Recherche fondamentale

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises au test de la piscine de Morris, une épreuve de nage forcée pour mesurer la mémoire spatiale, dans le cadre d'une recherche sur la maladie d'Alzheimer. Le porteur reconnaît une composante aversive au premier essai et un stress modéré lié à la nage, et indique que toutes les souris sont tuées dans les 48 à 72 heures suivant le test pour prélever leur hippocampe. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour étudier la mémoire et l'apprentissage et juge le modèle murin le plus "adéquat".

Objectifs

Depuis plus de 30 ans, les études sur la protéine amyloïde (APP) se sont focalisées sur la synaptotoxicité d’un fragment en particulier, le peptide amyloide beta (Aβ) dans la maladie d’Alzheimer. Mais APP qui est une protéine physiologiquement clivée, va produire de nombreux autres peptides comme les peptides Aη-α et Aη-β. Le rôle de ces peptides dans le cerveau est encore très peu connu. L’objectif de ce projet est de comprendre si la modulation de la quantité de peptides dans le cerveau peut entrainer une altération des capacités mnésiques. Plus particulièrement, ce projet va permettre d’analyser l’effet d’une accumulation d’un peptide sécrété de cette voie (Aη-α) à l’aide d’une lignée de souris transgénique ainsi que d’observer l’effet d’une délétion totale de cette voie à l’aide d’une seconde lignée de souris génétiquement modifiée par la méthode CRISPR/Cas9. Ce projet va permettre d’approfondir un projet déjà en cours, en analysant plus particulièrement les capacités de flexibilité de la mémoire spatiale mnésique sur ces animaux.

Bénéfices attendus

Cette voie de découpage de l’APP a été nouvellement découverte et à ce jour cette souris n’a pas encore été caractérisée. Ce modèle est tout à fait pertinent dans l’étude de la pathologie Alzheimer et des troubles mnésiques associés. Ce projet permettra de comprendre le rôle physiopathologique des peptides au sein du cerveau et plus particulièrement dans la mise en place d’une mémoire spatiale.

Procédures

Les animaux effecturont une tache comportementale en piscine de Morris. Si cette tache peut contenir une composante aversive lors de ses premiers essais chez la souris, la température de l'eau à 21°C+/-1°C, de l'air à >25C et l'attente des animaux entre les essais sous une lampe chauffante permet de réduire très fortement le stress associé avec la nage chez la souris (et éviter l'hypothermie). Une fois la procédure terminée, l’ensemble des animaux sera euthanasié (n=192) dans les 48-72h suivantes la fin de la procédure comportementale. Une fois la confirmation de la mort validée par absence de battements cardiaques et de mouvements respiratoires une dissection du cerveau sera effectuée afin de récupérer des structures telles l'hippocampe pour des études de quantification protéique.

Impact sur les animaux

Un stress modéré est généré par la mise dans la piscine lors de leur premier essai car l’animal ne sait pas ce qu’il doit faire puis ensuite il sait qu’il doit rejoindre la plateforme donc le stress s’atténue. Les animaux développent une pathologie amyloide avec l'âge, indépendante des procédures effectuées.

Devenir

Nous devons prélever les hippocampes pour effectuer desdosages protéiques sur ces tissus, c’est pourquoi nous avons besoin que l'ensemble des animaux (n=192) soit euthanasiés par par une méthode réglementaire une fois la procédure terminée.

Remplacement

Notre modèle de souris est le modèle le plus adéquat pour cette étude car les structures impliquées chez l’Homme dans la mémoire sont conservées chez la souris et présentent le même phénotype comportemental associé à un apprentissage. L'absence de méthodes alternatives quant à l'étude de la mémoire et de l'apprentissage au cours du vieillissement pathologique nous oblige à utiliser les modèles murins mentionnés.

Réduction

Le nombre total d’animaux impliqués est 192. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à un calcul de puissance. Des tests statistiques seront utilisés pour pemettre une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe de 3 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid vegetal. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure. Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une mise à mort pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress des souris. La présence de points limites généraux mais également spécifiques à la procédure sont définis pour permettre un meilleure raffinement.

Choix des espèces

Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. La souris possède un éventail génétique vaste, une reproductibilité fiable et rapide, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. La souris constitue un excellent modèle pour l’étude des processus mnésique d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires mnésique ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau de l’hippocampe sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension de la mise en place de la mémoire, et ainsi pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie). Pour toutes ces raisons, ce choix d’espèce constitue un bon modèle pour notre étude. Deux nouveaux modèles murins transgéniques pour la maladie d'Alzheimer seront utilisés. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte, mais selon le modèle murin et l'apparition des dépots amyloides chez ceux-ci, les animaux seront utilisés à des âges plus ou moins avancés.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour produire deux protéines humaines, elles reçoivent dans le cerveau, à cinq mois, des extraits cérébraux prélevés sur des personnes atteintes de maladies neurodégénératives, afin d'accélérer l'apparition de la maladie. Le porteur indique que les souris développent une démarche saccadée et des troubles de l'équilibre, et qu'elles sont tuées dès ces signes pour éviter la paralysie du train postérieur qui les empêcherait de se nourrir. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de remplacer l'expérimentation animale pour cette étude.

Objectifs

L’objectif du projet est d’induire une maladie accélérée chez des souris (APPxM83) produisant les deux protéines humaines alpha-synucléine et béta amyloïde après inoculation d’extraits cérébraux humains provenant de patients atteints des 3 formes de maladies humaines associées à l’alpha-synculéine (démence à corps de Lewy, maladie de Parkinson et atrophie multisystématisée).

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des nouvelles connaissances sur la diversité des différentes maladies neuro-dégénératives humaines associées à la protéine alpha-synucléine.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation dans le cerveau à l’âge de 5 mois réalisée sous anesthésie générale et locale. L’ensemble des souris disponibles à cet âge parmi les 176 animaux produits pour l’étude font l’objet de cette procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux font l’objet à l’âge de 5 mois d’une inoculation intra-cérébrale par voie stéréotaxique, sous anesthésie générale et locale. Les injections stéréotaxiques sont réalisées régulièrement au laboratoire et n’induisent pas d’effets indésirables chez les souris. Cette inoculation est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal, qui peut présenter une posture voûtée. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur qui empêcherait l’animal de se nourrir et boire à volonté.

Devenir

Les animaux sont mis à mort dès l’apparition des signes de démarche saccadée ou troubles de l’équilibre, annonciateurs d’une paralysie, et au plus tard à l’âge de 22 mois.

Remplacement

Le projet ne peut être actuellement réalisé que chez la souris, visant à évaluer le délai d’apparition des signes locomoteurs, les lésions du cerveau et les caractéristiques biochimiques de la protéine alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux sont constitués chacun de 16 souris adultes, mâles et femelles, pour chaque inoculum. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux analyses fondées sur l’examen de la durée d'incubation de la maladie, de la distribution des lésions cérébrales et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine agrégée. L’analyse statistique de la distribution des lésions cérébrales nécessite en particulier un minimum de 5 à 6 souris au stade clinique de la maladie. La constitution de lots de 16 souris doit ainsi nous permettre de pouvoir disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour l’analyse des lésions cérébrales. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs de la maladie dans les tissus périphériques.

Raffinement

Pour les inoculations dans le cerveau l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé chez un animal sous anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant de limiter la douleur après l’intervention. Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi pendant toute l’expérimentation. Les souris sont observées tous les jours et suivies individuellement lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre, stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la maladie de ces souris permet d’éviter que ces signes évoluent vers une paralysie, avec des difficultés d’alimentation et un mal-être de la souris. Une fiche individuelle est renseignée pour chaque souris, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau de la souris à l’âge de 5 mois. Le choix de cet âge à l’inoculation permet de réaliser l’inoculation par stéréotaxie chez un animal adulte et son observation pendant une durée suffisante avant le possible développement de signes cliniques spontanés lors du viellissement (au-delà de l’âge de 22 mois chez les animaux hémizygotes M83). Ces souris sont entretenues et surveillées jusqu’à l’apparition des premiers troubles d’équilibre ou de démarche, à partir de laquelle les animaux sont mis à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil. Les animaux éventuellement survivants à l’âge de 22 mois, à partir duquel ils deviennent susceptibles de développer spontanément un phénotype dommageable de souris M83 hémizygotes, sont sacrifiés.

2 500 rongeurs, 2 000 souris et 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une plateforme d'irradiation ouverte à d'autres équipes. Chaque animal reçoit une ou plusieurs séances d'irradiation sous anesthésie, puis retourne dans son animalerie d'origine, son sort final dépendant du projet qui l'utilise. Le porteur indique que l'irradiation d'une tumeur peut entraîner des nécroses et que l'irradiation du corps entier peut provoquer des douleurs à long terme. Il affirme que le recours à l'animal reste "essentiel" malgré des cultures cellulaires en 2D ou 3D, et justifie le nombre d'animaux par le seul "minimum nécessaire pour assurer une étude statistique".

Objectifs

La radiothérapie est un traitement localisé qui consiste à utiliser des radiations pour détruire les cellules cancéreuses. Les dommages induits par les rayonnements vont bloquer la prolifération cellulaire, tout en préservant le plus possible les zones périphériques saines. A l’heure actuelle, elle est utilisée seule ou en combinaison avec la chirurgie et/ou la chimiothérapie et concerne aujourd’hui 60% des traitements contre le cancer. Ainsi, la radiothérapie représente une technique nécessaire aux équipes de recherche travaillant dans le domaine de la cancérologie pour la compréhension des mécanismes biologiques en jeux et l’amélioration des traitements. Ce projet a pour objectif de permettre l’accès à un équipement de radiothérapie dédié au rongeurs à la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la recherche thérapeutique utilisant l’irradiation pour mieux comprendre les mécanismes en jeux et/ou pour le développement de nouveaux traitements. Ce projet s’inscrit de ce fait dans une volonté de faire progresser les connaissances sur le développement tumoral ainsi que d’améliorer le traitement des patients en augmentant ainsi aussi bien la qualité de vie que leur survie.

Procédures

L’ensemble des animaux sera soumis à une ou plusieurs séances d’irradiation sous anesthésie générale. La durée de l’irradiation avec mise en place, irradiation et retour dans la cage prendra au maximum 30 minutes. L’anesthésie générale durera au maximum 20 minutes et l’irradiation au maximum 15 minutes. Chaque session aura une durée courte et pourra être réitérée au maximum deux fois par jour sur une durée de 1 jour à plusieurs semaines.

Impact sur les animaux

L’irradiation n’induit pas d’effets indésirables directs. Néanmoins, l’irradiation de tumeurs peut induire des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement et l’irradiation totale d’un animal peut aussi induire des douleurs à long terme.

Devenir

Après irradiation chaque animal retournera dans son animalerie d'appartenance. L'issue finale des animaux dépendra de chaque projet et sera détaillée dans chacune des procédures expérimentales présentées dans les demandes de projet.

Remplacement

Nous tacherons dans la mesure du possible d’utiliser des cultures cellulaires en 2D ou 3D (sphéroïdes et organoïdes). Néanmoins, il est nécessaire de valider les résultats obtenus in vivo afin de prendre en compte toute la complexité du vivant et avant de pouvoir faire l’objet d’essai clinique sur l’homme. Ainsi, le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de nouveaux traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est établi afin de correspondre au minimum nécessaire pour assurer une étude statistique.

Raffinement

L’irradiation n’induit pas de souffrance ni de douleur à l’animal pendant et directement après. Les séances d’irradiation seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal avec maintien de leur température corporelle. La durée de l’irradiation prendra de 5 à 30 minutes maximum. De l’onguent ophtalmique sera déposé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. En cas d’irradiation ciblée, l’animal sera protégé par un bouclier adapté en fonction de la zone à irradier. La structure en charge du bien-être animal accompagnera chaque projet séparément dans sa mise en œuvre avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux. Si un animal (rat ou souris) venait à montrer des signes de problèmes respiratoires, il pourrait être euthanasié sur site. Cette procédure ne sera réalisée qu’après accord du porteur du projet.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Le rat est une alternative à l’utilisation de la souris de par sa taille permettant d’atteindre une maturité de tumeur plus importante nécessaire dans certaines études. Nous utiliserons des rongeurs à différents stades de développement pour couvrir le plus largement les situations rencontrées dans les services cliniques.

75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections dans le cerveau d'un virus puis de cellules de gliome, avant des enregistrements optiques sous anesthésie sans réveil, pour tester la faisabilité d'une méthode d'imagerie calcique. Le porteur présente cette étude pilote comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux en remplaçant l'électrophysiologie, et indique que les souris sont tuées par perfusion intracardiaque ou décapitation sous anesthésie pour prélever le cerveau. Il précise avoir privilégié, quand c'était possible, des approches ex vivo sur tranches de cerveau.

Objectifs

L'objectif du projet est la mise en place d'une approche expérimentale, l'imagerie calcique par photométrie in vivo pour évaluer les dommages fonctionnels occasionnés au sein de la substance blanche par la présence de cellules de gliome. Ce projet a donc pour objet de valider la faisabilité d’une nouvelle approche expérimentale dans cette thématique. A terme, cette technique devrait donc améliorer nos connaissances sur les interactions neurones-cellules de gliome dans la substance blanche. La photométrie à fibre optique (fiber photometry) désigne une méthode d’imagerie in vivo basée sur l’utilisation de fibres optiques de diamètres modérées (de quelques dizaines à quelques centaines de µm de diamètre), généralement implantées stéréotaxiquement dans des régions cérébrales d’intérêt. c'est une technique qui s'enligne dans la règle des 3R, puisqu'à terme, cette approche permettra de faire de l'imagerie in vivo, sur plusieurs semaines. Cette imagerie permet donc de faire de l’imagerie en profondeur et s’avère être une technique de choix pour beaucoup de chercheurs dans le domaine des neurosciences, en raison de sa simplicité relative comparée à d’autres techniques d’enregistrement in vivo (notamment l’électrophysiologie), de son rapport signal/bruit élevé et de son prix modéré. Les questions de ce projet sont les suivantes : peut-on utiliser cette approche pour monitorer l'activité des axones, dans les faisceaux de substance blanche ? Si c'est le cas, sera-t-il possible de détecter des changements d’activité neuronale dans les zones infiltrées ? L'objectif de ce projet est d'évaluer dans une étude pilote, la faisabilité de cette approche, par une étude in vivo sur souris anesthésiées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de deux ordres. 1 - d'un point de vue scientifique : Ce projet est un projet pilote pour évaluer la faisabilité d'une technique. Une fois validé, il sera possible d'utiliser cette technique pour de monitorer l’activité d'axones dans la substance blanche dans un contexte physiopathologique et de mettre en évidence d'éventuels changements d’activité au sein de la substance blanche dans les zones d’infiltration, sur plusieurs semaines. 2 - d'un point de vue éthique : cette nouvelle approche constituerait une technique alternative à d’autres techniques d’enregistrement in vivo telles que l’électrophysiologie in vivo (plus chères, plus longues à mettre en oeuvre et à maitriser pour les étudiants, nécessitant de fait plus d'animaux) et s'intègre donc ici dans la règle des 3R, puisque nous permettrait à terme de réduire le nombre d’animaux, dans certains aspects du projet.

Procédures

75 souris subiront des procédures chirurgicales sous anesthésie et analgésie (procédure 1, durée : 23-30 min), pour l'injection stéréotaxique d'AAV ou de cellules tumorales. Parmi ces souris, 5 subiront une perfusion intracardiaque de PBS puis PFA 4% pour le prélèvement de cerveau à des fins histologiques (procédure 2, durée 20 min). Parmi ces souris, 10 subiront une euthanasie par décapitation sous anesthésie, à des fins de prélèvements de tissus pour des expériences ex vivo (pas de procédure, durée : 1 min). Parmi ces souris, 60 souris seront soumis à des expériences sous anesthésie/analgésie pour des enregistrements aigus de photométrie in vivo (procédure 3, sans réveil, durée : entre 2 et 6 h)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certaines souris seront soumises à deux procédures chirurgicales stéréotaxiques sous anesthésie et sous analgésie (Procédure décrite dans la procédure numérotée 1, avec l'injection stéréotaxique d’AAV suivie quelques semaines plus tard d’une injection de cellules tumorales), ainsi qu’à deux procédures sous anesthésie et analgésie, sans réveil (Procédure décrite dans la procédure numérotée 2 , pour la mise à mort en vue de prélèvements de tissus fixés au formaldhéhyde, et dans la procédure numérotée 3, pour l'enregistrement par imagerie calcique in vivo). Ainsi, une attention particulière devra être apportée à l'utilisation adéquate des analgésiques et anesthésiques, et à la surveillance post-opératoire en aval des deux chirurgies (voir dans la procédure 1, la section "méthodes pour supprimer la douleur, la souffrance et l'angoisse" , dans le paragraphe "SUIVI DES ANIMAUX").

Devenir

Les animaux étant soumis à la procédure 1 (" Injections stéréotaxiques cérébrales répétées sur souris adultes, sous anesthésie et sous analgésie") seront maintenu en vie, puis apres quelques semaines seront soumis à des procédures sans réveil : soit la procédure 2 ("mise à mort de souris adultes en vue de prélèvement de tissu fixés au formaldéhyde), soit la procédure 3 ("enregistrement calcique sous anesthésie et analgésie), soit seront décapités sous anesthésie (isoflurane 5%) afin de prélever les tissus cérébraux et effectuer des expériences ex vivo.

Remplacement

Quand cela a été possible et justifié, l'utilisation d'approches ex vivo a été privilégiée dans ce projet. Elle permettra de limiter le nombre d'expériences in vivo à son maximum. Il s'agit d'approches sur tranches de cerveau de souris (perfusées avec du liquide de survie, de l'oxygène. Il s'agit de tranches aigues ou organotypiques) pour évaluer ex vivo l'activité calcique dans les soma et axones des neurones, au sein des tissus.

Réduction

La réduction est un objectif final phare de ce projet de recherche. En effet, il s’agit d’une étude pilote (réalisés sur un nombre réduit d’animaux, sur deux ans), pour évaluer la faisabilité d’une approche expérimentale pour le bénéfice d’un plus large projet de recherche sur le glioblastome. Si la photométrie in vivo permettait effectivement d’évaluer l’activité des axones par imagerie calcique, alors elle pourra être utilisée au sein du laboratoire, pour des enregistrements sur plusieurs semaines, chez un même animal - permettant ainsi de cumuler de nombreux résultats avec un seul animal – et servira d’alternatives dans certaines expériences, à d’autres approches in vivo comme l’électrophysiologie. Au sein même du projet, le nombre de souris a été réduite au minimum, et a été conçu pour permettre une recherche « pas à pas ». Si la première partie du projet n’est pas validée (validation sur des souris naÏves) alors la deuxième partie n’aurait pas lieu. De plus, ce projet est un projet pilote, utilisé pour évaluer, par évaluation de la puissance statistique a posteriori, le nombre minimum de souris nécessaire pour évaluer l’excitabilité et les changements d’excitabilité axonales chez la souris, par photométrie in vivo.

Raffinement

HEBERGEMENT AVEC ENRICHISSEMENT : les animaux sont hébergés en groupe dans les conditions réglementaires, nourris et abreuvés ad libitum selon un rythme nycthéméral de 12h/12h, à 22°C, avec un enrichissement dans chaque cage, pour leur permettre de faire des nids. SURVEILLANCE QUOTIDIENNE POUR EVALUER DES POINTS D ARRETS ANTICIPES : Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement afin de déceler des signes précoces de stress ou de douleur. Après toute chirurgie, les animaux seront en plus pesés pour détecter des pertes de poids anormales (révélateurs de douleur et/ou stress éventuels). Les expériences et le suivi des animaux seront réalisés par du personnel expérimenté. UTILISATION D UN ANIMAL POUR PLUSIEURS PROCEDURES : Lors que cela est possible et justifié, un même animal sera utilisé à plusieurs fins. TRAVAIL DE PAIR AVEC LE RESPONSABLE DE L ANIMALERIE : pour optimiser Les doses d’anesthésie et d’analgésie nécessaires.

Choix des espèces

La progression des cellules tumorales dans l'organisme dépend d'une part des propriétés intrinsèques des cellules tumorales mais aussi de l'environnement spécifique dans lequel la tumeur évolue. Il est donc essentiel de pouvoir étudier les cellules tumorales dans leur environnement immédiat, par le biais de greffes orthotopiques. Des souris Nude et/ou C57BL6 seront utilisées respectivement pour la greffe de lignées tumorale humaine (GMB-Hum) et la greffe de lignée tumorale murine (GMB-Murin). L'utilisation de souris Nude permet l'étude de lignées de souris humaines, ce qui constitue un modèle proche de la pathologie observée chez l'homme. D'autre part, parce que l'activation du système immunitaire est inhérante à la progression des cellues tumorales cérébrales, nous procéderons à des expériences sur des souris C57BL6, greffées de lignées de cellules murines de glioblastome. Les expériences sont faites sur des jeunes souris adultes (injection d'AAV et de cellules tumorales à 4-10 semaines). les Expériences de photométrie seront effectués 2 à 4 semaines plus tard. Chez l'homme, le glioblastome est un cancer cérébral malin particulièrement fréquent chez l'adulte.

3 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras ou par mutation génétique, elles reçoivent une injection derrière l'œil et des injections abdominales répétées pendant deux à douze semaines, pour étudier une modification de protéines liée au métabolisme du foie. Le porteur décrit des effets limités, une douleur au point d'injection disparaissant dans la journée, et indique que les souris sont tuées à la fin pour prélever leurs organes. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut modéliser la régulation circadienne du métabolisme et juge le recours au modèle animal "primordial".

Objectifs

Les rythmes biologiques endogènes, générés par l’horloge circadienne moléculaire (HC), permettent l’homéostasie métabolique. Chez les mammifères, une HC centrale synchronisée par la lumière régule les fonctions physiologiques comme le cycle de veille/sommeil ou les phases de jeûne et d’alimentation. Bien que synchronisés par l’HC centrale, les organes périphériques possèdent leur propre HC. Au niveau du foie, le rythme alimentaire a un fort pouvoir synchronisateur sur l’HC hépatique et sur la rythmicité du métabolisme. Nous avons montré l’importance des modifications post-traductionnelles (PTMs) des protéines dans la régulation des rythmes métaboliques. Le répertoire des PTMs est vaste et leur exploration circadienne constitue un défi majeur pour comprendre le lien entre l’HC et les troubles métaboliques. La malonylation des lysines (Kmal) est un PTM lié au métabolisme. Nous avons récemment observé au niveau hépatique que la Kmal est rhythmique, sous le contrôle de l’HC et dérégulée dans les maladies métaboliques tels que l’obésité et le diabète de type II. Nous avons aussi observé que l’expression de l’enzyme mitochondriale ACSF3 (ACSF3 acyl-CoA synthetase family member ; impliquée dans la régulation de la Kmal) est aussi rhythmique et dérégulée dans les maladies métaboliques. Les perturbations des rythmes quotidiens de Kmal accompagnent les perturbations du métabolisme et notre hypothèse de travail est que la Kmal sous le contrôle de l’enzyme mitochondriale ACSF3 est impliquée dans l’apparition et la progression des troubles métaboliques. Ainsi, les objectifs du projet sont d’étudier dans un contexte d’obésité, (1) la régulation temporelle de la Kmal et (2) le rôle d’ACSF3 dans cette régulation. Ce projet étudiera aussi l’implication du (3) rythme alimentaire et de (4) l’HC hépatique dans le pouvoir régulateur de la Kmal sur le métabolisme quotidien.

Bénéfices attendus

Nos travaux précédents ont étendu l’état des connaissances sur l'orchestration quotidienne du protéome hépatique. Ils ont aussi mis en évidence le rôle des modifications post-traductionnelles (PTMs) comme la phosphorylation et l'acétylation dans la régulation du protéome et du métabolisme rhythmique. Un défi majeur en chronobiologie reste de comprendre comment l'HC synchronise le métabolisme et coordonne la physiologie quotidienne au niveau post-traductionnel. Dans ce contexte, nous possédons une expertise unique pour étudier le rôle des PTMs chez les mammifères dans un contexte physio-pathologique. Le syndrome métabolique a une incidence épidémiologique et économique importante en France et plus largement dans le monde mais le rôle des rythmes biologiques (e.g. rythme alimentaire et HC) reste sous-estimé : En effet, les études nutritionnelles se concentrent souvent principalement sur la composition et la quantité des aliments. Cependant, la régulation quotidienne du métabolisme par l'HC et le moment de la prise alimentaire sont des facteurs importants de la santé métabolique chez les mammifères. Par conséquent, non seulement la qualité et la quantité, mais aussi le moment de la prise alimentaire sont importants pour une nutrition saine et pour prévenir les maladies métaboliques. La compréhension des mécanismes moléculaires impliqués est justifiée par (1) la forte incidence des troubles métaboliques, 30% des adultes étaient en surpoids et 17% étaient obèses en 2020 en France (Enquête Odoxa) (2) les perturbations toujours plus importantes dans les activités sociales et professionnelles modernes (le travail de nuit a presque doublé en 20 ans en France et ne cesse pas d'augmenter). En étudiant l’implication de la malonylation au niveau du lien entre l’HC, le rythme alimentaire et le métabolisme quotidien, ce projet va approfondir l’état des connaissances du fonctionnement et du dysfonctionnement moléculaire hépatique dans le cadre des désordres métaboliques liés à l’obésité et au diabète de type II. Compte tenu de l'éventail des maladies et de la population concernée par nos travaux, en clarifiant les rôles respectifs de l'HC et des signaux régulés par le rythme alimentaire dans la régulation du métabolisme quotidien, les résultats issus de ce projet de recherche pourront être appliquer au traitement des maladies métaboliques et auront sur le moyen/long terme un effet bénéfique sur la santé de la population en général.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une injection rétro-orbitale unique. Sur certaines procédures, certains animaux recevront une injection unique en intrapéritonéale. Sur certaines procédures, certains animaux seront injectés en intrapéritonéale quotidiennement pendant 2 à 12 semaines.

Impact sur les animaux

Les adéno-virus, le PBS et le malonate utilisées au cours de ce projet peuvent générer une douleur au site d’injection qui disparait rapidement dans la journée. Les injections d’adéno-virus en retro-orbitale, font apparaitre occasionnellement une pâleur ou une cyanose temporaire si l’injection est réalisée sur des souriceaux. Ces effets secondaires rares, ne se produisent jamais chez les souris d’age adulte utilisées lors de ce projet.

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort et les organes collectées pour réaliser les études de protéomiques ou de microscopie.

Remplacement

Ce projet préclinique d’étude de la physiopathologie métabolique commun aux mammifères nécessite l’utilisation de modèle murins d’obésité induite par le régime gras et d’obésité génétique (ob/ob) ainsi que l’utilisation de modèles murins d’invalidation et de surexpression de gènes d’intérêts pour évaluer le rôle spécifique du foie dans les effets métaboliques généraux. La régulation circadienne du métabolisme chez les mammifères implique simultanément de nombreux niveaux de régulation faisant intervenir des processus biologiques intégrés au niveau de l’organisme. L’expérimentation animale reste nécessaire afin d’étudier les réactions de l’organisme soumis à l'ensemble des contrôles nerveux, hormonaux et humoraux mis en place par l'horloge circadienne. Il est donc impossible de substituer ou de modéliser par des approches in-vitro ou in-silico de l’ensemble de ces processus biologiques et le recours au modèle animal est donc primordial. De plus, les souris C57Bl6 soumises à un régime gras et ob/ob sont des modèles déjà validés pour l'étude du métabolisme et validés pour les études portant sur les rythmes circadiens.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utiliser au total, nous commencerons ce projet par une phase pilote avec un nombre limité d’animaux. Par la suite, afin de réduire et d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante, nous avons (1) analysé des données récemment publiées et (2) utilisé les directives récemment publiées par les leaders mondiaux en chronobiologie. Ceci nous a permis de fixer le nombre de réplicas biologiques à 4 lors des études de rythmicité quotidienne, et à 10 animaux par groupes d’études lors de la réalisation des tests métaboliques.

Raffinement

Dans un but de raffinement, ce projet débutera par une phase pilote avec un nombre limité d’animaux. Les phases suivantes ne seront conduites que si la première phase valide les niveaux d’inhibition de nos gènes cibles. L’utilisation de système de mesure de calorimétrie indirecte et de suivi en temps réel de prise alimentaire limite le nombre d’interventions et la gêne/stress occasionné(e) sur les animaux (e.g. limitation du nombre d’interventions répétées pour peser le bol alimentaire dans le cadre du suivi du rythme de prise alimentaire). Le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations et soins appropriés pour garantir une efficacité expérimentale et une souffrance minimale. Le cycle jour/nuit sera contrôlé par des armoires circadiennes dédiées. Le nombre de souris par cage respectera la règlementation en vigueur avec un environnement enrichi (frisottis de papier). Les animaux seront observés quotidiennement pour déceler toute apparition de signes de détresse ou souffrance (points limites généraux). La fréquence d’observation sera ajustée si besoin.

Choix des espèces

Les souris C57Bl6 et ob/ob C57Bl6 constituent un modèle de choix pour les études métaboliques et de l’horloge circadienne. De plus, le modèle C57Bl6 est particulièrement adapté pour l’étude des pathologies métaboliques induites par régime gras et irrégulier dans le temps. Lors de ce projet les souris C57Bl6 seront âgées entre 10 et 30 semaines ce qui correspond à un age adulte chez l’être humain. A cet age, les effets secondaires indésirables liés aux injections rétro-orbitales sont inexistants (cf. 3.3.2.4).

600 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une ou deux biopsies de peau sont pratiquées dans leur dos pour créer une plaie, dont la cicatrisation, ralentie par le diabète, sert à évaluer des molécules ou des pansements. Le porteur indique que la plaie peut provoquer douleur, nécrose, contamination bactérienne et suppuration, la douleur étant prise en charge par la buprénorphine, et que les souris sont tuées faute de pouvoir être réutilisées. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace complètement la peau vivante et juge "indispensable" de tester ces molécules chez l'animal diabétique.

Objectifs

Le diabète est une maladie importante chez l’Homme. Cette pathologie est amenée à se développer de plus en plus avec le vieillissement de la population et l’augmentation de l’espérance de vie humaine. Cette pathologie étant correctement traitée actuellement et l’espérance de vie des patients augmentant, les complications du diabète sont nombreuses. Ces complications peuvent toucher la rétine (rétinopathies), les reins (néphropathies) et les nerfs (neuropathies). Dans ce dernier cas, les nerfs de la sensibilité de la peau étant touchés, il peut apparaître des complications de cicatrisation de la peau suite à des blessures bénignes ou non ressenties par les patients. La cicatrisation du tissu cutané est d’autant plus longue que le niveau de diabète du patient est important. Des complications encore plus invalidantes peuvent apparaitre ensuite (ulcères, nécroses pouvant nécessiter des amputations). Il est donc important d’avoir un modèle prédictif des complications de cicatrisation cutanée développé chez l’animal diabétique. Afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : a) Il n’existe pas de modèle in vitro de cicatrisation cutanée en conditions de diabète pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro de migration cellulaire et sur explants de peau qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal diabétique. b) Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux (types pansements, hydrogels, etc...) appliqués directement sur la peau en application externe (topique). c) L’efficacité ne pouvant être testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme).

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché une molécule permettant aux patients diabétiques de cicatriser plus rapidement, et donc éventuellement d'éviter des complications liées à cette présence de plaie.

Procédures

Une biopsie complète de peau ou 2 biopsies seront effectuées au niveau du dos des souris diabètiques (durée de la chirurgie environ 15minutes préparation de l'animal incluse). La cicatrisation de cette lésion sera plus ou moins longue en fonction de l'efficacité des molécules testées mais ces plaies cicatrisent naturellement au bout de 20 jours environ. La plaie est protégée via un pansement hydrofuge afin d'éviter les contaminations par des agents extérieurs.

Impact sur les animaux

L'induction de la plaie pourra provoquer de la douleur chez l'animal mais cette dernière sera pris en charge via une injection de buprénorphine. Il se peut également qu'il y ait des complications suite à l'induction de cette plaie, malgré des précautions en terme de stérilité. Ce projet sera réalisé sur des souris diabétiques db/db, cette pathologie peut entrainer diverses nuisances (nécrose, contaminations par des bactéries exogénes, suppuration), et un temps de cicatrisation plus long que chez des souris normales. Pour pallier à ces éventuelles complications, un soin sera apporté tous les deux jours en vue de désinfecter la plaie et la garder la plus propre possible.

Devenir

Suite à la procédure, tous les animaux seront mis à mort car ils ne pourront pas être réutilisés dans le cadre d'une autre étude.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle animal ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme).

Réduction

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle (car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement). Le nombre d’animaux sera de 10 par groupe (groupe d’animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence commercialisé type bétamethasone). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable.

Raffinement

Evaluation des animaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...) et enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, des analgésiques seront utilisés, une grille de score ainsi que les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement seront appliqués.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris) sont d’excellents modèles de cicatrisation cutanée de l’Homme. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la cicatrisation cutanée dans cette espèce. De plus, ces animaux développent des symptômes de diabète très semblables à ceux observés chez l’humain. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car les animaux à cet age ont un diabète bien établi. Tous les animaux auront le même âge.

1 404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent du tamoxifène par la nourriture et par injections pour supprimer un récepteur dans la prostate, une partie développant des lésions pré-cancéreuses puis des adénocarcinomes. Le porteur indique qu'elles sont tuées selon un calendrier échelonné, jusqu'à quinze mois après induction, pour prélever la prostate, et qu'une euthanasie intervient en cas de perte de plus de 20 % du poids. Il affirme que son projet "nécessite" un modèle in vivo, aucun modèle in vitro ne reproduisant la complexité des communications cellulaires de la prostate.

Objectifs

Le récepteur des androgènes et le récepteur des glucocorticoïdes jouent un rôle très important dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Des données suggèrent que ces deux récepteurs ont un mode de fonctionnement similaires, c’est pourquoi nous souhaitons comprendre si la perte de l’un de ces récepteurs peut être compensée par l’autre. Afin de répondre à cette question, nous avons établi des souris génétiquement modifiées où l’expression du récepteur des androgènes ou du récepteur des glucocorticoïdes peut être spécifiquement délété dans la prostate saine ou dans un modèle de cancer de la prostate. Ainsi, avec ces souris nous pourrons étudier l’impact de la perte du récepteur des androgènes ou du récepteur des glucocorticoïdes dans la prostate saine ou dans un modèle de cancer de la prostate. Une meilleure compréhension du mode d’action de ces deux récepteurs est importante afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer de la prostate, qui représente aujourd’hui la deuxième cause de mortalité par cancer.

Bénéfices attendus

Actuellement, le traitement de référence du cancer de la prostate métastatique consiste à bloquer toute activation de la voie de signalisation du récepteur des androgènes. Cependant, après 12 à 18 mois, la plupart des patients rechutent et développent une résistance à cette thérapie. De plus, des glucocorticoïdes sont administrés aux patients ayant un cancer de la prostate afin d’améliorer leur qualité de vie (contrôle de la douleur / diminution des effets secondaires). Toutefois, de plus en plus de données suggèrent que l’administration de glucocorticoïdes pourrait stimuler la croissance tumorale. Ainsi, il s’avère important de mieux comprendre le mode d’action du récepteur des androgènes et du récepteur des glucocorticoïdes et leur interconnexion dans la prostate sous des conditions physiologiques et dans le cancer de la prostate. Cette étude est importante afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer de la prostate, qui est aujourd’hui la deuxième cause de mortalité par cancer.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront nourries avec de la nourriture tamoxifène. De plus, la première semaine une injection de tamoxifène en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) par jour pendant 5 jours sera réalisée. Il s’agit de la seule intervention réalisée chez ces souris avant leur euthanasie après 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois et 15 mois (temps de cinétique pouvant varier en fonction de l’étude pilote).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous souhaitons étudier l’impact de la perte du récepteur des androgènes et des glucocorticoïdes dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Nous disposons donc au laboratoire de souris génétiquement modifiées où l’expression de ces deux récepteurs peut être spécifiquement délétés dans la prostate à l’aide d’une molécule appelée tamoxifène. Les souris seront nourries avec de la nourriture contenant du tamoxifène et injectées en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) avec du tamoxifène pendant 5 jours. Le site d’injection du tamoxifène sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. De plus, les souris seront pesées afin de vérifier une absence de perte de poids suite au nourrissage avec la nourriture contenant du tamoxifène. Cependant, au laboratoire, nous réalisons souvent ce type de traitement et n’attendons pas d’effet indésirables notables à ce stade. Concernant l’étude du rôle du récepteur des androgènes et des glucocorticoïdes dans la prostate sous des conditions physiologiques, nos connaissances actuelles sur la fonction de ces deux récepteurs nous mènent à penser qu’aucun effet indésirable n’est attendu chez ces souris. Concernant l’étude du rôle du récepteur des androgènes et du récepteurs des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate, nous nous attendons à ce que les souris développent des lésions pré-cancéreuses 2 mois après l'injection au tamoxifène, dont certaines pourraient évoluer en adénocarcinomes 8 – 10 mois après injection de tamoxifène. Toutefois, nos connaissances actuelles concernant le rôle du récepteur des androgènes et du récepteur des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate suggèrent que l’apparition d’adénocarcinomes pourrait être retardée suite à la délétion de ces récepteurs, comparé à notre modèle de cancer de la prostate chez la souris. Pour cette partie, les souris seront euthanasiées au plus tard 15 mois après induction au tamoxifène.

Devenir

Après traitement au tamoxifène (nourrissage + injection en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale)), l’ensemble des souris seront euthanasiées selon une cinétique définie à l’issue de l’étude pilote réalisée sur un petit nombre de souris. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en œuvre du projet de recherche.

Remplacement

Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle du récepteur des androgènes et du récepteurs des glucocorticoïdes dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Au sein d’une prostate saine, les communications entre les cellules épithéliales et cellules stromales sont importantes au bon fonctionnement de la prostate. De plus, les communications entre le microenvironnement tumoral et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer de la prostate. A ce jour, aucun modèle ne permet d’étudier une telle complexité in vitro. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte. Toutefois, des études in vitro seront réalisées dans la mesure du possible (i.e. interaction protéine-ADN pourront être validée in vitro, génération d’organoïdes et utilisation de lignées cancéreuses de la prostate pour certaines analyses moléculaires).

Réduction

Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs à l’aide de tests statistiques adaptés en fonction des expériences réalisées. Il n’est pas rare d’observer une forte hétérogénéité entre des souris du même groupe. En effet, il peut s’avérer nécessaire d’éliminer un échantillon de l’analyse car il possède une réponse différente des autres souris. Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous commencerons notre étude par une cinétique pilote avec un petit nombre de souris (5 souris par génotype). Cette cinétique nous permettra de raffiner notre étude mais également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le cas où le point limite serait atteint plus tôt que prévu. Par ailleurs, cette cinétique nous permettra de déterminer les temps les plus intéressants à utiliser pour les analyses plus approfondies et ainsi éviter d’utiliser des souris inutilement sur des temps d’étude qui n'aboutirait pas à un résultat convaincant. Notre expertise en expérimentation animale nous a permis de définir au mieux le nombre d’animaux qui sera utilisé pour cette étude. De plus, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, une même prostate sera utilisée pour plusieurs expériences (par exemple, recherche de différents marqueurs biologiques sur une même prostate).

Raffinement

Dans un souci de raffinement, une cinétique pilote sera réalisée avec un petit nombre de souris afin d’éviter toute souffrance inutile des animaux. Cette cinétique nous permettra d’évaluer la vitesse d’évolution des lésions pré-cancéreuses dans nos nouvelles lignées de souris, et donc de supprimer des temps trop tardifs qui pourraient altérer le bien être de l’animal. Durant toute l’étude, tous les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés tous les jours par le personnel de l’animalerie. De plus, l’état de chaque souris sera référencé deux fois par semaine dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement euthanasié par dislocation cervicale. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie par dislocation cérébrale sera réalisée.

Choix des espèces

A ce jour, la souris représente un modèle de choix pour notre étude en raison de : -Temps de gestation court, nous permettant d’avoir de larges cohortes contribuant à l’obtention de résultats significatifs. -L’Histologie de la prostate murine et humaine est similaire (présence de glandes et canaux constitués d’un épithélium composé de cellules luminales, basales et neuroendocrines). -Notre modèle de cancer de la prostate chez la souris présente la même cinétique de développement tumoral que celle observée chez l’homme (lésions pré-cancéreuses évoluant en adénocarcinomes). -Le système immunitaire chez la souris est proche du système immunitaire chez l’homme avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude. -Les voies de signalisation et gènes exprimés dans la prostate sont similaires chez l’homme et chez la souris. Les animaux utilisés seront adultes. Ils seront traités au tamoxifène à 8 semaines et sacrifié comme indiqué après 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois et 15 mois. Cette cinétique pourra être ajustée en fonction de l’étude pilote réalisée dans un premier temps sur un petit nombre de souris. Cette cinétique est importante pour étudier le rôle de AR et GR dans le développement et la progression du cancer de la prostate.

756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, des injections répétées et, pour 378 d'entre elles, des séances d'irradiation cérébrale, pour tester une molécule antioxydante seule ou avec la radiothérapie. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids, de motricité et de sensibilité, et que l'irradiation dégrade l'état général, les souris étant tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leur cerveau. Il affirme que les modèles in vitro ne peuvent pas reproduire les tumeurs multi-compartimentales et juge le modèle in vivo "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour but de caractériser l’impact de la modulation du métabolisme de l’interactome des espèces réactives (RSI) au sein de différents modèles murins de glioblastome (GBM) (immuno-compétent et immuno-déficients). En effet une meilleure compréhension de ce métabolisme permettrait de mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques qui viendraient compléter ou améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin de trouver de nouvelles approches pour le traitement du GBM en cherchant notamment à avoir un effet propre du traitement sur la tumeur mais aussi un effet sur la radiorésistance. Le projet consiste à étudier l’effet d’une molécule innovante aux propriétés antioxydantes « SOD-like » sur différents modèles murin in vivo de GBM. Cette molécule va également être évaluée en complément de la RT afin de voir si elle peut présenter des effets radio-sensibilisants. Des études préliminaires in vitro ont permis de déterminer que l’administration de ce traitement « SOD-like » couplé ou non à de la RT permettait de réduire significativement le nombre de cellules U251-MG après irradiation des cellules. Ces résultats in vitro étant encourageants, l’étude in vivo a pour but de vérifier les effets de ce traitement sur un modèle murin immuno-compétent présentant un microenvironnement complet de la tumeur et sur des modèles murins immuno-déficients présentant un microenvironnement partiel mais permettant l’étude de cellules humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’étudier le potentiel thérapeutique et radio-sensibilisant d’une molécule innovante « SOD-like ». Il a également pour but d’apporter de nouvelles connaissances sur le métabolisme du RSI dans différents modèles de GBM. Sur le long terme cet apport d’informations à la communauté scientifique va permettre de tester de nouvelles cibles thérapeutiques dans le domaine des tumeurs cérébrales permettant d’améliorer et de compléter les traitements utilisés de façon conventionnelle en clinique.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, les 756 animaux sont concernés. - Injection intra-péritonéale (animal vigile): 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole ; 5 minutes maximum par animal, les 756 animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy espacées de 48h (Groupe A), ou sur 3 jours consécutifs (Groupes B, C, D) : 15 minutes maximum par animal, 378 animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM. Toutefois, ces critères seront pris en compte dans les points limites de l’étude. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir la meilleure molécule SOD-like mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous avons réalisés des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe pour les groupes A, B et C. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence un nombre minimum de 4 animaux par sous-groupe de traitement pour obtenir une différence significative en espérant une valeur statistique de 5% pour une puissance de 80%. En raison d’une certaine variabilité observée sur les différents modèles d’injection au sein de l’équipe nous estimons que le nombre d’animaux par sous-groupe de traitement doit être augmenté à 10 animaux par sous-groupe. Ce nombre de 10 animaux est cependant un nombre maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Aucune simulation statistique n’a pu être réalisée pour le groupe D car les cellules ne sont pour l’instant pas en notre possession. D’après l’expertise de notre laboratoire, les cellules PDX présentes généralement une variabilité inter-individuelle assez importante. Pour cette raison, nous estimons un nombre de 12 animaux par sous-groupe de traitement maximum.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 3 fois par semaine. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée retenue pour réaliser ce travail est la souche Swiss Nude. C’est une souche de souris déficiente en lymphocytes T, mais présentant des lymphocytes B et des cellules tueuses naturelles (NK). Elle est particulièrement préconisée pour les études s’intéressant au développement du GBM d’origine humaine. Lorsque les cellules tumorales sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié. Le choix de la souris se justifie dans ce projet car cette espèce permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles sont bien caractérisés au sein du laboratoire. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs.

540 poissons, des raies et des requins de six espèces, vont être capturés puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont marqués sous anesthésie par un émetteur acoustique, inséré dans la cavité péritonéale par incision chez les roussettes et les requins taupes, ou fixé par perçage de la nageoire chez les raies, pour suivre leurs déplacements autour des parcs éoliens en mer. Le porteur indique que le marquage peut occasionner des mortalités directes ou indirectes, qu'il présente comme rares, et que les individus sont remis à l'eau à l'endroit de leur capture. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour étudier les mouvements en milieu naturel.

Objectifs

Le développement des parcs éoliens en mer est aujourd’hui en plein essor. Ces infrastructures génèrent des modifications de l’habitat au sein des écosystèmes marins ayant un impact potentiel sur la biodiversité. Ils peuvent agir comme des récifs artificiels pour certaines communautés de poissons avec des espèces présentant une forte résidence pour ces milieux. De plus, les câbles électriques sous-marins qui relient les éoliennes entre-elles et raccordent le parc éolien à la côte, peuvent générer des champs électromagnétiques et affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles, tel que les requins et raies. La croissance de l’éolien en mer risque d’amplifier ces effets, mais les conséquences sur les communautés ichtyologiques restent peu connues. Ce projet de 3 ans, vise à identifier et évaluer les effets des parcs éoliens en mer et leur raccordement sur les peuplements de raies et requins, espèces peu étudiées et à fort enjeu de conservation. Pour cela, ce projet se base sur l’utilisation de la télémétrie acoustique comme méthode de suivi, qui consiste à équiper un animal d’un émetteur acoustique (tag) émettant un signal sonore unique détecté par des hydrophones (récepteurs) placés dans les milieux ce qui permet d’étudier les déplacements et les comportements des individus dans le temps et l’espace. Cela permet de déterminer différents processus écologiques, notamment comment une espèce connecte et utilise les habitats, information essentielle pour mieux comprendre son rôle dans l’écosystème, ainsi que l’effet d’une modification d’habitat comme l’implantation d’un parc éolien en mer. Le projet a pour objectif d’étudier le comportement de raies et requins sur des zones de parc éolien en mer à différent stades de développement (pré-construction à exploitation). Ainsi, 6 espèces seront équipées de tags acoustiques : La raie brunette Raja undulata, la raie bouclée Raja clavata, la petite roussette Scyliorhinus canicula, la grande roussette Scyliorhinus stellaris, l’émissole tachetée Mustelus asterias et le requin taupe commun Lamna nasus. Les individus marqués seront suivis sur différents sites et habitats grâce à des récepteurs placés au sein des parcs éoliens et habitats côtiers. Ce projet servira à évaluer l’effet des parcs éoliens en mer sur le comportement de ces communautés et ainsi permettre de proposer des mesures d’amélioration pour la conservation de ces espèces et le développement des parcs éoliens offshores.

Bénéfices attendus

L’implantation d’un parc éolien en mer entraine des modifications d’habitats. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie des espèces suivies et ainsi répondre à différentes questions telles que : comment ces espèces réagissent-elles à des champs électromagnétiques générés par un câble sous-marin ? Quels sont les profils d’occurrence des espèces à enjeux de conservation dans la zone de parc éolien en mer ? Quel est le degré de connectivité entre les parcs éoliens en mer et les autres habitats marins pour ces espèces? Les individus font-ils preuve d’une fidélité pluriannuelle au site ? Comment les conditions environnementales influencent-elles ces tendances ? Il existe très peu de connaissances à ce sujet sur les raies et les requins. Ces connaissances relatives à l'écologie du mouvement de ces espèces, que le marquage en milieu naturel rend possible, serviront de cas concrets pour la mise en place de suivis pérennes des populations au sein des parcs éoliens en mer afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général.

Procédures

Les petites roussettes, les grandes roussettes et les émissoles tachetées seront marquées chirurgicalement sous anesthésie générale. L'acte d'insertion de la marque acoustique (13mm de diamètre) dans la cavité́ péritonéale est relativement simple et parfaitement maitrisé par les applicateurs du projet. Seule la paroi musculaire de l’individu à marquer est ouverte pour l’insertion de la marque, aucun organe interne autre que la peau et les muscles n'est impacté par cette incision. L'incision est ensuite suturée avec du fil résorbable qui disparait en 3 à 4 semaines. L'acte de chirurgie en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les raies seront marquées sous anesthésie générale pour la pose d’un émetteur externe de 13 mm de diamètre sur la nageoire pectorale de l’individu. Deux aiguilles de 3mm de diamètres perceront la nageoire de la raie pour fixer l’émetteur. Des études précédentes ont montré que ce type de marquage n’altéré pas la nage de l’individu et son comportement. L’acte de pose de l’émetteur en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les requins taupes seront marqués chirurgicalement sous anesthésie locale afin de limiter le temps de la procédure et le stress de l’individu comme il est conseillé par de nombreuses études sur les requins de grande taille (>2m). L'acte d'insertion de la marque acoustique (16mm de diamètre) dans la cavité́ péritonéale est relativement simple et parfaitement maitrisé par les applicateurs du projet. Seule la paroi musculaire de l’individu à marquer est ouverte, aucun organe interne autre que la peau et les muscles n'est impacté par cette incision. L'incision est ensuite suturée avec du fil résorbable qui disparait en 3 à 4 semaines. L'acte de chirurgie en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les individus seront relâchés dans la zone de capture le plus rapidement possible.

Impact sur les animaux

Au niveau individuel, cette étude nécessite un marquage (chirurgical pour les requins, externe pour les raies). Même si cela reste rare, ces procédures peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes. Aucun autre effet du marquage n’est à signaler.

Devenir

Tous les animaux marqués seront replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leur capture.

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser les mouvements individuels en milieu naturel, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. L’apport de la télémétrie acoustique (détection de la présence de poissons marqués à proximité d’un récepteur) devrait permettre l’amélioration de connaissance sur les habitats occupés par les espèces et de leurs mouvements. Pour atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines, l’évaluation de l’état écologique des écosystèmes marins doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie du mouvement des espèces et à la fréquentation des habitats essentiels, que le marquage en milieu naturel rend possible.

Réduction

Le nombre d’individu a été réduit au minimum d’après les préconisations de la littérature pour la télémétrie acoustique. Des tests de puissance préalables ont été́ effectués permettant d'estimer la taille de l'échantillon nécessaire pour confirmer ou infirmer les hypothèses de manière significative. Le fait de marquer 30 individus par espèce et par site, permet la réalisation d’analyses statistiques fiables et robustes permettant d’extrapoler à la population. Ainsi, le comportement des individus et des espèces analysées permettra de refléter un comportement global de la population et ainsi d’évaluer les effets des parcs éoliens sur le comportement de ces espèces.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors du marquage, incluant la capture (engins sélectifs en direct, l’hameçon ou traits de chalut courts), pour limiter au maximum le temps où l’animal est en phase « capture », ainsi que des procédures d’anesthésie optimales durant les phases pré opératoire, opératoire et post opératoire. Le protocole de pêche seront adaptés pour être les moins traumatisants avec notamment la sélection d’hameçons spécifiques et un personnel spécialement formé à ce type de capture. Les individus seront surveillés de manière régulière durant toute la période de détention. Lors de leur manipulation, en plus de l’utilisation d’anesthésiant, les individus seront placés en immobilité tonique afin de limiter le stress et la douleur. Un analgésique sera aussi utilisé conjointement. Les individus seront remis à l’eau le plus rapidement possible (quelque heures maximum). Après implantation, les individus ayant subi une anesthésie générale sont gardés en bassin de réveil et surveillé individuellement au moins 30min. Aucune remise à l’eau ne sera faite avant que l’animal ait retrouvé tous ses réflexes et sa mobilité. Aucune sortie de l’eau sans anesthésie ne sera effectuée de manière prolongée (supérieur à quelques secondes). Lors des sorties de l’eau pour chirurgie, les poissons resteront en permanence en milieu humide (dos dans l’eau, flux d’eau dans la bouche). Les individus seront retirés de la procédure si les points limites préalablement établis sont atteints. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale, absence de réaction) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). La taille et le poids des marques pour chaque espèce sont choisies bien en dessous des critères normalement appliqués (>2% du poids des individus).

Choix des espèces

Les raies et les requins sont des espèces présentes dans les zones d’étude où se situent potentiellement des habitats essentiels pour ces poissons (ex. zone de reproduction, aire de nourrissage). Ces espèces électrosensibles sont aussi susceptibles d’être impactées par les champs électromagnétiques générés par les câbles sous-marins des parc éolien en mer. L’ensemble de ces espèces sont présentes sur les différents sites d’étude et présente des degré de mobilité diffèrent (territoriale/résidentes à fortement migratrice). Les espèces sélectionnées sont exploités ou présentes dans les pêcheries et sont considérées comme robuste avec une capacité de récupération rapide. La méconnaissance sur l’écologie de ces espèces limite notre capacité d’évaluation de leur statut de conservation. Il est important de les étudier en milieu naturel afin d’apporter les connaissances nécessaires permettant d’établir le statu des populations et leur vulnérabilité face aux pressions des activités humaines. Seules les adultes de chaque espèce seront marqués car leurs conditions physiologiques sont jugées plus robuste que le stade juvénile.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie génétique liée au gène Bin1, elles subissent des injections dans le muscle ou l'abdomen, des mesures répétées de force musculaire sous anesthésie et des tests de suspension, pour tester une thérapie génique. Le porteur affirme n'attendre aucune douleur liée au phénotype et décrit une atrophie musculaire légère, tout en précisant que les souris sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et que la maladie deviendrait sévère si elles étaient gardées vivantes. Il conclut que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et juge le modèle murin "essentiel".

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Procédures

Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein ou du poumon, puis un traitement par gavage pendant trois à six semaines, pour comparer un dosage adaptatif des anticancéreux au dosage maximal habituel. Le porteur indique que la greffe provoque une douleur modérée sous anesthésie et que la tumeur sera limitée à 2 000 mm3, toutes les souris étant tuées pour analyser les cellules tumorales. Il affirme avoir déjà travaillé sur cellules en culture et par modélisation mathématique, mais juge le passage à l'animal nécessaire pour reproduire la formation des tumeurs.

Objectifs

Le cancer du sein est la première cause de mortalité des femmes par cancer en France, avec plus de 12.000 décès par an. Chez l’homme, le cancer du poumon est le plus mortel avec > 22.000 décès / an. L’échec thérapeutique dans les deux cancers est causé par le développement d’une résistance cellulaire aux drogues. L'approche conventionnelle d'administration d'anti-cancéreux consiste à donner les Doses Maximales de drogues Tolérées par les patients (MTD). Toutefois, en raison du grand nombre de cellules cancéreuses et de leur hétérogenéité, cela conduit inévitablement à une sélection de cellules qui sont adaptées pour résister aux traitements, et qui sont responsables des rechutes. Cette sélection des cellules résistantes par les thérapies est un problème d’écologie, et les écologistes ont conclu que le meilleur moyen de limiter les effets néfastes des éléments nuisibles est de les contrôler plutôt que de tenter de les éradiquer. Transposé au cancer, cela consisterait à appliquer des régimes adaptatifs de drogues où l'on diminue la dose si la charge tumorale diminue. Cela permettrait de maintenir une compétition cellulaire entre cellules sensibles aux traitements et cellules résistantes, tout en limitant les effets secondaires des drogues. Bien que cette "Thérapie Adaptative" (AT) connait déjà des succès dans la clinique, les paramètres essentiels pour l’implémenter, et les mécanismes cellulaires et moléculaires en jeu, restent inconnues. Nous avons récemment montré par une combinaison de modélisation mathématique et d'expériences à partir de cellules cancéreuses en culture, que la compétition entre cellules sensibles et résistantes est réelle et détermine l’efficacité de l’AT. Dans nos expériences, des régimes avec des faibles doses de drogues contrôlaient mieux la croissance des cellules cancéreuses dans le temps que des doses plus élevées, tout en évitant l'apparition de cellules résistantes. Ces expériences sont publiées dans une revue internationale. Comme il s'agit d'utilisation exclusive de cellules en culture, notre stratégie est conforme à la première règle des 3R (remplacement). Cependant, il est important de maintenant procéder aux expériences chez l’animal pour mieux reproduire la tumorigénèse, afin de mieux comprendre comment implémenter l’AT chez l’homme. Le but de ce projet est de tester les avantages et mécanismes de l'AT in vivo chez la souris dans des modèles cliniquement relevants de cancers du sein et du poumon.

Bénéfices attendus

La réussite de ce projet serait d'une importance majeure, car il permettrait d'envisager des essais cliniques avec des drogues déjà autorisées mais jusqu'à présent inefficaces pour lutter contre la résistance. Les avantages de l'AT seraient un gain de temps de survie des patients et la diminution des effets secondaires. L’AT est potentiellement applicable à n'importe quel cancer et n'importe quelle drogue.

Procédures

Greffes de cellules cancéreuses une fois, et traîtement avec des inhibiteurs de kinases par gavage orale une fois par jour pendant 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales chez la souris engendrait une douleur modérée mais sera réalisée sur souris anaesthésiées. La croissance des tumeurs sera limitée à une taille maximale de 2000mm3, ce qui n'engendre pas de douleur. L'application des drogues par le gavage des animaux implique une nuisance transitoire mas pas de souffrance sévère ni durable. Les drogues utilisées n'ont pas d'effets secondaires chez la souris aux doses utilisées.

Devenir

L'intégralité des animaux sera mise à mort pour éviter de dévélopper des souffrances et pour permettre l'analyse des cellules cancéreuses des tumeurs.

Remplacement

Nous avons déjà analysé in vitro des paramètres relevants des cellules de cancer mammaire (4T1) et du poumon (PC9) sensibles ou résistants aux drogues, et avons également réalisé la modélisation mathématique de ces données. L'ensemble de ces études nous a permis d'identifier et préselectionner les conditions d'intérêt. Mais il n'existe pas d'approches, autre que l'expérimentation in vivo chez l'animal, pour évaluer l'efficacité des différents régimes de drogues sur la diminution de la progression tumorale et de la résistance.

Réduction

Nous avons conçu les expériences pour utiliser le minimum d'animaux permettant de tirer des conclusions statistiquement robustes. Dans chaque expérience, nous comparerons la progression tumorale dans les souris nude entre deux groupes. Chaque expérience prévoit l'utilisation de 10 souris dans le bras AT et 10 dans le bras MTD, à répéter une fois si les résultats sont prometteurs. Ceci donne lieu à 80% puissance pour détecter un effet de différence de 10% avec une confiance p

Raffinement

Les expériences sont conçues pour éviter la souffrance des animaux, selon la règle 3R (raffinement): par exemple en arrêtant les expériences avant les signes de souffrance et en surveillant quotidiennement les animaux pour les points limites correspondant à des signes de souffrance. Les conditions d'hébergements sont les suivantes: 5 animaux par cages (501 cm2) avec pour litière un mélange de sciure de peuplier et de copeaux de peuplier

Choix des espèces

Les modèles choisis (greffe sous cutanées dans des souris nude) sont cliniquement relevants, ayant conduit à des essais cliniques qui ont permi l'approbation des drogues utilisées chez les patients. 8 semaines : il faut des souris adultes jeunes et du même stade pour les expériences de tumorigénèse afin de réduire la variance et diminuer le nombre d'animaux utilisés.