Recherche fondamentale

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc puis une injection de cellules Natural Killer dans le sinus rétro-orbitaire, avec une mesure quotidienne de la tumeur, pour étudier l'activité antitumorale de ces cellules immunitaires. Le porteur indique que les souris sont tuées quand la tumeur atteint 15 millimètres ou dès qu'un point limite est atteint, comme une gêne au déplacement ou une prostration. Sur le remplacement, il affirme que le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires en jeu rend la modélisation in vitro impossible et que les cellules NK n'existent que chez les mammifères.

Objectifs

Les cellules immunitaires Natural Killer (NK) appartiennent à la première ligne de défense du corps contre les agents pathogènes. En effet, ces cellules sont capables de reconnaître et d’éliminer les cellules infectées par des virus mais également les cellules cancéreuses. Ces cellules sont également douées d'une certaine mémoire, ce qui signifie que leur réponse sera amplifiée lors d'un second contact avec une cellule infectée ou tumorale. Ainsi, chez des souris porteuses de tumeurs, il a été montré une diminution de la taille des tumeurs et une meilleure survie des souris quand celles ci sont traitées avec des cellules NK pré-activées. Cette pré-activation consiste en une incubation de 16h de cellules NK purifiées avec un cocktail de cytokines. Les cellules NK ainsi pré-activées sont dites cellules NK mémoires car elles montrent une meilleure survie et de meilleures fonctions effectrices in vitro et in vivo lors d'un second contact avec des cellules tumorales. Le but de ce projet et de mieux comprendre l'interaction et l'importance de chaque cytokine prise séparément et en cocktail sur la préactivation des cellules NK. Il permettra notamment d'évaluer l'importance de différentes voies moléculaires en aval de ces cytokines pour la génération de NK mémoires. Afin d'évaluer leur rôle anti-tumoral in vivo, les cellules NK seront traitées avec différentes combinaisons de cytokines en présence d'inhibiteurs de ces voies. Ces cellules NK seront ensuite injectée à des souris porteuses de 4 types de tumeurs afin d'établir l'importance de ces voies moléculaires sur l'activité anti-tumorale des NK mémoires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact des cellules NK préactivées sur la pousse tumorale et de caractériser les voies essentielles à leur fonction in vivo. Il pourra permettre d'affiner les méthodes de pré-activation des NK, méthodes potentiellement transposable en immunothérapie contre le cancer.

Procédures

Injection de cellules tumorales en sous cutanée sur le flanc droit, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois . Injection de cellules NK purifiées préactivée en intra veineuse au niveau du sinus retro-orbital, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois. Mesure de la tumeur, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, journalier.

Impact sur les animaux

Le transfert de cellules NK par injection intra veineuse au niveau du sinus retro-orbatal ne devrait créer aucun stress particulier. Les cellules tumorales seront injectées en sous cutané au niveau du flanc droit ce qui conduit à une gêne associée à la pousse de la tumeur, c'est pourquoi la mesure de la tumeur sera journalière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude ou avant si un point limite est atteint.

Remplacement

Ce type de projet nécessite l'utilisation de modèles animaux, le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeu étant trop nombreux et leurs interactions trop complexespour pouvoir être modélisés in vitro. D'autre part, les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères ce qui exclut le recourt à d'autres modèles animaux non mammifères.

Réduction

Une étude bibliographique appuyée par nos expériences relevant d'autres projets nous ont déjà permit de définir les doses de cellules tumorales et NK à injecter ainsi que la cinétique de croissance des tumeurs ce qui limite les études préliminaires. Le nombre d'animaux nécessaires a été calculé de façon à apporter des réponses statistiquement fiables tout en évitant des mises à mort inutiles (test de LogRank pour les statistiques reliées à la survie, nombre d'animaux par groupe calculé par epiR package version 0.9-030). Afin d'optimiser le nombre d'animaux utilisés de nombreux paramètres sur la pousse de la tumeur, la fonction des cellules NK et leur phénotype à la fin de l'expérimentation seront analysés sur un même animal.

Raffinement

Lors de cette procédure, un suivit des animaux et des mesures journalières de la tumeur seront réalisées. Ainsi l'animal sera mis à mort lorsque le plus grand diamètre de la tumeur atteint 15 mm (Workman et al, BJC, 2010). D’autre part, les animaux seront mis à mort dans l’un des cas suivants : blessure au niveau de la tumeur, gène dans le déplacement, prostration, absence d’interaction avec le groupe. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique jusqu'à disparition des symptômes.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées (KO, KI, possibilité d'utiliser la technique CRISPR/cas9) et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. Cet âge correspond, selon la courbe de croissance des souris C57BL/6, à un poids de 19-21 grammes à jeun. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.

822 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans la moelle épinière ou le cerveau sous anesthésie et subissent des tests de force musculaire, avant une perfusion intracardiaque mortelle permettant de prélever la moelle épinière, pour évaluer une protéine censée protéger les motoneurones dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur indique que les souris mutées présentent dès huit semaines une baisse de force musculaire et un léger comportement dépressif. Il affirme que la production de ces données précliniques sur l'animal est nécessaire pour soutenir une demande d'essai clinique.

Objectifs

Les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlent les mouvements volontaires ainsi que la respiration. Dans la sclérose amyotrophique latérale (SLA), ces cellules dégénèrent ce qui entraîne des troubles moteurs. Notre laboratoire a montré que la protéine EN1 exprimée et sécrétée par les interneurones de la moelle épinière est importante pour la survie des MN. Une injection intrathécale unique de la protéine recombinante hEN1 permet de bloquer pendant 3 mois la neurodégénérescence, et des injections répétées de hEN1 permettent de maintenir l’effet neuroprotecteur sur une durée plus longue. Ce projet a pour objectif de produire des données précliniques sur l’activité neuroprotectrice de hEN1 permettant de soutenir une demande d’essai clinique évaluant le recours à hEN1 dans le traitement de la SLA, ainsi que d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous chercherons à : 1) tester l’activité de nos lots de protéine hEN1 afin d’évaluer leur conformité et permettre ainsi leur utilisation; 2) décortiquer les mécanismes d’action de hEN1; 3) déterminer si l’effet neuroprotecteur de hEN1 implique une action sur les synapses inhibitrices des MN ; et 4) évaluer l’impact de l’hyperactivité des MN corticaux sur la mort des MN spinaux. Nous prévoyons donc d’injecter la protéine hEN1 par voie intrathécale, ainsi que des virus encodant la protéine dans le cerveau de souris par injection stéréotaxique. Ces injections seront suivies d’études comportementales, physiologiques et histologiques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégénératives est en constante augmentation à l’échelle planétaire. En France, la SLA affecte actuellement 5000 à 7000 patients, avec une incidence annuelle proche de 2,5 pour 100 000 habitants. Chez les patients atteints de SLA, les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlant les mouvements volontaires ainsi que la respiration dégénèrent, ce qui entraîne des troubles moteurs. L’espérance de vie des patients est en général inférieure à 5 ans après établissement du diagnostic. Cette maladie est progressive et fatale. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour cette pathologie. En plus de la lourde souffrance pour les patients et leurs proches, le coût de prise en charge pour la santé publique est important. La protéine recombinante humaine Engrailed 1 (hEN1) promeut la survie des MN. Ce projet aidera à comprendre les mécanismes qui sous-tendent la mort des MN chez les souris et de caractériser le mécanisme d’action de hEN1 sur la survie des MN. Ce projet servira aussi à évaluer la conformité de nos lots de hEN1 en amont de leur libération pour injection chez le patient. L’ensemble de ces expériences est d’une importance critique pour permettre la soumission une demande d’essai clinique de Phase I/II visant à évaluer la sûreté mais également l’activité d’une thérapie innovante pour le traitement de la SLA reposant sur l’injection intrathécale de hEN1.

Procédures

Les injections intrathécale se déroulent en conditions d’asepsie et d’anesthésie générale. La procédure dure en moyenne environ 15 minutes. Un maximum de 640 souris sur 5 ans seront soumis à cette procédure. Les injections stéréotaxique intracérébrale se déroulent en conditions d’asepsie et d’anesthésie générale. La procédure dure en moyenne environ 1 heure. Les animaux utilisés seront âgés de 30 jours. Un maximum de 16 souris seront soumis à cette procédure. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront âgés de 4,5 mois. La procédure prend en moyenne environ 2 heures. Un maximum de 24 souris seront soumis à cette procédure. Les évaluations de la force musculaire par tests moteurs seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront âgés de 6 semaines à 4,5 mois. Environs 15 minutes sont nécessaires pour la réalisation des 3 tests pour un animal donné. Un maximum de 552 souris seront soumis à cette procédure. Les perfusions intracardiaque seront réalisées sous anesthésie générale et prennent environ 15 minutes. L’ensemble des animaux utilisés (i.e. un maximum de 822 souris) seront soumis à cette procédure.

Impact sur les animaux

Nos expériences nécessitent des procédures de classe modérée. Pour toutes nos expériences, les souris sont anesthésiées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Cependant, et même si notre laboratoire a acquis une solide expérience en la matière, suite à une injection intrathécale ou intracérébrale ou à une enregistrement électrophysiologique, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voutée, des problèmes digestifs, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Les souris En1+/- ont été caractérisées au laboratoire et sont actuellement utilisées dans le cadre d’autres projets. Elles présentent à partir de l’âge de 24 semaines de légères modifications de leur activité locomotrice et un léger comportement dépressif. Elles présentent à partir de l’âge de 8 semaines une baisse de force musculaire, mais ne manifestent cependant aucun point limite, au moins jusqu’à l’âge de 15 mois. Les souris Gephyrin-RFP ne présentent pas de phénotype dommageable. Nous attendons donc que les souris En1+/- ::Gephyrin-RFP que nous obtiendrons dans le cadre du croisement des 2 lignées présentent un phénotype dommageable au même niveau que la lignée En1+/-. Néanmoins, une fois ce croisement obtenu, une vérification de phénotype sera réalisée.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur moelle épinière collectée afin de permettre des analyses histochimiques visant à évaluer l’effet neuroprotecteur de hEN1 sur les MNs spinaux ou caractériser l’expression de L1, de Piwil1 ou du rapporteur fluorescent Gephyrin-RFP.

Remplacement

Nos expériences devant permettre de soutenir une demande d’essai clinique, il est nécessaire qu’elles soient réalisées sur l’animal. De plus, l’expérimentation in vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de l’activité neuroprotectrice de hEN1. Enfin, nos travaux ont pour objectif d’évaluer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la mort des MNs dans la SLA, ce qui implique d’avoir recours à un modèle animal offrant ainsi un contexte physiologique pertinent pour l’étude de l’origine des déficits observés chez les patients. Dans ce cadre précis, la souris s’avère être un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques.

Réduction

Nos travaux précédents réalisés sur des animaux soumis à une injection intrathécale ainsi qu’à une évaluation comportementale nous ont permis de démontrer qu’un nombre de 8 souris par condition expérimentale permet d’obtenir une puissance statistique satisfaisante malgré d’éventuels « drops out » ou de mauvaise réalisation de l’injection. Cependant, lorsque des animaux sont utilisés dans le seul but de permettre des analyses histologiques, nos résultats antérieurs indiquent que 6 souris par groupe constituent un nombre minimum d’animaux pour une puissance statistique suffisante (www.stasticalsolutions.net/pssTtest_calc.php). Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une cage elle-même chauffée grâce à un matelas chauffant jusqu’à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leurs groupes d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement et observés et pesés chaque jour pendant cinq jours. Ensuite, en plus d’une inspection visuelle quotidienne, des relevés de poids seront réalisés au moins 2 fois par semaine et d’éventuels signes de douleur seront recherchés. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.

Choix des espèces

La souris est une des espèces majoritairement utilisées dans le domaine scientifique pour l'étude des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet ainsi une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de SLA ont été générés et caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de EN1 dans un modèle murin de la SLA ainsi qu’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la mort des MNs spinaux chez la souris En1+/-. Les premiers signes de neurodégénérescence étant observés à l’âge de 3 mois, nous prévoyons d’injecter la protéine hEN1 à cet âge afin de pouvoir évaluer sa capacité à bloquer le phénomène dégénératif. Certaines de nos expériences seront également réalisées à des stades plus précoces (à partir de l’âge de 1 mois), afin de caractériser les déficits moléculaires intervenant en amont de la mort des MNs.

4776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à trois chirurgies stéréotaxiques du cerveau puis une imagerie terminale d'environ deux heures sous anesthésie, avant d'être tuées, pour développer des techniques de microscopie et cartographier l'espace extracellulaire du cerveau sain et malade. Le porteur décrit surtout les nuisances liées à la chirurgie et au transport vers le centre d'imagerie. Il affirme qu'obtenir ces données sur l'animal sain et pathologique passe par des modèles reproduisant la complexité des maladies humaines.

Objectifs

Comprendre le fonctionnement cérébral est un enjeu sociétal majeur tant pour la connaissance générale de cet organe encore bien mystérieux que pour notre capacité à combattre et traiter les maladies neurologiques et psychiatriques. La compréhension de la vie intracellulaire des cellules cérébrales, comme les neurones, a connu une expansion incroyable au cours des dernières décennies, ouvrant par exemple la voie à des manipulations de l’activité des réseaux neuronaux. Cependant, le coeur de l’activité d’un réseau neuronal qu’est le passage d’information d’une cellule à l’autre à travers le milieu extracellulaire, reste malheureusement un processus très peu compris. La compréhension de cet environnement, où toutes les molécules de l’information cérébrale passent, reste très limitée à cause d’un manque de technologie permettant son étude en condition vivante. Le projet repose sur une capacité à développer de nouvelles approches de microscopie à haute résolution au service de l’étude de la communication cérébrale. Il a pour objectif de comprendre le fonctionnement cérébral en décryptant comment l’environnement extracellulaire du cerveau contrôle la communication entre cellules dans un contexte physiologique et dans des maladies neurodégénératives et psychiatriques. En effet, combattre les maladies neurologiques et psychiatriques nécessite une compréhension fine des désordres moléculaires en place, jusqu’à la diffusion des molécules à visée thérapeutique. L’utilisation du modèle rongeur permet d’acquérir des connaissances et de favoriser leur transfert à la clinique humaine.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’utiliser deux nouvelles approches de microscopie super résolutive développées dans nos laboratoires pour fournir une description détaillée de l’espace extracellulaire et du réseau structurel de la matrice extracellulaire dans le tissu sain et pathologique : technique d’imagerie de nano-objets uniques (suivi des nanotubes/nanoparticules de carbone). Ces approches permettront de composer, à une échelle nanométrique, une carte de l’espace extracellulaire et de sa matrice dans les régions d’intérêt. C’est pourquoi, nous proposons à travers cette étude qui regroupe quatre laboratoires de caractériser l’espace extracellulaire via des technologies nouvelles et inédites de microscopie de super-résolution

Procédures

Chirurgie stéréotaxique (1h maximum), au maximum 3 chirurgies stéréotaxiques pour les modèles pathologiques sur 4 mois. Anesthésie pendant la chirurgie (1h) et en terminal pour l'imagerie (en moyenne 2h), une fois par animal.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie stéréotaxique, mais bien cadrés par l’utilisation d’analgésiques adaptés et d’un suivi régulier des animaux. Ils sont aussi liés au transport des animaux entre leur hébergement et le centre d'imagerie, mais réduits au minimum dans le temps, avec un respect du maintien de la température.

Devenir

A l'issu des procédures tous les animaux seront euthanasiés soit à des fins d'imagerie (tranches) soit après l'imagerie in vivo.

Remplacement

L'étude de l'espace extracellulaire a connu des avancées récentes, grâce au développement de techniques comme la microscopie en super résolution appliquée aux modèles ex vivo. Pour compléter les connaissances sur le sujet il est nécessaire d'obtenir des données sur l'animal sain et pathologique, à travers des modèles animaux réalisés chez le rongeur. Nous souhaitons caractériser l’espace extracellulaire sain et pathologique, nécessitant l’utilisation de modèles animaux pouvant mimer la complexité des maladies chez l’humain. Pour la partie expérimentale sur tranche des tests de Student seront pratiqués, en revanche pour les études sur les modèles in vivo la comparaison des groupes sera effectuée grâce à une ANOVA.

Réduction

Cette étude concerne un consortium composé de 4 laboratoires français qui à la fin de l’étude récupèreront des échantillons afin d’effectuer des études histologiques ou biochimiques, complétant ainsi les études in vivo et ainsi la base de données scientifiques, limitant l’expérimentation animale à cette seule étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Ils sont acclimatés pendant deux semaines avant l'expérimentation. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité.

Choix des espèces

L'utilisation de souris dans le développement d'outil de microscopie en super résolution est pertinente dans cette phase de notre projet. En effet, la taille réduite de l'animal, son cycle de vie court et la disponibilté des modèles pathologiques permettent d'optimiser le développement d'outils pour l'imagerie in vivo de l'environnement extracellulaire. Les animaux seront utilisés à l'âge de 2 mois et jusqu'a 6 mois, pour permettre de travailler avec des animaux sains et pathologiques adultes.

696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur du poumon ou de mélanome sous anesthésie puis un suivi de la croissance tumorale sur quatre à huit semaines, avant d'être tuées pour prélever la tumeur, afin de tester si l'invalidation d'un gène nommé TREX1 renforce l'effet des chimiothérapies. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements ou s'ulcérer et que les métastases pulmonaires provoquent des difficultés respiratoires. Il affirme que cette preuve de concept ne peut s'établir que sur des modèles immunocompétents, l'animal ne pouvant plus être remplacé à ce stade.

Objectifs

L'immunothérapie est l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement du cancer mais de trop nombreux patients ne répondent pas de manière satisfaisante à ses nouvelles thérapies, en particulier les patients atteints de mélanome métastatique et de cancer du poumon. Un défi majeur dans le traitement du cancer consiste donc à faire bénéficier l’immunothérapie à un plus grand nombre de patients. Des études précliniques ont montré que les traitements cytotoxiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie stimulent les réponses immunitaires antitumorales. Une meilleure compréhension de la façon dont ce processus est régulé pourrait être exploitée pour activer le système immunitaire du patient afin que celui-ci détruise les cellules cancéreuses. Nous avons montré récemment qu'une protéine, particulièrement présente dans les cellules cancéreuses, a pour but de rendre ces cellules cancéreuses invisibles au système immunitaire, empêchant donc celles-ci d'être détruite. Nos résultats montrent que lorsque l'on supprime cette protéine, les cellules tumorales deviennent à nouveau sensibles au système immunitaire, qu'elles sont plus sensibles également aux chimiothérapies et donc qu'elles sont détruites plus facilement. Le projet qui fait l’objet de cette saisine consistera donc désormais à démontrer, dans deux modèles précliniques murins de mélanome et de cancer du poumon dont les cellules tumorales n'expriment plus la protéine, une meilleure efficacité des chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif principal de faire la preuve de concept, sur deux modèles de tumeur solide de mélanome et de cancer du poumon, que l’invalidation du gène TREX1 peut à la fois augmenter la sensibilité de la cellule tumorale aux chimiothérapies conventionnelles mais également contribuer à générer une réponse immunitaire anti-tumorale, souvent liée chez l’homme à des réponses très favorables aux traitements et soutenues dans le temps avec l’absence de récidives (rémissions complètes). Cette étude ouvrira un champ particulièrement intéressant de développement d’inhibiteur de la protéine TREX1, comme nouvelles molécules thérapeutiques permettant de potentialiser les effets des chimiothérapies et donc d’en diminuer les doses, et par conséquents réduire les effets secondaires souvent sévères associés à ces doses.

Procédures

Tout au long des expériences décrites dans ce projet aucun type de prélèvement ne sera fait sur les animaux vigiles. Les seules manipulations au cours de l'expérience seront la pesée hebdomadaire et la mesure de la tumeur trois fois par semaine. Les mesures tumorales s'étaleront sur une durée de 4 à 8 semaines. Seuls des prélèvements terminaux seront faits en fin d'expérience. La greffe sous-cutanée ainsi que l'administration sous-cutanée du traitement se fera de manière unique et sous anesthésie et le réveil des animaux sera particulièrement suivi et surveillé..

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs. Dans le modèle sous-cutané, les effets indésirables peuvent être une gêne de la locomotion ou une ulcération de la tumeur. Dans le modèle métastatique (métastases pulmonaires) les effets indésirables peuvent être des difficultés respiratoires. Le suivi quotidien des animaux nous permettra de procéder à l’euthanasie de tout animal atteignant un des points limites décrit ci-après.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

La preuve de concept du rôle de cette protéine dans la résistance aux chimiothérapies conventionnelles revêt une importance capitale dans le cadre du développement de nouvelles molécules inhibitrices de cette protéine pour le développement en clinique chez des patients atteints de mélanome ou de cancer du poumon mais également pouvant être étendus à d’autres type de cancer. Cette preuve de concept ne peut s’établir que sur de véritables modèles précliniques immunocompétents dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Seuls les modèles proposés nous permettront non seulement de mesurer l’efficacité de nos traitements en fonction de la présence ou de l’absence de l’expression de TREX1 sur la croissance tumorale et la survie globale, et d’étudier les mécanismes de la mise en place d’une réponse immunitaire anti-tumorale. A ce stade du projet il n’est donc plus possible de substituer l’animal à un modèle in vitro qui ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester le rôle de TREX1 sur l’efficacité des traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 640 souris sur 3 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) des chimiothérapies lors de l'inactivation de cette nouvelle cible thérapeutique. Le nombre d’animaux a été évalué de manière à effectuer les tests statistiques adéquats pour définir la significativité de nos résultats D’autre part le projet est dessiné dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux dans le cheminement expérimental proposé, dans la mesure où la validation d’une étape donnera le feu vert à l’étape suivante uniquement si les résultats attendus sont significatifs. De la même manière la répétition d’une expérience ne se fera que si un effet est observé avec une tendance sans que le significativité statique soit atteinte. Cette répétition sera effectuée afin de montrer la reproductibilité de cette tendance. L’expertise et le recul que nous avons au laboratoire sur les deux modèles de mélanome et de cancer du poumon nous permettra de limiter le nombre d’animaux à son strict minimum afin d’avoir une validation statistique de nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage d'une superficie de 500cm2) à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. La prostration, les difficultés respiratoires, l’agressivité et l’isolement sont tous des critères d’arrêt conduisant au sacrifice des animaux avant la fin du protocole. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. L’utilisation de souris femelles dans nos protocoles expérimentaux réduit le risque d’agressivité et d’isolement. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience et seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation induite par les greffes de cellules de mélanome ou de cancer du poumon. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé. Les signes listés ci-dessous feront l’objet d’une attention particulière lors de nos visites journalières: - le volume tumoral et l’ulcération de la tumeur (observation de la tumeur et mesure) - l’absence d'hydratation ou de prise de nourriture (observation de l’état général) - la gêne de la locomotion (observation du déplacement dans la cage) - le saignement ou une perte de liquide par un orifice (observation de l’animal) - l’isolement par rapport aux autres animaux, le dos vouté, les yeux enfoncés, la respiration saccadée, l’amaigrissement (observation du comportement de l’animal).

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé dans notre étude est le modèle le plus relevant pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence des effets thérapeutiques sur le long-terme et éviter les récidives ou les résistances aux traitements actuels. Dans la mesure où nos effets passent par le système immunitaire, c'est le modèle le plus pertinent par rapport à ce qui se déroule chez l'homme. Ce modèle est considéré comme une étape obligatoire avant de potentielles applications cliniques. Les souris seront âgées de 7 semaines, âge adulte chez la souris, période à partir de laquelle le système immunitaire est complètement mature et fonctionnel, et où l'on observe une forte incidence et une forte homogénéité de prise de greffe.

540 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une à trois chirurgies cérébrales pour implanter cathéter, électrodes ou fibres optiques, et 520 d'entre eux s'auto-administrent de la cocaïne chaque jour pendant deux à trois mois, pour étudier les effets d'une stimulation cérébrale profonde sur l'addiction. Le porteur indique que les rats peuvent perdre du poids, se gêner du bloc de ciment dentaire fixé sur le crâne et se battre entre partenaires de cage. Il affirme que l'étude des comportements de consommation exige un animal vigile et libre de ses mouvements, faisant du rat un modèle qu'il juge irremplaçable.

Objectifs

L'addiction, notamment à la cocaïne, est une maladie psychiatrique pour laquelle il n'existe pas de médication efficace. Ainsi, les approches chirurgicales, telles que la stimulation cérébrale profonde (SCP) sont désormais envisagées pour réduire les comportements addictifs liés à la consommation de drogues. La SCP consiste en l’implantation d’électrodes de stimulation dans des zones profondes du cerveau afin de normaliser l’activité neuronale, responsable de comportements pathologiques en injectant des impulsions électriques à haute fréquence. Bien qu’utilisée avec succès chez l’homme, notamment pour la maladie de Parkinson et la dépression, les mécanismes cellulaires responsables des effets bénéfiques de la SCP restent largement méconnus. Nos données récentes obtenues chez le rat indiquent que la SCP du noyau subthalamique permet de réduire certains comportements pathologiques liés à l’auto-administration de cocaïne. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets bénéfiques de la SCP sur les comportements de type addiction chez le rat.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cellulaires et moléculaires du STN ciblés par le SCP pour produire ses effets bénéfiques sur les comportements addictifs. Pour cela, nous utiliserons un nouveau protocole comportemental, qui recrée fidèlement les conditions observées chez l'humain, en permettant l'observation concomitante de l'émergence de l'escalade de la cocaïne et de sa recherche compulsive. Les enregistrements électrophysiologiques sur tranches permettront de caractériser les neuroadaptations induites par la cocaïne dans le NST et de déterminer comment celles-ci sont affectées par la SCP. Ce projet permettra également de caractériser le rôle de la connexion préfrontale-NST dans les comportements addictifs. Ce projet générera des résultats à fort impact translationnel, apportant de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction, et confirmera le potentiel de la SCP du NST pour le traitement de cette pathologie.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée. 180 animaux seront soumis à un seul acte (160 implantés avec un cathéter, 45 min ; 20 injectés avec un virus, 60min). 180 animaux seront soumis à deux actes (implantation de cathéter, 45min, + électrodes de stimulation, 90min). 180 animaux seront soumis à trois actes chirurgicaux chirurgies (injection de virus, 60min, + implantation de fibres optiques, 90min, + cathéter, 45min). 520 animaux s'auto-administreront la cocaïne quotidiennement durant 2-3 mois, entre 2h et 8h par jour.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les conséquences ‘classiques’ à court terme des interventions chirurgicales. Dans les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation d’électrodes ou de fibres optiques, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas ad libitum), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. Enfin, les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters, électrodes, ou fibres optiques, peuvent parfois provoquer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu. Suivant les sessions d’auto-administration durant le protocole PIE, les animaux présentent une hyperactivité marquée, qui s’estompe en moins d’une heure (la dose i.v. de cocaïne est faible). Les symptômes de manque (perte de poids, agressivité…) sont rares, car les animaux ont accès tous les jours à la cocaïne.

Devenir

Afin d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques ex vivo, sur tranches, tous les animaux du projet seront mis à mort pendant ou à la fin de des procédures.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements et choix. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.

Réduction

Notre approche, visant à réaliser des enregistrements électrophysiologiques chez des animaux préalablement soumis à un protocole comportemental, permet à elle seule de réduire le nombre d’animaux. Toutefois, dans l’optique de ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous analyserons régulièrement les données expérimentales. Nous effectuerons a posteriori des tests de puissance statistique afin de calculer la robustesse statistique de nos résultats. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale. Par expérience, 10 animaux sont nécessaires par condition testée pour permettre de mettre en évidence un effet comportemental dans les protocoles d'auto-administration de drogues ; ce nombre prenant en compte l’exclusion de certains individus suite à d’éventuels problèmes inhérents à ce type d’étude (infection, cathéter bouché etc…). Pour les études combinant auto-administration et SCP et/ou de l'optogénétique, 15 animaux par condition testée sont nécessaires pour anticiper de possibles mauvais placements d'électrodes/fibres.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) et/ou de perte importante de poids, l’animal sera isolé et aura accès ad libitum à une nourriture enrichie. Un traitement antidouleur pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc). Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie appropriée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. Les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'homme. Afin d'améliorer la qualité des enregistrements électrophysiologiques, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez de jeunes adultes 7-8 semaines (environ 200g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer de l'ovaire, un suivi par imagerie deux fois par semaine, puis jusqu'à vingt et une injections d'un produit bloquant ou la pose chirurgicale d'une mini-pompe, pour étudier le rôle de protéines appelées prokinéticines. Le porteur indique que la maladie peut provoquer une accumulation de liquide, un amaigrissement et des ulcérations de la tumeur. Il affirme qu'après l'échec de ses essais sur des souris immunodéprimées, la confirmation dans un "organisme entier" doté d'un système immunitaire complet est "indispensable".

Objectifs

Le cancer de l’ovaire est le cancer le plus fréquent et le plus mortel parmi les cancers gynécologiques. ll est responsable de plus de 140 000 décès chaque année dans le monde. Sa forme la plus commune est le cancer épithélial de l'ovaire (CEO), généralement diagnostiqué à un stade avancé et qui représente plus de 95% des tumeurs malignes de l'ovaire. La chirurgie suivie d'une chimiothérapie à base de platine constitue le traitement standard actuel. Cependant, cette approche n’est pas toujours efficace pour améliorer la survie des patientes. Depuis une quinzaine d’années, notre groupe de recherche s’intéresse à l’étude d’une famille de protéines, les prokinéticines. Ces protéines sont spécifiquement exprimées dans les tissus endocrines (ovaire, testicule, cortex surrénal et placenta) où elles agissent sur les cellules endothéliales. Très peu de données existent quant à leur rôle dans le développement et la progression du cancer de l’ovaire, L’objectif de notre projet est de déterminer l'implication de deux protéines PROK1 et PROK2 dans le développement et ou la progression du cancer épithélial de l'ovaire (CEO) par le biais d'approches clinique, in vitro et in vivo. Nos expériences ont démontré que les taux circulants et ovariens de PROK1 et de ses récepteurs étaient augmentés chez les patientes CEO. Les prokinéticines sont également fortement exprimées par l’environnement tumoral et notamment par les cellules immunitaires. L’ensemble de ces résultats suggère que les prokinéticines contribuent au développement du CEO et que le blocage de leurs effets pourrait constituer une thérapie pour le traitement du CEO. Nos expériences précédentes sur des souris présentant une immunité fortement altérée et dans lesquelles des cellules humaines de CEO étaient injectées n’ont pas donné satisfaction, nous proposons donc dans ce projet de confirmer ces résultats dans un organisme entier vivant et possédant une système immunitaire complet, indispensable pour l’observation du développement de la tumeur ovarienne et pour le suivi de sa progression. Le nouveau modèle consistera à injecter des cellules murines du cancer de l’ovaire. Ce modèle de cancer de l’ovaire murin a déjà été utilisé et publié par plusieurs laboratoires. Il nous permettra de suivre le développement tumoral puisque les cellules seront dotées d’un marqueur bioluminescent.

Bénéfices attendus

Le cancer de l’ovaire reste une cause majeure de décès dans le monde. La recherche de nouvelles cibles dans son traitement est indispensable pour améliorer la survie des patientes. Les bénéfices attendus de ce projet seront une meilleure compréhension de rôle des prokinéticines dans le développement et la progression de ce cancer. Plus spécifiquement, les résultats de ces tests permettraient de démontrer la possible valeur thérapeutique du blocage des récepteurs au sein d’un organisme entier.

Procédures

Les animaux seront injectés avec des cellules de souris de cancer de l’ovaire, sous anesthésie gazeuse. Pour suivre le développement tumoral, elles seront imagées 10 min après une injection de luciférine pendant 15 sec. Ce suivi sera effectué 2 fois par semaine pendant 5 semaines maximum. Une partie de ces souris sera traitée par un produit qui bloque l’action des récepteurs pendant une durée maximale de 3 semaines, à raison d’un nombre d’injection maximum de 21 par souris. Pour l’autre groupe des souris, une mini pompe nécessitant une intervention chirurgicale de 10 min maximum sera posée pendant 2 semaines afin de délivrer en continu les protéines d’intérêt.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale ou en sous-cutané est susceptible de provoquer une modification du poids de l’animal, que ce soit une augmentation (avec le développement de liquide d’ascites) ou une diminution/ cachexie due à la progression de la maladie (affaiblissement). Des signes de stress (poils hérissés, absence de toilettage), de douleur due à une éventuelle ulcération de la tumeur ou une inflammation de la zone suturée peuvent apparaître. Des changements de comportement tels que des difficultés à se déplacer ou manger peuvent être attendus.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à la fin de la procédure en raison de l’injection de cellules cancéreuses. Leur réutilisation n’est donc pas envisageable.

Remplacement

L’équipe a récemment montré l’importance des prokinéticines dans l’environnement tumoral (cellules immunitaires, cellules des vaisseaux, adipocytes) sur des biopsies de patientes avec un cancer de l’ovaire. Nos modèles in vitro, sur lesquels nous nous sommes appuyés jusqu’à présent, limitent fortement l’avancée de nos recherches puisque la reproduction d’un environnement et notamment d’un système immunitaire y est impossible. En effet, ils ne nous permettent pas de mimer de façon précise le cancer de l’ovaire dans des conditions se rapprochant de ce qui est observé en clinique. Le recours au modèle animal est donc indispensable. Ces études sont donc à réaliser sur des animaux qui peuvent intégrer les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Nous utiliserons dans cette étude 165 souris femelles sur 5 ans. En utilisant des doses déjà testées dans d'autres études, nous éviterons de réaliser une étude dose-réponse ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les expériences seront réalisées dans un laboratoire contrôlé pour l’absence de pathogènes. Les souris sont hébergées en groupe sociaux dans un environnement contrôlé avec nourriture et eau ad-libitum. Le milieu est enrichi grâce à des maisonnettes et des carrés de coton (pour la nidification et le jeu) conformément aux règles mises en place dans l’installation. Les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins, y compris les week-ends, afin de s’assurer de leur bon état général. Une grille de « scoring » a été établie pour chaque procédure afin de définir des points limites précis. La prise en charge des souris en cas de stress, de douleur ou d’inconfort est également détaillée et connu par tous les responsables du projet. L’utilisation d’analgésiques est systématique lorsque les animaux présentent des signes de souffrance. La taille de la tumeur ainsi que le poids des souris seront mesurés 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Le projet a pour but de caractériser le rôle des prokinéticines dans le microenvironnement tumoral du cancer de l’ovaire et plus précisément sur les cellules immunitaires infiltrant la tumeur. Les souris utilisées dans nos expériences sont des souris immunocompétentes de la souche C57BL/6J pour réaliser un modèle syngénique. En effet, ce modèle nous permettra d’étudier les relations complexes entre les différents composants du système immunitaire et le développement du cancer de l’ovaire. De plus, ces souris ne présenteraient pas de risque de rejet car les cellules injectées sont d’origine murines. Plusieurs études ont démontré qu’il existe une grande similitude entre le développement tumoral chez la souris et chez la femme et dans l’expression et la régulation des gènes tumoraux et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse et de l’inflammation comme les prokinéticines sont exprimés dans des types cellulaires similaires et régulés de la même façon. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles.

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des tumeurs mammaires spontanées ou reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses, afin d'étudier le rôle de protéines appelées intégrines dans les cancers du sein liés au gène BRCA1. Le porteur indique que les tumeurs restent localisées et que des ulcérations sont rares. Il décrit les souris transgéniques comme des "modèles incontournables" et affirme qu'il est "indispensable" de travailler in vivo malgré les cultures cellulaires utilisées en complément.

Objectifs

Le cancer du sein représente la première cause de décès par cancer chez la femme, principalement dû à une connaissance encore incomplète des mécanismes moléculaires et cellulaires qui induisent le développement tumoral. La glande mammaire est une structure épithéliale constituée d’un système de canaux ramifiés et d’alvéoles. L’épithélium mammaire adulte est composé de cellules luminales sécrétrices du lait et de cellules basales myoépithéliales qui, en se contractant, aident à l’expulsion du lait vers les canaux. Ces deux types de cellules dérivent de la prolifération et de la différenciation de cellules souches mammaires. Or, des études récentes ont montré que l’amplification aberrante des cellules souches est à l’origine de cancers du sein agressifs associés à des mutations du gène BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène connu pour être un suppresseur tumoral. Ces cancers appartiennent à un groupe des tumeurs pour lesquelles les thérapies ciblées utilisées dans le traitement d’autres types de cancers du sein (par exemple, les thérapies hormonales) se sont avérées inefficaces. Les intégrines sont des protéines présentes dans la surface des cellules qui permettent leur adhésion et régulent de nombreuses fonctions. Certaines intégrines sont indispensables à la multiplication et la différenciation des cellules souches nécessaires à une gestation et lactation normales. Nous souhaitons étudier le rôle de ces intégrines dans un modèle murin connu pour développer des tumeurs mammaires dont l’origine et les caractéristiques sont très similaires aux cancers du sein avec mutation en BRCA1 chez la femme. Nos premiers résultats indiquant que la perte des intégrines dans ce modèle diminue l’apparition des tumeurs mammaires, nous projetons d’analyser les mécanismes qui expliquent cette inhibition. On déterminera en particulier l’impact de la perte des intégrines dans la glande avant l’apparition des tumeurs (statut pre-néoplasique) et sur son contenu en cellules souches tumorales, connues pour leur implication dans les récidives et la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

L’interaction des intégrines avec la matrice extracellulaire qui entoure les cellules joue un rôle important au cours des différentes étapes de la progression tumorale mammaire, du carcinome in situ (tumeur en stage initiale, souvent bénin) à l’invasion tissulaire (tumeur invasif mais encore localisé à la glande mammaire) et la métastase (invasion d’autres tissues). De façon notable, certaines intégrines sont surexprimées dans les tumeurs du sein et leur expression est associée à un mauvais pronostic et à des taux de survie réduits. Notre étude permettra de déterminer la contribution des intégrines dans le développement tumoral de la glande mammaire et la régulation des cellules souches tumorales, responsables des récidives et de la dissémination métastatique. Notre approche permettra d’évaluer la contribution de ces intégrines dans les anomalies de croissance cellulaire, différenciation et invasion observées dans les carcinomes mammaires humains. A long terme, ces informations permettront de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la communication entre cellules épithéliales et matrice extracellulaire et notamment d’évaluer si des signaux anormalement émis par les intégrines dans le contexte tumoral peuvent constituer des cibles thérapeutiques efficaces pour le traitement de certains cancers du sein.

Procédures

Un suivi des animaux développant spontanément des tumeurs mammaires (observation et palpation) sera réalisé pendant toute la durée de l’expérience (au maximum 4 semaines après la détection des tumeurs). Des expériences de transplantation (greffe) de cellules tumorales dans le tissu adipeux mammaire de souris receveuses seront réalisées. Cette intervention chirurgicale est peu invasive, le péritoine (membrane entourant la cavité abdominale), restant intact. Elle est de courte durée (15-20 min par animal) et s’effectue sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nos souris transgéniques sont viables et ne présentent aucun problème sévère de santé à l’âge adulte. Le modèle de tumorigenèse que nous étudions n’entraînent pas de souffrance notable. Les nuisances liées au développement tumoral sont faibles et les souris portant des tumeurs seront analysées en moyenne 2 semaines après leur détection, avec un maximum de 4 semaines pour les tumeurs à croissance lente. Les tumeurs restent localisées à la glande mammaire et ne sont pas métastatiques dans notre fenêtre expérimentale. L’apparition de tumeurs sur d’autres organes reste extrêmement rare dans ce modèle. De possibles mais rares ulcérations peuvent se produire dans les tumeurs mammaires chez certains animaux. Les animaux opérés pourront éventuellement développer des tumeurs mammaires qui, d’après la littérature, reproduiront le phénotype de la tumeur originale avec, notamment, une absence de développement métastatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

Notre projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées (souris transgéniques) pour définir les mécanismes qui régulent les cellules souches et leur contribution dans les cancers du sein. La glande mammaire est un tissu spécifique aux mammifères dont le fonctionnement normal est contrôlé par un ensemble complexe de régulateurs hormonaux et locaux. La souris reste à ce jour le modèle le plus pertinent pour étudier la biologie des cancers du sein. Les souris transgéniques sont reconnues comme des modèles incontournables pour explorer les mécanismes de tumorigénèse et développer des thérapies. Bien que nous utilisions des méthodes alternatives réduisant l’utilisation des animaux, en particulier des cultures pour modéliser le comportement des cellules tumorales in vitro, il est indispensable d’effectuer des expériences in vivo pour comprendre la formation et la progression des tumeurs dans leur environnement physiologique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements de glande mammaire, on utilise chaque glande mammaire d’une même souris donneuse, celle-ci étant pourvue de 5 paires de glandes. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.

Raffinement

Les animaux seront manipulés le moins possible. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. L’apparition de tumeurs sera surveillée à partir de l’âge de 4 mois (l’âge moyen d’apparition de tumeurs dans ces souris est de 7,5 mois). Des palpations seront effectuées trois fois par semaine. Un examen complet au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution) des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie. Les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour ce projet spécifique. Les expériences de transplantation se font sous anesthésie générale. Pour minimiser les risques d’infection, les instruments de chirurgie sont stérilisés et les surfaces et la loupe utilisées, soigneusement lavées et rincées à l’éthanol. Pendant l’opération un gel de protection oculaire est appliqué aux animaux pour éviter le desséchement. Des analgésiques, sont administrés 20 min avant l’anesthésie (buprenorphine, carprofen), puis relais 24h après l’opération (ibuprofène). Après l’intervention, nous utilisons du fil de suture stérile résorbable pour refermer la plaie. En post-opératoire, les souris encore anesthésiées sont réhydratées et placées sur une platine chauffante pour éviter l’hypothermie. Les souris greffées sont surveillées tous les jours afin de déceler tout signe de mal-être et pour détecter l’apparition de tumeurs (palpation trois fois par semaine). Si elles présentent des signes de mal-être (amaigrissement, prostration), elles sont mises à mort avant la fin programmée de l’expérience.

Choix des espèces

Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiques murins rendent ce modèle puissant. Enfin, c'est un animal facile à anesthésier, ce qui permet de réduire au maximum le stress qui pourrait être provoqué chez l'animal. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Pour l’analyse des tumeurs, les souris avec un phénotype potentiellement dommageable sont euthanasiées à l’âge adulte (à partir de 5-6 mois d’âge lors de l’apparition des tumeurs ou avant, pour analyse de la glande pre-néoplasique). Les tumeurs sont analysées avant qu’elles ne génèrent de signes de souffrance chez les souris. Les souris receveuses utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles pré-pubertaires âgées de 3 semaines. A ce stade, l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du tissue adipeux resté intact.

45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée par chirurgie sous anesthésie, puis ils reçoivent des injections intraveineuses de nanoparticules et des séances d'IRM et de scanner, pour optimiser la dose permettant de visualiser la tumeur et de renforcer l'effet de la radiothérapie. Le porteur qualifie de légère la douleur liée à l'incision du crâne et prévoit une mise à mort si un point limite est atteint, le cerveau étant prélevé pour analyse. Il affirme que la complexité des tumeurs cérébrales et la distribution des nanoparticules ne peuvent être appréhendées qu'in vivo.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.