre le prélèvement des cerveaux à des fins d’études histologiques.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité́ du comportement de la souris. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux vigiles.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec les tests statistiques adaptés. Les procédures ont été conçues pour qu'une même souris puisse participer à un maximum d'expériences, limitant ainsi le recours à de nouveaux animaux pour chaque expérimentation.

Raffinement

Ces protocoles sont conçus pour minimiser l’inconfort et garantir le bien-être des animaux tout en assurant des conditions optimales pour l’étude scientifique. Les animaux sont régulièrement manipulés pour réduire leur anxiété lors des tests de comportements. Enfin, afin de définir des points limites précoces permettant la mise en œuvre rapide de mesures adaptées en cas de douleur ou de mal-être, une grille de suivi graduée sera utilisée.

Choix des espèces

Le système dopaminergique mesocorticolimbique des rongeurs est relativement bien conservé par rapport à l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Des modèles de mammifères (rat, singe) ne se justifient pas non plus car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents n’existent pas chez ces espèces. Les modèles rongeurs sont donc des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, et présentent des mécanismes cognitifs complexes et une grande rapidité d’adaptation. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte. En effet, la procédure de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance du crâne est stabilisée, et le stade adulte permet l'analyse de régions neuronales mâtures.

Dépourvues de système immunitaire et irradiées, 2 580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. On leur injecte des cellules d'une leucémie humaine de mauvais pronostic, puis on suit la maladie par prélèvements de sang et de moelle osseuse, jusqu'à quinze fois. Le développement de la leucémie provoque fatigue, douleurs et baisse de mobilité. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit l'auto-renouvellement des cellules souches leucémiques, qui exige des greffes en série chez l'animal.

Objectifs

Les hémopathies à cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDC) sont divisées en deux principales entités : la leucémie à pDC (LpDC) et les leucémies aiguës myéloïdes avec excès de pDC (LAM-pDC). La LpDC est une maladie de mauvais pronostic : seulement 17 % des patients, tout traitement confondu, sont encore en vie après 5 ans et des rechutes sont observées dans 75 % des cas. Les LAM-pDC semblent être associées à un pronostic plus défavorable que les LAM sans excès de pDC, avec des taux de survie globale et sans rechute plus faibles décrits dans la littérature. En hématologie, de façon générale, il est décrit l’existence de cellules initiatrices de la leucémie (aussi appelées cellules souches leucémiques) qui sont capables de générer la maladie in vivo dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire. La présence de ces cellules est associée à un pronostic péjoratif chez les patients, avec des rechutes et une résistance au traitement plus fréquentes lorsqu’elles sont retrouvées en excès. A ce jour, les cellules souches leucémiques ne sont pas décrites dans ces deux hémopathies. Les objectifs du projet sont donc d’étudier les capacités de génération de la leucémie de différentes fractions cellulaires d’intérêt contenues dans des échantillons de LpDC ou de LAM-pDC. Le but de ces expérimentations est de mettre en évidence une population initiatrice de la leucémie afin de la caractériser pour pouvoir la cibler sur le plan biologique et thérapeutique chez les patients atteints de ces leucémies. Dans une deuxième partie du projet, les modèles mis en place par la sélection de populations cellulaires particulières permettront d’évaluer l’efficacité chez les animaux de thérapies mises en place et déjà évaluées en culture cellulaire par l’équipe, ainsi que d’autres thérapies déjà disponibles sur le marché, afin d’ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement de ces hémopathies.

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices sont attendus à la suite de ce projet : - La mise en évidence de nouvelles populations cellulaires à l’origine du développement des hémopathies à pDC dans un but de les mettre en évidence sur le plan biologique au diagnostic et, éventuellement, à la rechute - La mise en évidence de nouvelles voies biologiques et/ou biomarqueurs permettant de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques ou le développement de nouveaux médicaments - La compréhension des mécanismes biologiques sous-tendant la résistance aux traitements et la rechute chez les patients atteints d’hémopathies à pDC La validation de l’efficacité et l’évaluation de la toxicité de nouvelles approches thérapeutiques développées dans l’équipe avant d’envisager un passage chez l’être humain

Procédures

Les animaux seront irradiés le jour précédant l’injection des cellules leucémiques (1 fois, moins de 5 minutes). L’injection des cellules leucémiques sera réalisée en intra-veineux (1 fois, environ 1 minute par animal). L’injection de thérapies à évaluer sera réalisée en intra-veineux (1 fois, environ 1 minute). Le suivi de l’apparition de la leucémie sera réalisé par prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse (animal endormi, moins d’1 minute, 1 fois par mois et de façon plus rapprochée en cas de signes cliniques ou de suivi du taux de cellules leucémiques, en respectant un délai d’une semaine entre deux prélèvements, sans que cela dépasse 15 prélèvements durant le temps de suivi de l’animal). Le cas échéant, le suivi pourra être réalisé par prélèvement médullaire après anesthésie gazeuse et analgésie (animal endormi, environ 5 minutes, 1 fois dans la vie de l’animal au maximum, en cas de signes cliniques et en l’absence de détection dans le sang périphérique de la leucémie). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie, une injection de produit de traçage sera réalisée après analgésie (moins d’1 minute, au maximum 1 fois par semaine) suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie (animal endormi, environ 5 minutes, au maximum 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés n'ont pas de système immunitaire ce qui entraîne un risque accru d’infections s’ils sont exposés à un environnement non contrôlé. Les animaux issus d’élevage en dehors de notre établissement utilisateur subiront une période de stress en lien avec le changement de lieu d’hébergement. L’injection des cellules leucémiques chez les animaux entraînera l’apparition des maladies chez ceux-ci. Le développement des leucémies pourra provoquer un inconfort chez la souris, avec une diminution de la mobilité, une fatigue ou des douleurs. L’injection de ces mêmes cellules ou des thérapies à évaluer, par voie intra-veineuse, pourra être à l’origine d’une douleur au point d’injection ou d’un saignement bref. Les pesées régulières et les manipulations associées pourront également entraîner un stress modéré mais de courte durée. Les prélèvements veineux sanguins périphériques, réalisés au niveau mandibulaire, seront à l’origine d’une douleur modérée et éventuellement d’un hématome. De la même manière, les prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau de l’os fémoral pourront être à l’origine d’une douleur et d’un inconfort en lien avec un hématome pouvant gêner la locomotion de façon brève et résolutive. L’injection du produit de traçage qui sera réalisée chez les animaux suivis par imagerie pourra provoquer une douleur ou un inconfort dans les suites de l’injection.

Devenir

Pour les deux procédures, les réponses aux objectifs scientifiques doivent être apportées par le prélèvement et l'étude des organes (moelle osseuse et rate en particulier). Les animaux seront donc mis à mort sans possibilité d’intégrer un autre projet.

Remplacement

La partie du projet évaluant les capacités d’initiation de la leucémie de différentes populations cellulaires nécessite l’utilisation d’animaux pour valider fonctionnellement cette capacité, en particulier la souris. Il n’existe à l’heure actuelle aucun autre modèle animal validé et utilisable dans les leucémies permettant d’évaluer de façon précise ces propriétés. De plus, il n’existe pas de modèles robustes utilisables en culture cellulaire (in vitro) permettant de reproduire ce qui est observé chez la souris de façon fiable avec ce type d’hémopathies (survie faible des cellules leucémiques, absence de modèles en trois dimensions ou autres disponibles pour reproduire de façon fiable l’environnement leucémique). Les capacités d’auto-renouvèlement des cellules souches devant être mises en évidence par des greffes en série, il n’est, là non plus, pas possible de se passer de l’utilisation d’animaux. Concernant la partie évaluant l’efficacité de thérapies anti-leucémiques, des expériences in vitro avec des résultats encourageants ont déjà été réalisées mais ces modèles ne permettent pas, à l’heure actuelle, d’évaluer l’ensemble des paramètres que l’on retrouve dans les modèles animaux. Ainsi, des modèles animaux sont nécessaires afin de se rapprocher au mieux des conditions que l’on retrouve chez l’être humain et d'espérer un emploi des thérapies à évaluer pour traiter les patients.

Réduction

Pour chaque expérimentation nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif sur le plan statistique sans avoir recours à des animaux en excès. Pour calculer le nombre d’animaux par lot, nous nous basons sur des résultats d’expériences que nous avons réalisées précédemment sur ces modèles ainsi que sur des données de la littérature où sont réalisées des expériences similaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe afin de respecter leur caractère social, sans dépasser la limite recommandée d’individus par cages en termes de surface au sol. L’hébergement des animaux dépourvus de système immunitaire est réalisé dans des cages stériles avec de la nourriture, de la litière et de l’eau stériles, entreposées dans des portoirs ventilés permettant de les protéger de l’environnement extérieur. L'environnement d'hébergement est contrôlé en termes de température, d’hygrométrie et respecte des cycles jour/nuit réguliers. Pour leur bien-être, l’eau et la nourriture sont accessibles aisément et à volonté. Afin de leur permettre d’exprimer leur comportement physiologique (fouissage, nidification) une litière abondante ainsi que des matériaux spécifiques seront mis en place. Un enrichissement structural (tunnel en carton, pot en verre) sera également proposé afin d’éviter l’apparition de comportements stéréotypés. Une évaluation au minimum hebdomadaire du poids et de l’état de santé global à l’aide d’échelles spécifiques sera réalisée afin de détecter toute altération de l’état général des animaux. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie et/ou une analgésie le cas échéant. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place de prélèvements sanguins ou de moelle osseuse. Toutes les expérimentations seront réalisées sous poste de sécurité microbiologique afin d’éviter l’infection des animaux par des pathogènes environnants. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage ainsi que la capacité de locomotion. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.

Choix des espèces

La communauté scientifique privilégie l’utilisation de modèles murins pour l’étude des cellules souches leucémiques et pour l’évaluation de la réponse aux traitements. Les résultats obtenus chez la souris dans l’étude des processus hématopoïétiques pathologiques sont souvent extrapolables à l’être humain avec de nombreuses données issus de modèles animaux ayant abouti à de véritables stratégies de suivi de la maladie et de choix thérapeutiques. Les souris permettent aussi l’accès à des modèles modifiés génétiquement, pour ne plus avoir de système immunitaire, nécessaires au déroulement de notre projet. Les animaux utilisés seront des souris âgées de 6 à 12 semaines au maximum car il s’agit de la période du développement la plus optimale pour la génération d’une leucémie à partir d’échantillons de patients atteints de leucémies. De plus, l’utilisation de souris plus âgées n’est pas recommandée car certains échantillons de patients atteints de leucémie sont associés à un développement lent de la maladie (parfois plus d’un an) ce qui ne permet pas d’avoir une période d’expérimentation assez longue pour exploiter des résultats avec ces animaux.

Deux aimants comprimant un pli de peau du dos trois heures par jour pendant trois jours : 576 des 1 296 souris subissent ces plaies de compression, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet compare la cicatrisation selon des régimes riches en sucres ou en graisses, chez des souris rendues obèses ou diabétiques. Les animaux porteurs de plaies sont isolés pour éviter que leurs congénères les aggravent. La mise à mort finale sert à prélever la peau, le foie, l'estomac et les vaisseaux.

Objectifs

Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la compréhension des processus de cicatrisation et des réponses vasculaires de la peau dans un état pathologique tel que le diabète. Les plaies chroniques sont généralement des plaies de pression qui apparaissent chez les patients diabétiques. Ces plaies persistent dans le temps, ne cicatrisent pas et mettent la survie ou la qualité de vie du patient à risque, pouvant entraîner de graves complications voire un décès. L’objectif de ce projet est de caractériser la durée et de la qualité de la cicatrisation de la peau après application d’une pression chez des souris diabétiques, mâles et femelles en fonction des différents régimes alimentaires que l’on peut rencontrer dans les populations humaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension de l’impact de la consommation d’édulcorants sur la fragilité cutanée ainsi que les différences de réponses vasculaires de la peau chez des personnes obèses et/ou diabétiques.

Procédures

Toutes les souris seront pesées vigiles au moment de leur arrivée à l’animalerie, puis toutes les semaines jusqu’à la fin de l’expérimentation. Durée de la manipulation : 30 secondes. Toutes les souris seront dépilées au moins une fois durant la période de l’expérimentation. Afin d’éliminer les poils à la surface de la peau, les souris seront anesthésiées pendant 5 minutes. Toutes les souris recevront une injection lors de chaque test du sucre dans le sang (moins de 10 secondes). Toutes les souris subiront un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue pour les mesures de glycémie, lors des tests du sucre dans le sang (5 gouttes de sang par test). Chaque prélèvement dure moins de 5 secondes. Pour 576 souris, des plaies de compression seront réalisées, sous anesthésie générale gazeuse, par application de deux aimants en face en face sur un pli de peau du dos (3h par jour durant 3 jours pour les compressions chroniques et 3 x 2h dans une journée pour les compressions aiguës). Une mise en cage isolée des souris est nécessaire pour préserver les plaies induites et éviter des sur-blessures liées à ses congénères. 720 souris seront anesthésiées 2 fois durant toute la période de l’expérimentation. La première anesthésie durera 5 minutes pour la dépilation et la seconde anesthésie durera 50 minutes environ pour réaliser des mesures physiologiques non invasives au niveau de la peau du dos. Afin de faciliter l’entrée des molécules dans la peau des 720 souris, l’application d’un faible courant au niveau du dos peut induire un léger inconfort durant la stimulation électrique (picotements locaux) ; cet inconfort est temporaire et se termine à l’arrêt de la stimulation (durée entre 20 secondes et 60 secondes). Pour 120 souris, il est nécessaire de poser un implant sous la peau du crâne ; cette pose d’implant sera réalisée sous anesthésie en même temps que la dépilation.

Impact sur les animaux

La pesée des souris pour le suivi du poids ou avant anesthésie n’induira qu’un stress minime. La manipulation des souris lors de la dépilation et de la pose d’un implant est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. Les nuisances pour l’animal lors de la dépilation sont minimes. Pour les 120 souris nécessitant la pose d’un implant, une petite incision est réalisée et refermée par 2 points de suture pouvant engendrer une douleur. Lors du test de sucre dans le sang, les souris recevront une injection pouvant engendrer une légère douleur au point d’injection. Les souris auront un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue pour les mesures de glycémie (5 gouttes de sang par test du sucre dans le sang). Ces prélèvements peuvent engendrer une légère irritation au point de prélèvement. Sous anesthésie générale, les souris seront soumises à deux plaies de compression (3h de compression par jour durant 3 jours pour les plaies chroniques ou 3 x 2h dans une journée pour les plaies aiguës). L’induction des plaies peut engendrer une douleur. La répétition d’anesthésie gazeuse pour l’induction des plaies de compression et le suivi des plaies par photo (5min) peut fragiliser les souris. L’induction des plaies peut engendrer une douleur et une légère perte de poids. La mise en cage isolée suite à l’induction des plaies engendre une perte d’interaction sociale, palliée par un enrichissement du milieu des cages. Les souris sont isolées juste après la dépilation et jusqu’à la fin de l’expérimentation pour éviter toute sur-blessure. L’anesthésie générale par injection peut générer une douleur modérée au point d’injection. Aucune nuisance n’est attendue lors des différentes mesures réalisées sous anesthésie durant l’expérimentation. Seule la réponse à l’application d’un faible courant au niveau du dos peut induire un léger inconfort durant la stimulation électrique (picotements locaux) ; cet inconfort est temporaire et se termine à l’arrêt de la stimulation (durée entre 20 secondes et 60 secondes). Ce faible courant électrique est nécessaire pour faciliter l’entrée des molécules dans la peau.

Devenir

Il sera réalisé une mise à mort en fin d’expérimentations et un prélèvement des tissus cutanés et d’organes. Cette étude vise à étudier le processus de cicatrisation selon le régime suivi (régime alimentaire contrôle associé à différents « sucres » ou régime alimentaire riche en lipides associé à différents « sucres ») ainsi que les différences de réponses de la peau en fonction de ces régimes alimentaires. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet des différents régimes alimentaires sur la peau (peau, tissus adipeux, foie, estomac, vaisseaux, plasma).

Remplacement

La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Souhaitant étudier les défauts de cicatrisation liés au diabète (régime alimentaire enrichi en sucre/gras), notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats cellulaires obtenus et des travaux in vitro se poursuivent en parallèle.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 1296 incluant les 2 sexes. Le nombre d'animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs mesures seront couplées sur chaque animal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les souris seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Toutes les anesthésies seront gazeuses à l’exception de l’anesthésie pour l’étude des réponses de la peau nécessitant une anesthésie plus longue. Des analgésiques seront administrés avant toute induction de plaies et au minimum 24h après. Pour les manipulations sous anesthésie générale, les souris seront placées dans une enceinte chauffée pour maintenir un confort thermique.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Nous réaliserons les manipulations sur des souris âgées de 26 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé.

52 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant cinq semaines pour modéliser la malnutrition infantile, avec contentions quotidiennes, frottis vaginaux et un test au glucose comprenant six heures de jeûne, une incision de la queue et plusieurs prélèvements de sang. Le projet cherche à savoir si l'énergie dépensée pour maintenir la température du corps module la réponse au manque de protéines. Les retombées annoncées pour les 150 millions d'enfants malnutris restent lointaines, la mise à mort servant à prélever muscle et graisses.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur de santé publique dans le monde. Elle peut avoir des conséquences durables sur la croissance, le métabolisme (la manière dont le corps utilise l’énergie) et la puberté. Des études suggèrent que les garçons pourraient être plus touchés que les filles. Dans nos travaux précédents chez la souris, nous avons observé qu’un régime pauvre en protéines affecte davantage la croissance et le métabolisme des jeunes mâles, tandis qu’il retarde surtout la puberté chez les femelles. Ces résultats indiquent que, lorsqu’il manque de nutriments, l’organisme doit répartir son énergie entre plusieurs fonctions essentielles : grandir, maintenir son métabolisme et assurer la reproduction. Cette répartition semble différer selon le sexe. Nous avons montré que, chez les jeunes mâles, l’énergie consacrée à la reproduction joue un rôle limité dans ces effets. En revanche, une part importante de l’énergie pourrait être utilisée pour maintenir la température corporelle. L’objectif de ce projet est de comprendre si l’énergie associée au maintien de la température corporelle influence la façon dont l’organisme gère un manque de protéines, en particulier pendant la période juvénile, lorsque la croissance et la puberté demandent aussi beaucoup d’énergie. Nous mesurerons les effets d’un régime pauvre en protéines sur la croissance et sur certains paramètres du métabolisme, dans des conditions adaptées aux besoins physiologiques des souris. Ce projet permettra de mieux comprendre comment la nutrition au début de la vie peut influencer le risque ultérieur de troubles métaboliques et reproductifs, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’organisme répartit son énergie en cas de manque de protéines pendant l’enfance, notamment l’énergie utilisée pour maintenir la température du corps, et comment ces mécanismes peuvent différer entre les sexes. La malnutrition infantile touche malheureusement encore 150 millions d’enfants de moins de 5 ans à travers le monde. Ces connaissances aideront à mieux comprendre le fonctionnement du corps des jeunes en situation de malnutrition et pourraient, à plus long terme, contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou d’amélioration de la prise en charge en santé humaine.

Procédures

52 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées avec une règle chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). A 56 jours, les souris seront anesthésiées (3 minutes), et subiront un prélèvement sanguin (20 sec). Toutes les souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort transitoire. Ces manipulations sont associées à un stress transitoire lié à la contention. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. L’introduction orale est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation œsophagienne.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette recherche vise à comprendre comment l’organisme dans son ensemble réagit à différents régimes alimentaires, en particulier en cas de manque de protéines. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative (comme des cultures de cellules en laboratoire) capable de reproduire la complexité d’un organisme entier, où plusieurs organes interagissent en permanence pour réguler l’état nutritionnel. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour répondre à ces questions. La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi en recherche en nutrition et permet d’étudier de façon fiable les effets d’une carence en protéines dans des conditions proches de la physiologie. L’objectif étant d’analyser des mécanismes à l’échelle de plusieurs organes, ainsi qu’au niveau moléculaire, ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’être humain.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux par groupe (14 mâles et 12 femelles) a été déterminé grâce à un calcul statistique précis, afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant la validité scientifique des conclusions. Ce calcul s’appuie sur les paramètres les plus variables entre les individus. Les analyses permettront de comparer les effets de l’alimentation, du sexe et d’autres paramètres biologiques. Enfin, pour éviter d’avoir recours à de nouveaux animaux dans de futurs projets, différents organes pouvant être utiles à d’autres recherches (comme le muscle ou les graisses) seront prélevés à la fin de l’étude et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

L’étude ne débutera que chez des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. Leur croissance (taille et poids) sera suivie chaque semaine de manière individuelle. Pour faciliter l’alimentation des plus jeunes, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu’elle soit facilement accessible. La quantité de nourriture consommée sera également surveillée pour s’assurer de leur bon état général. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance. Les mesures finales, ainsi que le prélèvement nécessaire, seront effectuées sous anesthésie pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour comprendre le fonctionnement de l’organisme lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment la production de chaleur par l’organisme oriente la réponse à un manque de protéines dans l’alimentation. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car c’est le stade où la croissance et la reproduction se mettent en place chez la souris.