Recherche fondamentale

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le cerveau de vecteurs viraux bloquant l'expression de gènes associés au syndrome de Rett et à une encéphalopathie épileptique, puis une séance d'imagerie ultrasonore sous anesthésie, le blocage pouvant provoquer des troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs. Le porteur indique s'attendre à des troubles légers du fait de la petite zone ciblée, et met à mort tous les animaux à la fin. Il affirme que la complexité de ces maladies ne peut être reproduite in vitro et exige un travail chez l'animal vivant.

Objectifs

Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Ce constat est d’autant plus flagrant en ce qui concerne les maladies neurologiques rares, qui sont généralement des pathologies très sévères et handicapantes et encore mal comprises. Mieux comprendre les symptômes fonctionnels observés dans ces pathologies constituerait une étape importante afin de guider le développement de nouveaux traitements, adaptés au fort besoin médical chez ces patients. Dans ce contexte, nous nous focalisons ici sur les pathologies orphelines neurologiques liées à la perte de fonction d’un gène, en particulier le syndrome de Rett ou l’encéphalopathie épileptique précoce de type 4. Ces maladies, respectivement provoquées par une perte de fonction des gènes MECP2 ou STXBP1, se développent dès l’enfance et provoquent des symptômes très invalidants (troubles cognitifs, moteurs, troubles respiratoires ou épilepsies). De manière globale, les traitements existants pour les maladies orphelines neurologiques d’origine génétique sont extrêmement limités actuellement et ne couvrent que peu de symptômes. Notre objectif est d’étudier l’impact d’un blocage de l’expression des gènes responsables de ces maladies de manière locale dans le cerveau chez la souris, par injection de vecteurs viraux adéno-associé (AAV) contenant des petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) spécifiques des gènes d’intérêt, sur l’activité cérébrale in vivo mesurée par imagerie fonctionnelle ultrasonore à haute résolution. Etablir des profils d’altérations fonctionnelles in vivo pour ces gènes d’intérêt permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de ces maladies et constituera une base d’évaluation pour de futurs candidats-médicaments.

Bénéfices attendus

Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques pour lesquelles les rôles des gènes impliqués sont encore mal connus, et les mécanismes cérébraux conduisant aux symptômes sont peu établis. Notre stratégie consiste à étudier quelles sont les altérations de l’activité cérébrale qui sous-tendent les symptômes de ces pathologies. Les bénéfices attendus sont donc une meilleure compréhension de ces pathologies orphelines, et permettront de guider le développement de candidat-médicaments futurs.

Procédures

Les 60 animaux effectueront une procédure comprenant 2 interventions majeures : 1) Injections stéréotaxiques dont l’objectif est la mise en place du modèle de blocage de l’expression du gène (durée : 1 heure) • Réalisées sous anesthésie générale et analgésie • Sur la totalité des animaux décrits dans cette demande de projet • Chaque animal subira de manière bilatérale, une injection stéréotaxique dans le cortex d’un vecteur AAV contenant des shRNA permettant le blocage de l’expression d’un gène • Aucune autre intervention ne sera effectuée jusqu’à la session d’imagerie, trois semaines plus tard. 2) Imagerie fUS dont l’objectif est la visualisation des atteintes fonctionnelles de l’activité cérébrale dues au blocage des gènes (durée : 1 heure) • L’imagerie fUS sera réalisée sous anesthésie générale (isoflurane et médétomidine) ; la préparation du protocole d’anesthésie optimisé pour l’imagerie cérébrale dure environ 35 minutes • La session d’imagerie comportera une mesure de 15 minutes de l’état cérébral basal puis de 7 minutes de l’état cérébral sous stimulation du système visuel • Sur la totalité des animaux décrits dans la demande

Impact sur les animaux

Le blocage de l’expression des gènes d’intérêt sera susceptible de provoquer des symptômes neurologiques (troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs) chez les animaux. Néanmoins, comme ce blocage n’aura lieu que sur une petite zone du cerveau, nous prévoyons des troubles légers, similairement à de précédentes études utilisant des approches similaires sur ces gènes (pour le gène MECP2, des atteintes transitoires des réflexes sensori-moteurs ont été décrites chez le jeune rat après injection de shRNA intraventriculaire, et des troubles de la mémoire et des interactions sociale chez la souris après inactivation locale du gène dans l’amygdale ; pour le gène STXBP1, des épisodes d’épilepsies d’absence ont été décrites chez la souris après inactivation spécifique du gène dans la voie corticostriatale). L’injection stéréotaxique des vecteurs sera réalisée dans un état d’anesthésie générale, et sous analgésie (buprénorphine, et lidocaïne en local).

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis-à-mort.

Remplacement

La complexité des pathologies étudiées ne peut pas être reproduite exclusivement par des modèles in vitro, dont l’utilisation est préalable à cette étude. Pour comprendre l’impact du blocage de l’expression des gènes d’intérêt dans le cerveau en conditions réalistes, il nous faut travailler chez l’animal vivant, afin de pouvoir établir des parallèles avec les maladies observées chez les patients et évaluer des processus physiologiques pertinents tels que la connectivité fonctionnelle entre aires cérébrales, ou encore la sensibilité à des stimulations sensorielles extérieures.

Réduction

Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, un minimum de 8 animaux par condition est requis afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter une taille d’effet de 7%, avec une variabilité de 5%, une puissance de 80% et un risque alpha de 5%. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires en cas d’échec éventuel de la chirurgie (si le succès de l’injection n’est pas confirmé en immunohistochimie post-mortem notamment). Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests de Student ou d’analyse de variance à deux dimensions (two-way ANOVAs), selon les paramètres évalués.

Raffinement

L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés au modèle. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris est une espèce pour laquelle on dispose de données dans la littérature concernant l’impact comportemental d’une inactivation des gènes MECP2 et STXBP1, ce qui permettra une comparaison avec nos données d’imagerie. De plus, la souris est une espèce idéale pour l’utilisation de notre dispositif d’imagerie cérébrale ultrasonore, car l’épaisseur restreinte du crâne permet un passage des ultrasons et une qualité d’imagerie suffisante dans des conditions non invasives. De précédentes études utilisant ce type d’approche par inactivation locale des gènes MECP2 et STXBP1 ont obtenu des symptômes similaires à la pathologie humaine chez des souris adultes, nous utiliserons donc également des souris adultes.

480 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des sons puis reçoivent des médicaments administrés localement dans l'oreille et subissent des tests auditifs sous anesthésie pouvant durer jusqu'à quatre heures, avant une mise à mort pour prélever les cochlées. Le porteur affirme que les expositions sonores, inférieures au seuil de douleur, ne produisent aucun effet indésirable, et choisit la gerbille pour son champ auditif proche de celui de l'humain. Il annonce des retombées thérapeutiques contre les surdités professionnelles et prévoit un dépôt de brevet, ces essais cliniques restant projetés à cinq ans.

Objectifs

Il est aujourd’hui admis que les forts niveaux de stimulations sonores provoquent la mort des cellules sensorielles de la cochlée et l’apparition d’une surdité définitive. Une exposition sonore à des niveaux modérés entraine une dégénérescence des fibres du nerf auditif, sans altération des cellules sensorielles. Fait surprenant, la perte de fibres auditives peut atteindre plus de 50%, alors que les seuils audiométriques demeurent strictement normaux. Autrement dit, une audiométrie normale n'est pas synonyme d'une audition normale. Cette neuropathie cochléaire pourrait résulter d’un excès de neurotransmetteur (excitotoxicité) libéré par les cellules sensorielles lors d’une surexposition sonore. Si cette hypothèse est validée, elle ouvre des pistes pharmaceutiques nouvelles qui consistent à utiliser des agents pharmaceutiques capables de protéger les neurones auditifs ou de stimuler leur repousse. Toutes les expériences seront réalisées in vivo chez la gerbille de Mongolie. En plus d’être un animal couramment utilisé dans des projets pharmacologiques, la gerbille présente comme avantage d’avoir un champ auditif proche du champ auditif humain facilitant ainsi le transfert clinique.

Bénéfices attendus

Les surdités sont un problème majeur de santé publique. L’organisation Mondiale de la Santé estime que 1,5 milliard de personnes dans le monde présentent des déficits auditifs et que ce chiffre devrait atteindre 2,5 milliards d'ici 2050. Il est reconnu que le traumatisme sonore est l'une des causes les plus fréquentes de surdité et un problème coûteux au sein du monde du travail. Outre la surdité, les traumatismes sonores sont responsables de la survenue d’acouphènes (sifflements, bourdonnements d’oreille), voire d’hyperacousie douloureuse (intolérance au bruit). Ce projet a pour finalité d’améliorer la santé des personnes exposées à des bruits environnementaux (militaires, musiciens, techniciens du son, ouvriers dans l’industrie). Les agents pharmaceutiques identifiés et évalués dans ce projet pourront être proposés à visée préventive (protection préexposition) ou thérapeutique (post-exposition). La démonstration de leur efficacité devrait à moyen terme dans les 5 ans déboucher sur des essais cliniques. Cette étude porte sur les traumatismes sonores devraient intéresser des personnes exposées à des bruits environnementaux (militaires, musiciens, techniciens du son, ouvriers dans l’industrie). Une fois la preuve de concept faite, nous déposerons un brevet.

Procédures

En principe aucun animal ne devrait souffrir au cours de la mise en œuvre de ce projet car les tests auditifs sont tous réalisés sous anesthésie générale. Tout au long de l'anesthésie qui dure au maximum 4 heures, l’expérimentateur surveille attentivement la profondeur de l'anesthésie et le bien-être de l'animal. Le pouls et la température corporelle sont monitorées durant toute l'anesthésie. A l’issue des tests, les animaux sont placés en zone de réveil. Après leur réveil, ils sont réintroduits dans leur cage habituelle et le suivi consiste en une visite quotidienne. Lorsque que l’animal sort du protocole, il est mis à mort pour prélever ses cochlées pour des observations morphologiques.

Impact sur les animaux

Les expositions sonores ne produisent pas d’effet indésirable sur l’animal. Les niveaux sonores utilisés dans ce projet sont bien inférieurs au seuil de la douleur de l’animal (~140 dB SPL). De plus, ce type d’exposition sonore est utilisé depuis plus de vingt ans dans des dizaines de laboratoire de recherche dans le monde. Les auteurs des études n’ont jamais observé d’effet indésirable post-exposition. Par ailleurs, l’administration locale de drogues thérapeutiques ainsi que les explorations physiologiques sont réalisées sur l’animal anesthésié donc la principale nuisance est liée ici à la piqûre de l'anesthésie.

Devenir

Chaque animal est mis à mort à l’issue de la chirurgie pour prélever les cochlées pour des observations morphologiques.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales. Dans ce projet, le modèle expérimental s’appliquera à la Gerbille (Meriones unguiculatus) qui possède une gamme auditive de basse fréquence représentant un modèle précieux pour la compréhension de l'audition humaine. Par ailleurs, une grande partie des études sur les mécanismes auditifs a été réalisée sur la gerbille de Mongolie, afin de permettre une comparaison des résultats obtenus avec ceux déjà publiés il est essentiel d’utiliser cette espèce. Elles possèdent également des caractéristiques anatomiques uniques qui permettent l'application locale de drogues dans l'oreille moyenne par voie transtympanique.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Une étude statistique nous a conduits à utiliser 480 gerbilles pour 3 procédures expérimentales lors de cette étude qui se déroulera sur 5 ans. Le nombre d'animaux par groupe experimental a été calculé en utilisant un logiciel statisitique.

Raffinement

Les animaux seront particulièrement surveillés après les expositions (bruit et drogue) pour évaluer tout signe de souffrance : en cas de baisse du poids, de modification de l’apparence (yeux mi-clos, le poil hérissé, le dos courbé, animal prostré), ou de problème post-chirurgical (saignement, ouverture de la cicatrice, infection cutanée). La reprise d’activité motrice ainsi que la reprise de l’alimentation normale (nourriture et hydratation) sont contrôlées deux fois par jours après les interventions. Les gerbilles conservées sont isolées dans des grandes cages dans un milieu enrichi, avec des copeaux dans la litière, des tunnels et des maisons en plexiglass. Les animaux potentiellement en souffrance (évaluation selon les signes de souffrance classiques incluant les mimiques faciales stéréotypées, le dos vouté, la prostration, le poil ébouriffé, l'anorexie) seront soulagés par une injection d'un analgésique ou mis à mort en cas de souffrance persistante au-delà de 24 heures. Une fiche d’évaluation de la douleur sera également utilisée pour consigner tout signe de souffrance des animaux.

Choix des espèces

Nous entreprenons cette étude chez la gerbille, un animal dont la gamme de sensibilité auditive recouvre de manière significative celle de l'homme et dont les différences de distribution des sous-types fonctionnels de fibres du nerf auditif sont connues. La gerbille est de plus un modèle expérimental bien établi pour la recherche auditive et permet d'utiliser toute la panoplie des approches électrophysiologiques, moléculaires et d'imagerie modernes. La facilité d'accès à la cochlée facilite également l'administration locale de médicaments. Les animaux utilisés seront agés de 8 à 20 semaines afin de se préserver des effets liés à l’âge sur l’audition (presbyacousie).

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour être déficientes en vitamine A active, elles subissent une série de tests comportementaux moteurs et cognitifs, des examens de la rétine sous anesthésie et des injections répétées d'un marqueur, avant une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur indique vouloir caractériser les conséquences de cette déficience sur le système nerveux et la vision. Il affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et reste "indispensable", les modèles cellulaires ne reflétant pas selon lui la diversité des mécanismes in vivo.

Objectifs

La vitamine A et ses formes actives jouent des rôles très importants au cours du développement et dans la physiologie de divers organes. Ces molécules sont les ligands de certains récepteurs nucléaires qui contrôlent l’expression de gènes. Si les fonctions développementales de la vitamine A et de ses récepteurs sont bien caractérisées, les fonctions aux stades adultes restent encore mal connues. Ceci s’explique par le fait que des modèles murins génétiquement modifiés pour étudier la fonction de la vitamine A ne sont pas compatibles avec la survie de l’embryon. La solution trouvée pour palier à ce problème a été de produire un modèle murin génétiquement modifié, déficient en certaines formes actives de la vitamine A, mais supplémenté en celles-ci via l’alimentation maternelle, afin d’obtenir des embryons viables. Ces mutants ainsi obtenus pourront être analysés à l’âge adulte pour caractériser les défauts fonctionnels résultant d’une déficience en vitamine A. L’objectif de ce projet est de caractériser les conséquences liées à un déficit de la forme active de vitamine A : (1) au niveau du système nerveux central, en effectuant un ensemble de tests comportementaux pour analyser les fonctions motrices et cognitives ; (2) au niveau de la vision (les déficits visuels étant la première caractéristique de la déficience en vitamine A chez l’humain) par des analyses des performances visuelles; (3) après complétion des tests, les cerveaux des animaux seront utilisés pour des analyses moléculaires supplémentaires afin de déterminer si le déficit en vitamine A affecte la prolifération cellulaire, et d’analyser ses gènes cibles potentiels.

Bénéfices attendus

Des déficiences dans le métabolisme de la vitamine A se caractérisent chez l’Homme par des troubles de la vision. La vitamine A est obtenue dans l’organisme sous forme bioactive par une enzyme spécifique. Ces formes bioactives de la vitamine A sont ensuite capables de se lier à différents récepteurs pour réguler l’expression de gènes. Différents modèles murins spécifiquement mutants pour ces récepteurs ont été conçus mais ceux-ci ne permettent pas d’étudier les conséquences d’une déficience en vitamine A, contrairement à notre nouveau modèle murin. Celui-ci est déficient en l’enzyme spécifique permettant d’obtenir la vitamine A, privant l’animal de la forme bioactive de la vitamine A. Ainsi, grâce à des études comportementales et visuelles et des analyses moléculaires, les conséquences de cette déficience seront comparées aux différents modèles murins mutés pour les récepteurs de la vitamine A. Ce projet permettra pour la première fois de décrire précisément les conséquences comportementales et visuelles de souris déficientes en formes actives de la vitamine A. Des mutations de certains récepteurs de la vitamine A, avaient déjà été décrites chez l’Humain mais pas entièrement caractérisées, d’où l’intérêt de ce projet pour compléter les connaissances déjà acquises jusqu’ici. Des influences environnementales, notamment nutritionnelles, vont vraisemblablement impacter la santé des individus atteints. C’est pourquoi il est important de disposer de modèles mammifères permettant de reproduire ces anomalies, afin d’en tirer les bénéfices applicables à la santé humaine par la suite. En effet, ils permettent de caractériser les conséquences fonctionnelles et pathologiques, et de les traiter par des stratégies (nutritionnelles, pharmacologiques …) pouvant aussi être mises en œuvre chez les patients humains.

Procédures

Ici, nous voulons étudier les conséquences de la déficience en vitamine A sur le cerveau et les fonctions visuelles. Pour cela, nous réaliserons divers tests comportementaux cognitifs et moteurs sur l’ensemble des animaux utilisés ici (n=24, 12 contrôles ; 12 mutants). Ensuite, la moitié des animaux (n=12) recevront une anesthésie générale par voie respiratoire (pendant 5min) afin de visualiser la rétine et ses potentiels défauts (par observation du fond de l’œil par exemple) chez le mutant. Une semaine après, une seconde expérience sous anesthésie générale par injection dans l’abdomen d’anesthésique et d’analgésique (5sec) sera réalisée pour évaluer la réactivité de la rétine à des flashs lumineux. Enfin, pour caractériser l’effet moléculaire de la déficience en vitamine A, nous procéderons à la mise à mort de l’animal pour ensuite prélever le cerveau et réaliser des analyses moléculaires. Pour déterminer l’effet cellulaire généré par la mutation de l’enzyme spécifique, nous injecterons un produit chimique dans l’abdomen de l’autre moitié des animaux (n=12) pour marquer les cellules en croissance 2 fois par jour (matin et soir) pendant 3 jours pour augmenter le signal du marquage. A l’issue de la dernière injection, les animaux seront anesthésiés généralement et recevront une perfusion intracardiaque afin de fixer les tissus et de prélever le cerveau pour réaliser des analyses immuno-histochimiques. Aucun animal n’est maintenu en vie au cours de ces expériences car nous préleverons le cerveau pour réaliser des analyses moléculaires et immuno-histochimiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal pour les injections intra-péritonéales. En effet, les tests comportementaux à effectuer ne sont pas sujets à causer la moindre souffrance, et les analyses rétiniennes sont réalisées sous anesthésie générale sans endommager les yeux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé.

Remplacement

Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les fonctions cérébrales. Il permet de même les investigations des fonctions visuelles dans le modèle le plus proche de l’Homme. En effet, la complexité biologique des signalisations par la voie rétinoïde ne permet par de remplacer les animaux par des modèles, par exemple cellulaires, parce qu’ils ne reflètent pas la diversité des mécanismes biologiques in vivo.

Réduction

Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés, le nombre d'animaux utilisés (groupes de 12, 6 expérimentaux, 6 témoins) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues, chez des souris de fond génétique mixte à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes sera recherchée par application d’un test two-way ANOVA, suivi de tests post-hoc. Il a été vérifié préalablement que la distribution des valeurs est normale avec ce type de test. La seule variable incompressible est le nombre de femelles gestantes qui permettra d’obtenir, dans les portées, le nombre de mutants requis pour les procédures. Dans l’optique de réduction, un nombre limité d’accouplements

Raffinement

En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, dans une plateforme phénotypique à la pointe de l’art (Institut Clinique de la Souris), effectuées en conditions standard sans aucune administration, par exemple, de composés pharmacologiques.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de la vitamine A et les conséquences physiopathologiques de sa dysfonction, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain, des grandes fonctions physiologiques, de l’existence de tests fonctionnels validés pour ce modèle, et de la possibilité de mettre en œuvre des approches préventives (nutritionnelles) ou thérapeutiques qui pourront être ensuite transposées vers l’Humain. Chez l’humain les déficiences en vitamine A se caractérisent par des troubles de la vision. Afin de mieux caractériser le rôle de la vitamine A dans ces troubles, nous utiliserons des animaux adultes (10 semaines).

90 primates non-humains vont être utilisés, tous gardés vivants et réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente macaques à longue queue subissent des écouvillons vaginaux trois fois par semaine sur plusieurs mois et des prélèvements d'endomètre par les voies naturelles ou par laparotomie, trente singes vervets des prélèvements sanguins tous les deux jours puis une biopsie utérine par laparotomie, et trente ouistitis une ablation de l'utérus par hystérectomie. Le porteur décrit un projet visant à comprendre l'évolution de la menstruation chez les primates, dont l'humain. Il affirme que le recours aux primates non-humains est "indispensable", ce trait étant selon lui impossible à étudier in vitro.

Objectifs

Les menstruations sont une caractéristique dont l’évolution est récente, et n’existent que chez quelques espèces de mammifères, dont les humains et certains primates : chez les autres espèces, la muqueuse utérine se résorbe en fin de cycle sans saignements. Ce phénomène reste mal connu d’un point de vue scientifique, et est pourtant crucial pour la compréhension de certaines maladies gynécologiques. Chez l'Homme, la menstruation s'accompagne de changements importants dans la composition cellulaire du tissu endométrial, d'une colonisation par des cellules du système immunitaire et d'une réponse anti-inflammatoire. En l'absence de données chez les primates, nous ne savons pas si ces modifications cellulaires sont spécifiques de la menstruation, ou également partagées par les espèces non menstruantes. Dans ce projet global réalisé sur plusieurs sites, nous proposons de récolter des échantillons d'endomètre utérin chez l'Homme et 4 espèces de primates non-humains menstruantes (babouin et macaque) ou non-menstruantes (saïmiri et ouistiti) avant et au moment de la menstruation pour caractériser ce tissu au niveau cellulaire et moléculaire. Nous étudierons l’évolution, l'expression et la régulation des gènes dans les différentes populations cellulaires qui composent l’endomètre utérin chez ces espèces, pour comprendre comment la menstruation a été adoptée au cours de notre histoire évolutive et ainsi clarifier un aspect important de la physiologie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser les réseaux moléculaires mis en jeu lors du cycle hormonal et de la menstruation à l'état sain chez les primates, et d'évaluer leur conservation entre espèces. La caractérisation de cet état sain est une base indispensable à la compréhension des mécanismes pathologiques, et pour évaluer si l'utilisation actuelle de primates non-humains comme modèles de recherche pour les maladies telles que l'endométriose est pertinent.

Procédures

Macaque cynomolgus : - écouvillons vaginaux sur animaux éveillés 3 fois par semaine pendant 3 mois minimum - prélèvement sanguin sous anesthésie avant le prélèvement d’endomètre - prélèvements d’endomètre en passant par les voies naturelles (insertion d’un spéculum dans le vagin et passage d’une curette par le col de l’utérus) sous échoguidage. Si le passage du col de l’utérus est impossible (variabilté anatomique), une biopsie directe de l’utérus sera réalisée après laparotomie sous anesthésie. Vervets : - Prélèvements sanguins sous anesthésie tous les 2 jours pour suivi de cycle (dosage hormonal) - prélèvements d’endomètre par biopsie directe de l’utérus après laparotomie sous anesthésie. Ouistitis : - Récolte d’urine par habituation tous les 2 jours pour suivi de cycle (dosage hormonal) - prélèvement d’endomètre par hystérectomie après laparotomie sous anesthésie. Si la quantitié de tissu n’est pas suffisante, une ablation totale de l’utérus peut être envisagée.

Impact sur les animaux

Les dommages prévus dépendent des interventions et des espèces concernées. Il s’agit du stress causé par les captures et contentions répétées des animaux (toutes les espèces), la douleur liée à l’injection intra-musculaire de l’anesthésique pouvant être réalisé 2 fois en tout (macaque) ou tous les 2 jours (vervets), la douleur liée à la création d’hématomes possibles dans le cas de prélèvements sanguins répétés à la veine fémorale (vervets), la douleur liée à la chirurgie de laparatomie nécessitant une ouverture pour accéder à l’utérus (macaques, vervets) et enfin la douleur liée à la chirurgie d’hystérectomie (ouistitis). Les chirurgies, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer une période de récupération pendant laquelle l’animal peut présenter une réduction de la mobilité et une réaction inflammatoire locale.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après avis favorable d’un vétérinaire pour vérifier leur état de santé.

Remplacement

La menstruation étant un trait spécifique aux primates qui ne peut être étudiée sur des modèles in vitro, l'utilisation de modèles primates non-humains est indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Entre 3 et 10 réplicats biologiques de bonne qualité sont nécessaires pour la reproductibilité et le pouvoir statistique des analyses de génomique fonctionnelles envisagées dans ce projet. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et le nombre d'interventions par animal, tout en assurant la qualité du jeu de données, nous prélèverons un échantillon de tissu sur 5 individus différents/espèce à deux points du cycle menstruel (avant et pendant la menstruation), soit un total de 10 individus par espèce. Pour pouvoir prélever 10 individus, le suivi des cycles se fera sur 30 individus/espèce au total (pour être spurs d'avoir suffisament de femelles avec des cycles réguliers pour planifier les biopsies). Cette stratégie d'échantillonnage tient compte de la possibilité que certains échantillons ne soient pas de qualité suffisante pour poursuivre les analyses, sans remettre en cause la viabilité du projet. Il s'agit d'étude qualitative dans ce projet.

Raffinement

Chaque prélèvement d’endomètre sera réalisé sous anesthésie générale et couverture antalgique appropriée. Des points-limites spécifiques permettent de soustraire l’animal à la souffrance. Ce projet ne nécessite pas l’isolement d’animaux, ils seront donc hébergés dans leurs groupes sociaux d’origine. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires…), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises….). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal du site.

Choix des espèces

La menstruation est présente chez certains primates et absente chez d'autres. Nous avons sélectionné pour l'étude quatre espèces de primates non-humains et l'Homme. Parmi ces primates, le macaque menstrue mais le vervet, qui leur est plus proche que l'Homme, ne menstrue pas. Le ouistiti, plus éloigné évolutivement, ne menstrue pas et constitue le groupe externe caractéristique de l'état ancestral. Cette configuration nous permettra de mettre en évidence les différences fonctionnelles qui sous-tendent l'apparition des menstruations chez les primates sans effet confondant de la structure de l'arbre phylogénétique. L'étude nécessitant des échantillons de tissu utérin à la fin du cycle menstruel, tous les animaux utilisés sont des adultes en âge de procréer.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'anticorps, trois expositions intranasales à la bléomycine et une trachéotomie sous anesthésie sans réveil, pour provoquer une fibrose pulmonaire et mesurer la toxicité de nouveaux conjugués anticorps-médicament anticancéreux. Le porteur indique que le modèle entraîne une perte de poids et des difficultés respiratoires liées à la fibrose induite. Il présente ces études comme "essentielles" pour sélectionner le candidat le moins toxique avant une première administration chez l'humain, les bénéfices annoncés pour la santé humaine restant à moyen terme.

Objectifs

Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à évaluer l’induction d’une fibrose pulmonaire chez l’animal par de nouvelles molécules développées pour être des traitements anticancéreux. Connaître ce paramètre pour un composé permet de prédire l’apparition de toxicités pulmonaires observées chez l’Homme avec ce type de traitements. Les études proposées portent sur différents variants d’un anticancéreux en développement et visent à déterminer lequel des composés présente le profil de toxicité le plus favorable, afin de le qualifier pour un développement préclinique plus poussé

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’impact du design du conjugué anticorps-médicament sur la toxicité pulmonaire. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC (anticorps-drogue conjugué) induisant le moins de toxicité pulmonaire, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.

Procédures

Injection d'anticorps : nombre 1 durée : quelques secondes Exposition intra nasale a la bléomycine : nombre 3 durée : quelques secondes. Trachéotomie : nombre 1 : Durée 30 minutes sans réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles inherentes au modèle telles qu'une perte de poids, une apprition d'une fibrose induisant des difficultées respiratoire

Devenir

Toutes les souris seront mise a mort en fin de procédure pour analyses. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 8 souris par groupes. De ce fait nous utiliserons les tests de Mann-Whitney si la comparaison se fera entre 2 groupes ou Wilcoxon si le nombre de groupes à comparer est supérieur à 2. Ces tests reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Remplacement

Cette étude vise à évaluer l’induction d’une toxicité pulmonaire par un composé, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro et in vivo ont été réalisées en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique pour l’étude de toxicité pulmonaire.

Réduction

Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 8 souris par groupes.

Raffinement

Avant le début des procédures, les souris seront habituées aux expérimentateurs de l’étude par une observation quotidienne, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance quotidienne, des pesées régulières (1 fois par semaine) ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les animaux seront hébergés 4 femelles par cage (cages : hauteur supérieure à 15cm, surface de 500cm2) dans un environnement enrichi pour limiter le stress. L’enrichissement choisi consiste en la présence d'un dome et de frissotis.

Choix des espèces

La modélisation de la toxicité pulmonaire par la bléomycine est une méthode très répandue chez la souris. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des souris de 6 semaines ayant un système immuniatire mature.

63 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues épileptiques, elles subissent une microchirurgie cérébrale d'environ une heure pour l'implantation d'électrodes, puis des séances d'enregistrement de l'activité cérébrale dans un espace réduit de quinze centimètres de côté, à raison de huit sessions de deux heures sur un mois. À la fin, elles sont mises à mort pour prélever le cerveau et récupérer le bloc d'électrodes collé au crâne. Le porteur indique développer des modèles informatiques de tissu épileptique mais affirme qu'ils ne peuvent remplacer le modèle vivant, l'épileptogenèse mettant en jeu un processus qu'il décrit comme non reproductible.

Objectifs

Les Oscillations Haute-Fréquence (HFO) sont des signaux de courte durée (dizaines de ms) et de faible amplitude, enregistrés en électroencéphalographie intracérébrale (iEEG), dans une bande de fréquence particulière (200-600 Hz). Leur valeur clinique a été rapportée dans de nombreuses publications qui montrent que i) les HFO peuvent être observées avec des macro-électrodes intracrâniennes chez des patients atteints d’épilepsie focale pharmaco-résistante, ii) leur fréquence d’apparition est plus élevée dans les tissus cérébraux à l’origine des crises, dits zones épileptogènes, iii) il existe une corrélation forte entre la résection des zones cérébrales générant des HFO et l’issue favorable de la chirurgie dans le cadre des épilepsies pharmaco-résistantes. Notre hypothèse de travail est qu’il est possible de proposer un nouveau design d’électrode qui améliorerait l’enregistrement et la détection de HFO pathologiques dans les signaux iEEG. L’objectif général du projet Neuro-Sense est d’augmenter la valeur diagnostique des HFO en tant que biomarqueur fiable des zones épileptogènes.

Bénéfices attendus

Le but ultime du projet est d’amener à la conception d’électrodes hybrides macro-micro. En effet, le traitement des HFO est un problème difficile par essence, du fait des caractéristiques des signaux. Ces signaux présentent un grand éventail de formes, dont seulement une partie peut être expliquée par les modèles informatiques à ce jour. En améliorant leur observabilité, nous souhaitons d’une part débloquer des clefs de compréhension de leurs rôles dans l’épilepsie, et d’autre part faciliter la circonscription de la zone à enlever dans le cadre des chirurgies de résection pour les épilepsies pharmaco-résistantes

Procédures

Micro chirurgie cérébrale sous anesthésie générale avec analgésie, 1h par souris sur 63 animaux. Limitation de mobilité légère (monitoring iEEG et mesure d’impédance), 24h par souris répartissur 1 mois en session de 2h30 sur 63 animaux.

Impact sur les animaux

Toutes les souris auront comme effets indésirables : - Une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour la pose d’électrodes dans le cerveau afin de pouvoir mesurer l’activité cérébrale (1h à 1h30 par souris) - Une limitation de l’espace disponible pour se déplacer (15x15cm) durant les périodes d’enregistrement (8x2h par souris réparties sur 1 mois)

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort pour pouvoir prélever le cerveau pour des analyses histologiques et récupérer le bloc d’électrodes collé sur le crâne. Les animaux ne peuvent donc ni être réutilisés dans un autre projet ni adoptés.

Remplacement

Nous utilisons et développons dans notre laboratoire des modèles informatiques de neurones ou de tissu épileptique mais ils ne sont pas capables de remplacer les modèles in-vivo dans leur ensemble, ce qui est notamment le cas de l’épileptogenèse (mise en place de l’épilepsie) qui met en jeu un processus physiologique complexe non reproductible.

Réduction

Du fait de l’utilisation de modèles informatiques et des précédents projets de recherche, nous connaissons le nombre d’évènements attendus par heure d’enregistrement, nous pouvons donc réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour répondre à nos questions.

Raffinement

Cela fait plus de 10 ans que nous maîtrisons la mise en place de ce modèle mTLE au laboratoire. Au cours de cette décennie, nous avons amélioré les pratiques chirurgicales pour optimiser les protocoles de manière à réduire au maximum la souffrance animale. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé à la chirurgie et maîtrisant la totalité des techniques chirurgicales utilisées ici. Nous prenons en charge la douleur due à la chirurgie en utilisant un anesthésique et analgésique adaptés à la douleur provoquée et à notre projet. Le stress des animaux est également pris en compte dès leur réception et jusqu’à leur mise à mort en enrichissant les cages d’hébergement et en utilisant la technique de mise à mort réglementaire la plus douce possible. Tout au long de la chirurgie et également durant le réveil post-opératoire, nous faisons attention au maintien de la température corporelle, paramètre très important chez cette espèce qui est particulièrement sensible à l’hypothermie.

Choix des espèces

Ce type d’étude nécessite l’utilisation de mammifères épileptiques, dont l’épileptogenèse est bien établie, ainsi que leur neuroanatomie et neurophysiologie. La souris a été choisie comme modèle expérimental pour son adéquation avec les contraintes expérimentales. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines ayant un poids de plus de 20g. Cet âge et surtout ce poids permettent une meilleure réussite de la chirurgie ainsi qu’un ratio poids de l’animal/ poids du dispositif d’enregistrement de seulement 2.5%. Cet âge, considéré comme adulte, est également nécessaire pour que le cerveau soit complètement mature et que le volume de la boite crânienne soit stable.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, une chirurgie cérébrale d'environ trois heures avec implantation permanente d'une fibre optique, un hébergement isolé prolongé et une batterie de tests comportementaux mesurant la peur, l'anxiété, la mémoire, l'évitement et l'hypervigilance. Le porteur reconnaît que la stimulation optogénétique n'est pas transposable directement chez l'humain, mais affirme qu'elle fournira des résultats "nécessaires" pour justifier des études de neurostimulation. Il conclut qu'aucune méthode sans animaux ne peut répondre à la question, le modèle reposant sur l'observation du comportement de l'animal vivant.

Objectifs

L’État de Stress Post-Traumatique (ESPT ou PTSD, pour Post-Traumatic Stress Disorder, APA 1994) est une pathologie psychiatrique qui touche 8 à 12% de la population générale. Elle survient après l’expérience d’un événement traumatique pouvant être létal, causer une blessure grave ou menacer l’intégrité physique. Il existe plusieurs modèles murins permettant de mimer différents aspects du trouble de stress post-traumatique (PTSD). Le plus utilisé est basé sur le principe de conditionnement de peur au contexte où un contexte nouveau est associé à un événement aversif (chocs électriques). Les souris se rappelleront que l’évènement aversif a eu lieu spécifiquement dans ce contexte et en auront peur lorsqu’elles y seront réexposées. Dans le cas d’un évènement aversif léger, en réexposant l’animal de façon répétée au contexte sans choc électrique, l’expression de la peur associée devrait diminuer jusqu’à disparaitre. Les souris comprennent qu’il n’y a plus de danger dans ce contexte. Ce processus, nommé extinction de peur, est défaillant dans le cas du PTSD. Il est donc important que, chez la souris, la peur associée au contexte persiste après plusieurs réexpositions au contexte. De plus, des traits caractéristiques du PTSD (anxiété, trouble de la mémoire, évitement, hypervigilance, freezing ou immobilité lié à la peur) peuvent être observés à l’aide de différents tests comportementaux. Pour cette étude, nous voulons montrer qu’en activant le cortex infralimbique (zone du cerveau responsable de l’extinction de peur chez la souris) lors du rappel de l’évènement, nous arrivons à accélérer et accentuer l’extinction et que cette amélioration engendrerait une diminution des symptômes associés au PTSD.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous démontrerons que les symptômes du PTSD persistent après plusieurs rappels de l’évènement aversif confirmant la qualité du modèle murin de PTSD. De plus, Le cortex infralimbique a été montré comme responsable de la diminution de l’expression de la peur après l’occurrence d’un évènement aversif léger et que, dans le cas d’un PTSD, son activité est largement diminué. Pourtant un nombre très limité d’étude cherche à rétablir cette activité. La technique de stimulation choisie nous permettra d’être spécifique quant à la région ainsi que les neurones stimulés, à l’inverse d’autres techniques de neurostimulations. La stimulation pouvant être effectuée sur l’animal libre de ses mouvements, nous pourrons montrer son importance au cours du rappel de l’évènement aversif. L’optogénétique, même si non transposable chez l’homme directement, nous permettra ainsi l’obtention de résultats nécessaires pour la justification d’études de neurostimulation non invasive. Enfin, à ce jour aucune étude sur le PTSD chez l’animal n’a pris en contre des animaux femelles. En clinique, parmi les techniques thérapeutiques utilisées aujourd’hui, les thérapies d’exposition semblent être de plus en plus pratiquées. En mettant le patient dans une situation où il est obligé de se remémorer le traumatisme de façon répété dans le temps tout en étant dans un endroit où il se sent en sécurité, les psychiatres cherchent à diminuer l’expression des émotions négatives associées. Malheureusement ces thérapies peuvent prendre du temps et ne sont pas aussi efficaces pour tous les patients. Nous voulons monter qu’en stimulant la région responsable de l’extinction, nous pouvons accélérer le processus. Même si non transposable chez l’Homme directement, cette étude nous permettra ainsi l’obtention de résultats nécessaires pour montrer l’importance de venir stimuler le cortex infralimbique pendant le rappel de l’évènement. Enfin, à ce jour, on constate qu’aucune étude sur le PTSD chez l’animal n’a pris en compte des animaux femelles, posant un problème majeur dans la mise au point de thérapie chez l’Homme.

Procédures

Au cours de la première procédure, les souris vont être divisées en 3 groupes (un sous-groupe femelles et un sous-groupe mâle) suivant le protocole choisi : Le groupe PTSD qui recevra 4 chocs électriques dans un nouveau contexte, le groupe conditionnement de peur qui recevra 4 chocs électriques de plus faible intensité et le groupe contrôle seulement exposé au contexte sans chocs électrique. Trois semaines plus tard, toutes les souris sont réexposées au contexte pendant 20min par jour sur 3 jours. Enfin, les souris suivront une batterie de tests comportementaux, les deux semaines suivantes, pour tester différents phénotypes (l’expression de la peur dans le contexte de PTSD, l’anxiété, la mémoire épisodique, l’évitement d’un élément de rappel du contexte de PTSD dans un contexte neutre, la généralisation de la peur à un contexte similaire à celui du PTSD, l’hyperréactivité). Chaque test a une durée maximale de 15min et est effectué un fois. Le test d’hyperréactivité est répété quatre fois en 6 semaines. Les souris effectueront 2 tests comportementaux par jours maximum. Pour les procédures 2 et 3, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale. Cette procédure dure environ 3h sous anesthésie gazeuse. Elle consiste en une injection dans le cerveau et l’implantation d’une fibre optique qui dépassera du crâne de quelques mm (environs 1.25 mm). Cette fibre est nécessaire pour venir activer les neurones à l’aide d’une stimulation lumineuse (LED) et restera donc implanté indéfiniment. Au cours de la chirurgie les souris recevront une injection d’anesthésique local au niveau du crâne, d’analgésique et d’anti-inflammatoire. Pour la procédure 3, deux semaines après la chirurgie, les souris suivront un protocole de PTSD puis de 3 réexpositions au contexte 3 semaines plus tard (cf procédure 1). Les jours de réexpositions, les souris suivront un protocole de stimulation soit au cours des différentes réexpositions soit le matin des réexpositions dans un autre contexte neutre. Les souris de la procédure 2 suivront le protocole de stimulation uniquement, 5 semaines après la chirurgie dans le contexte neutre.La stimulation pour activer les neurones se fera sur l’animal éveillé et vigile. Il s’agira d’une session unique de 10 min (procédure 2) ou de 3 sessions de 10min (1 session par jour sur 3 jours ; procédure 2 et 3). Cette stimulation n’est pas ressentie par l’animal et n’aura aucun effet néfaste.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé en psychiatrie par une persistance de différents symptômes envahissants sur une durée de plus d’un mois. Lors de la mise au point du modèle, nous serons donc tenus de montrer la persistance de différents symptômes sur le long terme. La batterie de tests comportementaux demande de sortir les animaux de leur cage pour les mettre dans de nouveaux environnements inconnues et parfois lumineux, bruyant ou leur rappelant l’évènement aversif. Les tests peuvent donc entrainer un stress ne persistant pas lors de leur retour en cage d’hébergement. Il a de plus été montré à plusieurs reprises que la mobilité des souris ayant suivit un protocole de PTSD était réduite lors de l’exploration dans différents contextes comparé à des souris n’ayant pas subis d’évènement aversif et ce plusieurs jours à plusieurs semaines après. Les souris montreront des comportements de peur associés au contexte aversif encore un mois après le conditionnement. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni de signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Le modèle de PTSD a montré son efficacité dans plusieurs études ultérieures. Pour cela, les souris ont été hébergées seules au moins 14 jours avant le début des expérimentations. Nous hébergerons donc les souris en cages isolées afin de reproduire le modèle de PTSD et d’obtenir la même symptomatologie mais ceci risque d’induire un stress supplémentaire prolongé. Toutefois, les cages seront transparentes, rangées les unes à côté des autres et se trouveront sur un portoir ouvert. Les souris pourront donc se voir, s’entendre et se sentir. De plus, cette étude nécessite d’effectuer des chirurgies au niveau du cerveau. Les souris auront besoin de quelques jours pour se remettre de la chirurgie et de deux semaines avant toutes autres procédures. Le cerveau n’étant pas sensible, la douleur liée à la chirurgie sera dû à l’incision de la peau du crâne et les petits trous effectués dans le crâne. Enfin, la stimulation lumineuse ne sera pas ressentie par les animaux et n’aura aucun effet néfaste mais demandera de brancher les animaux à un câble ajoutant une gêne dans les déplacements tant que l’animal n’y est pas habitué. Les souris seront donc habituées au branchement dans leur cage d’hébergement plusieurs jours avant la stimulation. Cette habituation sera accompagnée d’une récompense alimentaire.

Devenir

Les 210 animaux de la procédure 1 seront euthanasiés. Les souris étant isolées pour l’ensemble de la procédure afin de reproduire un modèle de PTSD existant et ayant été validée dans différentes études, il ne sera pas possible de les regrouper à la suite de cette procédure. En effet des souris regroupées après isolement deviennent agressives et tendent à se battre violemment. En fin de procédures 2 et 3 tous les animaux seront destinés à l’étude immunohistochimique. Pour cela, nous devons fixer le cerveau avec une solution de paraformaldéhyde injecté dans la circulation sanguine de l’animal euthanasié. Cette solution de paraformaldéhyde est nécessaire à la fixation des tissus afin qu’il n’y ait ni dégradation ni modification post mortem. Cela nous permet de récupérer les cerveaux et de les conserver pour confirmer le site d’injection lors de la chirurgie ainsi que faire d’autres études histologiques à la fin des procédures. Sans cela nous ne pourrons pas montrer que les résultats obtenus sont une conséquence de l’activation de la zone cérébrale visée.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectif suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=35 sujets par groupe). Ne pouvant nous appuyer sur aucune étude conte tenue de la variabilité entre mâle et femelle, nous sommes obligé de les considérer comme des groupes séparés. Les procédures 1 et 2 sont des procédures préliminaires qui nous permettront d’arrêter l’étude si les résultats ne vont pas dans le sens attendu et nécessaire pour la suite.

Raffinement

Le stress traumatique appliqué aux animaux, chocs électriques de 2sec à 1.5 mA dans un contexte inconnu, peut être qualifié de moyen, en raison de sa brièveté. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur. Tous les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension/contention des souris et sont soucieux d’éviter tout stress lors de la réalisation des procédures. Pendant la chirurgie, les animaux sont sous anesthésie gazeuse, ils sont placés sur une couverture chauffante pour éviter toute hypothermie et leurs cornées sont protégées de la déshydratation par un gel. Les animaux resteront pendant deux semaines dans leur cage après la chirurgie sans aucune manipulation excepté pour le change des cages afin qu’ils puissent se remettre de la procédure. Un antidouleur (buprénorphine à 0.1mg/kg) sera injecté en sous-cutané en fin de chirurgie et les souris seront monitorée tous les jours pendant la semaine qui suit afin de vérifier que nous n’atteignons pas le point limite.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et la neurobiologie murine, par l’expérience du laboratoire dans l’évaluation comportementale des rongeurs ainsi que dans la mise en application de la stimulation optogénétique. La zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) est un équivalent fonctionnel du cortex préfrontal ventromédian chez l’Homme. Les souris C57/BL6N seront adultes (âgées de 10 semaines) à J0 de l’expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

1415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 1400 d'entre elles subissent une compression chirurgicale du nerf sciatique qui altère la marche et peut provoquer une douleur, suivie d'analyses du déplacement, 415 recevant en plus des injections de tamoxifène cinq jours par semaine. Le porteur indique surveiller quotidiennement la douleur avec une grille dédiée et administrer des dérivés morphiniques, et met à mort les animaux par exsanguination sous anesthésie pour prélever sang et nerfs. Il étudie le rôle d'un gène dans la réparation de la gaine des nerfs et affirme que ce processus complexe ne peut être modélisé in vitro.

Objectifs

Le but est de caractériser chez la souris la cinétique des évènements cellulaires et moléculaires impliqués de la réparation de la gaine isolante des nerfs (gaine de myéline, riche en lipide et cholestérol) après écrasement du nerf sciatique. Nous voulons analyser les conséquences sur cette régénération de l’absence d'un gène impliqué dans le métabolisme du cholestérol (le Liver X Receptor β -LXRβ-) dans les cellules qui forment la gaine de myéline (les cellules de Schwann). Nous nous intéresserons au fonctionnement du nerf en régénération, aux changements de son architecture tissulaire et aux modifications de l'activité des acteurs impliqués dans la réparation de la gaine de myéline. L’objectif est de mieux comprendre l’impοrtance du gène LXRβ dans les cellules de Schwann pour la réparation de la gaine de myéline.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats nous permettra de décrire avec précison les évènements cellulaires et moléculaires au sein des cellules de Schwann lors de la remyélinisation du nerf sciatique chez la souris et de comprendre l’implication du gène LXRβ dans ce processus complexe. Les résultats attendus pourraient ainsi permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des atteintes de la gaine de myéline des nerfs périphériques.

Procédures

415 des 1415 animaux seront traités au Tamoxifène pendant 2 semaines, à raison d'1 injection/jour dans le péritoine pendant 5 jours/semaine au moyen d'une seringue à aiguille fine, adaptée pour limiter au minimum la douleur de l'injection. Elle a pour but d'induire une recombinaison génétique du gène étudié dans les cellules de Schwann à l'âge adulte. Pour étudier la réparation de la gaine de myéline, 400 animaux parmi les 415 traités au Tamoxifène et 1000 animaux non traités au Tamoxifène seront destinés à la procédure chirurgicale de compression du nerf sciatique. Cette procédure a pour but d'induire une altération de la gaine de myéline. Elle dure quelques minutes et sera effectuée sous anésthésie générale après traitement analgésique pour limiter la douleur liée à l'opération. Après l'opération, nous suivrons au cours des semaines suivantes la récupération des fonctions du nerf sciatique par diverses études comportementales (analyse de la démarche de l'animal, analyse de la mobilité des doigts...).

Impact sur les animaux

L'injection de Tamoxifène dans le péritoine des souris est une procédure couramment exécutée en laboratoire qui ne produit pas de douleur notable chez l'animal. Une grille spécifique de prise en charge de la douleur a toutefois été créée pour évaluer les conséquences douloureuses qui pourraient survenir suite à l'invalidation génétique induite par ce traitement. Chez la souris, la démyélinisation induite par compression du nerf sciatique altère la locomotion et peut entraîner une douleur. Nous quantifierons quotidiennement la douleur chez les souris en utilisant la grille spécifique d'évaluation de la douleur que nous avons mis en place afin de prendre en charge chez ces animaux les nuisances induites par cette procédures.

Devenir

Nous souhaitons analyser chez tous les animaux concernés le statut immunitaire. Nous devons pour cela prélever une grande quantité de sang pour pouvoir analyser les marqueurs inflamatoires et immunitaires systémiques. Ainsi, à l'issue de chaque procédure, les 1415 animaux seront sacrifiés par exsanguination sous anesthésie générale avec traitement analgésique préalable. Après la mise à mort des animaux, les 2mL de sang prélevés seront analysés pour établir le profil cytokinique et les nerfs seront disséqués pour analyse biochimique et histologique.

Remplacement

La remyélinisation est un processus complexe qui nécessite l’intervention de multiples acteurs cellulaires qui ne peut être modélisé in vitro. La qualité de la mise en place de la gaine de myéline et de son maintien a des conséquences fonctionnelles qui nécessitent l’analyse de composantes sensori-motrices propres aux animaux vivants.

Réduction

Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation du systême sensori-moteur. Nous soumettrons les données au test satistique one way ANOVA suivi d'un test de Bonferroni et comparerons les groupes d'animaux deux à deux (sauvages vs transgéniques / lésés vs non lésés).

Raffinement

Afin de limiter au minimum la souffrance des animaux une grille spécifique d'évaluation de la douleur a été mise en place. Elle permettra une prise en charge adaptée de la douleur due aux injections et aux opérations chirurgicales (traitement journalier des animaux avec des dérivés morphiniques). Pour l'opération chirurgicale de compression du nerf sciatique, un traitement analgésique avant l'opération est prévu ainsi que durant les 5 jours qui suivent l'opération. L'état général des animaux sera quotidiennement évalué (mobilité, aspect du pelage...) et du gel d'hydratation ainsi que des croquettes seront mis à disposition des animaux au fond de la cage si un défaut de locomotion des souris était constaté.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères au système métabolique et physiologique suffisamment proche de l’Homme pour être utilisées dans une étude pertinante de la gaine isolante des nerfs (myéline) et pour élucider l’importance d'un gène (le LXRβ) dans la réparation de cette gaine. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ce gène sont très bien adaptées chez la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier la myéline nous permettront d’apporter des réponses claires sur le rôle du LXRβ sur la qualité de la gaine des nerfs. Les animaux utilisés sont âgés de 6 à 12 semaines, âge adulte classique pour étudier les phénomènes de réparation de la gaine de myéline pour lequel le système nerveux a achevé son développement et est pleinement fonctionnel.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales mammaires sous anesthésie, puis pour certaines un anticorps couplé à un isotope radioactif par voie intraveineuse et cinq séances d'imagerie. Le porteur indique que la tumeur peut réduire l'activité motrice et faire perdre du poids, la mise à mort intervenant avant que la tumeur n'atteigne 2000 mm³. Le projet teste un anticorps comme outil de diagnostic d'un cancer du sein agressif, bénéfice clinique présenté au conditionnel, et il affirme que la création de tumeurs chez la souris est "indispensable".

Objectifs

La capacité de notre organisme à se défendre face à des substances étrangères est aujourd’hui l’un des axes de thérapie innovantes notamment contre le cancer. Les anticorps sont des molécules biologiques impliquées dans l’immunité. De ce fait, les anticorps ciblant les tumeurs sont aujourd’hui largement utilisés pour le traitement de patients atteints de cancer. La spécificité des anticorps à aller préférentiellement sur la tumeur permet d’une part de gagner en efficacité thérapeutique mais également de se servir de ces anticorps comme molécule diagnostique. L’association d’un anticorps avec un isotope radioactif permet dans le cadre de la médecine nucléaire d’obtenir un outil d’imagerie in-vivo, non invasif et à haut taux de spécificité. Compte tenu de l’expérience déjà acquise au sein de notre laboratoire, le projet porte sur l’étude des tumeurs liées au cancer du sein. L’objectif de notre projet est de développer une molécule de type anticorps associé au cuivre-64, isotope radioactif, ciblant un type particulier de cancer du sein exprimant une protéine impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire (HER2 positif). Ces cancers HER2 positifs sont plus agressifs et ont un pronostic moins favorable que les autres types de cancers du sein.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de confirmer dans un modèle de cancer mammaire chez la souris la capacité de notre anticorps à ne reconnaître que les cellules cancéreuses porteuses d’une protéine particulière (HER2) à la surface de leur membrane. En cas de confirmation, résultats pourront directement influencer les pratiques cliniques actuelles concernant l’exploration fonctionnelle de ce type de cancer du sein plus agressif et au pronostic moins favorable qu’un cancer du sein n’exprimant pas HER2.

Procédures

L'étude implique des groupes de souris contrôle sans tumeur donc non injectées et des groupes de souris porteuses de tumeurs qui seront injectées avec des cellules tumorales sous anesthésie générale. Ensuite certains groupes de souris contrôles et des groupes avec tumeur recevront une injection d'anticorps radiomarqué par voie intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5 minutes) et seront soumis (étude in vivo) à 5 séances d'imagerie d’une durée de 10 à 40 minutes (en fonction du point temporel) alors que d'autres seront inclus dans l'étude ex-vivo (pas d’imagerie, une anesthésie finale en fin d'étude).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le développement d'une tumeur au niveau du site d'injection. Cette tumeur peut éventuellement induire une diminution de l'activité motrice et/ou une perte de poids lorsque celle-ci a un développement trop important. Les points limites de l'étude ainsi que la durée de l'étude devraient limiter ses effets indésirables. Les études d'imagerie n'induisent pas de stress ou d'effet indésirables par eux même.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude avant l'atteinte du volume de 2000 mm3 de la tumeur.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier les effets d’un anticorps couplé à une molécule radio-active à demie vie longue pour suivre au cours du temps la capacité de cet anticorps à détecter sa cible au sein de la tumeur. Les modèles in vitro ne permettent pas de créer une tumeur vascularisée possédant non seulement un amas de cellules tumorales, mais également une matrice extracellulaire, des cellules stromales de soutien et des vaisseaux sanguins, autant de cibles potentielles des stratégies antitumorales. C’est pour ces raisons que la création de modèles tumoraux chez la souris sont indispensables pour vérifier l’intérêt thérapeutique de cet anticorps comme outil de diagnostic en clinique.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été calculé comme étant le minimum pour pouvoir faire des études statistiques dans ce type d’étude qui présente une grande variabilité interindividuelle.Les résultats obtenus entre les groupes seront analysés par des méthdoes statistiques adaptées permettant d'évaluer si le nouvel outil diagnostic utilisé en imagerie permet un meilleur diagnostic des tumeurs. Le type d'imagerie que nous utilisons permet de réduire le nombre d’animaux car un même animal peut être suivi à des différents points temporel. En fonction des données recueillies au cours de l’étude d’imagerie, le nombre de points de mesure prévu dans l’étude de distribution de biodistribution pourra être revu à la baisse ce qui concourra à réduire encore le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont placés à plusieurs par cage afin de respecter l'interaction sociale et dans un environnement enrichi (frisure de papier kraft, carré de cellulose, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum. Des tunels sont également ajoutés dans les cages pour limiter l'agressivité entre congénères. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être. Pour se faire, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront, de sortir l'animal de l'étude et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. Une grille d'observation adaptée à ce protocole permet de mettre en évidence ces points limites. Pendant les séances d'imagerie les animaux sont anesthésiés, hydratés et rechauffés et leurs paramètres vitaux (température et fréquence respiratoire) monitorés en continu. Un gel ophtalmique est appliqué en début de séance pour éviter le dessèchement oculaire

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu dans la communauté pour le développement de cancer induit par l'injection de cellules cancéreuses et permet également de tester la pertinence d’une approche thérapeutique. L’âge de 7 semaines correspond aux standard de la littérature dans ce domaine.