Recherche fondamentale
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Analyses de l’infiltration immunitaire au sein de l’ovaire par des cellules issues de moëlle de souris invalidées ou non pour les récepteurs aux oxystérols LXR (Liver X Receptors) chez une souris hôte immunocompromise.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 15 sans réveil. Elles reçoivent une greffe de moelle par voie intraveineuse au sinus rétro-orbital, un prélèvement sanguin puis une stimulation hormonale provoquant une superovulation, avant mise à mort pour prélever ovaires et tissus lymphoïdes. Le porteur indique qu'une réaction du greffon contre l'hôte peut survenir et précise qu'aucun traitement antidouleur ne sera administré car il modifierait les paramètres de l'expérience, les animaux atteints étant alors tués. Il étudie le rôle de récepteurs dans l'hyperstimulation ovarienne liée à la procréation assistée et justifie la souris par la proximité de son cycle avec celui de l'humain.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans un démarche d’exploration de l’étiologie moléculaire de l’OHSS. Nous utiliserons des échantillons ovariens issues de souris NSG ayant subi une greffe de cellules de moelle issues de souris WT, invalidées pour les récepteurs LXRs et ces mêmes souris avec un transgène permettant le sauvetage spécifique des cellules de Granulosa. Le but du projet est de visualiser in vivo, le comportement des cellules immunitaires issues des moelles greffées sur le profil d’infiltration du tissu ovarien. Ce test fonctionnel in vivo va nous permettre de mieux comprendre la place jouée par LXR au sein de ces cellules dans la genèse du phénotype. Après 1 mois post- greffes, les souris seront soumises à un protocole de stimulation hormonale comme suit en vue d’une superovulation par Injection IP de PMSG, 7,5UI/souris. Les tissus prélevés seront analysés par des techniques d’histologie et d’immunohistochimie par l’étude de marqueurs des différents sous types immuniaires afin de caractérisé l’infiltrat. Ces études seront conduites en utilisant 3 donneurs de moelle osseuse distinct : 1) La lignée sauvage (Wild-Type ou WT) servant de control, 2) la lignée LXRs invalidés (LXR DKO ou LXR-/-) correspondant à un knock-out total des récepteurs LXRalpha et LXRbeta et 3) la lignée rescue pour l'expression de LXRbeta spécifiquement dans les cellules de Granulosa (Tg-AMH LXRbeta). Nous anticipons que les lignées KLXR DKO et Tg-AMH LXRbeta devrait se comporter de manière identique puisque les cellules immunitaires issues de ces souris sont déficientes pour les récepeteurs LXR. Ainsi nous pourront évaluer l'étendue et les caractéristiques de l'ensemble des infiltrats au regard du génotype des moelles implantées. Ainsi nous espérons être en mesure de conclure quand au rôle des LXRs dans les cellules immunitaires au sein de l'ovaire lors de la stimulation hormonale par la PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin).
Bénéfices attendus
Cette étude, couplé au reste du projet de recherche, qui est de plus grande envergure, va ainsi permettre de connaitre le role intrinsèque joué par les récepteurs LXRs au sein du compartiment immunitaire qui compose le tissu ovarien. Plus précisement, la greffe de cellules issues des souris transgéniques sauvages ou invalidées pour les LXRs sera injecté dans des souris avec un fond génétique NSG. Ceci va permettre de faire un rescue du répertoire immunitaire des ces souris et les cellules de l'immunité spécifiqes devraient ainsi recolonisées l'ovaire permettant de mieux comprendre comment ce dernier réagit à la stimulation à la PMSG. En termes plue vulgariseés, cette étude va permettre de comprendre le role des récepteurs LXR qui se trouve dans les cellules immunitaires au cours de la réponse de l'ovaire à une stimulation hormonale chez des patientes inclus dans un programme de procréation assistée. In fine, ces travaux pourraient permettre de trouver des biomarqueurs prédictifs de la réponse ovarienne à cette stimulation hormonale et ainsi éviter l'apparition de situation pathologique telle que le syndrome d'hyperstimulation ovarienne.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : prélèvement sanguin par voie sous mandibulaire NOMBRE 1 DUREE 1 minute Procédures d'implantation de moelle : implantation sous anesthésie par voie intraveineuse dans le sinus retro-orbitaire NOMBRE 1 DUREE 3 minutes
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans la présente demande sont largement utilisée dans de nombreux laboratoire, en particulier dans le domaine de l'immunologie. Ainsi, il y a un recul très important sur les nuisances susceptibles d'être rencontrée au cours des différentes procédures. Certains animaux peuvent éventuellement développer une GVH. De fait, les souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) après la troisième semaine pour détecter toute manifestation de mal-être ou de souffrance. Aucun traitement antalgique ne pourra être réalisé car il conduira de facto à modifier les paramètres expérimentaux (en particulier les anti-inflammatoires). En cas de GVH, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Chaque animal sera implanté par une moelle d'un donneur sauvage ou transgénique puis inclus dans le protocole de stimulation par la PMSG. L'ensemble des animaux seront mise à mort en fin d'experimentation pour prélèvement des ovaires et tissus lymphoïdes secondaires en vue de la caractérisation du profil immunitaire.
Remplacement
Cette étude fait suite à des tests réalisés in vitro en culture de cellules ayant permis de caractériser le comportement des cellules vis à vis de leur statut LXR. Ceci permet donc de limiter notre étude fonctionnelle sur un nombre limiter d’individus pour valider le phénotype d’infiltration in vivo. Cette approche d'anticipation permet ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés et limiter l'étude au strict nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante (test ANOVA) à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 45 individus.
Raffinement
Deux points sont à prendre en compte : i) les animaux en particulier les lignées transgéniques peuvent répondre de manière « exagérée » au traitement hormonale qui induit l’hyperstimulation. De fait, ces lots de souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) pour détecter toute manifestation de mal-être ou de souffrance. Cependant, le protocole post induction est relativement court puisque les souris seront mis à mort 40 heures après l’injection de PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin. ii) l’implantation de cellules immunitaires dans les porteurs NSG peut dans certains cas induire une réponse de l’hôte contre le greffon (GVH-Graft Versus Host syndrome). Cette réponse apparaît dans les 3 semaines qui suivent l’implantation. A cette période, les souris seront mises en observation soutenues pour détecter toutes manifestations de ce syndrome. Toutefois, ce type de complication est rencontrer essentiellement lors du conditionnement des souris par irradiation, ce qui n’est pas le cas ici, ou lors de l’injection de cellules immunitaires « matures » (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells). Dans le cas présent les cellules injectées seront des cellules de moelle, qui présente un risque faible de GVH.
Choix des espèces
Le cycle oestrien et la physiologie de l’ovaire chez la souris sont très proche de l’espèce humaine. En parallèle, l’existence de lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de l’OHSS justifie le choix du modèle murin. Enfin, le modèle NSG constitue un modèle de choix pour la transplantation de cellules de moelle. Nous utiliserons des femelles de 8 semaines concernant les donneurs de moëlles et des souris de 2 à 4 mois pour le modèle NSG. Les âges ont été determiné à partir des données de la littérature.
Modèles conditionels pour étudier la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance surtout modéré. Un modèle de dystrophie myotonique est induit par la doxycycline, y compris chez des souriceaux étudiés jusqu'à sept jours de vie pour leurs vocalises, leur respiration et leur alimentation, 160 animaux étant tués sans réveil par perfusion d'un fixateur. Le porteur indique que les effets attendus des souris induites sont neurologiques et présente les autres actes comme légers. Il cherche à créer un modèle "plus performant" de la forme congénitale de la maladie et qualifie ce développement d'étape "incontournable".
Objectifs
Les objectifs du projet sont: 1) la création d'un nouveau modèle murin (souris) conditionnel de la Dystrophie Myotonique de type 1, spécifique du cerveau permettant de décortiquer les mécanismes physiologiques, histologiques et moléculaires observées chez l'homme 2) la validation de ce modèle et l'optimisation des conditions d'induction de la mutation 3) étudier les impacts physiopathologiques des ARN DMPK mutants exprimés dans les motoneurones de souris nouveau-nés transgéniques: analyses phénotypiques, histologiques, moléculaires et fonctionnelles.
Bénéfices attendus
Ce nouveau modèle permettra de déterminer l'implication des motoneurones des nerfs craniaux et spinaux dans la pathologie notamment dans la forme grave néonatale. L'obtention et l'étude de ce nouveau modèle murin plus performant ouvrira la voie à une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires à l'origine de la pathologie et des conséquences physiologiques. Enfin l'utilisation de ce modèle devrait permettre de tester et de valider chez la souris le développement de nouvelles thérapies de traitement de la DM1 développées au laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur cette maladie.
Procédures
Les 848 souris de ce projet seront impliquées dans des procédures de sévérité légère, modérée et sans réveil. De séverité légère, sont concernées 96 souris qui seront utilisées pour l'étude des vocalises à 7 jours avec 3 minutes comme durée d'acte . De sévérité modérée, sont concernéees 592 souris: - les souris meres (128 souris) qui recevront la doxycycline au stade E11et P1 jusqu’à 7 jours, - les 16 souris qui permettront la validation du modèle après injection de l'inducteur doxycycline en injection intra-péritonéale sur une durée de 4 jours. - les 96 souris utilisées pour optimisation de la concentration de doxycycline. Cet acte durera jusqu à 7 jours de vie. - les 96 souris utilisées pour l'étude de la respiration par pléthysmographie à 7 jours. Cet acte dure au maximum 1h - les 96 souris utilisées pour l'étude de l’alimentation sur une durée de 7 jours. - les 160 souris utilisées qui recevront la doxycycline pour les etudes moléculaires jusqu’à 7 jours de vie. De classe sans réveil, sont concernées les 160 souris utilisées pour les études histologiques , perfusées au PAF pendant une durée d environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les symptômes ou effets attendus pendant ou à l'issue de la procédure P1 (classée modérée) sur les souris induites uniquement (cad ayant recu de l'inducteur: doxycycline) sont exclusivement neurologiques compte tenu de la specificité d'expression de l'ARN mutant. Les effets indésirables attendus pendant les autres procédures sont classés légers et sont un stress léger lors des manipulations et test d'évaluation fonctionnelle non invasifs ou de l'ordre de la gène ressentie lors d'une piqure (injections de doxycycline ou d'anesthésique).
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements qui sont nécessaires pour les analyses post-mortem.
Remplacement
La compréhension des mécanismes à l’origine de la DM1 et le développement d’approches thérapeutique nécessitent d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui expriment la mutation DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. A ce jour, les modèles murins de la DM1 existants ne reproduisent que partiellement les anomalies moléculaires et physiologiques observées chez les patients. Le développement d’un nouveau modèle murin de la DM1 présentant davantage de similitudes avec la pathologie chez l'homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine et l'évaluation des approches thérapeutiques développées dans notre laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur la DM1.
Réduction
Afin d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux, tous les animaux issus des croisements (mâles et femelles) seront utilisés soient 848 animaux. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, histologie et biologie moléculaire. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation d’animaux supplémentaire prévue dans la seconde étape, et ainsi de suite. Les analyses physiologiques finales seront réalisées avec des lots suffisants dont le nombre a été établi par un calcul mathématique lors d’études precedents. Nous avons ainsi déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Il sera ensuite nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
En conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux sera amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu avec des nid de lanière kraft. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30- 18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids de 20% seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Il est à noter que les souris transgéniques n’ont aucun phénotype avant l’addition de doxycycline au régime alimentaire. Les tests invasifs seront réalisés sous anesthésie et seront sans réveil. Des études histologiques et moléculaires seront réalisées à partir d’échantillons de tissus prélevés sur les mêmes animaux après euthanasie de l’animal selon les procédures standard, réalisées dans le respect de l'éthique animal.
Choix des espèces
Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques que nous avons créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie, nous permettent d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau ADN, ARN et protéines dans différents tissus, chez l'embryon et la souris adulte. Ce projet vise à comprendre les mécanismes et impacts physiopathologiques des expansions CTG dans le système nerveux d'un modèle murin conditionnel de la forme congénitale de la dystophie myotonique de type 1. La forme congénitale est “reproduite” chez les souriceaux d’ou le choix des analyses à 7 jours de vie.
Rôle des enzymes du métabolisme des phosphoinositides dans l’hémostase primaire et la thrombose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les groupes, elles subissent des sections répétées du bout de la queue pour chronométrer le saignement, des prélèvements de sang à la veine cave, des lésions provoquées de la carotide ou de la jugulaire et une ligature de la veine cave, sous anesthésie pour les actes chirurgicaux. Le porteur affirme que les composés injectés ne sont ni irritants ni délétères et que les souris génétiquement modifiées n'ont pas de phénotype dommageable. Il étudie le rôle d'enzymes plaquettaires dans la coagulation et juge le modèle murin "irremplaçable" faute d'approche in vitro.
Objectifs
Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Les plaquettes représentent cependant des cibles majeures en clinique dans la prévention de pathologies cardiovasculaires comme les maladies artérielles thromboemboliques, l'athérosclérose ou la resténose après angioplastie (première cause de mortalité dans les pays industrialisés). De nombreux anti-thrombotiques efficaces sont utilisés en clinique mais ils ont généralement des effets relativement drastiques pouvant entraîner des complications hémorragiques. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent aussi être dus à des défauts de production plaquettaire. Ainsi, la mise en évidence de cibles pharmacologiques et/ou de biomarqueurs plaquettaires est nécessaire pour une meilleure prise en charge des thromboses et des syndromes hémorragiques chez le patient. Le rôle des phosphoinositides et des enzymes régulant leur taux dans les diverses étapes qui sous-tendent la production et l’activation des plaquettes reste encore mal étudié. Pourtant, ils ont un rôle majeur à jouer dans les plaquettes sanguines car ils occupent une place de plus en plus centrale dans la régulation spatiotemporelle de la signalisation cellulaire, la dynamique cellulaire notamment le remodelage du cytosquelette et des membranes et le trafic vésiculaire, processus majeurs dans la production et les fonctions plaquettaires. Ainsi, ce projet vise à mettre en lumière comment le métabolisme de phosphoinositides régulent la physiopathologie des plaquettes sanguines.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra un meilleure compréhension du rôle des différents phosphoinostides et de leur métabolisme dans un contexte intégré visant à identifier de potentiels biomarqueurs et/ou cibles pharmacologiques dans les syndromes hémorragiques et thrombotiques dûs à des défauts de plaquettes sanguines.
Procédures
Pour la procédure 1, une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d'arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. Pour la procédure 2, la souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Pour la procédure 3, une injection d’un composé inoffensif et irritant est réalisé en intra-veineux durée de 10 secondes sur souris anesthésiée en IP. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en IP avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. En fonction des résultats obtenus , les procédures 4, 5 et 6 seront effectuées sur certains ou tous les groupes. Pour la procédure 4, la souris est anesthésiée par injection IP pendant toute la procédure. L’acte expérimental d’induction d’une lésion thrombogène à la carotide dure 10 minutes et l'enregistrement dure 30 minutes. Pour la procédure 5, la souris est anesthésiée et traitée par injection IP d’un anti-douleur . L’acte de ligature partielle de la veine cave dure 10 minutes. La souris est ensuite retraitée par injection IP d’un anti-douleur . Pour la procédure 6, la souris est anesthésiée et traitée par injection IP d’un anti-douleur . L’acte expérimental d’induction d’une lésion thrombogène à la jugulaire dure 15 minutes. Toutes les injections IP dure 10 secondes et se font sur animaux vigiles. Les autres actes expérimentales se font sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Les modèles génétiquement modifiés ne présentent pas de phénotypes dommageables de la vie à la mort. Pour les actes expérimentales, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères. Aucune données n'existent quant à des conséquences néfastes des produits injectés qui ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le notre, sans aucun effets indésirables. Chaque acte expérimentale de chaque procédure est maitrisée par les responsables du projet et est réalisée sous anesthésie/analgésie sauf pour les injections intra-péritonéales qui sont des actes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d'organes.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris selon la procédure réalisée. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. En effet, le nombre de souris sera diminué en fonction des résultats obtenus lors des procédures expérimentales 1 à 3, en réalisant ou pas les procédures expérimentales 4 à 6. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris selon la procédure réalisée.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d'apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées par inhalation ou injection de composés. Un contrôle permanent de l'état d'anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l'animal sera isolé et la blessure sera nettoyé 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d'une procédure expérimentale sera effectuée.
Choix des espèces
Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré. Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables de la souris à l'homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiées invalidés pour nos protéines d'intérêt car il n'existe pas à ce jour d'inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 24 semaines car de part et d'autre de cette fourchette d'âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.
Caractérisation d’un nouveau modèle murin d’autisme et évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 48 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent un traitement dans l'eau de boisson puis passent une batterie de tests comportementaux mesurant locomotion, apprentissage, mémoire, anxiété, coordination et interactions sociales, avant prélèvement du cerveau, une partie subissant une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur affirme que ces tests ne provoquent qu'un léger stress et utilise des souris génétiquement modifiées comme modèle d'autisme. Il étudie un gène et un traitement par modulateurs endocannabinoïdes, retombées cliniques présentées au conditionnel, et affirme qu'il n'existe pas de modèle informatique des comportements complexes.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont doubles : Le premier objectif est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire et l'activation des circuits cérébraux. Nous analyserons l'activité des régions cérébrales suite à un test de reconnaissance d'objet et explorerons les populations neuronales impliquées chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Le deuxième objectif est d'évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris transgéniques modèles d'autisme. Nous étudierons leur capacité d'améliorer ou corriger les déficits comportementaux et au niveau des synapses observés chez les souris transgéniques.
Bénéfices attendus
L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés. Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits cérébraux lors de l'apprentissage et la mémoire, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. Par ailleurs, l'évaluation d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris modèles d'autisme pourrait mener à terme à des essais cliniques chez les personnes atteintes.
Procédures
Certaines souris recevront un traitement chronique, administré par voie orale dans l'eau de boisson, pendant 1 mois. Après 7 jours de prétraitement, les souris seront testées séquentiellement dans une batterie de tests comportementaux, effectués à 1-3 jours d'intervalle ; pendant les tests elles continueront à recevoir le traitement. Nous évaluerons l'activité locomotrice (1 jour), l'apprentissage et la mémoire (4 jours), l'anxiété (2 tests, chacun 1 jour), la coordination locomotrice (5 jours) et le comportement social (1 jour). La durée de l'ensemble des tests est de 3 semaines. A la fin des expériences, le cerveau sera prélevé post-mortem afin de réaliser des analyses pour comprendre le mécanisme d'action du traitement. Dans d'autres expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.
Impact sur les animaux
L'administration par voie orale des traitements n'engendre pas d'effets secondaires. Les expériences de comportement réalisées ne provoquent pas de gêne particulière sauf un léger stress dû à la manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau. L'injection intrapéritonéale d'un anesthésique avant la perfusion intracardiaque peut causer de la douleur.
Devenir
Tous les animaux traités avec des modulateurs du système endocannabinoïde seront euthanasiés à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau et le sang pour effectuer des analyses. Dans d'autres expériences, les animaux seront perfusés avec un agent fixateur à la fin, afin de fixer le cerveau et effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et moteurs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation des gènes d'intérêt dans le cerveau et développer de nouvelles approches thérapeutiques. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1148 souris. Ce nombre des souris s'explique par la nécessité d'étudier des souris génétiquement modifiées et de souris normales de deux sexes traitées avec différents composés administrés à plusieurs doses. Les groupes d’animaux nécessaires afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans les expériences de comportement doivent se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux à utiliser dans les expériences d'administration chronique des traitements, les souris seront testées séquentiellement dans une batterie de tests comportementaux, effectués à 1-3 jours d'intervalle. De plus, à la fin des expériences de comportement, nous récupérons le cerveau des souris, afin d'étudier l'effet du traitement et doser le taux des substances administrées. Enfin, lors des études explorant les effets des nouveaux traitements, nous effectuons toujours une étude pilote de taille réduite, afin de déterminer la nécessité de réaliser des études dose-réponse utilisant un grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de gêne possible. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance est exclue du protocole. Les souris sont hébergées à raison de 2 à 5 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant les expériences, les souris sont manipulées quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 24-72 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales. A la fin de certaines expériences nécessitant de prélever le cerveau avec fixation pour des analyses histologiques, les souris sont anesthésiées avant d'être perfusées, leur évitant toute détresse.
Choix des espèces
Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.
Rôle de la signalisation IL-2 dans le lymphocyte B dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris : l’Encéphalite Auto-immune Expérimentale (EAE).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection déclenchant une maladie proche de la sclérose en plaques, subissent jusqu'à quatre prélèvements sanguins éveillées puis un prélèvement de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Le porteur indique que la maladie provoque une paralysie progressive évaluée sur une échelle de 0 à 6, les animaux dépassant un point limite étant tués. Il étudie le rôle d'une molécule immunitaire, bénéfice renvoyé au conditionnel, et affirme que le recours à l'animal est "nécessaire" faute de modèle in vitro reproduisant le microenvironnement.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire qui attaque le système nerveux central et pour laquelle il n'existe pas de traitement curatif. C'est la principale cause de handicap non traumatique chez les jeunes adultes. Le dérèglement du système immunitaire est impliqué dans cette maladie. Dans ce projet nous nous intéressons au role de l'IL-2 dans le controle des populations lymphocytaires B et les réponses immunes dans le contexte pathologique de la sclérose en plaques. L'objectif est de démontrer, dans un modèle de maladie chez la souris: l'Encéphalite Auto-immune Expérimentale (EAE), le lien entre l'IL-2 et le role des cellules B dans le developpement de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, cela pourrait permettre une meilleure compréhension des risques accrus de développer la sclerose en plaques et envisager le développement de thérapies ciblant l’expansion de cellules régulatrices avec l'IL-2.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une injection sous cutanée du peptide immunogène (336 souris). La procédure dure 5 minutes par souris (temps d'anesthesie et d'injection). Des prelevements sanguins sur ces animaux vigiles seront réalisés pour le suivi immunologique, maximum 4 prelevements par animal distants au minimum de 5 jours. La procédure de prelevement dure maximum 3 minutes par animal. Un prélèvement unique de LCR sera réalisé sur ces animaux avant mis à mort de ceux-ci (15min).
Impact sur les animaux
La procédure 1 entraînera une paralysie progressive des animaux suite aux injections des agents déclenchant la maladie. Les symptômes seront évalués sur une échelle de 0 à 6 et des actions adaptées seront mises en œuvre pour soulager l'inconfort selon le score établit. Tout au long de l’étude, un suivi rigoureux du bien-être animal sera également effectué. Si l'un des points limites décrits dans ce projet est atteint, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
Les animaux seront mis à mort selon une méthode autorisée.
Remplacement
Lors de nos précédents travaux nous avons utilisé un modèle de culture in vitro pour étudier l’effet de l’IL-2 sur le lymphocyte B. Cependant, l’étude des réponses immunes par le biais de cultures in vitro reste difficile car ces réponses sont étroitement liées à la présence d’un microenvironnement (cellulaire et moléculaire) qui ne peut être reproduit in vitro. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour déterminer l’implication de l’IL-2 dans le devenir des lymphocytes B au cours de réponses auto-immunes. Aucun autre modèle ne permet d'étudier la sclérose en plaque et le role du système immunitaire dans cette maladie.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été réduit au strict minimum nécessaire à une interprétation statistiquement significative des résultats. Les statistiques seront réalisés à l'aide de tests non paramétriques, le test de Mann et Whitney sera appliqué pour deux échantillons et celui de Kruskal et Wallis pour un nombre quelconque d'échantillons. Les expérimentations sont mises en place de manière à extraire le plus d'informations possible sur le même animal, notamment en analysant plusieurs tissus.
Raffinement
Les animaux seront surveillés et suivis quotidiennement. Une grille précise d'évaluation sera utilisée. Les souris seront élevées dans des conditions adaptées : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture au sol dans la cage pour favoriser l'hydratation et l'alimentation. Les animaux qui ont contracté l'EAE présenteront des déficits moteurs significatifs, les cages comporteront donc des refuges et des matériaux de nidification adéquats. L'inconfort provoqué par la maladie sera soulagé quand cela est possible (vidange de la vessie, hydratation par injection, séparation des souris pour éviter les traumatismes et assurer l'accès à la nourriture). Le modèle EAE étant dépendant du stress, les souris ne seront manipulées que par un nombre réduit de personnes parfaitement formées, les cages changées au moment du suivi des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier les maladies auto-immunes et inflammatoires mettant en cause un déréglement du système immunitaire. L'utilisation de souris modifiées pour un acteur de la communication cellulaire et dans lesquelles sera induit la maladie mimant la sclérose en plaque permettra d'étudier l’implication de la protéine IL-2 dans les mécanismes physiopathologiques de la maladie. Le système immunitaire étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des expérimentations seront menées sur des animaux adultes (8-12 semaines).
Évaluation du potentiel anti-obésité d’un composé ciblant le récepteur à l’Acide gamma amino butyrique de type B (GABAB))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras pendant douze semaines, reçoivent un composé par gavage oral et subissent des prélèvements sanguins lors de tests de tolérance au glucose, avant une mise à mort pour analyser sang et tissus. Le porteur reconnaît un isolement en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire, compensé selon lui par le rapprochement des cages. Il teste un candidat médicament anti-obésité et affirme qu'il "n'existe pas d'autre alternative" que l'animal, un modèle informatique étant selon lui impossible.
Objectifs
Contexte : Pour les autorités réglementaires, la prévention de l'obésité d'origine alimentaire chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. Nous allons utiliser un modèle d’obésité d’origine alimentaire, des souris seront rendues obèses par exposition à un régime riche en graisse (RRG), dans lequel les lipides représentent 60% de l’apport calorique, les animaux seront mis en contact avec cette alimentation pendant 12 semaines avant de débuter le traitement.
Bénéfices attendus
L’obésité est un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Actuellement, plus de 300 millions de personnes sont obèses et ce nombre ne cesse de s’accroître. Ces patients ont un risque accru de développer des pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et plusieurs types de cancers. Soigner l’obésité permettrait ainsi de réduire de manière significative l’incidence de toutes ces maladies associées. Malheureusement, les traitements existants à l’heure actuelle sont peu efficaces et les régimes hypocaloriques ne conduisent qu’à une perte de poids temporaire, suivie très fréquemment par un retour rapide au poids initial dès la fin du régime (phénomène dit de « yo-yo »). Seule une intervention chirurgicale associant une réduction de la taille de l’estomac et une déviation de l’intestin est à ce jour efficace à long terme pour traiter l’obésité. Cependant, les risques et effets secondaires liés à cette chirurgie en font un choix de dernier recours réservé aux cas d’obésité les plus graves. Nous manquons ainsi de traitements qui permettraient une prise en charge efficace de la majorité des patients obèses tout en limitant les contraintes et effets secondaires. Ce type d’étude permettrait de découvrir de nouvelles pistes de traitement pharmacologique.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront potentiellement réalisés lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, si le composé montre une efficacité à diminuer le poids corporel des animaux obèses. Les quantités de sang prélevées sont minimes et correspondent à moins de 1% du volume sanguin total. L'acte en lui-même n'est pas douloureux.
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte pour nous permettre de pouvoir quantifier la consommation de nourriture, afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux lors des différents actes expérimentaux (gavage, RMN, test de tolérance …), nous allons habituer les animaux aux expérimentateurs et à l’acte lui-même quand cela sera possible (habituation au gavage une semaine avant le début du traitement). De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.
Remplacement
Pour évaluer l'efficacité d’une nouvelle thérapie pour lutter contre l’obésité, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale, le niveau de complexité d’une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que les nombreux mécanismes biologiques qui contrôlant la balance énergétique restent inconnus. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé́ en se basant sur notre expérience ultérieure et en utilisant un estimation mathématique adapté. Les résultats seront analysés en utilisant des tests statistiques appropriés.
Raffinement
1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 18 semaines (10 semaines de RRG chez l’éleveur). Ils seront manipulés pendant 2 semaines, une semaine d’habituation générale à la manipulation des animaux (mesure du poids corporel et de la prise alimentaire) et 1 semaine d’habituation à l’administration par gavage oral. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs et aux procédures qui seront pratiquées tout au long de l'étude. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et permettent de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris arriveront à l’âge de 18 semaines dans notre animalerie, et nous commencerons un traitement de 4 semaines à partir de l’âge de 20 semaines (deux semaines d’habituation). Nous allons étudier l’effet d’un composé sur des animaux obèses, pour cela nous avons besoin que les animaux soient en contact avec le RRG pendant un minimum de 12 semaines (début du RRG chez des animaux adultes et âgés de 8 semaines).
Etude, chez le rat à microbiote humain, des flux microbiens et de l’impact sur la santé de produits laitiers fermentés (yaourts et fromages) fabriqués à partir de lait de vaches issues d’élevages agro-écologique ou intensif.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nés sans flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de volontaires humains, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires, un passage isolé de 24 heures en chambre respiratoire et une contention en tube pour mesurer leur composition corporelle, avant autopsie. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel et le gavage sont sources de stress, tout en les présentant comme brefs. L'objet du projet est de comparer l'effet sur la santé de yaourts et fromages issus d'élevages "agro-écologique ou intensif", et il affirme un "recours absolu" au modèle animal.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si des produits laitiers fermentés (yaourts et fromages affinés) fabriqués à partir de lait de vaches élevées en système agro-écologique ou intensif, impactent différemment la santé du consommateur
Bénéfices attendus
Le projet vise à faire la preuve de concept de la divergence de qualité de différents produits laitiers (fromages affinés ou laits fermentés) fabriqués à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif et des conséquences positives ou négatives respectives sur la santé du consommateur
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, 3) Le passage dans les chambres respiratoires, qui permet de mesurer les gaz excrétés par les animaux (H2, CO2 et CH4), est réduit à son minimum de 24h et enfin 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de ce projet des volontaires sains, l'alimentation est, de plus, adaptée, n'entrainant pas de troubles digestifs ou de croissance. La supplémentation, basée sur des produits laitiers fermentés de consommation courante, n'entraine pas non plus de nuisance ou d'effets indésirables pour les animaux. Cependant le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Le placement des animaux en cage individuelle peut occasionner un stress lié à la découverte d'un nouvel environnement et à l'absence de congénaire. Bien que les animaux s'adaptent rapidement, une surveillance accrue sera mise en place pendant toute la durée de la procédure pour détecter d'éventuels signes de mal être. Si des signes apparaissent et persistent pendant les 3 premières heures du passage en chambre respiratoires, les animaux retourneront dans leurs hébergements d'origine. Ce stress est limité par le temps de passage dans les chambres respiratoires réduit à son minimum (24h) et des enrichissements type Sizzle Nest sont également ajoutés à l'environnement pour permettre la réalisation de nid par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’évaluation de l’impact santé de produits laitiers fermentés étudiés (yaourts et fromages produits à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif) nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ces produits sur l’intégrité intestinale (perméabilité, immunité) et la santé cardio-métabolique (masse grasse, tissus adipeux et hépatiques) chez l’homme. Ceci nécessite en effet une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.
Raffinement
Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles et le passage en chambre respiratoire. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles. De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 8 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.
Modulation GABAergique et cholinergique du circuit hippocampique en condition vigile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une craniotomie avec injection intracérébrale et pose d'une barre pour être enregistrées tête fixée pendant qu'elles sont éveillées, un conditionnement comportemental, puis une mise à mort par perfusion transcardiaque. Le porteur reconnaît un maintien en cage individuelle qui prive ces animaux grégaires de relations sociales, ainsi qu'un risque infectieux et l'inconfort du réveil après la chirurgie. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du cerveau présentée comme un "intérêt sociétal considérable", et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut simuler la cognition.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre comment une structure clé de l'encodage de l'information spatiale et de la mémoire épisodique (l'hippocampe) est contrôlée par des catégories de neurones spécifiques, locaux (interneurones) ou issus de sa principale structure afférente modulatrice (le septum médian). Il s'inscrit dans l'objectif plus général de comprendre les propriétés des réseaux neuronaux qui sous-tendent l'encodage, le traitement et le stockage des informations ainsi que les déficits cognitifs associés aux principales pathologies cérébrales (neurodéveloppementales, neurodégénératives, épilepsie), sur des modèles expérimentaux chez le rongeur (souris).
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs et implantation d'une barre pour enregistrement en mode tête-fixée chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure comportementale expérimentale (enregistrements en mode tête fixée chez l'animal vigile) par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 2 à 4 semaines), et enfin anesthésie terminale (perfusion transcardiaque), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.
Impact sur les animaux
Les dommages suivants : - l'élevage d'animaux normaux et transgéniques (mais sans phénotype dommageable) - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - les animaux doivent être maintenus en cage individuelle pendant la periode expérimentale, entrainant un déficit de relations sociales chez des espèces grégaires - du conditionnement comportemental afin de caractériser les réseaux neuronaux pendant la résolution de tâches cognitives et d'états cérébraux contrôlés - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'injecter des constructions virales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation).
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Le nombre d'animaux nécessaires pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences est ici de 182 souris.
Raffinement
Les animaux utilisés sont des souris transgéniques, qui expriment un marqueur moléculaire permettant de cibler spécifiquement les neurones du type d'intérêt, et de leur faire exprimer des molécules nous permettant de contrôler expérimentalement leur niveau d'activité. Il devient ainsi possible de tester des hypothèses quant au rôle de ces neurones dans le circuit de façon causale (que se passe t'il quand ces neurones sont expérimentalement activés ou au contraire bloqués) et non plus seulement corrélative (quand ces neurones sont ils actifs). Les marqueurs moléculaires spécifiques des lignées utilisées n'ont pas d'incidence sur la physiologie, en dehors des strictes périodes de manipulation de l'activité des neurones, et le phénotype des animaux est donc sans conséquence sur leur bien être. Des éléments de distraction (les animaux sont élevés en cages collectives, autant que possible, selon des normes qui respectent leur besoin d'interactions sociales, et le milieu est enrichi avec du matériel de construction du nid) sont introduits dans les cages d'élevage pour pallier à la monotonie des conditions d'élevage en laboratoire. Pour prévenir, détecter et corriger les conditions de mal-être éventuel, les animaux sont suivis de façon très régulière par du personnel spécialisé, formé et sensibilisé au bien-être animal.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. La souris est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-cirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.
Développement d’une approche radiomique basée sur l’imagerie scanner pour identifier les signatures radio-immunes dans des modèles orthotopiques de cancer ORL et pulmonaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la muqueuse orale ou, par incision du thorax, dans le poumon, puis subissent des irradiations et des séances d'imagerie scanner sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur ORL peut gêner l'alimentation et la tumeur pulmonaire la respiration, et prévoit des points limites déclenchant la mise à mort. Le projet vise à entraîner des algorithmes d'intelligence artificielle sur les images, retombées cliniques présentées au conditionnel, tandis qu'il affirme que l'étude de la réponse immunitaire exige un "organisme vivant entier".
Objectifs
L'avènement de l'immunothérapie a conduit à un changement de paradigme dans le traitement de plusieurs cancers solides et hématologiques, conduisant à des résultats impressionnants en termes de survie et de réponse tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond à l'immunothérapie, soulignant ainsi le besoin urgent de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L'infiltration immunitaire tumorale est un élément essentiel de la réponse immunitaire contre le cancer, conditionnant la réponse à l’immunothérapie. Le développement de stratégies non invasives pour quantifier cette infiltration immunitaire tumorale et prédire le résultat du traitement pourraient représenter une avancée majeure. Ce projet vise à développer et tester, dans des modèles tumoraux murins, une approche basée sur l’analyse d’images radiologiques (CT-scans) combinée à des méthodes d’intelligence artificielle pour développer des algorithmes prédictifs.
Bénéfices attendus
À l'ère de la médecine personnalisée, où les stratégies thérapeutiques sont de plus en plus adaptées aux profils spécifiques des patients et des tumeurs, le développement d’algorithmes prédictifs pourrait représenter un outil précieux d'aide à la décision, guidant la prise en charge des patients atteints de cancer. La possibilité de déchiffrer de manière non invasive le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement, par le biais de signatures radio-immunes, pourrait impacter de façon majeure la pratique clinique. De plus, l’opportunité de suivre dynamiquement et "en temps réel" l’infiltration de cellules immunitaires peut nous permettre de proposer de nouveaux traitements sur mesure. Cela pourra améliorer l’efficacité des thérapies et réduire les chances d’échec thérapeutique, en sélectionnant les patients qui ont le plus de possibilités de répondre au traitement sélectionné et en arrêtant précocement des traitements inefficaces.
Procédures
Des injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, soit au niveau de la babine soit au niveau pulmonaire : - Les cellules tumorales seront injectées directement dans la muqueuse orale des souris préalablement anesthésiées, avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée < 5 min). - L’injection de cellules dans le poumon prévoit une petite incision chirurgicale à niveau du thorax de souris (sous anesthésie systémique) pour exposer la plèvre. L’injection sera effectuée travers la plèvre avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée max 20 min). Les irradiations seront faites sous anesthésie Kétamine/Xylazine (durée 15 min) Les imageries au micro-CT seront faites sous Kétamine/Xylazine ou Isoflurane (durée 15 min)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales. Des difficultés d’alimentation pour les souris avec une tumeur ORL sont possibles. Pour le modèle pulmonaire, la croissance de la tumeur peut engendrer une difficulté respiratoire. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur à son minimum. En effet, les animaux seront surveillés quotidiennement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales
Remplacement
Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie localisée combinée ou non à des immunomodulateurs sur le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement pour dévoiler des signatures radio-immunes. L’étude du recrutement et de la réponse des leucocytes dans la tumeur nécessite la présence d’un système immunitaire efficace dans un modèle dynamique (depuis la production des cellules dans la moelle osseuse, leur libération dans le sang, leur maturation dans les organes lymphoïdes secondaires, jusqu’au recrutement sur le site tumoral) qui ne peut pas être réalisée in vitro. Ceci met en jeu des interactions complexes nécessitant un organisme vivant entier. Les modèles murins sont imparfaits d’un point de vue purement biologique mais permettent d’étudier la réaction immunitaire anti-tumorale in vivo et ont l’avantage d’être d’une taille bien plus faible que chez l’humain, ce qui permet une inclusion en totalité des tumeurs et des tissus environnant pour une analyse histologique exhaustive. Cette inclusion en totalité ouvre une possibilité plus importante de mise en correspondance spatiale d’images histologiques et radiologiques, non réalisable en clinique, et apportera des éléments concrets quant à la réalité biologique d’hypothèses faites depuis plusieurs années en clinique. De plus, des modèles murins permettant la modulation in vivo de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires (par exemple la déplétion vs l'enrichissement en CD8) au sein du microenvironnement immunitaire tumoral pourraient renforcer la signification biologique de notre signature radiomique. Nous envisageons pour cela un traitement personnalisé incluant radiothérapie et agents immunomodulateurs (par exemple anti-TGF beta, anti-CD8) capables d'agir sur la contexture immunitaire tumorale.
Réduction
La génération d’un algorithme prédictif et pronostique par deep learning nécessite l’analyse d’un large set de données. En effet, cela est nécessaire pour un bon entraînement des algorithmes de prédiction. De plus, il est nécessaire d’utiliser une cohorte indépendante sur laquelle tester l’efficacité des algorithmes développés. Il n’existe aucune donnée dans la littérature concernant des analyses radiomiques dans des modèles tumoraux murins. Notre estimation de 50 souris par groupe est donc basée sur des observations cliniques et sera adaptée sur la base des données obtenues pendant la réalisation du projet. En outre, les modèles murins que nous utiliserons ont déjà été testés et validés dans de nombreuses publications, et la collaboration avec Gustave Roussy nous permettra d'avoir des modèles déjà testés et performants, minimisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Les animaux seront anesthésiés pour les procédures d’injection des cellules tumorales, d’irradiation et d’imagerie. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton ou des nids en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites seront strictement appliqués. - Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de pois, prostration) seront évalués 3 fois par semaine (euthanasie des souris dès qu’un point limite est atteint). -Un complément alimentaire (Renutryl, Nestlé) sera administré aux souris pour limiter les effets de l'asthénie et de l'irradiation. - Des aliments mous (pellets ramollis d’eau) pourront également être mis dans les cages pour faciliter l’alimentation des animaux
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures. De plus, les modèles tumoraux ORL et pulmonaire ont été développés et caractérisés en utilisant des souris de cet âge, et nous allons maintenir ces mêmes paramètres pour cette étude.
Mise au point du modèle d’ischémie/reperfusion cérébrale chez la souris : Rôle de nouveaux gènes et identification de cibles thérapeutiques d’intérêt dans l’ischémie cérébrale.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 230 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chez ces dernières, un monofilament siliconé bouche une artère cérébrale pendant une heure pour provoquer un accident vasculaire, avant 24 heures de reperfusion puis la mise à mort pour mesurer la zone du cerveau détruite. Le porteur décrit une paralysie possible, une prostration et une hypothermie, les souris les plus atteintes selon l'échelle neurologique étant alors tuées, et 40 autres subissent un prélèvement de sang terminal sans réveil. Il affirme que les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier le rôle des gènes dans un "système intégré" et juge le recours à la souris "indispensable".
Objectifs
En France, les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap acquis de l’adulte et la seconde cause de démence. Dans plus de 80% des cas, les AVC résultent de l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot sanguin ou thrombus. On parle alors d’« AVC ischémique » ou « infarctus cérébral ». La principale cause de ces AVC reste l'athérosclérose qui se définit comme une accumulation de dépôts de cholestérol sur les parois des artères. Ces dépôts durcissent et forment des plaques d'athérome qui favorisent la formation du caillot. L’élimination du caillot devient alors une priorité pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale reste une pathologie complexe à explorer chez l’homme. Les modèles in vivo ont pour objectif de reproduire, chez l'animal, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet alors de pouvoir tester plus facilement des hypothèses physiopathologiques et déterminer des stratégies thérapeutiques potentielles pour les patients atteints d’accident vasculaire cérébral. Pour ce projet, nous allons donc utiliser un modèle mis en place et développé chez le rat puis adapté à la souris. Ce modèle, reconnu pour être fiable et reproductible, est un modèle d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (tOMCA), par insertion, pendant 1 h, d’un monofilament siliconé au niveau de l’artère cérébrale moyenne. Après 24 h de reperfusion, la taille de l’infarct sera évaluée. La mise au point et la validation de ce modèle nécessiteront l’utilisation de 80 souris au maximum. Nous pourrons ensuite étudier le rôle de différents gènes potentiellement impliqués dans la formation du thrombus (jusqu’à 5) en mesurant la taille de la zone cérébrale infarcie dans des souris avec délétion ou mutation des ces gènes d'intérêt. Nous prévoyons d’utiliser 30 souris par mutation, soit 150 souris pour 5 gènes. Les premières mutations étudiées portent sur des gènes jouant un rôle important dans la régulation de l’agrégation plaquettaire. Des prélèvements sanguins seront donc réalisés pour évaluer cette fonction chez nos souris (besoin de 40 souris). Pour la réalisation de ce projet, 270 souris au maximum seront donc utilisées
Bénéfices attendus
Les accidents vasculaires cérébraux ischémiques (80% des AVC) résultent de l’occlusion d’une artère cérébrale par un thrombus (caillot sanguin) qui empêche le cerveau d’être alimenté en oxygène par une circulation sanguine normale. Ce type d’accident vasculaire est favorisé par les facteurs de risque cardio-vasculaires comme le tabagisme, l’hypercholestérolémie ou le diabète. Les accidents ischémiques cérébraux provoquent des dommages cérébraux parfois irréversibles, pouvant conduire, lorsque les lésions sont étendues, au décès. Il s’agit donc d’une urgence médicale absolue : le caillot doit être éliminé le plus rapidement possible pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale, en dépit de sa grande fréquence, reste une pathologie complexe à explorer, de par son hétérogénéité clinique mais aussi de par ses interactions possibles avec les nombreux facteurs de risque cardio-vasculaires. Ceci explique les difficultés à aborder, chez l'homme, les nombreux mécanismes physiopathologiques et/ou à identifier des cibles pharmacologiques potentielles de la pathologie ischémique cérébrale. Ces faits ont conduit à développer de nombreux modèles expérimentaux d'ischémie cérébrale chez le rat dans un premier temps, pour les adapter ensuite à la souris transgénique. Les modèles in vivo ont donc pour objectif de reproduire chez l'animal, dans un contexte physiologique proche de celui de l'homme, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet ainsi de tester des hypothèses physiopathologiques et d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Procédure 1: prélèvement terminal de sang en veine cave sur animaux anesthésiés (40 souris au maximum). Procédure 2: modèle d'ischémie/reperfusion réalisé sur 230 souris. L'ischémie transitoire est induite pendant 1h et la reperfusion se fait sur 24h. A l'issue, les animaux sont sacrifiés pour évaluer la taille de la zone infarcie.
Impact sur les animaux
Ce modèle d'occlusion transitoire induit des infarctus plus ou moins sévères qui se traduisent par une mortalité importante si le temps d’occlusion de l’artère est supérieur à 3h. Dans notre étude, le temps d’occlusion n’excèdera pas 1h, limitant ainsi la taille de l’infarct et les éventuelles complications. Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h après la reperfusion . Cette évaluation confirme le succès de la tMCAO post-AVC et détermine l'efficacité de la tMCAO post-reperfusion. Pour une occlusion d’1h, les souris devraient présenter au moins un léger enroulement cohérent (neuroscore 2) et selon la littérature, les déficits neurologiques sont généralement stables jusqu'à 72 heures. Un neuroscore de 4 ou 5 entrainera une mise à mort de l’animal par injection IP d’un bolus d’Euthasol. Les principales complications liées à ce modèle expérimental sont : risque d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, déplacement du fil induisant un risque d’hémorragie sous-arachnoïdienne par rupture vasculaire ou encore reperfusion diminuée liée à l’altération de la paroi carotidienne. La souris , prostrée, dos voûté, poils hérissé, et probablement en hypothermie, sera alors mise à mort. Pour les autres souris, la taille de l'infarct sera évaluée histologiquement après 24h de reperfusion.
Devenir
Procédure 1: Prélèvement de sang en veine cave: procédure sans réveil car nous avons besoin d'une grande quantité de sang pour étudier l'agrégation plaquettaire. Procédure 2 d'ischémie/reperfusion: les souris sont gardées en vie pendant 24h. Après 24h de reperfusion, l'animal est mis à mort pour prélever le cerveau et évaluer la taille de la zone infarcie
Remplacement
Les modèles in vitro disponibles à ce jour ne permettent malheureusement pas l’étude de l’implication de gènes dans un système intégré. Le recours au modèle animal reste ici indispensable pour nous permettre de cibler rapidement et efficacement les gènes ayant un impact positif sur la taille de l’infarctus.
Réduction
Quand ce sera possible, les souris contrôles serviront à l’étude de plusieurs gènes. Le modèle sera alors mis en place par des personnes expérimentées et un protocole analgésique adapté sera mis en place sur toute la durée du protocole pour limiter toute souffrance de l’animal.
Raffinement
Les animaux sont stabulées dans des conditions standards d’animalerie, avec dans la cage nourriture à volonté et milieu enrichi (frisottis ou dôme). Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h , selon une échelle en 6 points. Si l’atteinte neurologique est trop importante, l’animal sera alors exclu de l’étude.
Choix des espèces
Ce modèle d'AVC ischémique a tout d’abord été mis au point chez le rat. En raison de la disponibilité de souris génétiquement modifiées permettant d'analyser le rôle physiopathologique et/ou l'intérêt thérapeutique de gènes candidats, ce modèle a également été développé chez la souris. Pour l'étude de la physiologie et la physiopathologie du système cérébro-vasculaire, il est fondamental de prendre en compte l’ensemble des systèmes régulateurs de façon intégrée. Malheureusement, il n’existe pas, à ce jour, d’approche expérimentale in vitro ou in silico apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques ne faisant pas appel à l’expérimentation animale. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude des gènes identifiés en amont. De plus, nous disposons déjà du modèle de souris Arhgef1, premier gène que nous étudierons dans le cadre de ce projet Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes âgés entre 2 et 4 mois.
Génération de modèles de souris transgéniques la technologie par CRISPR / Cas9 combinée ou pas à un transgène
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
1366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1128 femelles reçoivent un traitement hormonal par deux injections pour produire des embryons, 178 autres subissent une chirurgie de réimplantation au niveau de l'oviducte et 60 mâles une vasectomie, l'ensemble servant à fabriquer de nouvelles lignées génétiquement modifiées à la demande d'équipes de recherche. Les mâles vasectomisés sont tués six à douze mois après l'opération, les femelles au moment du sevrage des portées. Le porteur affirme que seul un "organisme intégré" permet d'étudier les interactions entre cellules et tissus et présente ces souris transgéniques comme des "modèles indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste à développer de nouvelles lignées de souris transgéniques pour permettre aux chercheurs d’avoir les outils les plus adaptés à leurs études. La première étape de ce projet est de vérifier que cette lignée de souris transgéniques n’est pas disponible dans une banque internationale ou dans un laboratoire académique. En cas d’indisponibilité, le modèle de souris transgénique est alors créé dans notre service par transgénèse aléatoire ou par la technologie CRISPR/Cas9.
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes (Bradley et al., 2012, Meehan et al., 2017).
Procédures
Pour obtenir un grand nombre d’embryons, les 1128 femelles donneuses reçoivent un traitement hormonal qui consiste en 2 injections intra-péritonéales à 48h d’intervalle. Ces injections sont réalisées sur animal vigile. Les embryons sont ensuite manipulés génétiquement puis réimplantés dans 178 femelles receveuses (=mères porteuses) au niveau de l’oviducte qui est un conduit reliant l'ovaire à l’utérus, Ces femelles receveuses sont produites en accouplant des femelles avec des males vasectomisés c’est-à-dire rendus stériles. Pour obtenir ces mâles vasectomisés, 60 males subissent une chirurgie qui consiste à couper les canaux qui permettent aux spermatozoïdes de sortir du testicule. La réimplantation et la vasectomie requièrent une chirurgie qui est réalisée sous une anesthésie générale induite par une injection intra-péritonéale d’un complexe anesthésique. L’anesthésie de ces 238 animaux (178 femelles receveuses + 60 mâles vasectomisés) dure en moyenne 20 minutes. Une prise en charge de la douleur est systématiquement effectuée par une injection intra-péritonéale d’un anti-inflammatoire non stéroïdien Pour une récupération de meilleure qualité après l’anesthésie et la chirurgie, une injection sous cutanée d’une solution de réhydratation est réalisée sur les animaux opérés. Pour éviter l’hypothermie, le réveil se fait sur un tapis chauffant. Un apport de graines de tournesol et d’une nourriture enrichie en matières grasses permet d’augmenter les bien-être des femelles opérées. Il favorise ainsi un meilleur développement des gestations et une lactation de meilleure qualité pour la prise en charge des nouveaux nés L’ensemble de ces approches technologiques permettent de générer des modèles de souris transgéniques pour l’étude de mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire, le cancer ou dans des maladies immunitaires, par les équipes de recherche.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : 1- ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’hormone. La durée des effets indésirables est limitée au moment de l’injection. 2- ceux liés à des petites chirurgies abdominales. La durée des effets n’excédera pas 24 heures.
Devenir
Vasectomie : Les mâles sont conservés pendant la période de leur plus forte activité sexuelle et seront euthanasiés 6-12 mois après leur vasectomie (selon leur aptitude d’accouplement scorée). Après 8 accouplements sans bouchon vaginal, le mâle est euthanasié. Superovulation des femelles donneuses Les femelles superovulées qui présentent un bouchon vaginal sont euthanasiées pour la récupération des embryons Toutes les femelles sans bouchon vaginal sont réutilisées pour une deuxième injection d’hormones, 2-3 semaines plus tard. Réimplantation d’embryons L’ensemble des femelles réimplantées sont euthanasiées au moment du sevrage des naissances.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de des bases de données (études in silico ) et des modèles in-vitro ( culture de cellules , organoïdes…) . En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Les nouveaux outils technologiques tel que l’électroporation combinée à des nucléases toujours plus performantes et des ARN guides commerciaux plus stables (IDT ; Synthego) ont permis de diminuer par un facteur 2 le nombre de séances nécessaires à l’obtention de modèles Knock-Out et de petits Knock-In. Le nombre de naissance a été augmenté en changeant notre approche pour la réimplantation. Une réimplantation bilatérale sur une femelle unique est désormais effectuée en routine (Mahabir E et al 2018) Pour les grands Knock-In, un test d’efficacité de coupure des ARN guides est effectué sur un test in-vitro. Une analyse sur blastocyste unique est réalisée et permet d’éviter d’avoir recours à des femelles réimplantées et des naissances. À la suite de ces tests, une séquence d’ARN guide est choisie. Le plasmide donneur sera alors élaboré en fonction des résultats de ce test. L’expérimentation in-vivo (Injection des embryons avec mélange contenant le plasmide donneur / ARN guides / Cas9) sera alors réalisée avec réimplantation des femelles pseudogestantes.
Raffinement
L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale. Injection IP d’un mélange Xylazine (7.5mg/kg), kétamine (40 mg/kg) et flunitrazépam (0.5 mg/kg) dans du NaCl 0.9%, à raison de 50 μL pour 10g. Ce mélange permet une anesthésie assez longue et profonde ce qui permet de réaliser l’opération dans de bonnes conditions pour l’animal. L’effet analgésique de la Xylazine est utilisé pour soulager la douleur. En complément à la Xylazine, une injection de Rimadyl est effectuée pour une meilleure prise en charge de la douleur. A la fin de l’intervention avant de refermer la paroi musculaire, du Carprofène (Rimadyl) est administré dans la cavité abdominale à raison de 1mg/ml dans NaCl 0.9% à raison de 100µl pour 20g de souris.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée (superovulation efficace et embryons faciles à injecter) Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. En fond mixte B6D2 (C57BL6 x DBA/2), les femelles donneuses ont 8 semaines ce qui permet une quantité et une qualité optimale des embryons. En revanche pour un fond pur C57BL6/J ou N, les femelles ont 4 semaines pour l’obtention d’un plus grand nombre d’embryons avec une qualité correcte. Nous utilisons femelles pseudogestantes NMRI entre 8 et 24 semaines. Les mâles stériles NMRI (vasectomisés) utilisés pour les accouplements ont entre 2 mois et 12 mois.
Mise en place d’un modèle d’insuffisance cardiaque post infarctus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
127 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature d'une artère du cœur reproduisant un infarctus, la pose d'un implant abdominal puis une chirurgie du thorax pouvant durer jusqu'à 140 minutes, avec six échographies et six prélèvements sanguins sous anesthésie, avant la mise à mort jusqu'à seize semaines plus tard pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'une insuffisance cardiaque doit se développer après la seconde opération et prévoit des points limites en cas de souffrance qu'il ne pourrait soulager. Les retombées annoncées, mieux comprendre la maladie et évaluer des médicaments développés par des entreprises pharmaceutiques, restent au conditionnel et à long terme, tandis qu'il affirme que suivre la fonction cardiaque sur plusieurs semaines exige un "organisme entier".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque touche près d’un million de personne en France et on lui attribue 70 000 décès par an. L’insuffisance cardiaque se traduit par un remodelage du tissu cardiaque associé à des dysfonctions cardiaques. Outre une lourde mortalité (50% à 5ans après l’apparition des premiers symptômes), cette pathologie se traduit également à terme par des symptômes parfois invalidants et des hospitalisations longues et récurrentes. Les insuffisances cardiaques surviennent en très grande majorité dans les suites d’un infarctus du myocarde aigu et sont souvent associées à un remodelage cardiaque délétère. Plusieurs pistes de traitement sont à l’étude mais des efforts majeurs en ce sens restent à entreprendre. L’objectif de ce projet est d’adapter notre modèle de ligature transitoire de l’une des artères principales du coeur (mimant un infarctus du myocarde), afin de développer et caractériser un modèle murin d’insuffisance cardiaque post infarctus. Ce modèle devrait permettre, à terme, de mieux comprendre l’évolution de cette pathologie et de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux traitements médicamenteux, actuellement développés par les entreprises pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
L’insuffisance cardiaque est une pathologie à forte incidence (2,3% de la population adulte française) et aux conséquences lourdes (hospitalisations multiples, syndromes invalidants). Notre projet vise à caractériser un modèle murin d’insuffisance cardiaque, nous permettant à court et moyen terme d’étudier les mécanismes impliqués dans cette pathologie et proposer à terme des cibles thérapeutiques pertinentes et tester l’efficacité de molécules thérapeutiques nouvelles (études précliniques).
Procédures
Selon les groupes expérimentaux, les animaux suivront l’un des parcours suivants : 1) Deux chirurgies, espacées de 14 jours, seront réalisées sur l’animal, sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée (durée : environ 20mn et 140mn maximum respectivement) : la première chirurgie implique la pose d’un implant dans l’abdomen et la seconde chirurgie implique une chirurgie au niveau du thorax. Le suivi des animaux implique 6 examens échographiques (20-30 minutes chaque examen) et 6 prélèvements sanguins (1 minute chaque prélèvement), sous sédation ou anesthésie générale, répartis tout au long de l’expérimentation (à 6 reprises). L’animal est mis à mort au plus tard 16 semaines après l’infarctus pour le prélèvement et l’analyse du tissu cardiaque. 2) Une chirurgie unique, impliquant une chirurgie au niveau du thorax est réalisée sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée (durée de 140mn maximum). La mise à mort est réalisée 48h plus tard (sous anesthésie et analgésie), après un rapide examen échographique (10mn, sous anesthésie et analgésie), pour permettre le prélèvement et l’analyse du tissu cardiaque.
Impact sur les animaux
Les chirurgies sont réalisées intégralement sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée, impliquant l’injection de substances en sous-cutané et une mise sous respirateur (pour la seconde chirurgie). Les animaux sont réveillés en fin de chirurgie, impliquant des soins post-opératoires adaptés aux gestes réalisés. Un délai de 15 jours entre les deux opérations permet un rétablissement complet de l’animal avant la seconde opération. Les examens échographiques (non invasifs) et prélèvements sanguins sont réalisés sous sédation ou anesthésie générale selon l’examen. Pour les groupes d’animaux avec infarctus, le développement d’une insuffisance cardiaque est attendu après la seconde chirurgie. Des points limites sont donc établis en conséquence pour permettre d’interrompre l’expérimentation en cas de douleur/stress/angoisse/dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou soulager.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation, avec prélèvement du cœur pour mesures de la taille d’infarctus ou analyses tissulaires (selon les groupes expérimentaux).
Remplacement
L’insuffisance cardiaque post-infarctus est une pathologie complexe que les méthodes alternatives actuelles ne permettent pas de simuler dans son ensemble. Aussi, réaliser un suivi de paramètres tels que l’activité électrique cardiaque, la fonction cardiaque ou la température corporelle, sur plusieurs semaines d’évolution de la pathologie nécessite le recours à un organisme entier. Il s’agit enfin ici de la mise en place d’un modèle chirurgical animal d’étude de l’insuffisance cardiaque nécessitant par essence le recours à l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - Les approches chirurgicales et la compatibilité entres les méthodes de chirurgie, de mesures et d’imagerie seront au préalable validés sur des cadavres d’animaux mis à mort dans le cadre d’autres projets. - Les procédures seront réalisées de manière successive pour une validation par étape, limitant ainsi le nombre de tests et de groupe d’animaux au strict minimum nécessaire. - L’adaptation d’un protocole d’infarctus du myocarde déjà éprouvé au laboratoire nous permet de pouvoir comparer les résultats obtenus à nos données historiques, nous affranchissant d’avoir recours ici à des animaux pour l’un des groupes d’intérêt de ce projet. - Certains groupes seront réalisés en 2 sessions décalées : la première session comportera 2/3 des effectifs de chaque groupe. La seconde session (1/3 restant, au maximum) ne débutera qu’après analyse des résultats complets de la première session. De cette manière, l’interprétation des résultats de la première session nous permettra d’adapter au plus juste l’effectif et le sexe des animaux de la seconde session. Les effectifs ont été calculés afin d’obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
- Le présent projet doit permettre de valider une approche chirurgicale moins invasive que la méthode classique utilisée dans les études antérieures. C’est une approche que nous souhaitons pouvoir ainsi appliquer à nos futurs projets impliquant un infarctus du myocarde. - Le suivi de la température corporelle et de l’activité électrique cardiaque à l’aide d’un implant, en particulier en période post-opératoire, fournira des données importantes longitudinales supplémentaires sur l’état général des animaux en expérimentation. Ces données doivent nous permettre notamment d’optimiser nos conditions de réveil (température de la couveuse de réveil, timing d’extubation de l’animal, etc.) pour l’ensemble de nos projets impliquant un infarctus du myocarde.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires : Malgré certaines différences physiologiques telles qu’un rythme cardiaque plus rapide, la souris est en effet un modèle qui a fait ses preuves dans l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde et de la cardioprotection. La procédure chirurgicale d’infarctus du myocarde nécessaire pour induire une insuffisance cardiaque est par ailleurs maîtrisée au laboratoire, nous permettant de profiter d’un excellent retour d’expérience. A l’inverse, ce projet doit justement permettre de raffiner davantage notre modèle murin d’infarctus du myocarde utilisé par ailleurs dans d’autres projets. Les animaux participant à ce projet devront être de jeunes adultes (6 à 16 semaines) pour faciliter les examens échographiques : plus les os sont denses, plus ils gênent le passage des ondes ultrasonores, créant des « cônes d’ombre » sur les images échographiques, dont l’analyse peut alors s’avérer plus complexe.