Recherche fondamentale

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation corporelle totale, une injection de cellules leucémiques ou de moelle humaine, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des cures de traitement injectées dans l'abdomen sur animal vigile, puis sont tuées pour analyser leur moelle osseuse. Le porteur indique que les souris porteuses de leucémie peuvent présenter des signes de souffrance selon la progression de la maladie. Il affirme que le modèle murin reste "indispensable", le contrôle d'une moelle saine traitée étant selon lui impossible à obtenir autrement.

Objectifs

Le génome silencieux (qui ne permet pas la production de protéines) représente plus de 50% du génome. Il est composé de fragments d’ADN capables de se déplacer dans le génome. Chez l’homme comme dans d’autres espèces animales, il est démontré que ces séquences peuvent interférer avec le génome codant pour des protéines avec un retentissement fonctionnel. Dans le cancer, les insertions de ces séquences dans des gènes suppresseurs de tumeurs peuvent être responsables de la cancérogénèse mais elles peuvent également interagir avec des séquences codantes de l’ADN pour produire de nouveaux antigènes (néoantigènes) spécifiques de la tumeur. Lorsqu’une séquence d’ADN ne doit pas être exprimée, la cellule le signale en marquant cette séquence avec une étiquette appelée méthylation. Ce phénomène de marquage est très présent sur le génome silencieux dans des maladies comme les leucémies aigues myéloïdes (LAM) limitant sa capacité d’interaction avec le reste du génome. A l’heure actuelle une partie des traitements utilisés dans ces maladies est connu pour avoir la capacité de retirer ce marquage. Notre hypothèse principale soutenue par des travaux préliminaires est que ces traitements pourraient favoriser l’interaction du génome silencieux avec le reste de l’ADN induisant des erreurs qui seraient faciles à repérer par le système immunitaire afin d’éliminer la maladie. L’objectif de ce projet est d’étudier de manière systématique l’expression du génome silencieux dans les leucémies aigues myéloïdes (LAM) soumis à un traitement. Il permettra tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes d’actions de ces traitements mais les erreurs favorisées par le traitement peuvent également constituer une source de cibles pour des thérapies spécifiques et contribuer à améliorer le pronostique effroyable de ces hémopathies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Sur le plan scientifique, il permettra la description fine des mécanismes d’action des traitements qui retirent les marquages sur l’expression du génome silencieux dans les LAM et permettra une comparaison à des moelles saines traitées, impossibles à obtenir en dehors du cadre murin. Il permettra également d’établir un modèle de souris atteintes de LAM d’origine humaine afin de pouvoir tester d’éventuels traitements spécifiques des cibles identifiées dans le cadre d’un autre projet. Sur le plan médical, il peut permettre la découverte de cibles thérapeutiques permettant l’amélioration du pronostic de ces hémopathies.

Procédures

Les souris seront soumises à une irradiation corporelle totale (1 fois) suivie d’une injection de cellules tumorales ou de moelle saine. Des prélèvements sanguins hebdomadaires seront réalisés sur une partie des animaux. Des traitements seront administrés aux autres animaux. Ces traitements seront injectés directement dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Deux cures seront réalisées avec 2 jours de repos entre chaque cure. Tous ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles. Les gestes seront inférieurs à 2 minutes pour les injections/prélèvements. L’irradiation des animaux n’excédera pas 5 minutes au total

Impact sur les animaux

La réalisation des injections et prélèvements peut être source de douleur pour les animaux au moment de la piqûre. Les souris étant irradiées, le risque de toxicité en particulier digestive est présent avec une durée de quelques jours. Cependant, la dose d’irradiation étant faible, ce risque est très modéré. Les souris étant injectées avec des leucémies aigues myéloides, elles peuvent présenter des signes de souffrance dans le cas d’une progression de la leucémie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences pour analyse post mortem de la composition de leur moelle osseuse

Remplacement

L’analyse transcriptomique sera au préalable réalisée sur les mêmes lignées de LAM traitées in vitro. Cependant, le contrôle nécessaire qui est celui d’une moelle saine traitée par les mêmes agents est impossible à obtenir en dehors de la souris, ce traitement n’étant administré qu’à des patients malades. Par ailleurs, ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule tumorale. L’utilisation du modèle Souris reste donc indispensable pour le projet.

Réduction

Le nombre d’expériences et donc d’animaux utilisés seront réduits au minimum pour permettre la reproductibilité des phénomènes observés en assurant la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. L’analyse statistique entre les différentes conditions s’appuiera sur l’étude de l’expression différentielle des gènes en utilisant des modèles de régression linéaires. Les organes hématopoïétiques (moelle osseuse et rate) seront analysés chez toutes les souris après mise à mort.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les 2/3jours afin d’assurer leur bien-être et pour monitorer les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des points-limites ont été établis et une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre projet, la souris est le modèle de choix pour ces expériences qui étudient la cancérogénèse et la recherche en thérapeutique du cancer. C’est la seule espèce présentant une souche exprimant les facteurs de croissances hématopoïétiques humains permettant une bonne prise de cellules myéloïdes à partir de moelle osseuse humaine saine dans un environnement médullaire proche de celui de l’être humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 12 semaines après la naissance). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris sur la croissance tumorale.

Capturés à leur retour de mer, 5 saumons atlantiques sauvages sont opérés sous anesthésie pour qu'on leur implante dans la cavité péritonéale un capteur de fréquence cardiaque et un radioémetteur, puis remis dans la rivière. Ces poissons sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous doivent être mis à mort par surdose d'anesthésique après leur reproduction, pour récupérer le matériel et les données enregistrées. L'étude pilote vise d'abord à vérifier que l'équipe parvient à récupérer les émetteurs et leurs données, avant de mesurer la réponse cardiaque des saumons aux températures estivales. Le porteur justifie leur mise à mort en rappelant que 90 % des saumons de cette population meurent après la reproduction, épuisés, et écrit qu'elle est considérée comme "n'ayant qu'un effet marginal sur la population locale".

Objectifs

Les populations sauvages de saumon atlantique Salmo salar ont chuté de 70% depuis les années 1970. De nombreux facteurs sont incriminés parmi lesquels le réchauffement climatique. Le saumon atlantique est une espèce d’eau froide, et les températures observées dans les cours d’eau et en mer et celles prédites pour les décennies à venir sont suspectées être au-delà de l’optimum physiologique pour différentes étapes du cycle biologique. Les données disponibles sur la réponse physiologique aux températures élevées sont très éparses mais néanmoins nécessaires pour mieux prédire le devenir des populations et mieux les gérer. Les développements technologiques de ces dernières décennies, en matière de miniaturisation des capteurs notamment, permettent de réaliser des mesures physiologiques sur les animaux in situ. L’objectif de ce projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser, sur des saumons sauvages de retour en rivière après leur phase de croissance marine, des capteurs de fréquence cardiaque implantés dans la cavité péritonéale à proximité du cœur. Nous souhaitons notamment mesurer la relation qu’il existe entre la fréquence cardiaque – utilisé comme proxy de l’activité métabolique – et la température afin d’évaluer les limites physiologiques des saumons et l'effet des températures estivales élevées sur le comportement et la survie.

Bénéfices attendus

A court terme : Ce projet est en fait une étude de faisabilité qui vise notamment à évaluer notre capacité à récupérer les émetteurs et les données récoltées et le taux de perte ainsi que la qualité des données produites par le capteur afin de valider ou ajuster le paramétrage. Elle permettra en outre de produire des premières données sur la physologie des saumons lors de la phase de migration retour et d'évaluer la réponse physiologique aux températures estivales qui sont suspectées affecter la survie ou à la reproduction des saumons. A long terme : Il s'agit de mieux comprendre comment cette espèce emblématique des cours d’eau français répond aux contraintes thermiques et pourra faire face (ou non) aux conditions futures, dans le contexte du changement climatique. Il s'agit aussi de fournir des pistes pour améliorer la gestion des populations et des habitats, par exemple en préservant ou restaurant des habitats refuges.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule opération chirurgicale visant à l'introduction dans la cavité générale de matériel scientifiques (capteurs de fréquence cardiaque et radioémetteur). Cette opération durera moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Insertion par chirurgie du capteur et de l'émetteur (réalisée sous anesthésie ) : les nuisances potentielles (douleurs, saignements, infection) sont limitées par l'utilisation de mesures prophylactiques et des traitements adaptés et définis avec la collaboration d'un vétérinaire spécialisé. Cette intervention est considérée comme "modérée". Les individus choisis pèseront un poids qui leur permettra de supporter l'insertion du matériel scientifique. Ce dernier ne dépassera pas 2% du poids de l'animal comme recommandé dans la littérature.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, c'est à dire à l'issue de la reproduction des individus, tous les animaux sont mis à mort part surdose d'anesthésiant afin de récupérer le matériel scientifique et les données enregistrées. NB: 90% des saumons de la population étudiée meurent après la reproduction, épuisé par un effort et un investissement intense. Leur mise à mort est considérée comme n'ayant qu'un effet marginal sur la population locale.

Remplacement

L'objet de l'étude est de produire des connaissance sur les déplacements et la physiologie du saumon Atlantique dans le milieu naturel. Le modèle biologique ne peut être substitué par des alternatives non animales.

Réduction

Cette étude est une étude pilote. L'effectif d'animaux utilisés (5) a été déterminé en fonction de critères scientifiques (effectifs suffisant pour apporter des réponses aux questions posées dans le cadre d'une étude pilote) et le bien être animal (les interventions sur les individus se déroulent-elle comme prévu et quelles sont les effets notamment en terme de comportement et de survie après remise dans le milieu naturel). D'un point de vue scientfique, 5 est un nombre suffisant pour valider les réglages des paramètres d'enregistrement des biologgers.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après la chirurgie et la limitation des risques d'infection post-opératoire. La combinaison d'utilisation de produits anesthésiques de concentration adaptée (1- concentration pour l'anesthésie pré-opératoire et 2- pour le maintien de l'anesthésie pendant l'opération) et d'antalgiques limitent directement l'angoisse et la douleur pendant et après l'opération et l'administration d'antibiotiques limite les risques d'infections liés à l'opération. Les mesures prophylactiques classiques (désinfection du matériel) limitent également les sources d'infection pouvant induire des nuisances post-opératoires. Les opérations de chirurgie seront effectuées par du personnel habilité et spécifiquement formé par un vétérinaire. Le protocole opératoire est co-construit avec un vétérinaire. Les conditions environnementales d'importance première pour les poissons (température et oxygénation de l'eau) seront contrôlées avant, pendant et après la capture et l'opération. Les individus seront gardés en observation dans un vivier placé dans la rivière afin de contôler la façon dont ils récupèrent de l'anesthésie et seront relâchés lorsqu'ils auront retrouvé un comportement actif normal (équilibre dans la colonne d'eau, nage).

Choix des espèces

L'espèce ciblée, le saumon atlantique, est étudié dans son milieu naturel. Les populations de saumon sont actuellement menacées par divers facteurs dont certains sous contrôle anthropique (ex. changement climatique). L'objectif de l'étude est in fine d'améliorer la compréhension de la réponse des saumons à ces facteurs afin de produire des connaisances permettant d'améliorer leur gestion. Les individus seront des adultes de retour en rivière après la phase de croissance en mer. Les connaissances sur ce stade de vie sensible sont encore très éparses, mais on sait que les individus sont exposés à de multiples stress et que la mortalité ou les affections subléthales sont élevées.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour pendant dix jours un gavage ou une injection intrapéritonéale, subissent deux tests de tolérance au glucose, une coupure d'un à deux millimètres au bout de la queue et un prélèvement sanguin, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet vise à comprendre l'effet anti-hyperglycémiant de paraprobiotiques en vue d'un complément alimentaire pour l'homme. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", aucun modèle in vitro ne simulant selon lui les interactions entre organes qui règlent la glycémie.

Objectifs

Des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de bactéries non pathogènes naturellement présentes dans l’intestin, inactivées par la chaleur (appelé paraprobiotiques) et d’un métabolite dérivé de la sérine (présent chez les bactéries et les plantes) dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse mais également dans un modèle de souris saine. Un des objectifs de notre projet est de déterminer le mécanisme biologique impliqué dans cet effet anti-hyperglycémiant. Ce projet a pour objectif final le développement d’un complément alimentaire pour prévenir le prédiabète et ainsi le développement du diabète. Pour ce faire, plusieurs paraprobiotiques ainsi que des métabolites dérivés de la sérine seront administrées par gavage ou injection intrapéritonéale à un modèle de souris saines afin d’élucider le mécanisme d’action et les tissus cibles mis en jeu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de determiner le mécanisme mis en jeu par les bactéries sélectionnées ou le métabolite bactérien dérivé de la sérine pour obtenir cet effet anti-hyperglycémiant. La mise en evidence de ce mécanisme est incluse dans un projet de maturation qui vise, à terme, à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir de ces paraprobiotiques et/ou de ce métabolite. Ce complément alimentaire jouerait un rôle anti-hyperglycémiant au stade de pré-diabète et permettrait ainsi de prévenir le développement du diabète.

Procédures

Les animaux seront gavés ou recevront une injection en intra-péritonéale quotidiennement pour une durée totale de 10 jours (deux fois 5 jours). Les animaux seront soumis également à deux tests de tolérance au glucose (test de tolérance orale (gavage oro-gastrique du glucose, de quelques secondes) ou test de tolérance avec injection de glucose en intra-péritonéale (de quelques secondes). Pour ces tests de tolérance au glucose les souris subiront une petite coupure unique à l’extrémité de la queue de 1 à 2mm (1 seconde). Un prélèvement de sang sera effectué sur animaux vigiles, au niveau de la veine submandibulaire une seule fois avant de l’euthanasie (15 secondes). Les animaux seront mis à jeun des animaux avant les tests (6h) en période diurne.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur un temps très court (moins de 10 secondes) au cours de la contention nécessaire lors des gavages et à de l’injection en IP sur une période de 5 jours. Les gavages et l’IP seront réalisés par du personnel expérimenté. D’après les résultats préliminaires du laboratoire, ces gavages avec les différents composés n’induisent pas de perte de poids. Le poids des souris sera de plus contrôlé deux fois par semaine. Comme nous devrons mettre les souris à jeun avant les tests de tolérance orale au glucose, afin d’éviter une période de jeûne trop drastique, celui-ci ne sera pas réalisée durant la phase nocturne mais en phase diurne durant 6h.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de chaque procédure et certains de leurs organes et tissus seront prélevés pour des analyses, ncessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans la régulation de la gycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus du système digestif (l’intestin) et des organes internes impliqués dans la régulation des taux de glucose dans le sang (pancréas, foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80%) compte-tenu de la variabilité connue du paramètre « glycémie » mesuré. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris contrôles et de souris traitées avec la metformine pour les deux expériences de la procédure 1 et le même groupe de souris contrôles pour les deux expériences de la procédure 2 afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : au total 2 groupes de 12 souris contrôles et 2 groupes de12 souris traitées avec de la metformine sur les deux procédures = 48 souris au lieu de de 4 groupes de 12 souris contrôles et 4 groupes de souris 12 traitées avec de la metformine sur les deux procédures, soit 96 souris (nombre divisé par 2). Des études de biochimie sur des bactéries disponibles au laboratoire nous ont permis d’identifier des protéines de la surface des paroies bactériennes potentiellement intéressantes dans le contexte de la régulation de la glycémie (ces protéines ont des structures proches d’une autre protéine bactérienne connue pour ses effets améliorateurs de la glycémie). Ces protéines sont présentes sur huit souches d’intérêt (alors que nous disposons d’une collection de 40 souches donc cela nous a permis de réduire le nombre de paraprobiotiques à tester). Des points limites ont été définis pour chaque procédure.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d’un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine (surveillance visuelle plus suivi du poids). Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront 3 par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques en raison de ses réponses reproductibles due à une moins grande variabilité individuelle. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.

40 souris vont être utilisées, gardées vivantes pour être réutilisées ensuite dans d'autres expériences, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six jours un régime supplémenté en tamoxifène, qui peut leur faire perdre du poids, puis passent un test de mémoire consistant en une tâche motrice d'environ une heure deux jours de suite. Le porteur admet ne pas savoir si la perte de poids tient à l'appétence des aliments ou à des effets métaboliques. Il affirme qu'il n'est "pas possible" d'étudier la mémorisation pendant le sommeil autrement que sur des animaux vivants.

Objectifs

Le TNFα produit par les microglies contrôle l'activité des synapses inhibitrices dans le cortex et de ce fait, modifie certains paramètres du sommeil comme la structure des ondes lentes. Les ondes lentes sont necessaires à la consolidation de la mémoire par le sommeil. L'objectif de ce projet de montrer le TNFα microglial est necessaire à la consolidation de la mémoire par le sommeil

Bénéfices attendus

Quasiment toutes les pathologies du cerveau sont accompagnées de troubles du sommeil. D'autre part, toutes ces pathologies présentent des signes d'inflammation du cerveau, c'est-à-dire d'activation des cellules microgliales. Notre projet propose d'étudier le lien entre l'activation microgliale et les troubles du sommeil.

Procédures

Les souris seront exposées pendant 6 jours à un régime supplémenté en tamoxifen. Il est possible qu'elles perdent du poids pendant cette période. Nous n'avons pas identifié si cette perte de poids est due aux aliments qui seraient moins appétant ou à ses effets métaboliques. Les animaux feront ensuite un test de consolidation de la mémoire qui consiste en une tache motrice pendant environ 1h deux jours de suite

Impact sur les animaux

Il est possible que les animaux perdent du poids de manière transitoire lors du changement de régime. La manipulation des souris et le test d'apprentissage lui même sont susceptibles d'engendrer du stress et de l'inconfort aux souris.

Devenir

À l'issue des tests comportementaux, les animaux seront remis en cage de maintien sans autre manipulation. Aucune euthanasie ou prélèvements ne sera nécessaire dans le cadre de ce projet. Les animaux pourront être réutilisés par la suite dans d’autres expériences.

Remplacement

Il n'est pas possible d'étudier la mémorisation pendant le sommeil autrement que sur des animaux vivants.

Réduction

Nous utiliserons 40 souris soit deux groupes de 20 animaux. C'est selon l'article sur lequel nous fondons notre étude et les expériences précédentes d'apprentissage réalisées dans le laboratoire, le nombre minimal pour arriver à des résultats significatifs. Les resultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les souris sont stabulées en cages ventilées et leur milieu est enrichi par des copeaux de carton. Elles sont controlées tous les jours par du personnel compétent et seront sorties du protocole si elles atteignent un point limite. Pour réduire au maximum l'inconfort et le stress des souris, elles seront habituées à être manipulées tous les jours de la semaine précédent l'experience. Le jour de l'expérience, elles seront introduites dans la salle d'expérimentation 1h avant le début du test et celui-ci ne dure pas plus d'un heure, pour ne pas perturber trop leur sommeil. Enfin, l'appareil sur lequel se fera le test est concu pour que les souris qui ratent leur essai ne tombent que de quelques centimetres pour diminuer le stress lié à l'essai et les risques de blessures.

Choix des espèces

Travailler sur la souris permet de travailler dans la continuité de nos études précédentes. Puisque notre but est ici d'étudier le role du TNFα produit par la microglie, nous n'avons comme seul outil disponible les outils génétiques chez la souris. Les expériences se feront sur des jeunes adultes entre 2 et 5 mois qui est une période classique d'étude des comportements d'apprentissage liés au sommeil.

288 souris transgéniques développant une maladie du foie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant 28 jours, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que le gavage sur animal vigile peut provoquer un stress et, rarement, des lésions de l'œsophage. Il vise une "preuve de concept" de l'effet d'un probiotique sur la cholangite sclérosante primitive, dont la transposition à l'homme reste hypothétique, et affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie chronique du foie affectant les voies biliaires, souvent associée à une maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI). Plusieurs études ont démontré l’importance du microbiote intestinal dans le développement des MICI et de la CSP. Nous avons identifié une bactérie commensale du microbiote intestinal possédant des propriétés anti-inflammatoires, qui utilisée comme probiotique de nouvelle génération, a un effet bénéfique sur les MICI. Le but de cette étude est d’évaluer l’effet de cette bactérie sur la CSP, en utilisant un modèle murin transgénique qui développe spontanément une pathologie du foie qui mime la CSP. Nous traiterons ces souris en leur administrant le probiotique quotidiennement par voie oral. Nous analyserons leur microbiote intestinal avant et après administration du probiotique afin d’évaluer l’impact de ce traitement sur le microbiote. Nous comparerons le foie des souris traitées par le probiotique au foie des souris traitées par placebo pour évaluer l’effet de la bactérie sur les manifestations de la CSP. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP.

Bénéfices attendus

La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie grave exposant au risque de cirrhose et de cholangiocarcinome. Actuellement, le seul traitement efficace de la CSP est la transplantation hépatique. Or ce traitement est réservé aux patients avec une maladie avancée et n’est pas toujours possible en cas de cancer. Il est donc primordial d’étudier d’autres pistes thérapeutiques. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP et son éventuelle transposition à l'homme dans le cadre du traitement de la CSP.

Procédures

Les animaux seront produits au sein de l’établissement. A 4 semaines, ils seront soumis à un gavage quotidien sur animal vigile (15 secondes/animal) durant 28 jours. A l’issue de la période de traitement (4 semaines), les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal unique sous anesthésie profonde (5 minutes) puis seront immédiatement euthanasié sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris transgénique développe une cholangite sclérosante primitive avec le temps, nous utiliserons ici des animaux jeunes adultes dans lesquels les lésions du foie sont déjà présentes mais à un stade débutant n’entrainant aucun symptôme pour l’animal. Le gavage quotidien sur animal vigile peut être source de stress et d’inconfort pour l’animal. De façon extrêmement rare, il peut induire des lésions traumatiques de l’œsophage. L’administration de la bactérie ne devrait pas entrainer de nuisance en dehors du geste technique (gavage).

Devenir

L’ensemble des animaux (n=288) sera euthanasié à la fin de la période de traitement afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et analyser le potentiel effet bénéfique du traitement sur la CSP.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour reproduire les interactions foie-intestin mises en jeu dans le développement de la CSP, et l’effet bénéfique potentiel d’un probiotique. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec ces interactions inter-organes et tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec modèle animal (souris transgéniques) reconnu pour cette maladie biliaire afin d’évaluer les effets bénéfiques in vivo d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 288 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie si les actes le nécessitent). Dans ce projet, l’administration de la bactérie ne devrait pas entrainer de nuisance en dehors du geste technique (gavage sur animal vigile) mais plutôt un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression de la maladie du foie. De plus, le fait que ce geste soit pratiqué par une personne formée et expérimentée ainsi que l’utilisation de matériel adapté permettent de réduire significativement les nuisances liées au geste technique lui-même.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Le projet a pour objectif d'évaluer le potentiel bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération dans la CSP. Afin de répondre à cet objectif nous allons utiliser le modèle animal reconnu pour cette maladie biliaire qui est représenté par un modèle de souris invalidé pour un gène qui modifie la composition de la bile (modèle préclinique le mieux validé de CSP). Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP et son éventuelle transposition à animal/homme dans le cadre du traitement de la CSP. Justification des stades : Dans la grande majorité des études précliniques, les souris transgéniques modélisant la CSP sont traitées entre l’âge de 4 semaines, stade des lésions débutantes, et 8 semaines, stade auquel les lésions atteignent un plateau. Nous suivrons ce schéma validé dans de nombreuses études et débuterons ainsi le traitement chez des souris âgées de 4 semaines lorsque les lésions hépatiques sont débutantes, et ainsi accessibles à un traitement qui permettrait de freiner leur évolution. Justification du sexe : Chez la souris, comme chez l’Homme, la gravité des lésions hépatiques est variable en fonction du sexe. De plus, le même traitement peut avoir une efficacité variable en fonction du sexe. En effet, dans un projet précédent nous avions obtenu des résultats différents chez les souris mâles et les femelles. C’est pourquoi, il est nécessaire d’inclure dans ce projet 50% de souris mâles et 50% de souris femelles.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins sur animal vigile, une irradiation destinée à les rendre aplasiques, des greffes de cellules souches, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et une induction de lymphome par des globules rouges de mouton et du tamoxifène, les animaux étant tués dès une perte de poids de 20 % ou un gonflement abdominal. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans un cancer du sang humain et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le porteur affirme que la souris est un modèle "irremplaçable" et qu'"aucun autre système" ne peut s'y substituer.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est un groupe de cancers du sang qui se disséminent dans les organes lymphoïdes. Il est très agressif et la survie du patient atteint de DLBCL se compte en nombre de mois en absence de traitement. Malgré des traitements standards efficaces, environ 30 à 40 % des patients atteints de DLBCL meurent de leur maladie. Ce manque d'efficacité thérapeutique contre le DLBCL a été attribué entre autres par la présence de cellules immunitaires d’origine myéloïde. Ces cellules myéloïdes pourraient participer à la survie et au maintien des cellules tumorales chez des patients atteints de DLBCL, et pourraient aider les cellules tumorales à échapper à la reconnaissance immunitaire, donc pourraient contrecarrer les bénéfices des thérapies administrées aux patients. Jusqu’à présent, toutes les études visant à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans le DLBCL portaient sur des échantillons prélevés sur des patients atteints de DLBCL. Cependant, les accès aux biopsies sont limités : les biopsies ne sont pas fréquentes, et pour celles qui nous parviennent, elles ne contiennent que peu très peu de cellules myéloïdes et tumorales, et ne nous permettent pas de poursuivre des analyses expérimentales poussées. Ainsi, ce projet vise à développer des modèles de DLBCL chez la souris afin de déterminer comment, au cours de la progression tumorale, les cellules myéloïdes alimentent l’expansion des cellules tumorales. Les objectifs de ce projet sont : 1) Analyser les populations de cellules myéloïdes infiltrant les organes atteints par les cellules tumorales ; 2) Déterminer le rôle des populations myéloïdes dans le maintien de la survie des cellules tumorales ; 3) Identifier des cibles thérapeutiques exprimées par les cellules myéloïdes, et les valider expérimentalement. Ce projet en expérimentation animale est critique pour avancer sur notre compréhension du lymphome agressif DLBCL chez l’homme, contre lequel les traitements actuels ne sont pas efficaces à 100%.

Bénéfices attendus

Ce projet en expérimentation animale est essentiel pour plusieurs raisons : - il permet de mieux comprendre comment les cellules myéloïdes favorisent la persistance des cellules tumorales, et la résistance des patients atteints de DLBCL aux thérapies anti tumorales utilisées actuellement en clinique. - il participe à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques présentes sur ces cellules myéloïdes, qui pourraient être spécifiquement ciblées et/ou neutralisées en clinique pour améliorer les traitements actuellement appliqués, et qui restent sans effet chez des patients DLBCL. - il permet de valider l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements de DLBCL sur des modèles précliniques murins.

Procédures

En ce qui concerne les interventions, aucune intervention chirurgicale n’est prévue dans ce projet. Des prélèvements sanguins via la veine sous maxillaire sont effectués sur animaux vigiles (540 animaux). 560 animaux seront irradiés. Quant aux gestes techniques, le projet comprend des injections intraveineuses et sous-cutanées sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane et oxygène) (972 animaux), des injections par voie intrapéritonéale (772) sur animaux vigils selon la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Dans ce projet d’expérimentation animale, nous réalisons plusieurs gestes techniques nous amenant à : 1) administrer de cellules de lymphome d’origine murine; 2) irradier des animaux pour les rendre aplasiques et pouvoir reconstituer leur système immunitaire avec des cellules souches hématopoïétiques modifiés; 3) effectuer des administrations par voie intraveineuse de cellules immunitaires purifiées; 4) administrer un inhibiteur du développement des cellules myéloïdes par la voie intra-péritonéale, ou administrer des inhibiteurs de la vascularisation des tumeurs par la voie sous-cutanée; 5) induire des lymphomes B par administration de globules rouges de mouton et de tamoxifène. Toutes ces procédures nécessitent de la contention à l’origine d’un stress passager de l’animal (5 minutes). Les procédures impliquant l’administration d’un traitement par voie intrapéritonéale sur animaux vigils entrainent une douleur locale de 2 secondes causée par la piqure de la seringue. Toute autre administration (voie intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvements sanguins) se réalise sur animaux anesthésiés et ne provoque pas d’inconfort le temps de la manipulation. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins par voie rétro-orbitales entrainent un inconfort passager (5 minutes) de l’oeil qui est soignée par l’application d’un gel oculaire dès la fin de la procédure. L’irradiation n’entraine aucun effet indésirable dès lors que les animaux reçoivent une greffe de cellules souches hématopoïétiques suivie d’un traitement antibiotique continu de 4 semaines. L’immunisation par des globules rouges de mouton et le transfert adoptif n’entraine aucun effet indésirable sur le long terme. L’administration de tamoxifène peut entrainer une perte de poids de 10% le temps du traitement (ici, 9 jours). La croissance tumorale du lymphome peut entrainer une perte de poids dans 10% des cas ou un gonflement abdominal. La mise à mort des animaux concernés sera appliquée dès lors que la perte de poids atteindra 20% du poids total, ou qu’un gonflement abdominal est observé.

Devenir

Les animaux (mus musculus) sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements de plusieurs organes, et effectuer des analyses biologiques en laboratoire.

Remplacement

Il nous est à ce jour impossible de recréer grâce à des modèles informatiques ou des modèles de culture cellulaire tous les facteurs physiologiques et environnementaux permettant à une tumeur de se développer, d’être irriguée par le sang, drainée par la lymphe, de modifier son environnement, et d’interagir avec les cellules du système immunitaire. Ainsi aucun autre système ou modèle actuellement disponible ne peut se substituer au modèle murin, modèle animal irremplaçable pour notre projet.

Réduction

Des résultats fiables sont obtenus avec 5 animaux par groupe expérimental, et pour des expériences répétées deux fois. Tous les animaux ont un fond génétique uniforme pour limiter les variations entre les individus et assurer la reproductibilité des résultats. Nous appliquons des analyses statistiques spécifiques à chaque expérience pour déterminer si les différences que nous observons entre nos groupes d’animaux sont exactes et suffisamment fiables pour conclure sur les effets observés, établir de nouvelles hypothèses et avancer dans notre recherche de potentielles molécules candidates pouvant être ciblées dans les lymphomes de type DLBCL.

Raffinement

Les animaux sont gardés en groupes sociaux, avec nids et dômes protecteurs, et suivis quotidiennement. Les analgésiques administrés régulièrement en systémique modifiant les réponses immunitaires étudiées, leur utilisation n’est pas recommandée. La totalité des animaux utilisés dans ce projet et porteurs de cellules tumorales sont mis à mort avant l’apparition de signe de stress ou de souffrance. Cependant, un animal présentant des signes de trouble du comportement et/ou de douleur fera l’objet d’une surveillance accrue, disposera de nourriture humidifiée au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire, et sera mis à mort dès lors qu’il présente simultanément une perte de poids, des troubles du comportement, une déshydratation, et une baisse d’activité. Dans les expériences nécessitant des injections sous-cutanée, intraveineuse et des prélèvements sanguins, les souris sont anesthésiées par voie gazeuse (un mélange oxygène/isoflurane), ou chimiquement.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est proche de celle de l’homme : une étude de la souris nous permet de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle d’étude le plus simple et le mieux approprié pour 1) Analyser l’impact des mutations génétiques à l’origine des pathologies des lymphomes agressifs de type DLBCL chez les patients, et 2) Visualiser et analyser des cellules myéloïdes qui participent à l’émergence et à la persistance des cellules tumorales dans les tissus tels que la rate, la moelle osseuse et les ganglions grâce à des techniques d’imagerie de pointe (cytométrie, microscopie). Dans ce projet, les animaux utilisés ont atteint l'âge adulte (> 8 semaines d’âge).