Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Synchronisation de la méiose chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un gavage et une injection intrapéritonéale unique, puis sont mises à mort pour le prélèvement de leurs testicules, afin d'étudier la synchronisation de la méiose. Le porteur indique que la contention lors du gavage et l'introduction de la pipette peuvent générer stress, petites blessures et douleur. Il affirme que la souris est le seul mammifère permettant cette étude génétique et reconnaît qu'un modèle organoïde en développement ne peut pas encore la remplacer.
Objectifs
Notre projet a pour but de mieux comprendre la division cellulaire de cellules germinales appelée méiose. En effet, cette division est une étape indispensable de la production d’ovocytes et de spermatozoïdes. Son bon fonctionnement est essentiel pour transmettre le matériel génétique à la génération suivante. De manière intéressante, lors de la première étape de la méiose, les chromosomes subissent de nombreuses cassures de la double hélice de l’ADN (CDB) qui doivent être réparées. Cette étape est nécessaire pour le bon fonctionnement de la méiose. Plus précisément, notre projet a pour but d’étudier le lien entre le mécanisme de recombinaison homologue, initié par la formation de ces cassures double brin de l’ADN, et les mécanismes de contrôle de la structure du chromosome lors de la de la méiose. Nous avons identifié plusieurs protéines nécessaires à la formation des CDB en méiose. Notre premier objectif est de déterminer les sites de fixation à l’ADN de ces protéines, à l’échelle du génome entier. Dans un second temps, nous souhaitons déterminer si les protéines contrôlant l’organisation structurale des chromosomes méiotiques, sont aussi impliquées dans le contrôle de la fixation des protéines nécessaires à la formation des cassures double brin de l'ADN et d'évaluer les dépendances génétiques. Ce projet nécessite le développement d’approche de biochimie, biologie moléculaire, génomique et microscopie à haute résolution. Le protocole proposé permettra d’enrichir in vivo les cellules dans lesquelles les protéines que nous étudions sont présentes afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires par expérience. Le protocole sera utilisé sur des souris portant des mutations dans les gènes qui codent pour les protéines impliquées dans la recombinaison en méiose ainsi que sur des souris portant des mutations dans les gènes qui codent pour des protéines qui contrôlent la structure du chromosome méiotique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre comment les protéines impliquées dans la formation des cassures double brin de l'ADN sont régulées par la structure des chromosomes et comment ces protéines peuvent à leur tour influencer la structure des chromosomes méiotiques. Cette régulation est une étape cruciale dans le bon déroulement de la transmission du matériel génétique intacte aux générations suivantes et permets d'éviter la transmission de matériel endommagé qui mène à des maladies génétiques, telles que la trisomie 21 ou à l'infertilité.
Procédures
Les animaux seront soumis à un Gavage et une injection unique intrapéritonéale .
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques que nous étudions ne causent aucun phénotype dommageable en dehors de l’infertilité des animaux. Néanmoins la procédure expérimentale peut affecter leur bienêtre: La contention lors du gavage par pipette, peut générer du stress. De plus, l’introduction de la pointe de la pipette peut générer des petites blessures et donc engendrer de la douleur. L’injection intrapéritonéale peut générer de la douleur au point d’injection et du stress lié à la contention. Pour limiter ces effets indésirables, les animaux seront manipulés par du personnel expérimenté, le temps de manipulation sera réduit à minima, les points limites seront déterminés au préalable et respectés scrupuleusement.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort pour le prélèvement de leurs testicules synchronisés
Remplacement
Notre projet propose l'utilisation de souris. Ce sont les seuls mammifères sur lesquels nous pouvons développer ces recherches. Le processus fondamental de la méiose est étudié dans d’autres espèces (invertébrés, plantes, unicellulaires) mais ces processus se sont différenciés au cours de l’évolution. Chez les mammifères, seule la souris permet d’approfondir l’étude de fonction de gènes par la génétique et la transgénèse. Il reste à noter qu’actuellement, dans le cadre d’une collaboration internationale, et avec un soutien financier fort, nous nous efforçons de mettre au point un modèle in vitro qui permettra de reproduire certaines étapes de la méiose, grâce à la mise en place d’organoïdes. A terme ce modèle nous permettra de tester le phénotype de certaines mutations dans le cadre d’expériences pilotes et évitera donc à générer des animaux inutilement. Pour l’instant, ce modèle n’est pas encore suffisamment au point pour y avoir recours et même au point, et il ne permettra pas non plus se substituer complètement à l’utilisation du modèle souris, car pour un grand nombre d’expériences le matériel généré par le modèle in vitro ne sera pas suffisamment important.
Réduction
L'optimisation des croisements pour réduire au maximum le nombre d’animaux élevés sera de rigueur. Les différentes expérimentation se feront doublon ou triplicate avec une analyse statistique appropriée
Raffinement
Tout au long de la procédure, les animaux seront observés. Des signes apparents, comportementaux et physiologiques de douleurs observés chez les animaux impliqués dans ce protocole expérimental seront rapportés dans le cahier d’expérimentation. Lors du gavage par voie orale les animaux seront pesées tous les jours, l’utilisation de grille de score et de points limites permettra de déterminer si un animal doit sortir de l’expérimentation et être ou mis à mort
Choix des espèces
Notre projet propose l'utilisation de souris. Ce sont les seuls mammifères sur lesquels nous pouvons développer ces recherches. En effet le processus fondamental de la méiose est étudié dans d’autres espèces (invertébrés, plantes, unicellulaires), mais ces processus se sont différenciés au cours de l’évolution. Pour l'instant, seule la souris permet d’approfondir l’étude de fonction de gènes par la génétique et la transgénèse chez le mammifère. Le protocole proposé permettra d’augmenter le nombre de cellules d’intérêt par expérience. Bien que dans le cadre d'une collaboration internationale nous nous efforçons de mettre au point un modèle organoïde pour les étapes précoces de la gamétogenèse, à l'heure actuelle, le recours aux animaux reste indispensable mais le protocole de la synchronisation de la méiose ici proposé permettra d’augmenter le nombre de cellules d’intérêt par expérience et ainsi drastiquement (allant jusqu'à un facteur 5) diminuer le nombre d'animaux utilisés.
Etude préliminaire du système ocytocine dans le cervelet chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié sous anesthésie sans réveil et l'autre en gravité modérée. Chaque souris subit une ou plusieurs chirurgies stéréotaxiques du cerveau de deux à six heures pour l'injection d'un virus, d'un traceur ou une stimulation optogénétique, le réveil s'accompagnant de stress, d'hypothermie et de difficultés à se déplacer et se nourrir dans les premières heures. Les animaux sont tués en fin de procédure pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative satisfaisante et mentionne une collaboration avec des théoriciens développant des modélisations à partir de ses travaux.
Objectifs
Le système ocytocinergique n’a jamais été étudié dans le cervelet. Ce projet pilote vise à établir la présence d’ocytocine et de ses récepteurs dans le cervelet de souris, ainsi qu’à en déterminer l’origine. Il pose les bases d’un projet global, qui décrit et caractérise la physiologie et le rôle du système ocytocinergique cérébelleux dans le fonctionnement cérébral L’ocytocine est une hormone dont la fonction principale, au niveau cérébral, est de contrôler les liens sociaux. Ainsi, on a recherché les voies ocytocinergiques principalement dans les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales, le système de récompense et de gestion des émotions, mais pas dans les régions comme le cervelet. En réalité, les fonctions de l’ocytocine sont plus complexes et les travaux récents indiquent qu’elle aurait plutôt pour rôle d’adapter finement les comportements et réactions physiologiques à l’environnement social. Le cervelet étant une structure clef pour ces adaptations, nous avons entrepris de déterminer s’il existe un système ocytocinergique dans le cervelet de souris. A l’aide de techniques d’immunohistochimie et de traçage des voies neuronales, nous mettrons en évidence et caractérisons la présence de récepteurs à l’ocytocine. Nous testerons également la présence et l’origine de l’ocytocine dans le cervelet de souris adulte
Bénéfices attendus
Des recherches récentes ont étendu les fonctions de l'ocytocine (OXT) et du cervelet bien au-delà de leurs rôles traditionnels attendus. Le neuropeptide OXT est devenu une molécule de grand intérêt en neurosciences en raison de ses effets pro-sociaux et de son potentiel prometteur en tant que nouvelle cible thérapeutique. Les données les plus récentes ont étendu le rôle de l'OXT au-delà de ses effets positifs célèbres. L’OXT régule la confiance, l'empathie, l'agressivité, l'excitation sexuelle, le sommeil, le stress, l'anxiété, la douleur et le système sensoriel, tout au long de la vie et chez les deux sexes. Pour donner une cohérence à ces effets génétique multi-caractériel, on peut proposer que l’OXT permet aux individus d'adapter leurs interactions avec leur groupe de manière flexible et dépendante du contexte. Une conséquence de ces travaux est que le système OXT a été largement étudié dans les régions cérébrales des réseaux sociaux et émotionnels ; mais pas dans le cervelet, ce dernier n’étant pas considéré comme faisant partie de ces réseaux. Pourtant, les recherches des quinze dernières années ont révélé le rôle du cervelet ne se limite pas au contrôle moteur. Il contribue aux systèmes cognitifs et émotionnels, ainsi qu'aux comportements addictifs et sociaux. En effet, en raison de sa large connectivité au cortex cérébral, le cervelet pourrait amorcer ou biaiser le traitement cortical des informations motrices, sensorielles, émotionnelles et cognitives dans des directions contextuellement pertinentes. Cette fonction pourrait expliquer la contribution du cervelet à certains troubles cognitifs et émotionnels (dyslexie, syndrome cérébelleux cognitif-affectif) ainsi qu’à des troubles neurodéveloppementaux (troubles du spectre autistique, schizophrénie, troubles déficitaires de l’attention). Le cervelet étant une structure clef pour ces adaptations, nous avons entrepris de déterminer s’il existe un système oxyctocinergique dans le cervelet de souris et son rôle. Plusieurs articles indiquent la présence d’ocytocine et de ces récepteurs dans le cervelet humain et de rongeur (rat et souris). Cependant, aucune donnée ne le démontre, et surtout, il n’est pas prouvé que ce système soit fonctionnel. Nous devons donc récolter, via ce projet préliminaire, les preuves qu’un système ocytocinergique fonctionnel existe bel et bien dans le cervelet de souris afin de proposer son étude et sa caractérisation détaillée dans la suite de nos travaux.
Procédures
- 44 Souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 2 et 4h pour une injection de virus rAAV, 22 jours plus tard le même groupe de 22 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique pour la stimulation optogénétique pour une durée totale entre 2 et 4h - 16 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 1et 2h pour une injection de traceur anatomique - 60 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 3 et 6h pour l'enregistrement neuronal après injection d'ocytocine
Impact sur les animaux
-Stress du au réveil de l’animal pendant quelques minutes -Hypothermie du au réveil de l’animal après l’anesthésie -Difficulté pour se déplacer se nourrir et s’abreuver dans les 2 premières heures suivant le reveil
Devenir
Procédure n°1, Injections stéréotaxiques de virus AAV ou d’une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel avec stimulation optogénétique : Les 44 souris de la procédure seront mises à mort en fin de procédure pour prélevement d'organe Procédure n° 2 Injection stéréotaxique d’un traceur neuroanatomique Les 16 souris de la procédure seront mises à mort en fin de procédure pour prélevement d'organe Procédure n° 3 Chirurgie stéréotaxique pour enregistrement neuronal avec injection d’ocytocine (voie intrapéritonéale, Intra cérébrale et élacridar IV) Les 60 souris de la procédure seront mises à mort par surdosage d’anesthésie chimique à la fin de la procédure chirurgicale, ces animaux ne pourront pas être ré utilisés par la suite pour d’autres études, cette procédure fait partie d’une étude préliminaire et les cerveaux seront prélevés pour des analyses anatomiques
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences ex vivo et in vivo sur l’animal), car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu, de ce fait et pour répondre aux nombreuses questions de l'effet de l'oxycitocine par la communautée scientifique des lignées de souris transgénique ont été crées, nous utiliserons l'une d'elle, dont la modification transgénique entraîne la suppression de la séquence flanquée dans les neurones exprimant l'oxytocine. Néanmoins, nous avons une collaboration avec des chercheurs théoriciens qui vont développer des modélisations sur la base de notre travail
Réduction
Ce projet est une étude pilote utilisant un petit nombre d’animaux, les données preliminaires vont nous permetre d’affiner, d’arrêter ou de continuer les études dans le furur pour un projet plus global Pour réduire le nombre d’animaux et optimiser nos résultats, les animaux serviront à plusieurs mesures, chaque fois que possible. Par exemple, les animaux utilisés pour le traçage seront également étudiés par immunohistochimie. Grâce à des rAAV vecteurs simultanés de la ChR2 et de marqueurs fluorescents, les animaux utilisés en procédure N°1 serviront également à des études de traçage avec des techniques d’immnuhistochime Les différentes procédures expérimentales ont été pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Nous utiliserons des tests de puissances statistiques paramétriques (Mann-Whitney, Wilcoxon, t-test, ANOVA), avec indices de confiance fixés à 5%. Comme il s'agit d’expériences pilotes, nous ne connaissons pas les paramètres statistiques des populations testées. Nous ne pouvons donc pas déterminer a priori le nombre exact d’animaux nécessaires pour une puissance statistique cible. Nos estimations sont donc basées sur nos connaissances approfondies de la physiologie du cervelet et sur la littérature. Afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux nécessaires, la puissance statistique de nos tests sera évaluée régulièrement. Nous cesserons les expériences dès que les données collectées permettront d’atteindre une puissance de 80% et obtenir un resultat significatif, cela dépendra de l’amplitude, de la fréquence et de la variance des effets testés, ainsi que du nombre d’éléments (n). Afin de réduire n (et donc, le nombre d’animaux), nous utiliserons des méthodes et outils déjà caractérisés, des conditions réduisant au maximum la variabilité des données, et des effets aussi facilement détectables que possible (bonne sensibilité).
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé quotidiennement et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin Dans la mesure du possible les procédures n’auront pas lieu le vendredi ou veille de vacances/ jour férié pour éviter toute défaillance de surveillance, et si besoin une personé qualifier sera désignée pour la surveillance Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant /anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude des reseaux et échanges neuronaux et de la mémoire dans le cerveau des mammifères. L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau des rongeurs sont bien caractérisés. Il existe une vaste littérature sur la physiologie du cervelet de souris, les comportements, l'apprentissage et la mémoire. La souris constitue un modèle animal les plus classiques pour les études en laboratoire, et plus particulièrement chez la souris génétiquement modifiée Du fait de la disponibilité de souches connues. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Par ailleurs, les techniques de génétique, de marquage anatomique et d'immunohistochimie sont rendues possible du fait de la disponibilité de nombreux produits utilisables chez la souris Dans le cadre de ce projet pilote, nous utiliserons de jeunes adultes (40 à 50 jours) en raison de l’abondance des données disponibles sur cette gamme d’âge dans la littérature (tant ocytocine que cervelet) et de la plus grande facilité d’expérimenter à ces âges. Les protocoles d’anesthésie sont plus efficaces et plus sûrs, et les techniques d'électrophysiologie in vivo produisent plus rapidement des données en utilisant des animaux ayant atteint leur taille adulte et de jeune âge. Ceci permettra d’accélérer la collecte des données préliminaires et d’affiner nos stratégies ultérieures pour étudier des animaux plus jeunes
Évaluation de la biodistribution de bactéries thérapeutiques (LBP : Live Biotherapeutic Products) après leur administration dans les voies respiratoires du macaques cynomolgus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
150 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque macaque, maintenu vigile sur une chaise à contention, reçoit une administration de bactéries dans les voies respiratoires, puis subit jusqu'à cinq lavages bronchiques et dix prises de sang sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le porteur reconnaît que la contention représente la principale contrainte pour l'animal. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son système respiratoire avec celui de l'humain, un passage préalable par des rongeurs étant prévu.
Objectifs
Les maladies inflammatoires respiratoires représentent un ensemble de syndrome dont le développement est croissant avec l'augmentation de la pollution athosméphique et d'autres facteurs d'environnement. Ces maladies invalidantes sont souvent bien contrôles chez les malades, mais les traitements peuvent être lourds ou présentent des effets indésirables. Actuellement, les traitements des maladies inflammatoires du système respiratoire font appel à des thérapeutiques anti-inflammatoires chimiothérapeutiques ou à des immunothérapies classiquees administrées par voie générale. Ce projet a pour but d'étudier l'innocuité, la biodistribution et la biodisponibilité de produits de type Live Biotherapeutics Product administré par voie pulmonaire. Ces produits sont en cours de développement, leur effet aura été prouvé au préalable in vitro et doit être testé in vivo chez le singe macaque cynomolgus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de mieux caractériser produits immunostimulants innovants, et de mieux les connaître avant de les utiliser pour le traitement des maladies inflammatoires pulmonaires. Les informations obtenues chez les singes, dont la physiologie et l'immunologie des voies respiratoires sont très proches de l'homme.
Procédures
L'administration des produits se fait avec un animal vigile, maintenu sur une chaise à contention. Les prélèvements prévus sont des lavages broncho-alvéolaires, et des prélèvements de sang, d'urine ou de fécès. La fréquence et le durée des prélèvements sont fonction des caractéristiques estimées du produit, avec un maximum de 4 semaines. Au total, on peut envisager 5 lavages bronchiques et 10 prises de sang au maximum.
Impact sur les animaux
L'adminstration du produit représentante un stress pour les animaux, mais elle n'est pas douloureuse. La principale contrainte est que l'animal est immobilisé dans une chaise à contention. Les prélèvements réprésentante une contrainte, mais ils sont réalisés sous anesthésie générale. Il est prévu de pouvoir réaliser dees prélèvements sanguins ou des lavages bronchiques principalement.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie à la fin des protocoles pour pouvoir prélever les organes.
Remplacement
L'administration de LBP dans les voies pulmonaires pour lutter contre des maladies inflammatoires chroniques nécessite des développements précliniques spécifiques, permettant de mesurer la quantité de bactéries nébulisées dans les voies respiratoires, il est nécessaire de disposer d’un modèle animal pertinent. En effet, la nécessite de pouvoir observer des interactions complexes et fines entre organes n’est aujourd’hui possible que sur modèle animal, dans ce cadre d’étude. Même si des modèles in vitro de poumons existent, ils ne permettent pas de prédire la distribution et la viabilité d'un produit biologique aussi spécifique qu'un LBP, ni la réponse de l'organisme a l'influx soudain d'une large quantité de bactéries, même non pathogènes. Une approche sur des modèles de rongeurs est préalable aux essais sur Singes.
Réduction
Le nombre d'animaux est limité au minimum nécessaire. Pour tester un LBP, un groupe de 3 à 5 animaux au maximum est suffisant. Nos études sont exploratoires, très en amont dans le développement des produits. L'évaluation de l'effet se fait sur la base de l'analyse hostologique microscopique et de l'évaluation des populations cellulaires détectées après administration du produit. Avec un groupe de 3 à 5 animaux, seules des statistiques descriptives sont possibles, sachant que nous n'utilisons pas d'animaux témoins non traités. Nous comparons les résultats obtenus avec nos données de base, en comparant les données et parfois les moyennes pour évaluer une tendance. Le nombre d'animaux présenté dans ce projet est une estimation qui tient compte du nombre de produits qui pourraient être confiés à notre société pour en évaluer la biodistribution et l'innocuité. Si la demande est faible, il est évident que seuls les animaux nécessaires (3 à 5 par produit) seront utilisés.
Raffinement
Chacun des actes techniques mis en oeuvre pour ce projet ont été mis au point, étudiés et raffinés pour limiter le stress ou la douleur des animaux. La plupart des prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale. L'administration se fait avec un système de contention auquel les animaux sont habitués au préalable pendant plusieurs jours, sans administration. Les techniques analytiques auxquelles nous faisont appel sont suffisamment sensibles pour réduire la quantité de prélèvement nécessaire. Ainsi, les volumes des prises de sang ou des lavages alvéolaires sont très faibles.
Choix des espèces
La macaque cynomolgus possède une proximité physiologique et immunitaire avec l’homme ainsi qu’une anatomie des grandes fonctions extrêmement proche de l’homme. En effet, l’anatomie de son système respiratoire (en partie liée à sa posture verticale (semi-bipède- par opposition aux modèles rongeurs ou porcins) est très proche de celle de l’homme, ou encore un système digestif ou urinaire sensiblement similaire également. Ces similitudes permettent de tester la distribution et la viabilité d’un produit biologiques pour une transposition future chez l’Homme (thérapie par nébulisation, administration par voie orale). Selon le type de LBP choisi et sa cible thérapeutique, des animaux jeunes (2 ans) ou plus âgés (à partir de 3 ans) pourront être utilisés pour des raisons de maturité du système immunitaire et de poids. Cependant, le stade de développement pourra être affiné avec le donneur d’ordre selon le type d’individus visé par la thérapie.
Rôle d’Enterococcus faecalis dans la genèse de l’inflammation pancréatique : susceptibilité individuelle et gravité des atteintes pancréatiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une pancréatite, chaque souris reçoit jusqu'à dix-huit injections de céruléine, des gavages et des injections d'antibiotique ou de bactéries, la céruléine pouvant causer des douleurs modérées répétées. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem. Le porteur affirme que les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas ne peuvent être reproduites in vitro et que le modèle animal est le seul auquel il peut recourir.
Objectifs
Le microbiote intestinal influence le développement des maladies digestives. En effet, les patients avec une pancréatite alcoolique présentent des modifications de leur microbiote intestinal en comparaison des patients avec une consommation alcoolique similaire mais sans pancréatite ou développant une atteinte hépatique. On trouve notamment une augmentation des entérocoques, en particulier d’Enterococcus faecalis. Il a été́ démontré que, chez les patients ayant une hépatite alcoolique aigue, les souches d’E. faecalis produisant la toxine cytolysine sont augmentées, cela est corrélé à la sévérité de la maladie. Il est montré que les patients avec une consommation alcoolique excessive développant une pancréatite alcoolique hébergent plus souvent des souches exprimant la cytolysine que les patients ayant une hépatite alcoolique. De plus, l’abondance relative d’E. faecalis productrice de cytolysine est de 10 à 100 plus importante chez les patients développant une pancréatite par rapport à ceux développant une hépatite. Cependant, le rôle de cette souche dans l’apparition et la gravité de la pancréatite n’est pas connu. Notre objectif est de démontrer que cette bactérie est un facteur prédisposant à la pancréatite en particulier lorsque la souche est productrice de la toxine cytolysine. Nous avons isolé des souches de E. faecalis de patients ayant une pancréatite. Notre projet vise à évaluer sur des modèles murins de pancréatite chronique ou aigue induites par la céruléine, l’implication de E. faecalis (avec ou sans production de cytolysine) sur le développement des lésions de pancréatite.
Bénéfices attendus
La pancréatite et ses complications, notamment le risque de cancer du pancréas, sont associées à une mortalité élevée et il existe peu de traitements actuellement. Notre approche vise à évaluer le rôle du microbiote intestinal chez les patients alcooliques, et en particulier d’Enterococcus faecalis, dans la survenue des dommages du pancréas. Si notre hypothèse se confirme, des stratégies de modification du microbiote intestinal, avec éradication de E. faecalis, pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de pancréatite chronique, soit environ 15 000 patients en France, et potentiellement prévenir les complications de la pancréatite sur le long terme, comme le cancer du pancréas.
Procédures
- Induction d’une pancréatite chronique : de 3 à 6 injections maximum intrapéritonéales de céruléine espacées d’une heure, une fois par semaine, pendant 3 semaines soit 18 injections /souris, ce qui concerne 180 souris au total. - Induction d’une pancréatite aiguë : 6 injections intrapéritonéale de céruléine espacées d’une heure,suivi du sacrifice la même journée soit 6 injections intrapéritonéale /souris/ ce qui concerne 120 souris au total. - Gavage PBS ou E. Faecalis : 1 gavage par semaine pendant 2 semaines soit 2 gavages/souris ce qui concerne 168 souris au total. - antibiothérapie préalable au gavage : 1 injection sous cutanée de clindamycine pendant 3 jours, pendant 2 semaines soit 4 injections /souris ce qui concerne 168 souris au total. - injection intraveineuse d’E. Faecalis : 1 injection intraveineuse de souches d’enterococcus faecalis par semaine pendant 2 semaines soit 2 injections intraveineuse/souris ce qui concerne 36 souris au total.
Impact sur les animaux
Le traitement à la céruléine par injections intra péritonéales peut engendrer des douleurs modérées, mais répétées lors des injections et dans les heures qui suivent. Les injections sous cutanées d’antibiotiques peuvent entrainer des douleurs légères au moment de l’injection. Le gavage peut entrainer un stress de la souris, et des douleurs modérées lors du gavage.
Devenir
Mise à mort pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les complications qui vont être observées au cours de la pancréatite mettent en jeu des interactions entre les différents organes qu’il est encore actuellement impossible de reproduire in vitro. Notre projet correspond à un travail qui permettra de comprendre le lien entre microbiote intestinal, la barrière intestinale et le développement d’une pancréatite. Le modèle animal est le seul auquel nous pouvons avoir recours et qui permet d’intégrer les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas.
Réduction
Nous nous sommes basés pour calculer la taille des groupes sur le dosage d’un marqueur sérique de pancréatite qui est augmentée dans le modèle avec céruléine. Nous avons ainsi déterminé la taille des groupes de souris afin à la fois d’obtenir des résultats robustes d’un point de vue statistique et permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, 12 souris par groupe de comparaison seront utilisées dans les procédures.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 4. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique. Le jour de la mise à mort, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. C’est une des raisons pour laquelle nous demandons à ne pas avoir à pré-traiter les souris par une pommade à la lidocaïne. Nous utilisons pour les injections intra-péritonéales des petites aiguilles et un volume réduit afin de minimiser la douleur de la piqure. Pour les injections en intra-veineuse au niveau du sinus retro-orbital, les souris seront anesthésiées et les 2 injections à une semaine d’intervalle seront réalisées sur le sinus gauche puis à droite la semaine suivante. Les gavages réalisés sur souris vigile pour éviter les fausses routes seront également réalisées 2 fois à 1 semaine d’intervalle avec un volume réduit à l’aide de canules de gavage fine et courte bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les injections sous cutanées permettant l’administration des antibiotiques au niveau interscapulaire seront réalisées. Dans tous les cas les souris hébergées par 4 seront remises dans la cage avec leurs congénères avec une quantité de sciure augmentée favorisant leur enfouissement, en particulier après les manipulations.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la physiopathologie de la pancréatite sont proches de ceux observés chez l’Homme.
Étude de l’activité anti-Pseudomonas aeruginosa d’une souche clinique de Porphyromonas instillée en prophylaxie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit deux instillations nasales de suspensions bactériennes à dix-huit heures d'intervalle, puis est tuée vingt-quatre heures plus tard pour récupérer ses poumons ou réaliser des lavages, les groupes recevant Pseudomonas aeruginosa pouvant perdre du poids et devenir inactifs. Le porteur affirme ne pas pouvoir répondre à sa question avec des outils de culture cellulaire et choisit donc de conserver le modèle animal. Il retient la souris pour sa sensibilité permettant de provoquer une pneumonie sans mortalité trop importante.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer le mécanisme d’action de cette souche potentiellement bénéfique avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart. 24h plus tard, les animaux sont mis à mort avant récupération des poumons ou réalisation de lavages broncho alvéolaires.
Impact sur les animaux
Ce projet a été conçu pour minimiser les effets indésirables. Ce projet peut induire un stress chez les animaux. Un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec une table de suivi de soins permettent également une diminution de ses effets. Les groupes recevant seulement Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 ou Pseudomonas aeruginosa résitant à plusieurs antibiotiques (PA MDR) peuvent être sujets à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec la table de soins. Pour les groupes recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
Les 90 souris C57BL/6 mâles survivantes sont mis à mort à l’issu du protocole
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer son effet sur le système immunitaire. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
Approche statistique : Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P. aeruginosa et celui recevant du Porphyromonas préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Nous avons choisi de suivre nos souris uniquement jusqu’à 24 h post-infection et non 7 jours pour limiter le nombre d’individus en nous basant sur l’expérience apportée par notre équipe lors de DAP précédentes. Nous nous limitons à une seule espèce de Porphyromonas (P. catoniae) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon et une seule souche clinique parmi les 7 isolées par notre équipe.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table de suivi de soins. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Caractérisation du circuit cérébral permettant les effets d’une hormone intestinale sur l’homéostasie glucidique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, rendue obèse par un régime hypercalorique, subit l'implantation chirurgicale de canules dans le bulbe olfactif et l'hypothalamus, opération d'une quarantaine de minutes qui peut provoquer un saignement du crâne, puis des prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur reconnaît que certaines souris supportent mal l'anesthésie et que la chirurgie peut entraîner douleur et difficultés de récupération. Il affirme que ces expériences ne peuvent se faire in vitro car elles requièrent l'observation de paramètres sanguins.
Objectifs
>>>Contexte. La prévalence de l’obésité est en constante augmentation au niveau mondial. Elle résulte d’un déséquilibre entre les apports (alimentation) et les dépenses (exercice physique) d’énergie. Une des complications majeures dans l'obésité est l'apparition d'un diabète de type 2 qui conduit à un taux de glucose dans le sang (glycémie) trop important, ou hyperglycémie chronique, par une altération de la secrétion et/ou de l'effet de l'hormone pancréatique hypoglycémiante, l'insuline. Le GLP-1 (pour glucagon-like peptide-1) est une incrétine, une hormone intestinale qui stimule la sécrétion d'insuline pancréatique lorsque la glycémie est élevée, après un repas notamment. Les analogues du GLP-1 sont commercialisés afin d'aider les patients diabétiques à réguler leur glycémie. Cependant, les mécanismes d'action du GLP-1 sur le cerveau sont très mal connus. Au laboratoire, nous avons montré que l'action du GLP-1 sur son récepteur dans le BO a pour conséquence d’améliorer la tolérance au glucose de souris rendues obèses par une alimentation hyperlipidique. Il s'agit donc d'un effet protecteur très prometteur à étudier. Ceci est d'autant plus intéressant que le BO est une structure cérébrale qui permet de donner des indications sensorielles sur la toxicité ou l'aspect agréable des aliments et qu'un mauvais fonctionnement du BO a été décrit chez le patient obèse. >>>Objectifs. Dans ce projet, nous voulons donc caractériser le rôle de la voie neuronale entre le BO et l'hypothalamus dans la régulation bénéfique de la glycémie chez les souris obèses. L'hypothalamus est une structure-clé de la régulation du métabolisme énergétique, qui permettrait l'augmentation d'insuline plasmatique en périphérie par l’activation de la voie GLP-1 dans le BO. Pour vérifier l'hypothèse d'un passage du signal engendré par le GLP-1 dans le BO vers le pancréas via l'hypothalamus, nous proposons d'injecter de la bicuculline par une canule placée à demeure dans le noyau paraventriculaire et ainsi en empêcher l'activation. Le PVN est le noyau de sortie de l'hypothalamus et module les neurones sympathiques prégangliaux de la moëlle épinière qui projettent sur le pancréas. Si la bicuculline bloque l'action bénéfique de l'injection du GLP-1 dans le BO, alors nous aurons démontré que l'hypothalamus est la structure cérébrale intermédiaire permettant un relais avec la périphérie dans la régulation de l'insuline. >> Nombre total de souris: 48 (24 souris obèses et 24 témoins).
Bénéfices attendus
Jusqu'à présent, les expériences publiées afin de démontrer que les mécanismes d'action bénéfique du GLP-1 sur les problèmes de régulation glycémie et de la prise alimentaire chez les souris obèses et diabétiques passeraient uniquement par une action sur l'hypothalamus n'ont pas été concluantes et les recherches sont portées sur l'identification de nouvelles structures cérébrales permettant cet effet. Il est en fait apparu qu'il existe un réseau de structures cérébrales complexes sensibles au GLP-1 et qui permet cette régulation de la glycémie. Nous avons précédemment exploré et montré la possiblité de la participation du BO dans ce réseau, une structure impliquée à la fois dans le codage cérébral des informations olfactives et la régulation de l'homéostasie glucidique. Ce projet permettra de mieux comprendre les effets du GLP-1 et de ses analogues sur le système nerveux central, et notamment sur le système olfactif. Il est tout à fait possible que dans le futur le GLP-1 puisse être délivré au patient par voie intranasale, de façon totalement non invasive contrairement aux piqures répétées, comme l'insuline, qui est depuis récemment utilisée par cette nouvelle voie d'injection.
Procédures
Le cumul des cinq expériences qui sont effectuées dans chaque procédure les classent toutes en une classe de sévérité modérée. En particulier, trois expériences requièrent une procédure chirrugicale et des prélévements sur animaux vigiles >>> Expérience 2 (toutes procédures): chirurgie. Les 48 souris seront implantées avec des canules dans le bulbe olfactif et l'hypothalamus. Chaque chirurgie dure une quarantaine de minutes. >>> Expérience 4 (procédure 1 et 2, 24 souris): prélévements sanguins mineurs chez la souris vigile en vue d'un test de tolérance au glucose. Le prélévement se fait en quelques secondes après avoir effectué une petite coupure sur le bout de la queue. >>> Expérience 5 (toutes procédures, 48 souris): Réponse insulinémique de la phase céphalique (Cephalic phase insulin release: CPIR). Pour mesurer le taux d'insuline dans le sang, deux prélévements sanguins de faible volume seront effectués au bout de la queue.
Impact sur les animaux
Pour chaque procédure, des nuisances sont possibles et une approche bioéthique est adaptée pour les prévenir, les diminuer et les éliminer si possibles. Pour l'expérience 1 (procédure 1 et 3) de régime hypercalorique, nous n'avons pas de nuisance attendue. Nous n'avons jamais observé de problèmes de souris ne voulant pas se nourrir avec une nourriture hyperlipidique. De plus, le surpoids induit chez les souris sous régime hyperlipidique n'entrave pas leur locomotion. Pour l'expérience 2 dans toutes les préocédures, qui consiste en une chirurgie pour installer les canules d'injection dans le BO et le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus, des souris peuvent mal supporter l'anesthésie et la chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération. Pour les tests métaboliques, OGTT (expérience 4, procédure 1 et 2) et ITT (expérience 4, procédure 3 et 4) des problèmes de volume sanguin prélevé peuvent survenir et pertuber l'animal dans sa récupération.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort. 3 souris de chaque procédure seront perfusées au paraformaldéhyde 4% après une injection de pentobarbital en overdose afin de vérifier l'emplacement des canules par immunohistochimie de coupes cérébrales.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet visant à étudier le rôle de l'incrétine GLP-1 sur le cerveau et sur la glycémie, nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres sanguins. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Même si chez les poissons il existe des équivalents de certains groupes de neurones des mammifères, nous ne disposons pas de modèle d'obésité dans cette espèce, qui se nourrit de façon très différente par rapport aux mammifères. Enfin, nos modèles murins, à savoir les souris C57BL6 mâles rendues obèses par régime hypercalorique, sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre.
Réduction
La réduction du nombre d'animaux utilisés est fortement liée à la puissance statistique qui pourra montrer l'effet recherché, ici si nous pouvons bloquer l'effet du GLP-1 bulbaire par l'injection de bicuculline dans l'hypothalamus. Ceci nous permettra de définir la voie cérébrale impliquée dans la régulation de la glycémie à partir du bulbe olfactif. L'ensemble des expériences réalisées au laboratoire ont montré qu'un nombre maximal 12 individus doit être engagé par groupe. Ce nombre permet de compenser des exclusions éventuelles de souris qui ne répondent pas aux tests pharmacologiques ou métaboliques. Nous aboutissons ainsi toujours à un nombre minimum de 8 souris nécessaires à la puissance statistique de nos comparaisons. De plus, ce projet bénéficiera du développement de 2 projets antécédents qui nous ont permis de déterminer les doses de GLP-1 dans le bulbe et de bicuculline dans l'hypothalamus. Il n'y aura donc pas d'animaux engagés dans la recherche d'un effet dose/réponse de ces agents pharmacologiques. De plus, l'implantation de canules à demeure pour injecter le GLP-1 dans le bulbe olfactif et la bicuculline dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus chez la souris vigile permet d'utiliser chaque souris comme sa propre témoin et de réduire grandement le nombre de souris qui aurait été nécessaire par une approche pharmacologique aigüe: nous effectuerons différentes expérimentations sur des mêmes groupes de souris tant que celles-ci se révèlent non invasives, non douloureuses, non stressantes pour l’animal. Tests statistiques: vérification de la normalité de la distribution par un test de Shapiro-Milk. Si la distribution suit la loi normale, comparaison intragroupe sous différentes injections par un test d'ANOVA, sinon par un test de Kruskal-Wallis (et tests posthoc adaptés si nécessaires).
Raffinement
Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Les animaux seront examinés individuellement tous les jours par le personnel de l'animalerie. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
La souris C57BL6 représente une souche murine adéquate comme modèle d'étude du récepteur du GLP-1 dans le bulbe olfactif chez les souris obèses versus des souris contrôles. Elle a notamment été utilisée pour les études précédentes sur l'action des incrétines dans le système nerveux central. De plus, elle a un système olfactif développé propice à l'étude du bulbe olfactif. Enfin, nous avons l'expertise depuis plusieurs années i) du régime hypercalorique rendant les souris progressivement obèses ii) de l'implantation de canule dans le BO chez la souris anesthésiée et de la surveillance postchirurgicale iii) du suivi du bien-être de l'animal après injection. Pour rendre les souris obèses, une alimentation hypercalorique leur est fournie: à partir de 3 mois de cette alimentation, elles présentent un poids allant jusqu'à 10 ou 15 grammes supérieures aux souris sous régime standard. Comme le régime commence à 6 semaines d'âge, les souris qui seront injectées et testés métaboliquement auront donc au moins 4 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris.
Le Fingolimod, inhibiteur du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate, comme stratégie thérapeutique pour traiter les calcifications vasculaires associées à l’insuffisance rénale chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
66 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Un régime enrichi en adénine provoque une insuffisance rénale chronique, puis un régime calcique induit des calcifications vasculaires, avant l'administration de fingolimod dont l'effet immunosuppresseur entraîne souvent une baisse persistante des lymphocytes. Les rats sont tués par anesthésie terminale au pentobarbital, avec un prélèvement de sang par ponction cardiaque et une nécropsie. Le porteur affirme qu'une vérification in vivo est nécessaire pour confirmer ses résultats in vitro et espère faire du fingolimod un traitement des patients insuffisants rénaux.
Objectifs
La calcification vasculaire (CV) est un processus actif de formation osseuse par des cellules locales, notamment des cellules du muscle lisse (CML), qui se transdifférencient en cellules calcifiantes entrainant l’apparition des dépôts de cristaux de calcium dans la paroi des vaisseaux. La CV est reconnue comme une complication majeure chez les patients atteints d’une insuffisant rénale chronique (IRC) en augmentant fortement leur morbidité dû à l’apparition des complications cardiovasculaires. Malheureusement, les mécanismes moléculaires impliqués dans la CV restent largement méconnus ainsi que des thérapies ciblées pour éviter sa progression. Nos résultats préliminaires montrent que des patients IRC sous hémodialyse avec un score modéré de calcification abdominale aortique, ont la concentration sérique de la sphingosine 1 phosphate (S1P), un lidpide bioactif, significativement augmentée par rapport aux patients sous hémodialyse sans calcifications. Nous retrouvons également cette augmentation dans le sérum d’un modèle murin d’IRC avec des CV, dans un modèle ex-vivo d’aorte calcifié ainsi que dans le milieu extracellulaire d’un modèle de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. De plus, nous avons impliqué plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P, dans le processus de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Le but de ce projet de recherche est de déterminer si l’inhibition générale du métabolisme de la S1P avec l’immunomodulateur fingolimod a des effets délétères dans la calcification des aortes de nos modèles in vivo et ex vivo ainsi que dans la transdifférenciation des CML d’origine vasculaire en cellules calcifiantes.
Bénéfices attendus
Notre objectif est d’apporter une contribution importante dans la compréhension de la physiopathologie des CV associées à l’IRC ; l’axe S1P étant potentiellement impliqué dans la transdifférenciation des CML vasculaires ainsi que dans l’apparition et l’entretien de la calcification de l’aorte. La physiopathologie des CV associées à l’IRC est toujours méconnue et peu de données sont disponibles sur les mécanismes de la néoformation osseuse qui a lieu dans les vaisseaux. Aussi, nous allons évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur les CV dans notre modèle murin d’IRC et particulièrement sur l’ossification ectopique de l’aorte. Le fingolimod, que nous utilisons dans ce projet comme inhibiteur général de la voie de la S1P, pourrait agir à la fois comme un inhibiteur de la CV ainsi que comme un immunomodulateur. A terme, nos données devraient permettre de valider l’intérêt thérapeutique de l'inhibition du métabolisme de la S1P pour prévenir ou traiter les CV chez des patients IRC et fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients, qui n’est actuellement pas entièrement satisfaisante.
Procédures
Néphrectomie chimique : Induction d'une IRC par régime enrichi en adénine (0,75% w/w). Un régime enrichi en adénine est une méthode non chirurgicale pour induire une IRC chez le rongeur (néphrectomie chimique). Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 0,75% (w/w) d'adénine (Sigma Aldrich) Ces régimes sont produits à façon par la société SAFE (Augy, France). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance. Induction des CV chez le IRC - Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 1% (w/w) de calcium et 0.9%(w/w) de phosphore (Sigma Aldrich). Ce régime est produit à façon par la société SAFE (Augy, France). Ce régime est bien toléré par les animaux et n'induit pas de manifestation observable. Ils recevront 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) des injections intrapéritonéales de calcitriol (1,25-dihydroxycholécalciférol ou vitamine D3) (Rocaltrol, Roche) à la dose de 80 ng/kg afin de maximiser la fixation du calcium alimentaire. Le calcitriol est dilué dans du propylène glycol (injection 0,3mL/100 g) qui est un véhicule métabolisé et dépourvu de toxicité.
Impact sur les animaux
A cause de son action immunosuppressive, l’effet secondaire le plus fréquent et le plus préoccupant du fingolimod est une lymphopénie qui s’installe chez les animaux dès le début du traitement et qui persiste, très souvent, tout au long de l’étude. Il a été démontré que dans un modèle d’arthrite induite par le collagène, 4 semaines de traitement avec le fingolimod dans l’eau de boisson à 0,1 mg/kg/jour permettent de diminuer l’incidence de la maladie et de restaurer partiellement la qualité osseuse chez le rat. En même temps, cette dose n’affecte pas le nombre de monocytes ou neutrophiles présents dans le sang périphérique. Dans un modèle murin d’Alzheimer, la même dose de 0,1 mg/kg/jour de fingolimod, également administrée diluée dans l’eau de boisson, ne modifie pas le nombre de lymphocytes par rapport au nombre total de leucocytes, même après 28 semaines de traitement. De plus, la présence du fingolimod dans l’eau de boisson, ne modifie la prise d’eau quotidienne par les animaux. Nous attendons donc du traitement avec le fingolimod à faible dose pendant 5 ou 7 semaines, des effets sur les CV, sans induction de lymphopénie. La procédure expérimentale N°1 nous servira à choisir la dose de fingolimod la plus adaptée à utiliser dans la procédure expérimentale N°2 qui ne provoque pas de lymphophénie et qui ne modifie pas a priori la prise d’eau et/ou de la norriture à cause de son gout. Dans la procédure expérimentale N°2 nous utiliserons un regime à base d’adenine pendant 4 semaines pour provoquer une IRC irreversible. Cette procédure à recemment été validé et publiée par notre équipe (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments. A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du protocole expérimentale par anesthésie terminale au pentobarbital sodique (60 mg/kg). Nous réaliserons également un prélevement terminal de sang par ponction cardiaque et une nécropsie (prélevement de différents tissus pour des études histologiques et biochimiques).
Remplacement
Nos résultats montrent qu’il existe un lien entre le métabolisme de la S1P et les CV dans l’IRC. Plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P semblent être impliqués dans la transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Des manipulations dans un modèle in vivo s’avèrent nécessaires pour vérifier nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Le ciblage global du métabolisme de la S1P avec le fingolimod semble être une approche idéale pour l’inhibition de la calcification à la fois in vitro et in vivo. Si les résultats s’avèrent concluants, le fingolimod pourrait devenir un traitement de choix pour les patients IRC dans le but de prévenir, diminuer ou ralentir l’apparition des CV et en conséquence diminuer les accidents cardiovasculaires et la morbidité.
Réduction
La procédure expérimentale N°2 ne sera réalisée que si la procédure expérimentale N°1 donne les résultats attendus. La procédure N°1 nous permettra de vérifier que la présence du fingolimod dans l’eau de boisson ne modifie pas la prise d’eau/croquettes quotidienne par les animaux et n’induit pas une lymphopénie.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’entretien des rats seront adaptés pour éviter des conditions délétères pour l’animal. Les animaux sont réceptionnés des établissements Janvier, deux semaines avant le début de l’expérimentation. La surveillance de l'environnement, fournitures et équipement auxquels les rats sont exposés est essentiel à l'entretien. L’état de bien-être est évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). De la nourriture sera disposée au fond de la cage par prévention dès la période de stabulation afin de permettre aux rats de se nourrir en cas d’apparition de douleur au cours des procédures. Une couche importante de litière sera mise au fond de chaque cage, et le non enfouissement des rats étant un signe de mal-être nous y ferons attention.
Choix des espèces
Le présent protocole sera conduit sur des rats Sprague-Dawley. Les rats IRC développent en 4-5 semaines des CV lorsqu'ils sont soumis à un régime enrichi en P/Ca et qu'il recoivent des injections calcitriol. L'incidence des CV dans cette population est supérieure à 60%. Les rats Sprague-Dawley procedant de Janvier arriveront à l’animalerie avec 6 semaines et seront stabulés 2 semaines avant le début des expériences. A 8 semaines, les rats sont considerés comme jeunes adultes en ayant adquis leur maturité séxuelle à environ 6 semaines. Les rats auront un poids d’environ d’environ 200-250 g à l’arrivée à l’animalerie et de 300-350 g au début des manipulations.
S-nitrosylation des myofilaments cardiaques : conséquences sur l’adaptation du cœur au stress mécanique.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
110 rats vont être utilisés, tués à l'issue, la plupart sous anesthésie sans réveil et vingt en gravité modérée. Une partie court sur un tapis roulant motorisé, une autre reçoit un bêta-bloquant pendant vingt-quatre heures, puis les animaux sont tués pour prélever leur cœur et l'étudier en montage isolé perfusé ou en biochimie. Le porteur affirme qu'aucun modèle de substitution in vitro n'existe pour évaluer l'effet d'un étirement sur la fonction cardiaque et conclut que le recours à l'animal est "indispensable". Il retient le rat au motif que la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l'humain.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle du monoxyde d'azote et de la s-nitrosylation des protéines mitochondriales et myofilamentaires dans la régulation de la réponse du coeur à un stress mécanique.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux identifier les voies de signalisation impliquées dans la réponse du coeur à un stress mécanique. En effet, il est bien connu qu'un stress mécanique transitoire peut aboutir à une adaptation bénéfiques du coeur alors qu'un stress chronique peut conduire à un remodelage cardiaque défavorable. Néanmoins, à ce jours, les mécanismes cellulaires permettant d'expliquer qu'un même stimulus puisse aboutir à des réponses adaptatives différentes n'ont jamais été identifié.
Procédures
Les animaux de la procédure 1 seront traités avec un Beta-bloquant afin de réduire le stress adrénergique cardiaque au moment de leurs manipulations. Les animaux de la procédure 2 seront soumis à un protocole d'exercice physique sur tapis roulant motorisé.
Impact sur les animaux
Certaines expérimentations necessiteront de faire courir des animaux sur tapis roulant motorisé. Le laboratoire possède une grande expérience de ce type d'expérimentation. Par ailleurs, les animaux sont surveillés tout au long de leur course par un personnel habilité et formé pour ce type d'acte expérimental. Certains animaux seront traités avec un beta-bloquant pendant 24h00 avant leur euthanasie. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules, des myofilaments isolés et necessiteront l'euthanasies des animaux avant le prélèvement des tissus.
Devenir
A la fin des deux procédures, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur. Celui sera utilisé soit dans un protocole de coeur isolé perfusé de Langendorff soit pour réaliser des analyses biochimiques.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer d'un stress d'étirement (stretch) sur la fonction cardiaque et sur la réponse contractile du coeur. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.
Réduction
Un grand nombre d'expérimentations seront réalisées sur des organes ou des cellules isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres (facteurs circulants, conditions de charge cardiaque, fréquence cardiaque) et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du coeur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser diffrentes évaluations (microscopie électronique et biochimie à partir d'un même prélèvement cardiaque).
Raffinement
Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites (pièce jointe).
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications.
Imagerie de l’inflammation par IRM via l’activité des protéases (2/2).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
855 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit une injection d'agent de contraste avant un passage à l'IRM, puis est tuée sans réveil pour prélever ses organes et corréler le signal aux sites inflammatoires, une partie développant au préalable des modèles inflammatoires pulmonaires, rénaux ou pancréatiques. Le porteur affirme que l'examen IRM n'entraîne aucun effet indésirable et que le recours aux animaux vivants est "indispensable" faute de pouvoir simuler la physiologie d'un organe inflammatoire. Il justifie l'espèce par la taille des souris, adaptée à l'antenne IRM existante.
Objectifs
Les inflammations pulmonaires sont responsables de 2,5 millions de morts par an dans le monde. Une détection précoce permettrait de protéger les poumons avant que leur dégradation ne soit irréversible. Dans ce projet il s'agit de détecter une inflammation pulmo-naire à ses débuts avant tout changement anatomique et physiologique visible par les méthodes actuelles. De plus dans les maladies inflammatoires, il a été décrit un syndrome pneumo-renal c’est à dire que si les poumons sont touchés par l'inflammation, le rein le sera aussi ou l'est déjà (mais sans symptôme). En parallèle, le diagnostic des pancréatites chroniques échappent à toutes les méthodes d’imagerie et dont la détection biochimique est peu fiable. Divers facteurs déclenchant les pancréatites sont caractérisées par une activation prématurée des protéases digestives dans le pancréas (en particulier l’élastase pancréatique). La conséquence est une destruction progressive du pancréas et une inflammation chronique pouvant conduire à un cancer de très mauvais pronostic. Le point commun de ces pathologies est l’enzyme élastase. Soit elle provient de la présence de neutrophiles (cellules du système immunitaire) qui libèrent ces enzymes, lors d’un processus appelé dégranulation. Soit elle provient du pancréas. Afin de détecter précocement ces pathologies, l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique de choix du fait de son innocuité. Nous voulons donc développer un agent de contraste (donnant un signal en IRM) qui détecte l'activité de l’élastase. Pour cela, nous développons des agents de contraste (substrats détectables par IRM) capables d’être clivés par l’élastase et dont le produit de la réaction enzymatique pourrait être détectable par IRM via un signal différent de celui du substrat. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de détection de l’activité des élastases afin de mettre au point un diagnostic fiable et précoce de trois modèles d’inflammation (pulmonaires, rénales et pancréatite) qui seront développés chez des souris.
Bénéfices attendus
1- Notre projet devrait permettre de détecter très précocement des maladies inflammatoires : actuellement les pathologies chroniques pulmonaires sont détectées trop tardivement, uniquement lorsque les destructions du tissu pulmonaire sont irréversibles (COPD, mucoviscidose). De plus, notre projet permettra de détecter l’inflammation rénale induite par l’inflammation pulmonaire et ainsi débuter un traitement plus précocement. Finalement, notre projet devrait permettre de détecter les pancréatites chroniques avant qu’elles ne se développent en cancer. 2- Notre projet vise à développer des agents de contraste qui possèdent une forte spécificité de contraste. Ainsi soit le substrat soit le produit de la réaction enzymatique pourront être détectés. Ceci permettra de non seulement détecter où se trouve l’inflammation, mais aussi de quantifier l’activité enzymatique présente et donc le stade inflammatoire. 3- Notre projet vise à détecter toute inflammation protéasique présente dans le corps, afin de développer un outil « universel » de détection
Procédures
La procédure décrite dans ce document sera réalisée sous anesthésie générale. Les animaux recevront une seule injection d’un agent de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Du fait de la haute spécificité des agents de contraste, ceux-ci ne devraient pas entrainer de nuisance ou d'effets secondaires. Cependant, en théorie une baisse de tension est possible due à la présence des nitroxydes. Selon notre expérience elle n’entraine jamais de séquelle ou de perte d’animaux. L’examen IRM n'entraîne aucun effet indésirable.
Devenir
L'euthanasie des animaux est nécessaire pour extraire les organes et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence des neutrophiles dans les sites inflammatoires et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.
Remplacement
Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car il n'existe pas de moyens de simuler l'anatomie et la physiologie complexes d'un organe sain ou inflammatoire en raison d'un nombre de paramètres physiques, physico-chimiques, biochimiques et pharmacologiques trop important pour être modélisé. En effet, nous souhaitons détecter une activité enzymatique, liée à une inflammation. Ces pathologies ne sont pas reproductibles in vitro car elles nécessitent soit un système immunitaire complet soit un organe fonctionnel dans lequel une situation pathologique doit être provoquée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées en amont, pour étudier l'effet des agents de contraste sur des cellules en culture. Le nombre d'animaux a été évalué à 15 souris par agent de contraste, afin d'avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats significatifs. Des tests statistiques adaptés seront utilisés pour analyser les résultats.
Raffinement
Nous utiliserons une anesthésie gazeuse, un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et un ballonnet pour le contrôle de la respiration pendant les sessions IRM. Pour limiter la souffrance des animaux développant les modèles inflammatoires, ils seront euthanasiés dès que l’examen IRM sera terminé, sans réveil préalable. Entre la mise en place des modèles inflammatoires et l’examen IRM, des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si ces points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement imagés sous anesthésie générale puis euthanasiés sans réveil préalable après la session d’imagerie. Les animaux seront surveillés au minimum 1 fois par jour par le zootechnicien et/ou le porteur du projet et/ou l’étudiant en charge des expérimentations (post-doctorant ou doctorant ayant suivi la formation en expérimentation animale).
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car leur taille permet une imagerie IRM sur le système existant où seulement une antenne dédiée à la souris est installée. De plus, de nombreuses pathologies inflammatoires peuvent y être développées. Les souris seront utilisées à 8 semaines donc au stade adulte, car nous visons des pathologies survenant principalement chez l’adulte.
Évaluation de l’effet thérapeutique du transfert adoptif de lymphocytes T humains optimisés dans le traitement de tumeurs solides humaines dans un modèle de souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris NSG immunodéficientes reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections hebdomadaires de lymphocytes T, une grosseur tumorale se développant dans le flanc. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, ou plus tôt si trois signes cliniques notables ou un signe sévère apparaissent. Le porteur reconnaît que davantage d'animaux par lot serait préférable statistiquement mais retient cinq souris pour des raisons éthiques, et affirme que les cellules tumorales se comportent différemment in vitro et in vivo.
Objectifs
L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers métastatiques, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer la tumeur. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie passive par transfert adoptif repose sur l’administration à un patient de cellules du système immunitaire reconnaissant un antigène tumoral spécifiquement exprimé par les cellules à éliminer. Des essais cliniques d’injection de lymphocytes ont déjà été réalisés et, s’ils ont montré une bonne tolérance, ils ont eu une efficacité anti-tumorale encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement des cancers, de nouvelles approches d’immunothérapie passive par transfert adoptif de différents types d’effecteurs lymphocytaires T anti-tumoraux. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, un modèle de développement de xénogreffes de cellules tumorales et d’administration d’effecteurs lymphocytaires T humains optimisés sera établi dans les souris immunodéficientes NOD-SCID-IL-2Rγ [NSG]. Compte-tenu de la diversité importante des cancers, les différentes stratégies thérapeutiques pourront être testées dans deux modèles de cancers humains hautement immunogènes : le mélanome et le cancer colorectal. Les effecteurs lymphocytaires T humains utilisés seront des : - lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigènes tumoraux. - lymphocytes T modifiés génétiquement pour inactiver l'expression des gènes codant pour des Immune Checkpoint (IC), dont les ligands sont exprimés par les cellules tumorales préalablement injectées.
Bénéfices attendus
En conclusion, l’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés par modification génétique visant à inactiver un ou plusieurs IC, dans le traitement des cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certains de ces IC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de 50µL de tampon PBS stérile (avec ou sans cellules) dans le flanc à J0 dans chaque procédure. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir de J7) en intraveineuse de 100µL de PBS stérile (avec sous sans cellules) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute. La procédure d’injection des cellules tumorales dans le flanc sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé pour induction puis 2%/air comprimé pour le maintien).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrisèque à l’injection (piqûre) dans le flanc, de cellules dans un volume donné (50 à 100µL) de tampon phosphate salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie gazeuse. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc est attendu.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.
Remplacement
Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'homme du bénéfice thérapeutique de l’administration d’effecteurs immunitaires, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant l’immunothérapie anti-tumorale, il est établi que les cellules tumorales se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la lyse et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T injectés sur le site tumoral), et de définir les modalités optimales d’administration des effecteurs lymphocytaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.
Réduction
Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris et les résultats seront analysés statistiquement par des tests de comparaison : test de Wilcoxon ou Mann -Whitney. D'un point de vue statistique, l'utilisation de plus d'animaux par lot semble préférable mais d'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum. Plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot.
Raffinement
Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne s’il y a présence de signes cliniques notables (cf annexe « gestion de la douleur »)). De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort, après une anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé) par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie anti-tumorale, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients (évite le rejet de greffe) tels que les souris NSG qui sont dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation d'effecteurs T d'origine humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-10 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules tumorales et de lymphocytes T mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).
Impact de l’épilepsie sur un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 083 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Des souris transgéniques Alzheimer reçoivent une injection de kaïnate pour déclencher des crises d'épilepsie, avec pour certaines l'implantation chirurgicale d'électrodes ou d'une pompe sous-cutanée, les crises pouvant provoquer des morsures de la langue et, dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque. Le porteur indique que l'euthanasie est "incontournable" pour étudier le cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif validé pour étudier ensemble épilepsie, neurodégénérescence et déclin cognitif.
Objectifs
L'association entre crise épileptique et mort neuronale (ou neurodégénérescence) a été observé à maintes reprises en clinique. Les sujets épileptiques présentent des troubles de la mémoire, de l’attention, mais aussi des déficits dans les fonctions d’exécution (comme la gestion du temps et de l'espace, l'élaboration de stratégies...). Dans la maladie d'Alzheimer, l’état de mal ou des crises épileptiques mal contrôlées pourraient servir de déclencheur. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles de crises épileptiques avec des modèles de la maladie d’Alzheimer. De plus, aucun mécanisme ou cible pharmacologique n’a été proposé pour limiter la progression de la maladie d'Alzheimer dans le contexte de crises épileptiques. Ce projet permettra de tester les hypothèses suivantes: 1-les crises épileptiques suffisent à déclencher de la neurodégénérescence dans le cerveau. 2-ces effets sont plus sévères avec l’âge (cette exploration est importante, à la vue de l’incidence importante et croissante des épilepsies chez les personnes âgées). 3-les crises épileptiques sont capables d’accélérer la mort neuronal dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer. Un traitement pharmacologique spécifique et adapté pourrait freiner le développement de la maladie d'Alzheimer associé à l’épilepsie.
Bénéfices attendus
En terme de santé publique, aucune étude n’a encore établi un lien de cause à effet entre une crise épileptique aigue et l’apparition de signes associés à des processus neurodégénératifs chez un même patient. Par contre, il est bien connu, qu’un état de mal épileptique peut entrainer des séquelles neurologiques à long terme. L’absence de connaissances fondamentales sur la prédiction de la trajectoire neurologique et du suivi clinique est un réel problème après l’apparition d’une première crise épileptique sans cause définie. Nous connaissons, néanmoins, l’existence d’un lien entre crises et neurodégénérescence dans la maladie d’Alzheimer car l’état épileptique a été démontré comme un facteur de risque chez l’homme. Avec cette étude, nous posons donc l’hypothèse d’un mécanisme reliant l’hyperactivité des neurones aux processus neurodégénératifs associés à la maladie d’Alzheimer. Ce projet nous permettra d’en appréhender les mécanismes fonctionnels et biochimiques sur le long terme et de tester le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules ciblant les principales hormones endogènes anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions selon leur groupe, soit des procédures chirurgicales (< à 35 min), soit des injections intrapéritonéales, soit des analyses comportementales et enfin la mise à mort pour analyses des tissus cérébraux: implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (120 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (288 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate (288 animaux) - implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (160 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (128 animaux). Les animaux seront suivi au maximum pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
L'induction de l'épilepsie sur la souris engendre des décharges neuronales fortes et incontrolables. Ces crises « épileptiques », comme chez l’homme, peuvent entrainer l'animal à se blesser (morsure de la langue). Dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque peut également survenir. Si les crises devaient perdurer au dela des 2 heures suivant l'induction de l'épilepsie, une injection intrapéritonéale d’un calmant (le diazépam) permettra de diminuer l’apparition des crises. Cette injection induit une somnolence prolongée de l’animal, entrainant une possible déshydratation, qui est anticipée de façon systématique par l’injection intraperitonéale d’une solution saline stérile. Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. La pose d'un implant crânien pour le suivi électroencéphalographique, ou de la pompe osmotique, peut entrainer un inconfort temporaire, et être associé à un grattage plus intense au niveau de la zone de cicatrisation.
Devenir
Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.
Remplacement
De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier les crises épileptiques, la neurodégénérescence et le déclin cognitif (e.g., maladie d’Alzheimer) dans leur globalité.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaire est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe . Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress le jour de l'expérimentation (en particulier au moment des tests comportementaux), mais également afin de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront leur comportement général, ainsi que leur apparence. Toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmises à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > à 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…). Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. Tous les tests seront réalisés dans une pièce dédiée et les animaux y seront placés au minimum 30 minutes avant les tests. La chirurgie sera réalisée sous anethésie générale et afin de minimiser la douleur liée à la chirurgie, un analgésique sera injecté en amont.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer et de l’épilepsie. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Une première caractérisation sera effectuée à l’âge de 3, 6 et 9 mois sur le modèle de souris Alzheimer. La caractérisation comportementale a déjà été effectuée sur ce modèle dans notre laboratoire et des déficits de mémoire apparaissent dès l’âge de 3 mois. Nous nous baserons donc sur ces résultats obtenus et sur les résultats obtenus aux âges de 3, 6 et 9 mois, pour choisir l’âge le plus pertinent afin de tester des traitements préventifs et/ou curatifs.
Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines virales en utilisant des souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.
Objectifs
Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).
Bénéfices attendus
Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.
Procédures
Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.
Impact sur les animaux
La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.
Devenir
Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.
Réduction
Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)
Choix des espèces
La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance