Recherche fondamentale

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime gras pendant vingt-quatre semaines pour induire une obésité et une résistance à l'insuline, avec des injections répétées et des incisions de la queue pour prélever le sang, afin d'étudier le rôle de certains lipides dans la graisse brune. Le porteur relie ce travail au développement de thérapies nutritionnelles contre l'obésité humaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'"organisme entier" pour ces questions faisant intervenir plusieurs organes.

Objectifs

L’obésité (accumulation de masse grasse blanche appelée tissu adipeux blanc) est un problème de santé publique dû à un apport calorique trop important, à une sédentarité mais aussi à un déséquilibre dans les lipides ingérés, avec une consommation trop importante en lipides ω6 (huile de tournesol) par rapport aux lipides ω3 (huiles de poisson, colza). Selon les recommandations, un ratio adéquat de lipides ω6/ω3 inférieur à 5 devrait être trouvé dans l’alimentation or actuellement en France ce ratio dépasse 12 en moyenne. L’obésité induit une inflammation chronique responsable du développement de pathologies dites métaboliques comme le diabète de type 2. Une autre masse grasse existe en petite quantité chez l’homme, le tissu adipeux brun qui permet une dissipation de l’énergie ingérée sous forme de chaleur et limite ainsi l’accumulation de tissu adipeux blanc. Il a été montré que cette masse grasse brune est déficiente chez les personnes obèses. Enfin il a aussi été décrit que dans certaines conditions comme l’exposition au froid, du tissu adipeux brun pouvant apparaitre au sein de la masse grasse blanche et ce phénomène est appelé brunissement. À ce jour, il n'existe aucun traitement efficace de l'obésité et une perspective serait de développer des stratégies médicamenteuses ou nutritionnelles favorisant la formation du tissu adipeux brun ou favorisant le brunissement du tissu adipeux blanc. Nous avons montré en culture qu’un lipide dérivé des acides gras ω6 empêchait le brunissement des adipocytes blancs. Des études, montrent qu’une alimentation riche en lipides ω3 contrôle les niveaux de ce lipide et ont des effets bénéfiques sur la santé. Il est ainsi possible d’envisager que ces effets bénéfiques puissent passer par une réactivation de la masse grasse brune du fait d’une diminution de ce lipide. Nous envisageons donc de soumettre des souris à une alimentation grasse avec un fort ratio ω6/ω3 pendant 12 semaines afin d’induire une obésité. Après 12 semaines, les animaux passeront à des régimes avec de faibles ou de forts ratio ω6/ω3 pendant 12 semaines supplémentaires. Nous vérifierons si ce changement alimentaire améliore l’obésité des animaux et l’inflammation associée et si ces effets sont sous-tendus par une augmentation de la masse grasse brune ou du brunissement de la masse grasse blanche. En parallèle nous doserons dans le sang et les tissus la quantité du lipide dérivé des ω6.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que ce travail nous permette de comprendre l’impact des lipides ω6 et ω3 dans le développement de la graisse brune et du brunissement de la graisse blanche, ouvrant la voie au développement de thérapies nutritionnelles pour lutter contre le surpoids/obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Les animaux recevront différents régimes pendant 24 semaines. Ils seront placés dans une armoire thermostatée à 30°C pour leur confort thermique. Lors des tests métaboliques aux semaines 12, 22 et 23, les animaux recevront des injections intrapéritonéales et auront des prélèvements (sur animaux vigiles) d'une goutte de sang à la queue. Concrètement, suite à une injection (durée max 5 secondes) de glucose (S12 et S22) ou d'insuline (S23), une légère incision (durée 1 à 2 secondes, une incision unique pour tout le test) est réalisée à la queue et une goutte de sang (5µL, il faut environ 3 à 5 secondes pour que la goutte de sang se forme à la queue par massage de celle-ci) sera prélevée à 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes pour doser la glycémie. Au cours de la dernière semaine (S24), les souris recevront une injection intrapéritonéale quotidienne (durée d'une injection max 5 secondes; 7 injections au total) d’un activateur adrénergique ou d'une solution saline. 10 minutes après la première injection, une goutte de sang sera pélevée (incision 1 à 2 secondes ; formation de la goutte 3 à 5 secondes) à la queue pour un dosage du glycérol, représentatif de l’activité lipolytique des tissus adipeux. Au total un même animal pourra recevoir au maximum 10 injections sur une période de 24 semaines et 195 µL de prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Dans le programme présenté les nuisances prédictibles pour l’animal sont liées 1) au régime riche en graisse qui induira l’obésité et l'insulinorésistance ; 2) aux douleurs provoquées par les injections intrapéritonéales qui sont nécessaires à différents stades de l’expérimentation pour réaliser les tests métaboliques et 3) aux prélèvements sanguins à la queue pendant ces mêmes tests métaboliques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Après 24 semaines de régime alimentaire, les animaux seront anesthésiés (injection intrapéritonéale), une analyse de la composition corporelle sera réalisée par tomographie (rayons X) et le sang sera prélevé. Les animaux seront ensuite mis à mort et le prélèvement d’un maximum de tissus/organes à la fin de la procédure sera réalisé. Les tissus seront pesés, une partie sera congelée pour les analyses ultérieures (ARN... ) et l’autre partie fixée pour des analyses histologiques. Notre programme vise à étudier l'impact de différents régimes alimentaires (ratio ω3/ω6), sur la fonction des tissus adipeux et sur le métabolisme insulino-glucidique qui implique de nombreux organes (tissus adipeux, foie, muscles, ...), ce qui nous contraint à mettre à mort les animaux afin d'accéder à ces organes.

Remplacement

Ce programme vise à découvrir les liens qui existent entre composition alimentaire en lipides (ratio ω3/ω6), fonction des tissus adipeux blancs, bruns et brites et l’insulino-résistance ou le diabète de type 2. Ces processus pathologiques complexes touchent la régulation du métabolisme insulino-glucidique et impliquent de nombreux organes dont le pancréas, le foie, les tissus adipeux et les muscles. Il n‘existe pas pour l’instant de modèle in vitro qui pourrait remplacer l‘expérimentation sur un organisme entier pour répondre aux questions posées ici. De plus ces expériences font suite à de nombreuses expériences menées in vitro sur des cellules en culture qui ont permis de cibler les hypothèses les plus pertinentes à poser in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un nombre minimum d’animaux. Nous débuterons par des groupes de 8 souris mâles (72 souris au total) puis nous réitérerons l’expérience par des groupes de 8 souris femelles (72 souris au total) et 4 souris par cage. Le nombre total de souris (cf. ci-dessus) nous permettra d’obtenir en quantité suffisante tous les échantillons tissulaires nécessaires à notre étude. Ce nombre de souris nous permettra également de réaliser des études statistiques adaptées en comparant les groupes deux par deux (régime alimentaire versus régime contrôle, ou encore régime alimentaire versus traitement mimant l’exposition au froid). Si aux termes de la première expérience avec les souris mâles nous n’avons aucun résultat concluant, nous ré-évaluerons l’intérêt de réaliser l’expérience avec les souris femelles.

Raffinement

Les souris utilisées sont des souris contrôles. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées avec le souci de préserver le bien-être de l‘animal : maintien à la thermoneutralité donc à leur température de confort (30°C) ; enrichissement de l’environnement; surveillance régulière; suivi selon une grille d’évaluation prévoyant le recours à des points limites précoces et adaptés (absence de toilettage, perte de poids) ; prélèvements sur animaux vigiles effectués par des personnes expérimentées; prélèvements espacés dans le temps au maximum et volumes prélevés correspondant au minimum nécessaire.

Choix des espèces

Nous envisageons d'utiliser des souris C57Bl6J. Ce modèle correspond à l'espèce et à la souche sur laquelle nous travaillons dans notre laboratoire et pour laquelle nous avons plusieurs données de référence pour notre étude. De plus la souche C57Bl6J est connu pour répondre aux régimes riches en graisse en développant une obésité et une insulinorésistance. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 semaines. Ces expériences étant d’une durée maximum de 24 semaines, l’âge maximum des souris en fin d’expérience sera d’environ 34 semaines. L’obésité nutritionnelle prend du temps à se mettre en place et nous voulons examiner des sujets adultes.

260 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne pour la pose de canules puis des stimulations cérébrales répétées destinées à provoquer aversion, évitement et troubles anxio-dépressifs, avant divers tests de comportement. Le porteur indique que cette aversion et ces troubles sont attendus et ne peuvent être évités car ils sont l'objet de l'étude. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation chez l'"animal entier" vivant.

Objectifs

Les neurones de l'aire tegmentale ventrale (VTA) constituent le point de départ du système de récompense du cerveau. Ils sont donc impliqués dans les processus motivationnels et dans la récompense, mais également dans l’aversion et dans les troubles de l’humeur (anxiété et dépression). Les neurones de la VTA sont régulés différents niveaux et notamment par des structures inhibitrices telles que la "queue de la VTA" (tVTA). Les données pionnières sur la tVTA ont conduit à de premières études fonctionnelles montrant un potentiel rôle de cette région dans les processus aversifs chez le rat. Néanmoins l’absence de marqueur spécifique de la tVTA ne permettait pas de manipuler et d’étudier spécifiquement cette région. Récemment un marqueur spécifique des neurones de la tVTA a été mis en évidence et nous avons à présent des souris permettant de manipuler spécifiquement ce marqueur et donc la tVTA. Ces souris nous permettent de spécifiquement stimuler ou enregistrer l’activité des neurones de la tVTA grâce a des approches virales Le but de ce projet est de définir le(s) rôle(s) de la tVTA dans la réponse à des stimuli aversifs. Pour se faire nous allons 1/définir si des stimulations de la tVTA sont aversive, 2/ enregistrer l’activité des neurones de la tVTA dans des taches aversives 3/définir si une stimulation chronique de la tVTA induit un phénotype anxio-dépressif. Ces expériences seront réalisées chez la souris vigile libre de ses mouvements impliqués dans diverses taches comportementales. Des souris mâles et femelles seront utilisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de la tVTA dans la réponse aux stimuli aversifs ainsi que d’évaluer une potentielle implication de la tVTA dans l’anxiété et la dépression. Le but premier de cette étude est fondamental, mais il amènera également des avancées permettant de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux pourront subir une chirurgie de 1h30, et des tests comportementaux d’aversion et d’évaluation des troubles anxieux et dépressifs. Maximum 1 test par jour (allant de 5min à 6h). Des stimulations chroniques de la tVTA (20min par jour pendant 10 jours) seront également effectuées. Les animaux subiront au maximum 7 tests ce qui correspond à 20 jours de procédures. 2 tests de 1 jour de procédure pourront etre répétés 2 fois (inclue dans les 20 jours).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire de la douleur post-opératoire et une inflammation locale transitoire autour du dispositif des canules (peau du crane). Les stimulations de la tVTA peuvent induire une aversion (comportement d’évitement et arrêt comportemental) et le développement de troubles anxio-dépressifs. Cela est attendu et ne peut être évité, car c'est l'objet de l'étude. Les tests comportementaux génèrent un stress pendant le test. Cela est inhérent à ces tests qui interrogent le niveau d'anxiété et/ou de dépression des animaux. Cela est attendu et ne peut être évité. Le stress s'arrête dans tous ces cas à l'arrêt du test.

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, le développement des troubles anxio-dépressifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique par test. Les effectifs ont été calculés grâce à deux facteurs. A : un calcul statistique pour calculer le nombre de sujets nécessaires pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables de notre étude. B : Les effectifs ont été augmentés de 30% pour prendre en compte la variabilité comportementale interindividuelle des animaux et d'éventuelles mauvaises positions des injections virales et des canules. En effet, la littérature et notre expérience dans le domaine de l’anxiété et de la dépression montrent une forte variabilité (physiologique) dans les niveaux de base d’anxiété et de dépression des animaux naïfs. Certains animaux naïfs peuvent montrer des niveaux d’anxiété et de dépression élevés nécessitant leurs exclusions. Ensuite, comme dans tout modèle d’anxiété et de dépression (conformément à ce qui se passe chez l’homme) tous les animaux ne montrent pas une aversion à un stimulus aversif et ne développent pas de phénotype anxio-dépressif en réponse à des stimuli aversifs répétés. Ces animaux dits résilients nécessitent une augmentation des effectifs. Ces facteurs de variabilités interindividuelles nous amènent à augmenter de 20% nos effectifs. Enfin, nous évaluons a 10 % la perte d’animaux du a des mauvais placements des injections virales et des canules pendant la chirurgie dû à la taille réduite de la structure cible. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux. 20 souris mâles ou femelles sont également ajoutées afin de réaliser des essais de chirurgie et de comportement et de raffiner au mieux les expériences

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie (température, humidité et le cycle jour/nuit contrôlé). Nourriture et boisson sont disponibles à volonté. Les animaux sont hébergés en cohorte de 2 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit inversé (lumière allumée de 21h à 9h), pour éviter les manipulations durant le temps de sommeil des animaux et ainsi diminuer le stress. Les tests comportementaux, à l’exception des tests du labyrinthe en croix surélevé basé sur l’aversion a la lumière) se fond en lumière rouge afin de limité au maximum la perturbation du cycle circadien des animaux. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement suivit afin de déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) sera réalisée après concertation avec le vétérinaire ou la SBEA. Des points limites adaptés, un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance est sont utilisé tout au long des experiences. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, elle pourrait être intégrée dans nos procédures.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris modifié génétiquement pour cibler spécifiquement la tVTA. Ceci implique l'utilisation de souris spécifique et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces Étant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à partir de 8 semaines, poids supérieur à 20g). La limite d’âge supérieur est de 1an afin d’éviter les facteurs liés au déclin cognitif des animaux âgés

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est induit et un traitement au tamoxifène est administré, sans recours à l'analgésie ni à l'anesthésie que le porteur écarte pour ne pas perturber le développement embryonnaire, afin d'étudier les malformations cardiaques chez des souris génétiquement prédisposées. Le porteur indique que le tamoxifène peut être délétère voire mortel pour les femelles gestantes et provoquer des défauts de développement des embryons. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Objectifs

Lors de la grossesse, le tabac, le diabète, l’obésité et l’âge de la mère sont associés à un risque accru d’avoir un enfant présentant une malformation cardiaque. Les mécanismes sous-jacents sont encore mal compris. Les facteurs épigénétiques induits par les changements environnementaux influent profondément sur l’occurrence et le spectre des malformations chez l’homme et les modèles animaux. Par conséquent, une compréhension détaillée de ces facteurs et les altérations génétiques sous-jacentes est cruciale pour un meilleur diagnostic. Les 3 formes d’hyperglycémie maternelle (diabète de type I, II, gestationnel) sont associées à diverses malformations cardiaques congénitales notamment des anomalies de latéralité (hétérotaxie), des anomalies de type conotroncale (ventricule droit à double issue, transposition des grandes artères, tronc artériel commun, ventricule unique), des défauts de septation des cavités cardiaques et d’hypertrophie cardiaque. Ce projet a pour but d’étudier l’effet du diabète pre gestationnel sur le développement embryonnaire de souris génétiquement prédisposées aux malformations cardiaques.

Bénéfices attendus

Le diabète prégestationnel chez la mère augmente le risque de malformations cardiaques chez l'enfant de 5 fois. La prévalence du diabète prégestationnel (type 1 et 2) a d'ailleurs presque doublé au cours des dernières années avec une tendance à augmenter encore plus. Cependant, les mécanismes par lesquels les altérations de l'homéostasie du glucose maternel perturbent le développement cardiaque reste encore largement incertain. Par conséquent, le but de ce travail proposé est d'acquérir une meilleure compréhension des processus compromettant le développement cardiaque dans les cardiopathies induites par le diabète. Cette connaissance nous permettra d'avoir une meilleure prédiction des risques et la possibilité d'identifier des cibles thérapeutiques pour des thérapies individualisées et de prévention. De plus, en utilisant le modèle de méthylation de l'ADN dans le sang, nous serons en mesure de présenter une gamme plus large d'outils de diagnostic pour l'identification et la quantification des facteurs environnementaux contribuant à un développement cardiaque perturbé.

Procédures

Les animaux seront soumis aux suivantes : injection sous cutanée et prélèvement sanguin de 10 microlitres au niveau de la queue..L’induction du modèle sera réalisée par une injection sous cutanée de tamoxifène (médicament bien connu) qui devrait engendrer peu de douleurs aux animaux. Dans cette étude, nous n’avons pas recours à l’administration d’analgésiants et anesthésiants, une procédure pouvant impacter sur le développement embryonnaire compte tenu de l’interaction gènes-environnement et des effets épigénétiques sous-jacents. Dans le cas d’une souffrance légère, la surveillance de l’animal sera renforcée avec une observation bi journalière. L’eau sera remplacée par une eau enrichie en pyruvate 1% jusqu’à la fin du protocole expérimental. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 ul par animal et réalisés au niveau de la queue. Ceci est rendu possible par l’utilisation de glucomètre à bandelettes réactives.

Impact sur les animaux

Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’injection de Tamoxifène peut avoir un effet délétère voir potentiellement mortel pour les femelles gravides si l’administration a lieu en début de gestation. L’administration de Tamoxifène durant la gestation est associée à des défauts de développement du placenta avec pour conséquences des défauts de formation des embryons. Des défauts embryonnaires peuvent aussi être directement liés à l’exposition au Tamoxifène. Bien qu’aucun défaut cardiaque n’ait été décrit à ce jour nous prévoyons d’inclure des groupes supplémentaires afin d’exclure l’impact du Tamoxifène sur l’apparition d’anomalies du coeur et n’envisageons pas d’administration pendant la gestation mais prévoyons une seule injection 7 jours avant la mise en accouplement, à ce stade d’injection le tamoxifène n’aura pas d’effet délétère.

Devenir

Tous les animaux entrant dans cette procédure seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude d’une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. 810 (540 en procédure 1, 270 en procédure 2) correspond au nombre minimum d’animaux à utiliser afin d’obtenir des données scientifiquement robustes sans augmenter inutilement la souffrance infligée aux animaux. Il s’agit d’une analyse de biologie fondamentale visant à observer l’apparition potentielle d’un phénotype dans un contexte donné et de caractériser ce phénotype. Nous n’utilisons donc pas d’approche statistiques.

Raffinement

Le modèle animal de diabète pre gestationnel qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et est un excellent modèle au regard de la pathologie humaine. Par ailleurs, le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 microlitres par animal. Afin d'assurer le bien-être des animaux, nous respecterons la réglementation européenne concernant la densité d'animaux par cage et les cycles d’éclairage diurne. Les souris seront au nombre de 5 maximum par cage de 542 cm2 afin de respecter leur instinct grégaire. L’environnement sera enrichi à l’aide de dômes en cartons et de bandelettes de kraft. Les reproducteurs ne seront pas mis en accouplement dans la semaine suivante leur déménagement de pièce ou avant 8 semaines d’âge. Les mères auront au maximum trois portées en production et nous ferons le maximum pour que ces portées ne soient pas immédiatement successives. Bien que le protocole soit relativement peu invasif, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Avant chaque procédure, nous nous assurerons que l’animal présente un bon état général. Après l’injection de tamoxifène, nous nous assurerons qu’aucun animal ne présente de signe d’infection au site d’injection. Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’animal pourra être hydraté par injection intra péritonéale de solution saline. Pour limiter leur stress, nous doublerons l’enrichissement (bandelettes de kraft et maisonnettes en carton).

Choix des espèces

Notre sujet de travail porte sur les malformations cardiaques causées par une hyperglycémie maternelle. A ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de mimer assez fidèlement ces pathologies. En effet, il existe une excellente homologie des gènes Kir6.2 et Nkx2.5 chez l'humain et chez la souris. Les cœurs humains et murins ont un développement anatomique remarquablement similaire. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre la formation du cœur. Ce projet utilisera des femelles âgées de 12 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge maternel sur l’apparition d’anomalies cardiaques.

338 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de quatre heures, une privation de sommeil de dix-huit heures et une épreuve d'endurance respiratoire sous contention, pour étudier le lien entre manque de sommeil et fatigue des muscles respiratoires. Le porteur relie ce travail au sevrage de la ventilation en réanimation, une retombée située dans le futur. Il affirme qu'aucune méthode substitutive comme la culture cellulaire ne peut remplacer l'étude du comportement veille-sommeil chez l'animal.

Objectifs

L’un des enjeux majeurs pour les patients en service de réanimation est le sevrage de l’aide artificielle à la respiration (ventilation mécanique). En effet, les patients en échec de sevrage chez qui il est nécessaire de maintenir la ventilation mécanique ont plus de risques de décéder au cours de leur hospitalisation en réanimation. L’endurance des muscles respiratoires joue un rôle essentiel lors du sevrage de la ventilation mécanique, puisqu’elle doit être suffisante pour permettre une respiration spontanée non assistée. Il a été proposé que le manque de sommeil puisse diminuer cette endurance inspiratoire, les patients en réanimation ayant un sommeil diminué et fragmenté. Des études ont effectivement montré chez l’être humain une diminution de l’endurance inspiratoire après une privation d’une nuit de sommeil. Une étude précédemment menée au laboratoire a démontré qu’il existe un lien entre la privation de sommeil et l’endurance inspiratoire chez le rat. Les objectifs de ce projet sont 1) de comprendre les mécanismes cérébraux à l'origine de la fatigue des muscles respiratoires suite à une privation de sommeil et 2) de tenter de limiter la fatigue musculaire en administrant des médicaments qui sont connus pour avoir un effet "éveillant"

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre une meilleure compréhension du fonctionnement du lien entre endurance inspiratoire et sommeil. Le projet devrait aussi permettre dans le futur de proposer de nouveaux médicaments pour faciliter le sevrage à la ventilation assistée pour les patients en réanimation. D'un point de plus large, ce projet ouvre la voie à des pistes thérapeutiques pour soulager les patients atteints de maladies respiratoires chroniques très souvent associées à des troubles du sommeil.

Procédures

chirurgie (4h), injection intrapéritonéale de molécules (moins de 1 min), enregistrement de l'activité de l'animal +/- privation de sommeil (18h), épreuve d'endurance respritoire (1h)

Impact sur les animaux

Stress lié à l'isolement des animaux en post chirurgie, à la privation de sommeil et à la contention lors de l'épreuve d'endurance respiratoire

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever leur cerveau pour les analyses post-mortem.

Remplacement

Ces approches nécessitant des expériences comportementales avec interaction entre différents organes (système respiratoire et système nerveux) et ce en fonction de deux états très différents de l’organisme (la veille et le sommeil), il n’est pas envisageable d’utiliser des méthodes substitutives à l’expérimentation animale telles que la culture cellulaire ou les analyses informatiques.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Un calcul de puissance statistique a été utilisé pour minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives. Pour satisfaire à ces critères, ceci implique d'utiliser des groupes expérimentaux composés de 13 rats. De plus, le nombre d'animaux contrôles sera réduit en utilisant un même lot contrôle pour plusieurs molécules médicaments ayant le même solvant, il a été possible de réduire le nombre d’animaux pour ces groupes contrôles. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en termes de "mal être" animal. L’évaluation et la prise en charge de la douleur, la souffrance et l’angoisse seront effectuées lors du suivi quotidien des animaux. Des critères de points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal…). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée 2 fois par semaine, l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les animaux sont hébergés en groupe de deux avec accès à la nourriture et à l’eau à volonté et à un enrichissement (bâton de peuplier et baguette de papier compressé) pour assouvir leur besoin naturel de ronger. Le stress lié à la nouveauté sera diminué par l’habituation de l’animal aux différents appareils (non fonctionnels). Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude combinée du sommeil et de la fonction respiratoire. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison d’une variabilité inter-individuelle faible et des données déjà disponibles. Âge adulte (8 semaines à 12 semaines) pour s’approcher au mieux des données de la littérature et des résultats obtenus par le laboratoire

600 souris, dont des souris au foie humanisé, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de virus des hépatites B et C, des plasmides et des composés par gavage jusqu'à deux fois par jour, puis des prélèvements sanguins répétés, pour tester des candidats médicaments. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer douleur, perte de poids et difficultés à se déplacer. Il affirme que les modèles murins constituent une approche "indispensable" quand la culture in vitro ne recrée pas les interactions d'un organe fonctionnel.

Objectifs

Bien qu’un vaccin et des traitements anti-viraux existent contre le virus de l’hépatite B et de l’hépatite C, plus de 250 millions de personnes dans le monde vivent avec une infection chronique, ce qui les exposent à un risque grave de cirrhose voire de cancer. La recherche de nouveaux traitements pour ces maladies est donc essentielle. Par ce projet, nous souhaitons développer un modèle d'étude de l'hépatite B et de l’hépatite C, en inoculant le virus à des souris, en particulier des souches possédant un foie humanisé. Ce modèle sera utilisé, non seulement pour la compréhension de cette pathologie, mais aussi pour le développement de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

En utilisant des souris au foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier l'hépatite B et l’hépatite C et d'évaluer les effets toxicologiques et thérapeutiques de candidats médicaments déstiné à lutter contre cette pathologie avec davantage de spécifité de l'espèce cible de ces recherches : l'Homme.

Procédures

Injection intraveineuse d’adénovirus, injection hydrodynamique de plasmides, injection intraveineuse de surnageant. Chacune de ces injections sera d’une durée de 10 à 15 secondes. Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes d'administration seront déterminés sur base du poids de la souris. A titre d’exemple, le volume maximum prélevé sera de 100 μL par semaine pour une souris de 25 gr. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. L’administration de composés de recherche : réalisée par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation) ou parentérale (veineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intra-musculaire). Les volumes à administrer seront préétablis par le vétérinaire d’établissement et le comité de bien-être. A titre d’exemple, pour une souris de 20 g, la limite d’administration sera de 400 μL per os; 200 μL par voie sous-cutanée; 200 μL par voie intrapéritonéale; 50 μL par voie intramusculaire et 200 μL par voie intraveineuse. La durée des administrations est de 10 à 15 secondes. Le nombre de gavage maximal autorisé sera de 2 par jour.

Impact sur les animaux

De la douleur peut être induite par : l'inoculation virale intraveineuse, l'injection hydrodynamique intraveineuse de plasmides, les prélèvements sanguins et l'injection et les effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux étant infectés par des virus humains, ils seront euthanasiés.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, lorsqu’il n’est pas possible de recréer in vitro les interactions complexes qui peuvent exister entre un organe fonctionnel, une pathologie et les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux les impliquant, les modèles murins constituent une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 600 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 20 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe sur une durée de 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Celle-ci sera objectivée par une échelle de score adaptée aux études en infectiologie. Le vétérinaire aura pleine autorité pour envisager un traitement anti-douleur ou une euthanasie de la souris pour raison éthique s’il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Deux modèles murins d’infection par le virus de l’hépatite B sont décrits dans la littérature et ont démontré leur efficacité pour prédire l’activité thérapeutique de candidats médicaments. De plus, nous maîtrisons l'humanisation du foie chez les souris. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. La procédure expérimentale requiert des animaux adultes utilisés à l’âge de 7-8 semaines pour les animaux non- humanisés et 15 à 18 semaines pour les animaux humanisés.

40 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime obésogène induisant une obésité, à des gavages de glucose, à des prélèvements sanguins répétés et à un isolement, pour étudier le rôle d'un récepteur lingual dans la préférence pour le gras. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à la mise à disposition d'une nouvelle souche de souris. Le porteur indique avoir déjà testé les molécules sur des lignées cellulaires, sans effet toxique, avant de recourir aux souris.

Objectifs

Des études récentes chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon est constitué par un amas cellulaire constitué de 4 types cellulaires. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Il existe des récépteur aux acides gras, dont l'un est appelé CD36. Il est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Le but de cette étude est de démontrer l’implication in vivo, du CD36 situé au niveau de la langue dans l’action de nos molécules « faux lipides ». Pour mener à bien les objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle souche génétiquement modifiée, qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur CD36 et le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris subira une mise sous régime (obésogène ou standard), une pesée hebdomadaire, une glycémie toutes les deux semaines (prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale, nécéssitant une contention inférieure à une minute), une mesure en echoMRI toutes les deux semaines (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 2 minutes). A la fin du régime, les organes seront prélevés, après mise à mort. Les souris seront individualisées pendant 5J pour réaliser des doubles choix. Les mesures de dépenses énergétiques nécessiteront également une individualisation pendant 5J dans les cages de mesures. Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose nécessitant un gavage au glucose (contention de quelques secondes) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale, nécéssitant une contention inférieure à une minute).

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité, ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. De même, les animaux peuvent subir un stress, lors des prélèvements répétés ou encore des suites d’individualisation (pour les tests double-choix). Les animaux disposeront d’un enrichissement supplémentaire dans leur cage de vie afin de minimiser le stress induit.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements d’organes.

Remplacement

Les études physiologiques et les relation inter-organes nécessitent l’utilisation d’animaux pour cette étude. De plus, nous avons déjà étudié les mécanismes sur des lignées cellulaires in vitro, et ces tests n’ont montré aucun effet toxique, tératogénique ni mutagénique jusqu’à la concentration de 100µM.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté. Lors de prélèvements, comme la glycémie ou le prélèvement de sang, les souris seront sous anesthésie locale à la lidocaïne afin de minimiser la douleur. Enfin, les animaux étant observés quotidiennement, si un signe clinique fait apparaître un mal-être ou une douleur, ils seront euthanasiés par asphyxie au CO2.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction du KO étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un peptide amyloïde est injecté dans leur cerveau pour reproduire une perte de mémoire, puis elles reçoivent un composé pendant sept jours et passent des tests de mémoire, dont un test d'évitement où elles reçoivent un choc électrique. Les retombées attendues, l'arrivée en clinique d'un traitement contre des maladies rares, sont renvoyées au long terme. Le porteur affirme que le recours à un modèle murin de la maladie d'Alzheimer est "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est de déterminer les effets neuroprotecteurs d'un composé. Ce produit à visée thérapeutique cible un mécanisme de neuroprotection novateur et peut permettre le développement de candidats-médicaments pour le traitement de maladies rares.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant une preuve de concept d'efficacité d'un composé sur notre modèle de toxicité amyloïde. Le bénéfice attendu est à terme d'amener en clinique ce composé à visée thérapeutiques pour des pathologies rares / orphelines pour lesquelles il n'y a actuellement pas de traitement.

Procédures

Les animaux auront au cours de leur vie des injections IP (30 minutes avant) et sous cutanée 10 min avant l' inoculation du peptide amyloide 25-35 dans le ventricule cérébral droit sous anesthésie (en moins d'une minute). Ensuite durant 7 jours les animaux recevront une injection intrapéritonéale du traitement combinatoire mis en place (durée de l'injection maximum 1 minute). Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec 3 tests de mémoire d'une durée de 5 à 8 minutes maximum plus le test d'enfouissement d'une durée de 30 minutes pour tester l'anxiété des souris

Impact sur les animaux

Un certain stress lié aux injections pourra être engendré. Une perte mnésique voulue, et dûe à la diffusion du peptide amyloide dans le cerveau sera également observée. Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress et pour le test d'évitement passif, les animaux recevront un choc électrique léger, (0.3 mA pendant 3 sec) afin d'évaluer leur performance mnésique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieurs réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant l'année du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra plus de 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères.

Choix des espèces

Afin de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer en vue d'un traitement curatif, la souris reste à ce jour le modèle se rapprochant au plus près de l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines.