Recherche fondamentale

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent un traitement induisant chez leurs embryons des mutations qui reproduisent une carence complète en vitamine A, puis sont tuées par dislocation cervicale pour que les fœtus soient prélevés, observés et fixés, certains fœtus étant refroidis puis plongés dans un fixateur histologique. Le porteur décrit une "douleur minime" pour les femelles et reconnaît que la souffrance fœtale est "difficile à évaluer", les prélèvements étant programmés un jour avant la mort ou la naissance attendue. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier l'organogenèse et conclut à l'impossibilité d'un remplacement in vitro.

Objectifs

Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les anomalies congénitales sont définies comme des anomalies de développement qui surviennent durant la vie intra-utérine et qui peuvent être identifiées avant la naissance, à la naissance ou plus tard dans la vie. Pour mieux appréhender la pathogénie des anomalies congénitales, nous proposons de comparer des reconstructions tridimensionnelles (3D) d'embryons de souris porteurs de mutations connues avec leurs congénères normaux, entre le début de la formation des organes (9.5 jours post-fécondation ; E9.5) et la fin de la gestation (E18.5). Pour les stades de développement compris entre E9.5 et E15.5, nous utilisons une nouvelle technologie d’imagerie, l’HREM (microscopie épiscopique haute résolution), qui génère des images comparables, en termes de résolution, à l’histologie : elle permet de visualiser les surfaces et les volumes des organes internes et des cavités, dans le système nerveux, le poumon, le cœur et les vaisseaux, l'intestin et le système urogénital. Les embryons et fœtus mutants pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara, Rarb et Rarg) développent des anomalies congénitales. Ce modèle imite un état de carence complète en vitamine A qui, pour des raisons techniques, n’avait jamais été analysé auparavant puisque cette vitamine est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères. Ces mutants seront utilisés comme modèle d’anomalie congénitale dans notre étude en imagerie.

Bénéfices attendus

Les anomalies congénitales affectent 1 nourrisson sur 30 partout dans le monde et entraînent annuellement 3 millions d'incapacités physiques, fonctionnelles et mentales. Les anomalies congénitales ne sont diagnostiquées qu'après la naissance ou, plus rarement, en fin de grossesse. Pourtant, la plupart d'entre elles sont déterminées très précocément, au cours des toutes premières semaines qui suivent la fécondation. De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de l’ensemble de ses gènes, la souris est un excellent modèle pour comprendre les maladies humaines. Les études cliniques et les approches expérimentales ont révélé que la vitamine A et ses dérivés actifs (les rétinoïdes dont l’acide rétinoïque) exercent une grande variété d'effets sur l’embryogenèse. Ces anomalies sont retrouvées chez l’un ou l’autre des mutants combinés pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara/b, Rara/g et Rarb/g) ce qui suggère une redondance fonctionnelle entre les RARs. Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension du moment propice d’action de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque pour permettre les différentes étapes de l’organogenèse. Cet objectif sera atteint en étudiant les conséquences de l’inactivation de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Ceci sera réalisé par l’ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs.

Procédures

Les souris femelles gestantes sont traitées pour permettre la mutation (recombinaison). Une contention simple qui dure 15 à 20 secondes pour administrer avec soin le traitement. Les souris femelles sont euthanasiées par dislocation cervicale (cela prend entre 5 secondes et 5 minutes selon la méthode utilisée). Les fœtus à E18.5 sont sortis des cornes utérines en incisant longitudinalement le muscle utérin. Après une observation macroscopique, ils sont ensuite euthanasiés par administration d’un euthanasiant chimique (contention de 10 secondes pour administrer l’euthanasiant). Les fœtus à E14.5 sont sortis des cornes utérines. Après une observation macroscopique sous loupe binoculaire, ils sont rendus inconscients par le froid. Ensuite, les foetus sont euthanasiés par immersion dans le fixateur histologique.

Impact sur les animaux

Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux animaux. La souffrance des femelles gestantes est limitée à la contention pour l’administration du traitement permettant la mutation (recombinaison). Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables de nos manipulations génétiques chez la femelle gestante traitée, mais tous les animaux sont surveillés soigneusement. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort anticipée ou un jour avant la naissance.

Devenir

Tous les animaux décrits dans ce projet (Femelles gestantes et fœtus) seront euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus à E14.5 et à E18.5 sont euthanasiés pour les analyses HREM ou les analyses sur coupes. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.

Remplacement

L’organogenèse fait intervenir plusieurs types cellulaires de l’embryon. Notre étude vise à évaluer les périodes pendant lesquelles l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires dans un système physiologique. Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

La stratégie des accouplements permet d’obtenir la moitié des animaux contrôles et l’autre moitié des animaux seront mutants après le traitement utilisé pour permettre la mutation (recombinaison). La stratégie de prélèvement des embryons ou des fœtus permet aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés car les stades sont choisis à des moments clés de l’organogenèse et permettent d’éviter la dissection au hasard. Les mâles et les femelles sont utilisés pour l’étude quand l’organogenèse s’y prête. Par exemple pour les études sur le développement du crâne ou des poumons, nous pourrons analyser les deux sexes. Par contre, pour les études sur le système urogénital, nous aurons besoin d’analyser à la fois des mâles et des femelles. Les nombres d’animaux sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique. A chaque stade nous analyserons 3 embryons/foetus contrôles et 3 embryons/foetus mutants. La réduction du nombre d’animaux (2e R de la règle des 3R) est donc appliquée dans notre projet.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour le bien-être des animaux, la surveillance de l’état de santé et des actions appropriées sont réalisées à l’animalerie si nécessaires (soins, analgésie, …). Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes (traitement utilisé pour permettre la mutation par recombinaison). Le bien-être est surveillé en permanence et toute altération du comportement des animaux (souffrance, angoisse) sera immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires. Les malformations congénitales attendues suite à la mutation des gènes Rar entrainent généralement une létalité embryonnaire ou foetale. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort attendue ou un jour avant la naissance. Le raffinement (3e R de la règle des 3R) est donc appliqué dans notre projet.

Choix des espèces

De part sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal de la souris est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome; temps de génération court; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans l’organogenèse sont conservés chez l’homme. Afin d’évaluer les périodes pendant laquelle l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires (développement du crâne ou de la tête, du tractus urogénital, du tractus gastrointestinal, du système cardiovasculaire ou du système respiratoire), nous allons procéder à une ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs chez la souris. Cette ablation sera réalisée au moment où les RARs sont supposés être nécessaires aux processus de : neurogenèse, cardiogenèse, développement des bourgeons des membres, développement de l’oeil, etc.. Nous allons prélever les embryons à des stades précis pour pouvoir observer l’organogenèse. Stade traitement des femelles (Stade prélèvement embryons/foetus) E8 (E9 et E10) E8.5 (E10.5 et E11.5) E9.5 (E11.5, E12.5, E13.5 et E14.5) E10.5 (E12.5, E13.5 E14.5 et E18.5) La liste des observations qui vont être faites et qui sont énumérées ci-dessous n’est pas exhaustive : E9 à E10 = Vasculogenèse, développement des cavités cardiaques E10.5 = Trachée et arcs aortiques E11.5 = Artères iliaques, développement des poumons, de l’œil ou des cavités nasales, E12.5 = Cœur, aorte, cavités nasales, œil, rétine, E13.5 = Glandes salivaires, Vessie E14.5 = Paupières, Gonades, Canal de Muller, Rein E18.5 = Morphologie complète de l’embryon

175 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lignée de glioblastome humain est greffée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique, avec une pompe implantée diffusant une molécule tumorale rechargée chaque semaine, pour étudier son effet sur la croissance de la tumeur et l'épilepsie. Le porteur décrit des crises d'épilepsie, des troubles moteurs et une perte de poids liés à la tumeur, un petit groupe étant gardé jusqu'à des signes de souffrance inévitables. Il affirme que ce microenvironnement cérébral ne peut être reconstitué in vitro et retient la souris immunodéficiente pour accepter la greffe humaine.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales restent souvent sans thérapeutique efficace. Certains types de ces tumeurs produisent de grandes quantités d’une molécule nommée D2HG, et sont alors associées à une survie prolongée mais à un risque d’épilepsie accru. Nous émettons l’hypothèse et possédons des résultats préliminaires suggérant que le D2HG peut affecter l'excitabilité des cellules cérébrales neuronales par la régulation des principaux récepteurs excitateurs. En conséquence, une excitation déséquilibrée peut déclencher des crises épileptiques. C'est pourquoi, l'objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets de l'accumulation de D2HG sur la croissance des tumeurs cérébrales et sur développement de l’épilepsie. En complément d’études réalisées sur des tissus humains épileptiques postopératoires, nous souhaitons étudier les effets D2HG in vivo sur un modèle de souris de tumeur cérébrale. Le modèle de souris permet de reproduire les interactions de la tumeur humaine avec l'environnement cérébral et d'administrer en même temps des quantités contrôlées de D2HG. Les effets seront évalués sur la taille des tumeurs (identifiée par imagerie), la survie des animaux et sur l’épilepsie. Cette étude pourrait ouvrir la voie à de nouveaux développements thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet étudie le rôle du D2HG dans la neurobiologie des gliomes, translatant des concepts et des outils de l'électrophysiologie à la neuro-oncologie. Il vise à mieux comprendre comment le D2HG module la signalisation glutamatergique, influence l'excitabilité neuronale et la croissance tumorale, et comment les processus d’infiltration tumorale et de remodelage épileptique peuvent se co-localiser et permettre de développer de nouveaux biomarqueurs peropératoires. Les modèles animaux xénogreffés permettent d’étudier la croissance des cellules tumorales cérébrales placées dans un micro/macro-environnement récapitulant au plus près celui observé chez l’Homme et jouant un rôle clé dans le développement des cellules tumorales. Il n’est pas parfaitement modélisable in vitro. Il permet de plus d’étudier la réaction du tissu cérébral à la croissance de la tumeur et notamment l’épilepsie. De plus, il est maintenant reconnu que le microenvironnement neuronal joue un rôle majeur dans la croissance des gliomes, cette dernière ne pouvant se modéliser en cultivant ex vivo une ligne cellulaire. Les résultats de ce projet aideront à comprendre le rôle de la D2HG dans la croissance tumorale et l'épileptogenèse et son interaction avec d'autres effets de la mutation de l'IDH dans le meilleur modèle de glioblastome humain disponible aujourd'hui.

Procédures

Injection stéréotaxique de cellule tumorale - 1 fois (20 min, anesthésiée et analgésiée). Implantation de canule et d'une pompe - 1 fois (40 min, anesthésiée et analgésiée). Recharge de la pompe avec solution D2HG - 1 fois par semaine (5 min, anesthésiée). Imagerie bioluminescente - 1 fois par semaine (10 min, anesthésiée).

Impact sur les animaux

L'hypothermie pendant l'anesthésie. Les saignements à cause de l'endommagement des vaisseaux sanguins pendant l'intervention chirurgicale. Déshydratation pendant l'intervention chirurgicale en raison de l'hémorragie et pendant la période de récupération en raison de la difficulté à boire. Une inflammation excessive à cause des lésions tissulaires provoquées par l'intervention chirurgicale ou à une contamination accidentelle. Crises d'épilepsie et problèmes moteurs à cause de la développement de la tumeur. Perte de poids à cause de la réduction de la capacité à s'alimenter et au développement de la tumeur.

Devenir

Un petit groupe d'animaux sera conservé jusqu'à lorsqu’ils atteignent des signes de souffrance inévitables vu la croissance tumorale, selon les points limites, ils seront euthanasiés. Cela permettra d'estimer et de comparer la survie dans trois groupes d'étude différents (30 animaux au total). Le reste des animaux sera euthanasie pour des analyse électrophysiologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes qui ne peuvent se résumer exclusivement à des cellules tumorales se multipliant. Dans une tumeur cérébrale, il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement (notamment neuronal) qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro. De plus ce travail évalue les effets du glutamate (produit par le tissu nerveux et par les cellules tumorales) et du D2HG (produit par les cellules tumorales) sur le tissu tumoral et sur le tissu cérébral avoisinant. Ces interactions ne sont pas étudiables in vitro. Les études préalables des effets de la mutation IDH et du D2HG sur tissus humains aigus ex vivo et en culture in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum requis pour disposer de souris dans lesquelles des cellules tumorales humaines xénogreffées peuvent survivre. L’utilisation de cellules tumorales transduites par le gène de la luciférase permet un suivi en temps réel de la croissance tumorale. Cela évite le euthanasie séquentiel d’animaux au cours du temps. Compte tenu de la complexité des procédures chirurgicales impliquées dans ce projet, nous estimons la perte possible d'animaux à environ 15%, c'est pourquoi le nombre total d'animaux utilisés doit être porté à 175. Cela nous permettra d'avoir un nombre suffisant d'animaux pour l'analyse finale (150). Le nombre d'animaux à inclure dans les groupes lors des procédures a été a été estimé grâce à un calcul de puissance et les résultats seront évalués à l'aide de l'analyse statistique. Chaque animal sera exploité au mieux dans les différentes techniques pour obtenir un maximum d'informations. Chaque souris sera greffée dans l'hémisphère droit, et l'hémisphère gauche constituera un contrôle, limitant ainsi l'emploi de souris contrôles surnuméraires. Les mêmes animaux seront utilisés pour évaluer la survie et le volume tumoral. Les mêmes animaux seront utilisés pour étudier le volume tumoral et l’épilepsie.

Raffinement

Les animaux sont analgésiés à la Buprénorphine en pré-opératoire puis au Métacam en post-opératoire et anesthésiés à l’Isoflurane avant toute procédure chirurgicale. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Les animaux seront placés durant la chirurgie et le temps de réveil sur une plaque chauffante à 37°C jusqu’à leur réveil total (la température est monitorée à l’aide d’une sonde rectale durant la chirurgie). Après la greffe, une observation quotidienne des animaux sera effectuée jusqu'à l'euthanasie de l'animal. Une pesée quotidienne permettra de vérifier la régularité de leur prise de poids. Dès l'apparition de douleurs ou souffrances supérieures au tolérable (posture, amaigrissement, mauvais état du poil, apparition de lésions de grattage, etc.) la souris sera euthanasiée. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvage automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (12 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté.

Choix des espèces

Les rongeurs (souris) sont les modèles animaux classiquement utilisés dans les expériences et les études, cognitives ou thérapeutiques, menées en cancérologie. La taille et le poids de souris permet d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques, compte tenu du faible volume de distribution, et d’utiliser un faible volume expérimental dans l’animalerie. Les souches de rongeurs consanguines immunodéficiences (Athymic-Nude) permettent d’utiliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. Les lignées de souris immuno-compromises sont disponibles chez au moins 2 des éleveurs agréés en France. Des travaux pionniers utilisant ce type de matériel cérébral humain, ont été réalisés par des équipes internationales de recherche, validant ainsi ce choix. Les manipulations commenceront à partir de la 8ème semaine d’âge chez animaux sevrés et ayant atteint une taille et un poids adulte. La 8ème semaine chez les souris est le début du stade adulte le glioblastome étant une tumeur de l’adulte chez l’Homme.

441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est provoquée par injection intracérébrale d'un détergent sous anesthésie, complétée par des injections d'un marqueur de prolifération, pour étudier la régénération de la myéline dans la sclérose en plaques chez des souris génétiquement modifiées. Le porteur indique une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque d'un fixateur pour prélever le cerveau. Il affirme que la myélinisation ne peut être reproduite que chez un animal vivant "dans son intégrité" et retient la souris comme modèle de référence des récepteurs de la vitamine A.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une membrane biologique, essentiellement composée de lipides, qui forme une gaine autour des fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, son remplacement est effectué par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche les OL de reformer la myéline conduisant aux symptomes cités précedemment. Il est important de comprendre pourquoi les OL ne forment plus la myéline. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler ces OL pour qu’ils régénèrent la myéline à nouveau. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons des facteurs impliqués dans la génération des OL pour mieux comprendre comment les stimuler à régénérer la myéline. De plus, dans la SEP les cellules immunitaires du SNC, les cellules microgliales (CM), contribuent à la pérennisation de la signalisation inflammatoire mais assurent aussi l’élimination des debris de myéline pour stimuler la remyélinisation. Les déterminants moléculaires impliqués dans le contrôle de ces fonctions opposées des CM ne sont pas connus, alors que leur connaissance est critique pour le développement de nouveaux traitements. Afin de caractériser ces déterminants, nous étudierons les CM et la progression de la remyélinisation par les OL en induisant une perte minime de myéline chez des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

La myéline est une gaine biologique composée majoritairement de lipides qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est synthétisée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL) et est nécessaire pour la bonne conduction des influx nerveux. La dégradation de la myéline est un processus physiologique naturel au cours duquel les cellules immunitaires du système nerveux central, les cellules microgliales (CM), éliminent les débris de myéline. Ceci stimule ainsi à nouveau les OL à renouveler la myéline. Toutefois, chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est la cible du système immunitaire qui entraine une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher les OL à régénérer la myéline. Différents acteurs ont été identifiés comme facteur stimulant la formation de myéline dans la SEP, notamment des récepteurs de la forme bioactive de la vitamine A. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces récepteurs dans la formation des OL pour comprendre comment ceux-ci favorisent la myélinisation aussi bien en conditions physiologiques qu’en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques impliquant la vitamine A. D’autre part, nous caractériserons comment la myéline et notamment les lipides la composant sont pris en charge par les cellules microgliales (CM) pour être éliminés en utilisant des souris génétiquement modifiées. Cette information peut orienter des stratégies thérapeutiques basées sur un apport d’acides gras spécifiques dans la SEP.

Procédures

Une injection intrapéritonéale d’un produit marquant les cellules en prolifération cellulaire sera effectuée sur 231 animaux lors de la procédure 2, et sur 120 animaux lors de la procédure 3, soit sur un total de 351 animaux. Cette injection ne dure qu’une dizaine de secondes entre le moment où l’animal est saisi et le produit injecté. Nous réaliserons également une injection intracérébrale d’un produit détergent pour induire la démyélinisation unilatéralement sous anesthésie générale. Cet acte chirurgical sera réalisé sur 90 animaux en procédure 1, et sur 231 animaux en procédure 2. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal. Au total, 321 animaux recevront une injection intracérébrale une seule fois.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales vont génèrer un stress chez l’animal. Les procédures des injections intracérébrales peuvent être douloureuses et générer un stress/déconfort à l’animal. Ces procédures seront effectuées par un expérimentateur entraîné sous anesthésie générale avec des propriétés analgésiques et ne devraient pas engendrer de troubles majeurs visibles de comportement car les lésions induites par l’injection seront unilatérales et très limitées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permet de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires (de type Western Blot). D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque d’un agent fixateur sera réalisée. Ceci permet la fixation complète et homogène des tissus, y compris du cerveau. Les organes pourront ainsi être prélevés et utilisés à des fins d’imagerie.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un autre modèle animal dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités des types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant et la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs des formes bioactives de la vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié les programmes moléculaires contrôlées par ces récepteurs ainsi que les traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, ce projet émane des nombreuses analyses in vitro réalisées sur des cultures cellulaires qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.

Réduction

Dans notre projet nous utilisons le nombre minimal d’animaux permettant d’effectuer les analyses statistiques afin de révéler les différences significatives (n=3). En effet, ces effectifs ont été déterminés à partir de données de la littérature et sont suffisants pour voir si on obtient des différences en comparant la moyenne (et autres paramètres) des différentes conditions, notamment par l'utilisation d'un test de Wilcoxon, ou de Kruskall-Wallis. De plus nous utilisons les deux sexes pour ne pas produire de façon inutile les femelles qui sont plus rarement utilisées pour ces analyses à cause d’effets possibles dus aux différences hormonales ou sexuelles au niveau des fonctions de cellules étudiées. C’est un risque dans cette étude, que nous allons contrôler par une comparaison des résultats provenant des mâles et des femelles pour chaque condition expérimentale et génotypique. Pour minimiser le nombre d’animaux nous allons injecter qu’un hémisphère pour utiliser le deuxième comme contrôle. De plus, les effets de l’intervention chirurgicale (injection de solution saline) seront évalués sur un groupe d’animaux contrôle.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés, en groupe, et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Sont mis à la disposition des souris ad libitum des croquettes et de l’eau. La litière est renouvelée une fois par semaine. Ici, nous minimiserons la douleur chez les animaux. En effet, la dose de lysolécithine utilisée étant très faible, les dégradations de myéline seront mineures et ne devraient pas générer de troubles chez l’animal durant le suivi expérimental. Les procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale accompagnée d’analgésiques (Xylazine/Kétamine) afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie, les yeux des animaux sont protégés du dessèchement. Ils sont préservés du refroidissement provoqué par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération, et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Les injections intrapéritonéales engendrent un stress chez l’animal. Les animaux ayant reçu l’injection seront remis en groupe en cage et surveillés. Les mises à mort des animaux seront effectuées par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones, assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La synthèse de myéline (ou myélinisation) est assurée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Chez des patients atteints de sclérose en plaques, la myéline est dégradée par le système immunitaire. La régénération de myéline par les OL (ou remyélinisation) est très limitée voire inexistante. Par conséquent, la transmission des messages nerveux est moins efficace et les patients souffrent de différents symptomes tels que des déficits moteurs et cognitifs. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler les OL, notamment via la vitamine A, à régénérer la myéline similairement à leur génération lors du développement embryonnaire En effet, la formation des OL se déroule durant le développement pré et post-natal. Leur formation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de différents types cellulaires qui ne peut être reproduit que sur un animal vivant dans son intégrité. Pour comprendre comment les OL sont ainsi formés, un modèle d’étude ayant un système nerveux proche de l’Homme est nécessaire. La souris est un très bon modèle puisqu’elle récapitule très bien la formation des OL et de la myéline chez l’Homme. Bien que le rôle de la vitamine A dans la formation des OL n’est pas encore élucidé, il est nécessaire d’avoir un modèle où la vitamine A est caractérisée. La souris reste le modèle de référence sur les travaux de la vitamine A. En effet, les mécanismes d’action de la forme bioactive de la vitamine A sont très bien caractérisés chez la souris et différents traitements pharmacologiques sont déjà disponibles pour évaluer son mode d’action. Les étapes clés de la formation de myéline chez la souris ont lieu au jour de la naissance 0 (dit P0), P7, P14, P21 et à l’âge adulte (8 semaines). Pour suivre et comprendre comment la myéline est formée, nous devrons étudier des souris à ces stades de développement. Pour étudier la régénération de myéline en conditions pathologiques comme la sclérose en plaques, des souris adultes (8 semaines) seront utilisées afin d’évaluer le processus d’élimination et de régénération de la myéline.

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie injecte un vecteur viral dans le cerveau pour bloquer une protéine des cellules gliales, puis les souris, logées seules, passent des tests d'anxiété en arène, de préférence alimentaire et un jeûne de 24 heures, afin d'étudier la régulation de la balance énergétique. Le porteur reconnaît que la récupération après chirurgie, l'isolement et le jeûne sont sources de douleur, de stress et de perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'étudie le rôle de ces cellules gliales et renvoie au long terme d'éventuelles voies contre l'obésité.

Objectifs

L’obésité et ses comorbidités représentent un grave problème de santé publique. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques de l’organisme et les apports par la prise alimentaire) est assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu à une région cérébrale appelée complexe vagal dorsal (CVD). Le CVD dispose de réseaux de neurones sensibles à de multiples signaux informant du niveau des réserves énergétiques de l’organisme, mais aussi de cellules gliales dont la contribution au contrôle de la balance énergétique commence à être révélée. Les cellules gliales sont équipées de protéines appelées connexines qui leur permettent d’envoyer des signaux aux neurones et d’établir une communication directe entre cellules gliales adjacentes. Nous utilisons des vecteurs viraux pour inhiber la fabrication des connexines spécifiquement dans les cellules gliales du CVD. Notre objectif global est d’évaluer le rôle joué par les connexines des cellules gliales du CVD dans le contrôle de la balance énergétique chez la souris. Les procédures décrites permettront de déterminer si les connexines des cellules gliales sont impliquées : 1) dans les préférences alimentaires des animaux ; 2) dans le maintien du métabolisme énergétique, le contrôle de la prise alimentaire et hydrique, ainsi que la régulation des dépenses énergétiques ; 3) dans les réponses comportementales, hormonales, et cellulaires à une réalimentation après mise à jeun.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales du tronc cérébral caudal régulent la balance énergétique chez le rongeur. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle des connexines 43 fortement exprimées par ces cellules gliales : 1) dans les choix alimentaires entre une nourriture standard et une nourriture enrichie en graisse et sucre ; 2) dans le contrôle fin de la prise alimentaire, de la prise hydrique, des dépenses énergétiques, ou encore de l’activité locomotrice ; 3) dans la réponse au jeûne et à l’hyperphagie consécutive à un jeûne. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie morphinique et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un vecteur viral contrôle ou ciblant la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité et pour les mesures individuelles de prise alimentaire et la réponse au jeûne et à l’hyperphagie consécutive à un jeûne. Après récupération chirurgicale, un tiers des animaux subira un test comportemental, au cours duquel ils sont placés dans une arène pendant 30 minutes pour mesurer leur activité exploratoire et établir leur niveau d’anxiété. Une semaine après, un test de préférence alimentaire sur une durée de 8 jours sera employé. Les souris auront accès, à deux régimes différents : un régime standard et un régime enrichi en graisse et en sucre qui ne génère aucune douleur ou inconfort. A l’issue de ces régimes, soit à 6 semaines post-chirurgie, les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie générale et le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem. Après récupération chirurgicale, les autres animaux seront transitoirement hébergés dans des cages couplées à un système de calorimétrie indirecte pour étudier le métabolisme des animaux. Cet hébergement dure 3 jours, et aura lieu au cours de la 6e semaine post-chirurgie ou au cours de la 4e puis de la 7e semaine post-chirurgie. Le premier jour permet à l’animal de s’habituer à son environnement. Les enregistrements sont réalisés au cours des 48h suivantes. A la fin de la 9e semaine post-chirurgie, ces animaux sont utilisés dans un protocole visant à mesurer l’hyperphagie consécutive à un jeûne, les niveaux de signaux métaboliques en réponse au jeûne ou à la réalimentation, ainsi que la réponse neurale à ces modifications du statut nutritionnel. Ce protocole a lieu après une habituation de 3 jours, au cours de laquelle la nourriture est retirée de la cage pendant 2h afin de minimiser l’angoisse des animaux vis-à-vis du jeûne. Les souris du groupe contrôle sont mises à jeun pour une durée de 24h et les souris du groupe test sont mises à jeun pendant 21h et sont réalimentées pendant 3 heures. Après ces 24h, soit à 9 semaines post-chirurgie, les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie générale et le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem.

Impact sur les animaux

Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire dans la suite des procédures. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après récupération postopératoire, l’hébergement de 3 jours dans les Physiocages nécessaires pour l’exploitation du système de calorimétrie indirecte est une source d’inconfort, dû à l’environnement hermétique qui limite les contacts olfactifs avec les congénères. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal, entrainant une perte de poids corporel importante chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. L’exposition aux régimes riches en graisse et en sucre ne génère aucune douleur ou inconfort mais la pesée toutes les 12 heures pourrait également constituer une nuisance. La récupération des cerveaux fixés, indispensable aux études immuno-histologiques post-mortem, nécessite une mise à mort par perfusion intracardiaque.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortem sont indispensables : 1) Pour vérifier l’expression du vecteur viral par les cellules gliales dans la région d’intérêt ; 2) et caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la consommation alimentaire et du poids corporel.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 48 souris mâles, réparties en 6 lots de 8 animaux. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Un précédent projet pilote nous a permis de vérifier l’efficacité de nos vecteurs viraux à réduire spécifiquement la fabrication des connexines des cellules gliales dans la zone cérébrale d’intérêt. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction. La procédure 1 mobilise deux lots de 8 animaux pour tester l’impact de la réduction des connexines sur les préférences alimentaires des souris. La mesure des préférences alimentaires entre un régime alimentaire standard et un régime riche en gras et en sucre nécessite un effectif de 8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Deux lots d’animaux sont à comparer dans cette procédure, l’un ayant été traité avec le vecteur viral permettant de réduire la fabrication des connexines, et l’autre avec un vecteur viral contrôle. L’effectif de 8 animaux par lot est également compatible avec les autres mesures prévues dans cette procédure 1 (comportement exploratoire des animaux, qui donne une mesure du niveau d’anxiété) et analyse post-mortem du nombre de cellules gliales ayant incorporé les vecteurs viraux). La procédure 2 mobilise 4 lots de 8 animaux pour tester l’impact de la réduction des connexines sur les réponses à un jeûne ou la réintroduction de nourriture après un jeûne : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la fabrication des connexines) x 2 statuts nutritionnels différents (à jeun pendant 24h et à jeun pendant 21h puis réalimenté pendant 3h). Les mesures à effectuer nécessitent 8 animaux par lot compte tenu de la variabilité des mesures (mesure de la consommation alimentaire des animaux renourris ; mesure post-mortem sur le tissu cérébral analyse de la morphologie des cellules gliales, cartographie des neurones activés). Cet effectif par lot est compatible avec les mesures préalables prévue dans la procédure 2 (suivi de la consommation alimentaire et analyse du métabolisme énergétique par mesure de la consommation d’oxygène et de la production de dioxyde de carbone).

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie des points limites et points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et anesthésie. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique pré-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids et une analgésie est systématiquement administrée. La mise à mort sera réalisée sous analgésie préopératoire et anesthésie générale. Le recours à un système de calorimétrie indirecte s’inscrit dans une démarche de raffinement puisqu’il permet, en une seule étude et par des méthodes non invasives, la mesure de plusieurs paramètres relatifs au métabolisme énergétique. Les mesures sont effectuées simultanément sur un même animal pour faciliter les études de corrélations entre les différents paramètres mesurés. Avant les tests de réponse au jeûne, les animaux seront habitués à la manipulation et au retrait de la mangeoire (pendant 2h en phase diurne les trois jours précédant la mise à jeun de 24 h). Cette phase d’habituation a pour objectif de réduire l’angoisse animale, notamment causée par l’absence de nourriture en fond de cage et d’éviter, au cours de la phase de réalimentation, des fluctuations importantes de la prise alimentaire dû à la manipulation des animaux. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie d’injection intracérébral jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Les atlas stéréotaxiques se basent sur cet âge pour estimer les coordonnées stéréotaxiques des structures ciblées.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par inhalation de CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules d'ostéosarcome sont injectées dans le tibia sous anesthésie, y compris chez de très jeunes animaux, pour reproduire cette tumeur osseuse de l'enfant et suivre sa progression. Le porteur indique que l'apparition de métastases peut provoquer une gêne respiratoire entraînant une mise à mort immédiate, et un boitement traité au paracétamol. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du microenvironnement tumoral et retient une lignée conservant un système immunitaire.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente chez les enfants et les adolescents (âge médian au diagnostic 15 ans). Pour mieux comprendre l’ostéosarcome et donc mieux le traiter, il est nécessaire de développer des modèles animaux récapitulant les interactions entre les cellules tumorales et l’environnement osseux prenant en compte l’âge de survenue. La majorité des modèles d’ostéosarcome sont établis à partir de lignées cellulaires humaines hors de l’os et ne permettent pas alors de reproduire l’interaction de la tumeur avec l’environnement osseux. De plus ces modèles ne possèdent pas le système immunitaire afin d’éviter le rejet de greffes des cellules humaines. Pour mieux comprendre la biologie de cette tumeur, un modèle récapitulant les caractéristiques environnementales et pédiatriques (immaturité du système immunitaire et influence hormonale notamment) serait nécessaire. Nous avons un modèle d’ostéosarcome de souris établi dans le tibia chez des animaux avec le système immunitaire (immunocompétents) et âgés de 5 semaines. Nous souhaitons à présent établir une greffe dans le tibia chez des animaux plus jeunes afin de reproduire l’ostéosarcome de l’enfant (survenue et traitement de l’ostéosarcome avant 13-15 ans). Nous souhaitons le caractériser en termes de progression, histologie, signature moléculaire et immunitaire.

Bénéfices attendus

Nous avons un modèle d’ostéosarcome implanté dans le tibia chez des souris immunocompétentes âgés de 5 semaines. Cet environnement d’origine influe sur le comportement de la tumeur (progression, résistance). Or, les hormones, notamment sexuelles, ont été démontrées comme agissant également sur le développement des os. Un modèle d’ostéosarcome au niveau de l’os établi chez des animaux plus jeunes récapitulerait les étapes essentielles de l’ostéosarcomagenèse d ans le contexte du système immunitaire immature avec une influence hormonale. Un tel modèle permettrait d’avancer les connaissances biologiques de l’ostéosarcome et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en tenant compte de ses particularités notamment celles liées à l’âge de survenue de cette tumeur pédiatrique avec un pic à la puberté.

Procédures

Les animaux vont subir une injection orthotopique des tumeurs en intratibiale dans toutes les procédures sous anesthésie et de durée 5 min au maximum.

Impact sur les animaux

En cas d’apparition des métastases, une gêne respiratoire peut subvenir (fréquence respiratoire irrégulière ou accélérée). Cette gêne est rapidement repérée grâce aux observations cliniques régulières et l’animal sera mis à mort immédiatement pour éviter sa souffrance. Dans le cas de la douleur de l’animal, le plus souvent observer par le boitement de l’animal qui ne pose pas sa patte au sol, on administrera un antalgique (paracétamol, 300 mg/kg) dans la boisson des animaux. En cas de non amélioration de l’état de l’animal jusqu’à 3h après l’administration du paracétamol, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par l’inhalation de CO2 à la fin des procédures et les tissus seront récupérés pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le microenvironnement de la tumeur étant très complexe, il n’existe pas un autre moyen i.e. in vitro, pour reproduire sa complexité avec tous ses composants, notamment immunitaires et d’autres modèle in vivo sont insuffisants.

Réduction

Ces expériences de la mise en place du modèle par l’injection intratibiale des cellules tumorales de souris seront réalisées de façon séquentielle par les procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A la fin des procédures les animaux seront mis à mort et les tissus collectés afin de construire une banque tissulaire pour d’autres analyses histologiques et moléculaires. Il n'y aura pas de statistiques pour les procédures 1 et 3 avec une détermination de la quantité des cellules à injecter par la voie intratibiale. Pour les procédures 2 et 4 des tests paramétriques ou non-paramétriques, selon les règles de leur application, pour la caractérisation de l’environnement tumoral pourront être appliqués.

Raffinement

Toute intervention d’injection intratibiale sera faite sous anesthésie générale. Les animaux seront manipulés sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale. Une définition précise des points limites conduisant à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux. Une surveillance adaptée des animaux, une pesée bihebdomadaire et une observation au minimum 3 fois par semaine permettront d’éviter toute douleur ou souffrance de l’animal. Dans le cas de la douleur de l'animal, le plus souvent observer par le boitement de l'animal qui ne pose pas sa patte au sol, on adminsitrera un antalgique (paracétamol) sans influence sur le système immunitaire dans la boisson des animaux. Les animaux plus jeunes à l’implantation tumorale seront surveillés avec attention accrue sur la journée après le réveil afin de vérifier que la mère ne les rejette pas. En plus, pour éviter le rejet par la mère nous minimiserons le temps de séparation des petits avec la mère. Nous remettrons les petits dans le nid après qu’ils aient été frottés avec de la litière de la cage d’origine.

Choix des espèces

Nous disposons d’un modèle d’ostéosarcome établi par l’injection dans le tibia dans les souris âgées de 5 semaines. Ce modèle est à notre connaissance le plus proche de l’ostéosarcome humain (agressivité, pouvoir métastatique, environnement immunitaire) hormis les cancers spontanés. Les cellules utilisées sont une lignée cellulaire d’ostéosarcome d’origine des souris de la même souche ; ce modèle peut donc être établi sur un animal immunocompétent, condition nécessaire pour étudier l’environnement immunitaire de cette tumeur. L’âge plus jeune ne devrait pas influer le taux de prise tumorale, voire le taux de prise peut être améliorer avec le système immunitaire immature avec moins de rejet de greffe.

40 cailles japonaises adultes vont être utilisées dans des procédures classées en gravité modérée, puis gardées pour de futurs projets ou confiées à une association pour placement. Chaque oiseau est logé en cage individuelle et déplacé deux à quatre fois par semaine pendant trois semaines pour des tests de réaction à la nouveauté, isolé au plus dix minutes, son comportement étant filmé. Le porteur situe la gravité surtout dans le logement individuel, qu'il reconnaît comme une nuisance pour les femelles, et affirme n'infliger aucune atteinte physique. Il décrit un projet collaboratif d'observation du comportement et retient la caille pour sa petite taille et son développement rapide.

Objectifs

Le projet global est un projet collaboratif multisite de science ouverte qui vise à collecter le plus de données possibles sur la cognition des oiseaux afin de comparer différentes espèces, d'évaluer la variabilité individuelle et de relier facteurs socio-écologiques (alimentation, socialité...) et évolution de capacités cognitives caractéristiques de chaque espèce. Le premier volet du projet porte sur la néophobie, c'est-à-dire la réaction à la nouveauté de différentes espèces d'oiseaux et de différents individus. La néophobie détermine la façon dont les individus vont interagir avec leur environnement et l'explorer et va donc avoir des conséquences sur l'adaptation et la survie des individus, notamment dans un environnement changeant. Toutes les espèces sont les bienvenues dans le projet collaboratif. Celle que nous étudierons est la caille japonaise. Deux autres laboratoires vont utiliser cette espèce, ce qui permettra d'obtenir plus de données et d'évaluer la reproductibilité et la généralisation du protocole et des résultats obtenus. Le projet s'articule autour de 3 questions : la première est de comparer la néophobie chez différentes espèces et de voir si l'espèce peut prédire le niveau de néophobie ; la deuxième est d'examiner les effets de facteurs socio-écologiques tels que la taille, le régime alimentaire, la socialité... sur la néophobie ; et la troisième est de tester la répétabilité dans le temps et dans le contexte des réactions individuelles.

Bénéfices attendus

Nous espérons apporter une contribution significative à un projet collaboratif multisite qui devrait aider à mieux comprendre le comportement et la biologie des oiseaux en général, et plus précisément leurs capacités cognitives. D'un point de vue plus restreint, les données collectées nous permettront aussi de mieux connaître le comportement et la variabilité individuelle des cailles. La néophobie est un comportement déterminant lors de toute situation nécessitant de placer l'animal dans un environnement nouveau ou de le confronter à des objets inconnus. Il est donc crucial de pouvoir la mesurer chez différents individus et de voir comment elle se caractérise, en général mais aussi chez chaque individu.

Procédures

Les animaux seront élevés en cages individuelles. Cela peut constituer une nuisance pour les femelles, mais pas pour les mâles, qui ne se tolèrent pas. Les cages seront néanmoins placées dans une pièce où les oiseaux pourront se voir et s’entendre. Les individus seront déplacés et testés dans un dispositif auquel ils auront été habitués. Ils seront testés au plus une fois par jour, 2 à 4 fois par semaine, pendant 3 semaines. Ils seront isolés le temps des tests expérimentaux (pas plus de 10 minutes). Leur comportement sera filmé afin que la présence d'un expérimentateur ne les perturbe pas.

Impact sur les animaux

Les éléments qui sont susceptibles de perturber les animaux et de les stresser sont le déplacement et l'isolement lors des tests (pas plus de 10 minutes par jour), et la présence d'un objet nouveau. La présence d’un objet nouveau est par exemple susceptible de réduire la mobilité des animaux qui auront peur de l’approcher. Nous nous attendons néanmoins à ce que les effets de ces perturbations soient minimes et à ce que les animaux retrouvent très rapidement un comportement habituel une fois leur cage de vie et les congénères retrouvés (les animaux seront hébergés dans des cages individuelles mais dans une pièce où ils peuvent voir et entendre des congénères).

Devenir

Le projet n’implique aucune atteinte à l’intégrité physique et comportementale des animaux. Ceux-ci pourront donc être, soit gardés au laboratoire pour de futurs projets, soit confiés à une association de réhabilitation des animaux de laboratoire pour placement en refuge ou en famille d’accueil.

Remplacement

Le projet consiste à observer le comportement d’animaux vivants libres de leurs mouvements et de leurs réactions, ce qui, par essence, exclut tout remplacement par des modèles autres que ces animaux.

Réduction

Le projet s'inscrit dans le cadre d'un projet plus vaste qui cherche à collecter le plus de données possibles venant de structures et institutions du monde entier. Il se base sur le modèle d'autres études multisites qui ont réussi à constituer de vastes banques de données qu'aucune structure ou institution aurait pu collecter à elle seule. Cette approche collaborative multisite nous permet de réduire au minimum le nombre d'individus testés, tout en gardant un échantillon suffisant pour observer des effets modérés à forts et des variations entre individus.

Raffinement

Tout sera fait pour limiter les manipulations des animaux. Les tests nécessiteront néanmoins de déplacer les animaux et de les isoler de façon ponctuelle et limitée dans le temps (pas plus de 10 minutes par jour). Les oiseaux seront hébergés dans des cages individuelles enrichies (avec nourriture et eau à volonté, abri, substrat permettant d’exprimer des comportements naturels), en présence de congénères (contact auditif et visuel). Ils seront soignés et observés tous les jours. La détection de tout changement de comportement conduira à isoler l'individu et à le soigner si nécessaire, l’objectif étant de pouvoir le remettre dans ses conditions de vie habituelles dès que possible.

Choix des espèces

Les cailles japonaises sont domestiquées depuis des siècles. En raison de leur taille relativement petite et de leur développement rapide, elles sont rapidement devenues populaires tant dans l'industrie agricole que dans la recherche scientifique. Ce sont des gallinacées dont les capacités cognitives ne sont pas toujours suffisamment explorées. Pourtant, elles sont capables d'apprentissage et sont douées d'une mémoire pouvant aller jusqu'à au moins 1 mois. En tant que telles elles ont donc toute leur place dans une étude comparative sur la cognition chez les oiseaux. Leur comportement social (notamment maternel), leur régime alimentaire et leurs cycles biologiques sont bien connus, ce qui permettra de fournir les données socio-écologiques nécessaires, à la comparaison des autres espèces du projet collaboratif qui englobe notre étude, et à la compréhension de l'évolution des capacités cognitives propres à chaque espèce. Les cailles utilisées seront âgées de 7 à 8 mois. A cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle et on peut considérer que leurs traits de personnalité sont stables, ce qui nous permettra de caractériser chaque individu de façon robuste et de comparer les différents individus entre eux pour estimer la variabilité inter-individuelle.

110 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur humaine greffée, elles reçoivent cinq injections dans la veine de la queue puis sont imagées pour suivre la colonisation de la tumeur par des bactéries, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et dislocation cervicale. Le porteur précise que le projet est une prestation de service pour un client privé cherchant à utiliser ces bactéries comme vecteur thérapeutique. Il affirme que la physiologie globale de l'animal ne peut être remplacée pour étudier cette colonisation.

Objectifs

Ce projet est réalisé dans le cadre de la contractualisation de prestations de services pour un partenaire privé. Cette étude vise à imager la colonisation par des bactéries d'un modèle de cancer implanté en sous-cutané grâce au 18F-fluorodeoxysorbitol (18F-FDS).

Bénéfices attendus

La visualisation des bactéries grâce au 18F-FDS permettra de valider la colonisation des tumeurs par les bactéries. Ainsi, elle permettra à notre client de définir si les bactéries utilisées dans cette étude pourraient être interessantes pour vectoriser des molécules d'intéret vers les tumeurs dans une optique d'utiliser ces bactéries comme un nouvel outils de ciblage thérapeutique.

Procédures

Les animaux recevront au total 5 injections en intraveineuse dans la veine caudale en vigile dans un système de contention dédié: J0: 1 injection intraveineuse des bactéries ou du véhicule (volume environ 50µL; durée moins de 1min) et 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J1: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J4: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J6: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). NB: la demi-vie du 18F étant de 110min, il est nécessaire de réinjecter les souris pour chaque point de suivi soit à J1, J4 et J6.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétaire de l'injection de 18F-FDS ou des bactéries n'est attendu sur la durée du suivi en imagerie. Les effets indésirables pourraient être liés à la pousse tumorale et à une nécrose précoce de la tumeur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par surdosage d'anesthésie gazeuse suivie d'une dislocation cervicale en vue des analyses de comptage des organes ex vivo.

Remplacement

La physiologie globale de l'animal entre en jeu dans le processus étudié (colonisation de bactéries depuis le tractus digestif vers des tumeurs). Ainsi, l'animal ne peut être remplacé dans cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience de notre client sur ces modèles murins de tumeurs et le nombre d'animaux nécessaires pour apporter une valeur statistique à l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire est réduit au maximum en sélectionnant uniquement les expérimentations essentielles.

Raffinement

Un enrichissement des cages d’hébergement sera assuré par l'ajout de briquettes de bois. Les animaux seront suivis de façon quotidienne. Ainsi tout signe d’inconfort pourra être détecté rapidement ce qui permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est classiquement utilisée pour les études en cancerologie. Son statut immunitaire permettant de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines. Les animaux seront inoculés avec une xénogreffe chez notre client à 5 semaines. Ils seront transférés par un transporteur agréé vers notre établissement à 6 semaine et seront hébergés pour une durée estimée à 4 semaines (le temps de la croissance tumorale).