Recherche fondamentale

80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'injection d'un vecteur viral dans le cerveau, puis un isolement en cage individuelle pour toute la durée du projet, des jeûnes prolongés jusqu'à quatorze heures, des tests de tolérance au glucose et de privation de glucose provoquant une hypoglycémie, avant mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur reconnaît que la récupération chirurgicale, le jeûne et l'isolement sont sources de douleur, de stress et d'inconfort, et cherche à les limiter par des contacts visuels entre cages. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier le rôle des cellules gliales dans le contrôle de la glycémie et du poids.

Objectifs

L’obésité et ses comorbidités représentent un grave problème de santé publique. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques et les apports par l’alimentation) est assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu au complexe vagal dorsal (CVD) localisé dans le tronc cérébral caudal. Le CVD dispose de réseaux de neurones sensibles au glucose et à d’autres signaux informant des réserves énergétiques de l’organisme, mais aussi de cellules gliales dont la contribution au contrôle de la balance énergétique commence à être révélée. Cette procédure vise à réduire l’expression de la connexine 43 par interférence ARN et ainsi altérer, au sein du complexe vagal dorsal, les communications par jonctions communicantes entre cellules gliales et les communications paracrines depuis les cellules gliales via les hémi-canaux de connexines, puis à en tester les effets sur la croissance pondérale, la prise alimentaire, la tolérance au glucose et l’adaptation précoce à un régime riche en sucre et graisse (comportement alimentaire, marqueurs métaboliques circulants et morphologie des cellules gliales). Nous utilisons des vecteurs viraux adéno-associés pour inhiber la connexine la plus abondante du système nerveux central spécifiquement dans les cellules gliales du CVD et ainsi altérer leur communication. Nous avons vérifié la spécificité et la fonctionnalité de ces outils dans un précédent projet pilote. Dans le présent projet, nous souhaitons déterminer le rôle fonctionnel joué par cette molécule sur l’homéostasie glucidique et énergétique chez la souris. Les procédures décrites permettront de déterminer si la communication des cellules gliales intervient : 1) dans la tolérance au glucose et les réponses comportementale et neuronales à une privation en glucose ; 2) dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel sous un régime alimentaire standard ; 3) dans l’activation gliale et l’adaptation homéostatique lors d’une exposition brève à un régime riche en sucre et en graisses.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales du tronc cérébral caudal régulent la prise alimentaire et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la connexine 43 fortement exprimée par ces cellules gliales : 1) dans la régulation de la prise alimentaire et du poids corporel dans le cadre d’un régime alimentaire standard ; 2) dans les régulations de la glycémie en réponse à une surabondance ou une privation en sucre ; 3) dans les phases précoces de réaction à un régime alimentaire riche en sucre et en graisse, lors desquelles une surconsommation initiale laisse place à une normalisation de l’apport calorique. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie morphinique préopératoire et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un vecteur viral contrôle ou ciblant la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité (risque de blessures par les congénères) et pour les mesures individuelles nécessaires pour déterminer l’impact de la réduction de la connexine 43 sur le contrôle de la glycémie et la prise alimentaire. Après récupération chirurgicale, certains animaux subiront un test de tolérance au glucose (4h), au cours duquel une solution de glucose sera administrée par voie orale (moins d’1 min), puis des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale sous anesthésie locale pour suivre l’évolution du glucose sanguin (7 prélèvements en 4h, moins d’1 min par prélèvement). D’autres animaux subiront des tests de privation en glucose (par injection IP d’un analogue non métabolisable du glucose ; durée 2h), suivi de mesures de la glycémie (5 prélèvements de sang à la veine caudale en 2h) ou de la prise alimentaire. Les tests de tolérance au glucose et les tests de privation en glucose nécessitent une mise à jeun préalable, respectivement de 14h et de 5h. A la 9ème semaine post-chirurgie, les animaux ayant subi le test de tolérance au glucose seront soumis à un régime alimentaire riche en graisse et en sucre pour une durée de 12h ou 5 jours, ou maintenus sur régime alimentaire standard pendant 5 jours (groupes contrôles). A l’issue de ces régimes, les animaux seront mis à mort sous analgésie morphinique et anesthésie générale. Le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux ayant subi les tests de privation en glucose recevront à nouveau une administration IP d’un analogue non métabolisable du glucose (ou de solution saline) et seront mis à mort 3h après cette injection, sous analgésie et anesthésie générale. Le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem.

Impact sur les animaux

Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation du statut glycémique et de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire et des régulations du statut glycémique dans la suite des procédures. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après récupération postopératoire, l’administration orale de glucose ou l’administration intrapéritonéale d’un dérivé non métabolisable du glucose (2DG) causent un inconfort dû à la contention de l’animal et à l’administration elle-même. Ces administrations sont précédées d’une mise à jeun indispensable à la standardisation du statut glycémique, limitée à 14 h pour le test de tolérance au glucose et à 5 h pour la glucoprivation. Cette mise à jeun est une source de stress pour les animaux. L’hypoglycémie provoquée par l’administration 2DG et les contre-régulations physiologiques permettant le retour à la normo glycémie sont une source d’inconfort pour l’animal. Le suivi du statut glycémique requiert des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue. L’exposition à un régime riche en sucre et en graisse pendant 12h à 5 jours ne génère aucune douleur ou inconfort mais nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. La récupération des cerveaux fixés, indispensable aux études immuno histologiques post-mortem, nécessite une mise à mort par perfusion intracardiaque.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortem sont indispensables : 1) Pour vérifier l’expression du vecteur viral par les cellules gliales dans la région d’intérêt ; 2) et caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales. Ces analyses post-mortem nécessitent donc une mise à mort des animaux.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de l’homéostasie glucidique, la consommation alimentaire et le poids corporel.

Réduction

Au total, 80 souris mâles sont nécessaire à ce projet. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Un précédent projet pilote nous a permis de vérifier l’efficacité de nos vecteurs viraux à réduire l’expression de la protéine Cx43 de façon ciblée dans la zone cérébrale d’intérêt. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction d’expression. Les mesures terminales à effectuer consistent en une analyse immunohistochimique avec quantification : du nombre et de la morphologie des cellules gliales d’intérêt en réponse à l’exposition brève à un régime riche en graisse et en sucre (procédure 1) et de l’activation cellulaire neuronale et gliale en réponse à une glucoprivation (procédure 2). Le nombre de lots nécessaires à ces analyses dépend du nombre de variables testées dans chaque procédure. Pour la procédure 1 : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 3 conditions différentes de régime alimentaire (régime riche en graisse et sucre : 12 h ou 5 jours HFS ; régime alimentaire standard : 5 jours), soit 6 lots d’animaux. Pour la procédure 2 : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 2 traitements pharmacologiques (solution saline ou analogue non métabolisable du glucose), soit 4 lots d’animaux. Pour l’effectif par lot, la quantification du nombre et de la morphologie des cellules gliales nécessite 7-8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Un effectif de 8 animaux par groupe est choisi ici pour prendre en compte la variabilité de ciblage des injections de vecteur viral. Cet effectif par lot est pleinement compatible avec les mesures préalables de tolérance au glucose aux 3 délais post-chirurgie envisagés (4, 6 et 7 semaines), chacun de ces tests mobilisant deux lots d’animaux parmi les 6 de la procédure 1 (2 variables : vecteurs viraux contrôle et ciblant la connexine 43). Pour la procédure 2, les mesures de glycémie et prise alimentaire en réponse à la glucoprivation imposent un effectif de 8 animaux par lot. Ces expériences mobilisent chacune les 4 lots d’animaux de la procédure 2, en raison des 4 variables par expérience : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 2 traitements pharmacologiques (solution saline ou analogue non métabolisable du glucose).

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et de points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et/ou anesthésie générale chimique. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique pré-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale chimique et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une analgésie est systématiquement administrée et une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids. Les prélèvements sanguins à la veine latérale de la queue pour dosages glycémiques seront réalisés sous anesthésie locale. Les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention avant les tests de tolérance au glucose et de glucoprivation. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la glycémie et de la prise alimentaire dû à la manipulation des animaux et à la contention. De plus, une habituation au retrait de la mangeoire (pendant 2h en phase diurne les deux jours précédant la mise à jeun de 14 h) et à la nourriture enrichie en sucre et en graisse (pendant 10 minutes en phase diurne les deux jours précédant la bascule sur ce régime) contribuera à diminuer le stress des animaux et évitera la néophobie lors du changement de régime alimentaire. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie d’injection intracérébral jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Les atlas stéréotaxiques se basent sur cet âge pour estimer les coordonnées stéréotaxiques des structures ciblées.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent des injections répétées de morphine sur cinq jours qui provoquent selon le porteur une tolérance et une hyperalgésie, puis subissent des stimulations mécaniques de la patte au filament de Von Frey déclenchant un retrait douloureux, pour étudier le rôle d'un récepteur dans les effets de la morphine chronique. Le porteur souligne que l'animal peut échapper à la stimulation faute de contention et décrit des points limites incluant vocalisations, automutilation et perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo car la douleur met en jeu de nombreuses régions nerveuses.

Objectifs

La morphine est un antalgique puissant qui appartient à la classe des opioïdes. Son utilisation, qui permet de soulager des douleurs intenses, peut être limitée en raison de l'apparition d'effets secondaires et de phénomènes de tolérance (accoutumance nécessitant d’augmenter la posologie pour maintenir l’effet antalgique) et d’hyperalgésie (amplification de la douleur suite à un stimulus nociceptif). Ses deux effets secondaires sont liés à l’utilisation de morphine de façon chronique. Il a récemment été mis en évidence l’importance du récepteur Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) au niveau périphérique dans le développement des douleurs neuropathiques. L’objectif général sera d’étudier le rôle de ce récepteur FLT3 au niveau central (plus précisément de la moelle épinière) dans les effets induits par la morphine administrée en aigue et par la morphine administrée en chronique. Les objectifs spécifiques du projet seront : Objectif 1) d’étudier les comportements d’analgésie et d’hyperalgésie des souris Wild type (WT) et des souris KO FLT3 après administration de morphine en aigue ou de morphine en chronique, Objectif 2) d’étudier les effets de ce même traitement (morphine aigue versus morphine chronique) sur les propriétés électrophysiologiques et morphologiques des neurones de la moelle épinière dorsale sur les souris WT et les souris KOFLT3 et Objectif 3) de déterminer si l’activation globale des neurones des couches superficielles de la corne dorsale est différente après morphine aigue ou chronique et si la suppression des récepteurs FLT3 modifie cette activation.

Bénéfices attendus

Ce projet présente un intérêt fondamental via l'étude des mécanismes d'action de la morphine au niveau central, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les effets secondaires dus à la prise chronique de morphine.

Procédures

Les animaux seront soumis à des piqures intrapéritonéales de morphine (1 à 10 piqures sur 5 jours). Par ailleurs, des stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey pour induire un retrait de la patte sera réalisé. Cette stimulation dure moins d’une seconde.

Impact sur les animaux

Les souris vont soit recevoir une seule injection de morphine (ou de liquide physiologique) en intrapéritonéale qui va induire un effet analgésique ou bien 2 injections/jours pendant 5 jours de morphine (ou de liquide physiologique), qui va provoquer une tolérance ou une hyperalgésie à la morphine qui n’empêche pas les mouvements de l’animal. Par ailleurs, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention.

Devenir

Tous les animaux des 2 procédures seront mis à mort. Les 2 procédures sont 2 expériences différentes ne permettant pas de réutiliser les animaux.

Remplacement

Il n’y a pas de méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Tout d'abord, une réduction sera réalisée dans la partie 1 du projet car les animaux de l'étude « comportement chronique morphine »(objectif 1) seront ré-utilisés pour l'étude des enregistrements électrophysiologiques (objectif 2). De plus, une réduction sera également réalisée dans la partie 2 du projet où nous ne ferons pas de groupe de souris "controle", nous utiliserons le coté contralatéral d'un même animal comme groupe contrôle. Enfin, le nombre de groupes de souris et le nombre de souris par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de souris par groupe a été déterminé sur la base des études précédentes et sur un calcul de puissance (http://www. 3rs-reduction.co.uk/html/6__power_and_sample_size.html). Ainsi le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 souris par groupe pour observer une différence de 50% entre les animaux contrôles et les animaux traités. Afin d'anticiper une perte éventuelle d'animaux liée à la procédure expérimentale (injection...), un nombre maximum de 10 animaux par groupe sera envisagé pour le comportement et les stimulations électriques. La période d’habituation avant le comportement est fondamentale afin d’assurer une reproductibilité des tests et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les données récoltées seront analysés par une mesure de variance suivie d’un test de Tukey si normalité vérifiée (sinon test de Mann-Whitney) pour comparer 2 groupes et une ANOVA one-way ou two-way sera réalisée pour comparer plus de 2 groupes expérimentaux.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement social: elle seront par groupes de 4 à 6 par cages et environnemental: des rouleaux et des nids seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue)…mettrait fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Pour limiter l’angoisse due aux tests pratiqués, une habituation de minimum une semaine sera réalisée au cours de laquelle les animaux seront placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h puis ensuite seront exposés aux différents tests sans appliquer le stimulus. Cela permettra aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress lié à la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Il est nécessaire de réaliser ces études in vitro chez l’animal car aucune méthode alternative actuelle ne permet d’évaluer les effets de la morphine et les effets de délétion de FLT3 dans le développement de la chronicisation douloureuse. Les souris ont été choisies afin de pouvoir travailler en parallèle sur des souris transgéniques adaptées à nos recherches (dépourvues du gène FLT3) pour mieux comprendre les mécanismes d’action de la morphine dans l'induction de la tolérance/hyperalgésie, et sur des souris sauvages. Les souris auront entre 3 et 8 semaines, ce qui correspond aux âges utilisés dans la littérature.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie, elles subissent des injections, des examens RMN et une électrostimulation musculaire sous anesthésie, certaines recevant un vecteur de thérapie génique quelques jours après la naissance, avant mise à mort pour prélever plusieurs muscles. Le porteur présente ces atteintes comme compatibles avec "une vie tout à fait normale" et met en avant le caractère non invasif de la RMN et de l'électrostimulation. Il conclut qu'aucune culture de cellules musculaires ne reproduit les mesures physiologiques recherchées et revendique une étape "indispensable" avant l'application à l'homme.

Objectifs

Le récepteur à la ryanodine de type 1 (RyR1) est une protéine essentielle à la contraction musculaire. Chez l’homme, une mutation (notée RyR1I4895T) dans le gène RyR1 est à l’origine de la myopathie à cores centraux. Cette affection neuromusculaire génétique et héréditaire se caractérise par la présence de lésions rondes dans les cellules du muscle et par une faiblesse musculaire (réduction de la capacité à produire de la force, fatigabilité accrue) de sévérité variable. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif contre cette pathologie, et la prise en charge des patients se réduit à de la kinésithérapie et à de la corticothérapie, ce qui conduit à une légère amélioration de leur état général. Afin d'étudier le rôle de la protéine RyR1, un modèle de souris portant la mutation RyR1I4895T a été développé. Des études préliminaires ont montré que, comme chez l’homme, ces souris développent une myopathie à cores centraux et une faiblesse musculaire modérée. Ce projet vise à caractériser les muscles de ces souris myopathes d’un point de vue fonctionnel par le biais d’une analyse de leurs performances musculaires en lien avec le métabolisme énergétique. Cette étape est indispensable d’une part pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie mais également pour la mise en place d’approches thérapeutiques chez les patients souffrant de cette myopathie. Ainsi, nous envisageons dans un deuxième temps d'évaluer le potentiel thérapeutique de différents agents pharmaceutiques à rétablir un phénotype sain chez ces souris.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’une part de mieux comprendre l’histoire naturelle de la myopathie à cores centraux et d’autre part d’identifier des approches thérapeutiques susceptibles d’engendrer une augmentation de la force musculaire (agents thérapeutiques) voire de restaurer un phénotype sain (par thérapie génique). Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.

Procédures

Les animaux subiront : des injections intrapéritonéales de molécules thérapeutiques sur animaux vigiles, des ingestions de croquettes ou de boisson supplémentées en molécules thérapeutiques, des examen RMN sous anesthésie générale, et des contractions musculaires induites par électrostimulation transcutanée sous anesthésie générale. Les injections d’AAV seront réalisées par l'organisme partenaire nous fournissant les animaux, avant le transfert de ces derniers dans nos locaux. Ces injections d'AAV seront réalisées en intrapéritonéal sur animaux vigiles, quelques jours après la naissance pour augmenter l'efficacité du traitement, réduire la quantité de virus à injecter et augmenter l'immunotolérance.

Impact sur les animaux

D’après la littérature, les souris RyR1I4895T hétérozygotes âgées de 4-5 mois présentent une diminution de leur masse corporelle de 15% et une perte de force musculaire de 25% par rapport à des souris contrôles du même âge. Ces modifications n’entraînent pas de signes dommageables et les animaux ont une vie tout à fait normale. Concernant les nuisances associées aux actes expérimentaux, seules les injections IP de molécules thérapeutiques sur animaux conscients pourront entrainer un léger stress et une faible douleur lors de l'acte. L’administration de molécules par le biais de la nourriture (croquettes à façon) ou de l'eau de boisson, ainsi que les examens RMN et l’électrostimulation musculaire sur animaux anesthésiés ne devraient pas entrainer de nuisances particulières si ce n’est un léger stress lors du réveil de l’anesthésie générale. En particulier, le protocole d’électrostimulation musculaire transcutanée que nous mettrons en œuvre (comparable à ceux utilisés chez l’homme en kinésithérapie) est strictement non invasif et ne provoque ni blessure ni séquelle, les animaux retrouvant dès leur réveil leur mobilité initiale.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort une fois qu’elle sera terminée, en l’occurrence 3-4 jours après leur 3ème exploration non invasive du métabolisme énergétique et la fonction musculaire, de manière à laisser aux muscles (qui seront prélevés post mortem afin de réaliser des dosages biochimiques et de l’histologie) le temps de récupérer d’un point de vue métabolique et fonctionnel. Les euthanasies seront réalisées par dislocation cervicale pratiquée sur animaux anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Plusieurs muscles (gastrocnémiens, soléaire, EDL, tibialis antérieur) seront prélevés sur les animaux euthanasiés. Ces tissus musculaires seront ensuite conservés à -80°C. Le cœur et les tissus adipeux seront également prélevés pour d’éventuels dosages ultérieurs.

Remplacement

Ce projet a pour objectifs de mieux comprendre le rôle physiologique de RyR1 et de réaliser des essais précliniques afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de différents agents pharmaceutiques à rétablir un phénotype sain. Les critères métaboliques et fonctionnels (mesure des performances mécaniques) que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux de manière longitudinale ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours aux techniques RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal des mesures du métabolisme énergétique dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques de biochimie qui auraient nécessité de sacrifier des cohortes d’animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser des dosages métaboliques sur biopsies musculaires.

Raffinement

Les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (coton), d’abris en plastique permettant aux animaux de se cacher, et de bûchettes de bois destinées à être rongées. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. Par ailleurs, l’utilisation des techniques RMN sur animaux anesthésiés par inhalation gazeuse permettra de par leur caractère non invasif et totalement indolore de réduire le stress des animaux. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation de la douleur par score avec indices pour différents critères physiologiques et comportementaux, et des actions seront à mener en fonction des scores obtenus. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale induite par inhalation d’isoflurane afin de réduire au maximum leur douleur et leur détresse.

Choix des espèces

Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’Homme pour sa physiopathologie et qui soit génétiquement modifiable. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris seront utilisées entre leur 2ème et 5ème mois d’âge : dès que la force musculaire commence à diminuer, à l'âge de 2 mois d'après les données de la littérature et pendant les 3 mois suivants de manière à suivre de manière non invasive et longitudinale l’évolution de la pathologie et les effets des approches thérapeutiques.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est provoqué par injection de streptozotocine, puis les animaux subissent des mesures répétées de glycémie par piqûre de la queue, des tests auditifs et une électrophysiologie du nerf caudal sous anesthésie, avant prélèvement des cochlées, pour préciser l'atteinte auditive liée au diabète. Le porteur prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 20 % de leur poids ou montrant prostration, léchage excessif ou automutilation, ce seuil déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ces tests menés sur animal vivant et retient la souris pour la "similitude" de sa fonction auditive avec celle de l'homme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche C57Bl/6J Rj (souris présentant une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie, modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives seront effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie des animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez une souche de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la streptozotocine fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris C57Bl6/JRj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation gazeuse de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, - une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence à un document « points limites », tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2.

Choix des espèces

La souris de souche C57Bl/6J Rj présente une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie (modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie). L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris présentant une dégradation spontanée de leur fonction auditive. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.