Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Creation d’un modèle murin des affections neurosensorielles et étude d’une thérapie
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une neuropathie humaine, elles développent des déficits auditifs et visuels, et subissent des mesures de l'audition et de la vision sous anesthésie générale avec pose d'électrodes sous-cutanées et cornéennes, puis un traitement par gavage. Le porteur indique que la privation sensorielle perturbe leurs interactions avec l'environnement et génère du stress. Il teste une molécule censée restaurer la régulation du fer, présentée comme préalable à un essai clinique chez les patients.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’efficacité d’un traitement médicamenteux dans la récupération ou la stabilisation des fonctions auditives et optiques dans un modèle animal présentant ces atteintes neurosensorielles causées par des mutations du gène étudié. Il s’agit d’un gène découvert chez l’Homme dans un contexte de neuropathie auditive et optique débutant à l’adolescence et s’aggravant rapidement pour entrainer une cécité quasi-complète ainsi qu’un déficit auditif profond. La protéine qui est codée par ce gène présente un rôle important dans la synthèse de protéines régulant le fer intracellulaire (protéines à centre fer-soufre). Les études cellulaires ont montré que les mutations du gène entrainent une surcharge de fer dans la cellule. Les défauts de synthèse des acteurs de la régulation du fer, dont les protéines fer-soufre, sont à l’origine de cela. Il a été démontré dans ces cellules que la molécule A permet de restaurer la régulation du fer lorsque ces acteurs manquent. Or, nous ne savons pas si cela peut se traduire par la restauration des fonctions auditives et/ou optiques chez les patients. L’étude du modèle murin permettra donc, d’une part de comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la mutation du gène, en étudiant d'une part, les modifications des structures de l'oreille interne et de la rétine, et d'autre part, l’efficacité de la molécule A dans la récupération des fonctions sensorielles.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de comprendre les mécanismes in situ des atteintes neurosensorielles (auditive et oculaire) chez les patients portant une mutation. Nous serons capables d’étudier l’évolution de ces atteintes neurosensorielles chez la souris qui présente un développement plus rapide que l’Homme, cela nous permettra d’avoir une idée du pronostic. Nous analyserons la morphologie des cellules ciliées et du nerf auditif, ainsi que les éléments permettant la neurotransmission au niveau de la synapse. De même, une étude parallèle des cellules de la rétine, ainsi que du nerf optique, sera effectuée de la même manière. Ces éléments permettront de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces atteintes. Le traitement des souris par la molécule A permettra d’avoir des éléments de réponses pour juger de son efficacité dans la préservation ou la récupération des fonctions auditives et optiques.L’efficacité chez la souris permettra de mettre en place un protocole de traitement des patients durant un essai clinique.
Procédures
Nous étudierons cette lignée à différentes étapes de son développement en mesurant les fonctions auditive et oculaire. La fonction auditive sera évaluée par la mesure des potentiels évoqués auditifs ainsi que des otoémissions acoustiques provoquées via le recueil des produits de distorsions. Ces mesures dureront environ 30 à 45mn. La fonction oculaire sera étudiée par l’électrorétinogramme (environ 15mn) Les enregistrements des fonctions oculaires et auditives seront réalisés après anesthésie générale (injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine 100mg/Kg, et xylazine 10mg/Kg) Le traitement sera administré sous forme liquide par gavage oral une fois par jour chez des souris vigiles qui seront surveillées dans les minutes qui suivent afin de s'assurer de l'absence de fausse route.
Impact sur les animaux
Les souris étudiées seront atteintes de déficit auditifs et visuels, ces atteintes entraineront une perturbation leurs interactions avec l’environnement du fait de la privation sensorielle, ainsi que des modifications de leurs comportements liées au stress que cela va entrainer. Les explorations fonctionnelles auditives et optiques nécessiteront une anesthésie générale des souris par ketamine et xylazine afin de limiter au maximum la douleur liée à la mise en place d’électrode sous-cutanée permettant de recueillir les potentiels évoqués auditifs durant les stimulations auditives. Durant cette même anesthésie générale, l’implantation d’une électrode de recueil cornéenne associée à des stimulations lumineuses permettront de réaliser l’electrorétinogramme.
Devenir
Toutes les souris utilisées pour cette étude seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin d'obtenir les prélèvements histologiques pour analyser post mortem
Remplacement
L'utilisation de cellules en culture (fibroblastes) permettra d’effectuer les premières analyses fonctionnelles pour caractériser l'impact des mutations et pour évaluer l'efficacité de la molécule A in vitro dans les fibroblastes de patients. Dans un deuxième temps, dans le cadre de développement thérapeutique, il sera indispensable d’utiliser un modèle animal afin de tester l'efficacité de la molécule in vivo, avant que son utilisation ne soit envisagée chez l’homme.
Réduction
Afin de Réduire le nombre d'animaux utilisés, la procédure d'enregistrement de l'électrorétinogramme et des potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions seront standardisée sur les deux yeux et sur les deux oreilles respectivement. De plus, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les études fonctionnelles (électrorétinogramme,des potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions) et les analyses histologiques.Les explorations fonctionnelles serons réalisées à chaque stade de développements chez 10 souris dans chaque groupe (mutantes et témoins) avant la mise à mort de celles-ci. Le nombre de 10 animaux par condition par groupe sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Les enregistrements de la fonction visuelle par électrorétinogramme ainsi que la fonctionne auditive par potentiels évoqués auditifs et les Otoemissions acoustiques par produits de distorsions seront réalisés sous anesthésie générale pour éviter toute souffrance et éviter que les animaux bougent. Les procédures mises en place pour réaliser le projet sont peu traumatiques, de courte durée, elles peuvent néanmoins engendrer du stress. Les animaux seront surveillés quotidiennement, des antalgiques seront administrés en cas de douleur et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Le globe oculaire et l'oreille de la souris présentent des structures similaires à celles de l’humain et représentent donc des modèles adaptés pour les études physiopathologiques. De plus, les neuropathies optiques et auditives sont des pathologies pour lesquelles il est difficile de récupérer du matériel biologique adapté chez l’humain (énucléation ou pétrectomie inenvisageables), et donc de réaliser une étude scientifique fondamentale précise du tissu d'intérêt. Enfin, pour tester l’efficacité d'une molécule in vivo dans le cadre d'un développement thérapeutique, il est indispensable d’utiliser un modèle animal. Le modèle murin présente également l'avantage d'une reproduction relativement rapide compte tenu de la durée d’ovulation et de gestation de la souris. Pour toutes ces raisons, nous avons considéré le modèle murin comme étant le plus adapté pour l’étude de ces affections neurosensorielles.
Étude des fonctions de modifications du squelette cellulaire et leur implication dans les pathologies
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
5 209 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs organes, dans des procédures relevant de la gravité sévère ou menées sous anesthésie sans réveil. Une partie ne subit qu'un suivi de son état clinique, d'autres une ouverture du thorax sous anesthésie profonde sans reprise de conscience, pour étudier la régulation du squelette des cellules. Le porteur signale qu'une souche présente une ataxie et que l'état des nouvelles lignées créées reste inconnu à l'avance. Il justifie l'usage de la souris par l'étude de ces mécanismes au niveau de l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du squelette cellulaire (cytosquelette): d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Le cytosquelette étant impliqué dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies. A terme, ce projet permettra de développer les moyens de dépistage et de nouvelles thérapies ciblant les maladies reliées à la dérégulation du cytosquelette. Le cytosquelette est présent dans toutes les cellules, ou il exerce des rôles très divers : il donne aux cellules leur forme, participe au mouvement des cellules et au transport intracellulaire, rend possible la division cellulaire et le déplacement de spermatozoïdes lors de la fécondation. Le cytosquelette interagit avec de nombreuses protéines qui contrôlent ses fonctions. Une des hypothèses suggère que le choix des éléments utilisés pour construire le squelette cellulaire et les modification de ces éléments constituent un code, qui définit ses propriétés et influence les interactions avec les autres protéines spécifiant ainsi ses fonctions. Le présent projet est une continuation d’un projet précèdent, qui a permis de démontrer le rôle essentiel de la régulation du cytosquelette dans la survie des neurones et dans la fertilité. Nous proposons maintenant d’étendre notre analyse à d’autres modèles murins de ce code de cytosquelette.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de maladies telles que les neurodégénérescence, cancer ou infertilité. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette et de développer les moyens de dépistage et les traitements des pathologies liées à sa dérégulation.
Procédures
Les animaux sont soumis à une analyse phénotypique (analyse de l’état clinique des animaux) pendant leur vie mais ne subiront aucune intervention. A différents âges, les animaux seront anesthésiés et ensuite mis à mort pour fixation de leurs organes.
Impact sur les animaux
Une des souches murines utilisée dans ce projet a été décrite comme ataxique, c'est à dire qui présente des problèmes de coordination de mouvements. Pour les nouveaux modèles qui seront générés dans le cadre de cette étude, la condition des animaux n’est pas connue à l’avance. Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s'arrêteront en fin de chirurgie (procédure sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses de leurs organes
Remplacement
Après les premières étapes d'analyse des enzymes, impliquant la culture cellulaire (expression d’enzymes dans les lignées cellulaires et observation de leurs activités), le projet a pour but maintenant de comprendre la fonction de ces enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris.
Réduction
Les animaux générés lors de ce projet seront utilisés à la fois pour l’analyse phénotypique et pour l'analyse de leurs organes, permettant de réduire le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs. Les croisements seront optimisés pour produire les animaux d'intérêt. Les animaux contrôles proviendront des mêmes portées que les animaux d’intérêt.
Raffinement
Les animaux seront surveillés deux fois par semaine minimum. Tout signe de mal-être, tel que la perte de poids, blessure, mauvaises relations sociales sera détecté et l‘animal sera soigné et soit isolé, soit mis à mort. Les soins peuvent inclure l’application d’une crème désinfectante (blessure) ou d’un complément nutritif (perte de poids). Une grille de score est mise en place pour le suivi clinique des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges : nouveau-né, 1 mois (animal jeune), 4 mois (animal adulte), 12 mois (animal âgé) et 18 et 24 mois (animaux très âgés). En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme. De plus, certains mutants devront être analysés très âgés, vu que l’on veut observer la dégénérescence liée à l’âge chez ces animaux. Les analyses de certaines lignées (à phénotype non-dommageable uniquement) nécessiteront la génération d’embryons au stade embryonnaire E14.5 ou E17.5 (soit 14,5 jours-post fécondation ou 17,5 jours post-fécondation) E14.5 ou E17.5. En effet à partir d’embryons de ces âges (en jour post-fécondation) il est possible de cultiver les cellules primaires nécessaires pour l’étude de mécanismes cellulaires impliqués.
Étude de la circulation des cellules ILC2s au cours de l’inflammation de type 2.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.
Objectifs
Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.
Procédures
• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).
Devenir
les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.
Raffinement
Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.
Choix des espèces
Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.
Effets cardiovasculaires précoces des toxines urémiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit deux chirurgies à sept jours d'intervalle pour provoquer une insuffisance rénale, avant l'administration de toxines urémiques et un suivi par échographie et IRM sous anesthésie jusqu'à une mise à mort échelonnée. Le porteur indique une douleur après les chirurgies, une perte de poids et des troubles du comportement dans les semaines suivantes. Il affirme que l'analyse des atteintes cardiovasculaires ne peut se faire in silico et juge le modèle souris "indispensable".
Objectifs
L'objectif de ce travail est d'étudier les effets vasculaire et cardiaque spécifiques de deux toxines urémiques: l’Indoxyl sulfate (IS) et le Para-cresyl sulfate (PCS).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de démontrer que les dysfonctions cardiaque et vasculaire observées au cours de l'insuffisance rénale aiguë (IRA) sont en partie secondaires à l'accumulation des toxines urémiques IS et PCS. Ce projet nous permettra d'en montrer le lien direct indépendamment de l'IRA en elle-même en utilisant des groupes de souris sans insuffisance rénale avec exposition par voie orale à l'IS ou au PCS. Les résultats de ce projet pourraient nous permettre également d'envisager des études thérapeutiques visant les toxines urémiques directement ou leurs mécanismes d'action.
Procédures
Les animaux du groupe IR (insuffisants rénaux ou groupe témoin positif) seront soumis à une procédure chirurgicale destinée à réduire le fonctionnement rénal. Les souris subiront 2 chirurgies à 7 jours d'intervalle afin de créer une insuffisance rénale. Les autres groupes (groupes sham ou groupe sans insuffisance rénale) seront soumis à des opérations blanches. Les animaux seront ensuite traités selon les groupes par KCl, IS ou PCS et suivis par imageries non invasives (échographies et IRM réalisées sous anesthésie), jusqu'à l'euthanasie qui surviendra dans chaque groupe à 3 temps (J7, J15 et J45). La procédure d'échographie durera 30 minutes et l'IRM 1 heure. Les prélèvements sanguin et tissulaires seront réalisés à l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux directement liés aux chirurgies et aux imageries de suivi. Les risques liés aux chirurgies et aux imageries de suivi concerneront tous les groupes de l'étude cardiovasculaire. Ils seront représentés essentiellement par la douleur aux décours des actes de chirurgies puis dans les semaines suivantes par un retentissement sur le bien-être (perte de poids, troubles comportementaux etc.).
Devenir
L'étude sera divisée en deux parties (étude préliminaire puis étude cardiovasculaire). Au terme des deux procédure (étude préliminaire et étude cardiovasculaire), les souris seront euthanasiées. Pour l'étude préliminaire, elles seront euthanasiées à J7 et J15 pour évaluer une cinétique de concentration d'IS et de PCS afin de définir la dose adéquate à administrer aux souris dans l'étude cardiovasculaire. Pour l'étude cardiovasculaire, les souris seront euthanasiées à 3 temps différents (10 souris à chaque temps par groupe) J7, J15 et J45 afin de réaliser une cinétique d'étude des atteintes structurelles cardiovasculaires (par mesure de marqueurs vasculaires et cardiaques dans le plasma et au niveau tissulaire).
Remplacement
L’analyse précise des conséquences cardiovasculaires de l’IR sur le plan tissulaire et fonctionnel ne peut être réalisée par des études in silico et l’utilisation de modèles animaux reste à l’heure actuelle indispensable. Notre choix s’est porté sur un modèle de souris car c’est le modèle le plus utilisé, le plus accessible et reconnu par l’ensemble de la communauté scientifique.
Réduction
En vue de réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude préliminaire sera effectuée avec un effectif d’animaux réduit (7 groupes de 10 souris par groupe soit 70 souris) pour établir la dose adéquate d’IS et de PCS à administrer aux souris dans la suite de l’étude. L'étude cardiovasculaire sera réalisée sur un total de 120 souris avec 4 groupes de 30 souris par groupe. Dans l'étude cardiovasculaire de nombreux paramètres tissulaires et fonctionnels seront réalisés sur les mêmes animaux. Afin de pouvoir mettre en évidence une différence significative entre les groupes en tenant compte de la variabilité des mesures et de la mortalité, 10 animaux par groupe et par temps seront nécessaires pour les analyses tissulaires et biochimiques.
Raffinement
Dans le cadre d’un raffinement, on placera des nids végétaux, litières adaptées à la nidification et un fond sonore musical afin de favoriser le bien-être des animaux qui seront hébergés à plusieurs par cage. Des points limites seront établis et adaptés aux procédures mises en place et toutes les précautions d’usage seront mises en œuvre en terme d’anesthésie et d'analgésie afin de limiter la douleur des animaux au décours des chirurgies et lors des d’imageries. Afin de réduire la douleur lors des chirurgies (blanches ou IR), celles-ci seront effectuées sous anesthésie. Les chirurgies seront réalisées après avoir vérifié que le niveau d’anesthésie et d'analgésie est adéquat en appliquant une pression sur une des pattes de l’animal. De l’anesthésique sera réadministré en cas de réaction de l’animal. La douleur postopératoire sera systématiquement évaluée et traitée par une injection sous-cutanée d'analgésique. Tous les animaux seront suivis en postopératoire immédiat quotidiennement et jusqu’à la fin du protocole selon un score permettant de caractériser l’état de bien-être des animaux. Ainsi, la plus grande attention sera portée afin d'éviter la survenue de douleur et de stress chez les animaux tout au long du protocole.
Choix des espèces
Notre modèle murin d’IR a été validé par plusieurs publications aussi bien par notre équipe que par d’autres. Il s'agit d'un modèle d'IR stable (le niveau d'urée restant relativement stable avec le temps) qui peut devenir chronique si on laisse l'IR persister pendant plus d'un mois (chez l'homme c'est 3 mois). Avant un mois d'évolution chez la souris, l'IR est encore considérée comme aigue, permettant l’étude des stades précoces. Le modèle murin d’IR par électrocautérisation/néphrectomie est très largement utilisé depuis plusieurs années dans la communauté scientifique et accepté par les Comités d’Ethique en Matière d’Expérimentale Animale. De plus, l’étude présentée ici vise à apporter des données physiopathologiques complémentaires à ce modèle. Conformément aux publications précédentes de notre laboratoire employant le modèle d’IR, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines. Les souris arriveront à l’animalerie âgées de 6 semaines et nécessiteront 2 semaines d’acclimatation.
Optimisation des modèles de maladies neurodégénératives chez la souris par implantation intracérébrale d’organoïdes cérébraux
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tuées à l'issue et 60 reproductrices réutilisées pour d'autres projets ou le maintien de la lignée. Un organoïde cérébral de 1 à 2 mm leur est greffé dans le cerveau sous anesthésie, parfois suivi d'une injection d'une molécule candidate. Le porteur indique des effets possibles pendant environ une semaine, stress, douleur, œdème, hémorragie ou comportement anormal, ainsi qu'un risque de prolifération des cellules injectées. Les retombées thérapeutiques sont renvoyées au long terme, et il affirme qu'un tissu complet reste accessible uniquement via l'animal.
Objectifs
Les recherches dans le champ du vieillissement du cerveau humain et des maladies neurodégénératives sont largement menées chez des souris génétiquement modifiées qui surexpriment des protéines pathologiques associées à ces maladies. De ce fait, il est difficile d’étudier ces pathologies au plus proche du contexte physiologique ainsi que les mécanismes qui mènent à leur propagation. Le projet s’intéresse à mettre au point un nouveau modèle murin permettant l’étude du vieillissement et des maladies associées. Les souris recevront une greffe d’organoïdes cérébraux dans le cerveau. Ces organoïdes, aussi appelés « minibrain », sont des structures en trois dimensions de cellules cérébrales obtenues in-vitro. La greffe de ces organoïdes chez la souris permettra d’évaluer de multiples mécanismes, comme la vascularisation ou la mise en place des projections axonales, mais aussi leur colonisation par les cellules gliales et l’interconnexion neuronale entre elles et les tissus cérébraux de l’hôte. En conditions pathologiques, suite à la greffe d’organoïdes provenant de cellules génétiquement modifiés, les conditions d’initiation de la pathologie étudiée seront plus proches de celles retrouvées chez les patients. Il sera alors possible d’étudier l’évolution, la prolifération et la colonisation de la pathologie au sein d’un organisme modèle et d’évaluer la transmission des signaux nerveux entre la greffe et le tissu hôte des souris. Enfin, une dernière partie s’intéressera à valider et repositionner notre modèle avec les traitements déjà utilisés chez les modèles transgéniques et qui permettent d’endiguer la propagation et/ou avoir des effets bénéfiques sur les déficits observés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra dans un premier temps d’étoffer les connaissances scientifiques sur plusieurs aspects, tout d’abord techniques, sur l’implantation d’un organoïde chez la souris mais aussi fondamentales, sur les mécanismes prolifératifs des maladies neurodégénératives ainsi que la mise en place des processus neuronaux et gliaux. Un nouveau modèle murin sera alors accessible à la communauté scientifique pour étudier toutes sortes de mécanismes cérébraux. Ce projet vise aussi à repositionner notre modèle par rapport au modèles transgéniques en évaluant les effets de différentes stratégies thérapeutiques déjà éprouvées chez les animaux transgéniques. Ce nouveau modèle pourrait permettre à plus long terme la mise en place de traitements, préventifs ou palliatifs, pour lutter contre les maladies neurodégénératives.
Procédures
En fonction de la procédure les animaux recevront au maximum une intervention chirurgicale pour réaliser la greffe de l’organoïde dans le cerveau des rongeurs. Cet acte chirurgical sera effectué sous anesthésie et analgésie, qui durera environ une trentaine de minutes. Une injection permettant l’administration d’une molécule candidate pour un traitement sera réalisée elle aussi sous anesthésie (30 minutes), un mois après. D’autres animaux pourront recevoir, toujours sous anesthésie (30 minutes), une injection contenant les cellules des organoïdes dissociées suivi d’une autre injection un mois plus tard contenant une molécule candidate pour un traitement.
Impact sur les animaux
Les animaux participant à cette étude pourraient présenter des effets indésirables suite à la greffe dans la cavité cérébrale d’un organoïde dont la taille est comprise entre 1 et 2mm de diamètre. Dans la semaine qui suit cette procédure, les animaux pourraient être affectés de différentes manières par des effets indésirables : un stress et/ou une douleur accrus, un œdème ou une hémorragie ou encore un comportement anormal. La durée probable de ces effets indésirables est estimée à une semaine. Un autre effet indésirable possible est la prolifération des cellules injectées dans les temps plus tardifs.
Devenir
A l’exception des animaux reproducteurs qui n’auront reçu aucune chirurgie ni injection (élevage et production des animaux pour les autres procédures), les animaux entrant dans les procédures seront euthanasiés. Il sera ainsi possible de rechercher et scorer les mécanismes permettant à l’organoïde et au tissu cérébral de l’hôte de cohabiter, ainsi que les effets pathologiques liés à la présence d’un organoïde porteur d’une mutation retrouvée dans les maladies neurodégénératives. Les animaux reproducteurs seront réutilisés, toujours en tant qu’animaux reproducteurs pour d’autres projets ou le maintien de la lignée dans l’animalerie.
Remplacement
De nombreuses caractérisations du développement et de la prolifération des maladies neurodégénératives ont déjà été faites au niveau cellulaire et sur des modèles animaux transgéniques. Nous souhaitons mettre en place dans ce projet un nouveau modèle animal, le plus complet possible, qui permettrait de suivre le développement de ces pathologies. Pour suivre et évaluer la dissémination des marqueurs physiopathologiques, nous avons besoin d’un tissu complet disposant de tous les types cellulaires interagissant ensemble. Tous ces paramètres sont accessibles uniquement via un modèle animal.
Réduction
Dans la littérature spécialisée, les essais « pilotes » se font sur des groupes de 5 à 15 souris immunodéficientes. Chaque expérience peut être répétée au moins 2 fois, si besoin, pour obtenir des données statistiquement exploitables. Pour établir un nouveau modèle biologique et acquérir une expertise technique pour effectuer le geste chirurgical pour effectuer la greffe, nous envisageons d’utiliser des groupes de 5 animaux lorsqu’il s’agit de mettre au point les conditions optimales pour réaliser la greffe et des groupes de 10 animaux pour les études des pathologies ou des traitements. Ce nombre d’animaux par groupes nous permettra de considérer l’étude comme statistiquement significatives. Pour une expérience donnée, si les résultats statistiques se montrent significatifs après une répétition, la seconde et dernière répétition ne sera pas effectuée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5, dans un environnement approprié à leur statut immunodéficitaire (litière et nourriture stérilisées, eau sur filtre antibactérien d’exclusion 0,22 µm, cages avec couvercle filtrant dans un local isolé) à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies autant que nécessaire. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens, sous la supervision du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi sera fourni aux animaux, selon nos procédures standards (tubes de carton, boules de coton…). De plus, une première expérience sera destinée à apporter un raffinement technique sur l’implantation d’organoïdes cérébraux chez la souris en passant d’une opération chirurgicale à une injection intracérébrale. Des mesures spécifiques sont prises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales : surveillance accrue, soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur, …). Mise en place egalement de points limites adaptés et d’un arbre décisionnel en fonction des observations faites pour l’application des points limites .
Choix des espèces
Le modèle murin (souris) est le modèle de référence dans le domaine des maladies neurodégénératives. Il s’agit du modèle le plus utilisé et le plus étudié dans la communauté scientifique et une bibliographie riche et abondante y est associée. Pour réaliser notre projet, nous nous appuierons sur les différentes données déjà publiées, comme l’évolution des pathologies pour les animaux génétiquement modifiés, afin de comparer ces données aux résultats que nous obtiendrons avec notre nouveau modèle. Ces données nous permettent de faire reposer ce projet sur des bases bibliographiques solides qui ne sont pas à répéter, ce qui va aussi dans la logique d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, le laboratoire dispose des compétences techniques pour effectuer les greffes d’organoïdes chez la souris ce qui permettra une diminution du nombre d’animaux utilisés. Age/poids des souris : 6 à 8 semaines et de 20 à 25g. Il s’agit d’après la littérature scientifique du stade optimal pour réaliser les greffes d’organoïdes chez les souris immunodéprimées.
Implantation en tant que pontage artérioveineux chez le gros animal d’un vaisseau sanguin allogénique obtenu par tissage de fils de matrice extracellulaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trois à quatre heures de chirurgie pour poser deux pontages entre carotide et veine jugulaire, puis aucun anti-inflammatoire après l'opération : les brebis de ce projet sont privées de ce traitement parce que l'étude porte sur leur réaction inflammatoire. 10 brebis adultes, âgées d'au moins 13 mois, vont être utilisées, toutes tuées à 4 ou 8 semaines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec des échographies sous anesthésie générale toutes les deux semaines et, pour le groupe suivi huit semaines, une ponction du pontage à l'aiguille. Le projet compare un vaisseau tissé à partir de matrice produite par les cellules d'autres moutons à une prothèse synthétique du commerce, et le porteur dit avoir choisi le mouton parce que ses cellules sont les seules, selon ses travaux, à produire des feuillets proches de ceux des cellules humaines. Les procédures décrivent huit brebis implantées, pour un effectif déclaré de dix, sans expliquer l'écart.
Objectifs
Les substituts vasculaires entièrement biologiques d’origine humaine issus d’une approche basée sur la synthèse de matrice par les cellules in vitro dite de « Cell-Assembled extracellular Matrix-CAM » ont été implantés chez l'Homme avec succès. Pour pallier les limites des prothèses vasculaires synthétiques, l’approche CAM permet la production de feuillets entièrement biologiques grâce à des cellules extraites à partir de peau humaine adulte saine. Des greffons de vaisseaux sanguins obtenus par roulage de ces feuillets ont été implantés avec succès chez des patients montrant une remarquable biocompatibilité. Cependant, leur méthode d’assemblage est longue pour permettre la fusion des différentes couches du vaisseau. Pour réduire le temps de production, ces feuillets sont transformés en fils qui, une fois montés sur un métier à tisser, permettent l’obtention d’un substitut vasculaire par tissage. Une implantation dans un modèle de gros animal ayant une anatomie proche de celle de l’humain est indispensable pour évaluer le comportement mécanique des produits d’ingénierie tissulaire tissés issus de l’approche CAM. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’étudier le comportement mécanique ainsi que le remodelage in vivo de nos substituts vasculaires biologiques tissés à partir de fils de CAM face à une hémodynamique propre à l’hémodialyse, un contexte clinique pertinent, et ce dans un contexte de greffe allogénique, c’est-à-dire dans un contexte où un tissu d’un individu d’une espèce est implanté chez un autre individu d’une même espèce. Cela permettra d’étudier les réactions immunitaires innées et adaptatives, et de mettre en évidence que notre substitut peut être implanté en tant qu’accès vasculaire artérioveineux et subir/s’adapter à une hémodynamique importante et subir un remodelage adapté. Cela permettra également de mettre en évidence la faible réponse immunitaire à court terme de l’hôte suite à l’implantation. Ces résultats permettront d’envisager la réalisation d’une étude à plus long terme (jusqu’à 1 an) pour évaluer la viabilité à long terme du greffon et ce à terme pour utiliser cette technique chez les patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples. Ce projet permettra de mettre en avant la possibilité d’utiliser des substituts vasculaires tissés à partir de CAM allogénique. En effet, ce projet permettra de mettre en avant la faible réponse immunitaire de l’hôte à notre substitut allogénique. Ces réponses supporteront l’idée que des vaisseaux allogéniques tissés dévitalisés peuvent être utilisés avec efficacité et peuvent pallier à la limite des substituts autologues. Également, les études du comportement mécanique et du remodelage du substitut apporteront des réponses essentielles qui permettront de modifier les paramètres de tissage des substituts afin d’adapter leurs propriétés mécaniques et structurelles de l'organisme. Les adaptations mises en place suite à ces résultats permettront ainsi d’obtenir un substitut dont les propriétés répondront au mieux à une situation clinique donnée.
Procédures
Toutes les interventions dans cette étude seront faites sur des animaux anesthésiés. Premièrement, les implantations d’un substitut vasculaire tissé ainsi que d’un contrôle avec une prothèse synthétique commercialisé et actuellement utilisée en clinique, seront effectués dans un modèle bilatéral sur chacune des huit brebis, après anesthésie et avec des protocoles pré, per et post opératoires adaptés. Cette procédure chirurgicale est prévue une fois par animale pour une durée estimée à 3 à 4 heures. Les animaux seront soumis à des contrôles échographiques post-implantation et à des temps de 2 et 4 semaines (pour le groupe de 4 semaines), et post-implantation et à des temps de 2, 4, 6 et 8 semaines (pour le groupe 8 semaines). Chaque échographie sera réalisée sur animal anesthésiée pour réduire le stress des animaux. Chaque échographie ne durera pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure. Pour le groupe de 8 semaines, une ponction de l’abord vasculaire sera effectuée avec une aiguille 16G afin de simuler un contexte d’hémodialyse. Cette ponction sera réalisée à 4 semaines, lors de l’échographie de contrôle, sur animal anesthésié. La ponction et l’échographie ne dureront pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure.
Impact sur les animaux
La phase déterminante pour le bien-être de l’animal repose sur un temps d’intervention court. En effet, chaque brebis sera sous anesthésie générale pour effectuer la chirurgie d’implantation du greffon. Plus le temps passé sous anesthésie est court, mieux c’est pour le bien-être de l’animal et la réduction des effets indésirables de l’anesthésie. Nous estimons la durée de la chirurgie de 3 à 4 heures. Une fois implanté, des effets indésirables liés au greffon pourraient apparaître. Si des problèmes d’hémorragie ou d’écoulement à travers le greffon apparaissent, le protocole d’anticoagulation pourra être revu et adapté. Un autre effet indésirable potentiel est le déchirement du greffon, suite à un mouvement brusque de la brebis ou un coup porté sur l’implant par un autre animal. Si un déchirement est observé et est attribué directement au greffon, le design de ce dernier pourra être adapté pour les brebis suivantes. Afin de gérer le stress des animaux et d’éviter un endommagement du greffon et/ou une blessure de l’animal, les contrôles échographiques se feront sous anesthésie générale. De plus, cela permettra d’analyser le greffon avec plus de précision que si la brebis est vigile et en mouvement. Ces contrôles et l’anesthésie générale dureront une heure maximum. Une des nuisances pour l’animal au sein de cette étude est également l’absence de traitement anti-inflammatoire en post-opératoire. En effet, ce projet repose sur l’étude de la réaction inflammatoire de l’hôte suite à l’implantation des substituts vasculaires. Ainsi, aucun traitement anti-inflammatoire ne sera administré suite à l’implantation Au cours de cette étude, un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié.
Devenir
A l’issu des contrôles terminaux, tous les animaux seront mis à mort aux différents temps définis (4 et 8 semaines). En effet, nous étudierons la réponse immunitaire ainsi que le remodelage des allogreffes par les cellules ; cette étape nécessitant le prélèvement du substitut vasculaire préalablement implanté entre la carotide et la veine jugulaire, la mise à mort de celui-ci est inévitable.
Remplacement
Un modèle de vaisseau humain peut être largement étudié in vitro d’un point de vue mécanique grâce à des bancs d’essais. Cependant, ces plateformes de tests ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire ou l’intégration d’un greffon dans des conditions réelles d’utilisation. Il ne sera donc pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux. Ainsi l’utilisation d’un modèle animal de grande taille possédant un système cardiovasculaire proche de l’homme (porcin, ovin, canin ou primate) est souhaitable pour ce projet. En effet, l’objectif du projet est d’évaluer la fonctionnalité, la réponse immunitaire et l’intégration du substitut vasculaire dans l’organisme vivant et entier et ce, dans un contexte clinique pertinent (pontage artérioveineux), afin d’envisager à terme une utilisation chez les patients.
Réduction
Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. Huit brebis seront implantées avec le même nombre de conditions expérimentales. Un modèle bilatéral sera utilisé ; ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux impliqués dans l’expérimentation.
Raffinement
Le raffinement sera pris en compte tout au long du projet. Le projet sera mis en place dans des locaux agréés avec du personnel dédié et expérimenté. De l’enrichissement sera mis en place pour répondre au besoin des animaux (pierre à sel, foin, hébergement en groupe sociaux, paille). Un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place lors des différentes phases et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié et formé à l’espèce étudiée. Si nécessaire, des actions adaptées seront appliquées et le vétérinaire désigné de l’établissement sera sollicité.
Choix des espèces
Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité de greffons vasculaires de diamètres qui correspondent à ceux utilisés en clinique, notamment en pontage artérioveineux. Le modèle ovin a été choisi car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine vasculaire (comme le modèle canin et le modèle porcin). En revanche, d’après nos études menées au laboratoire, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de CAM qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes, à ce stade les brebis possèdent un système immunitaire et un système vasculaire mature.
IronTWIK
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
De l'embryon de 15 jours à la souris de 60 jours, les petits de femelles gestantes nourries avec plus ou moins de fer sont tués à cinq stades de leur développement pour prélever leur cerveau, leur duodénum, des neurones de la moelle épinière, leurs nerfs sciatiques et de la peau du dos. 400 souris, issues de lignées qui expriment différentes formes du canal potassique TWIK1 ou en sont dépourvues, vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Pour ce niveau sévère, le porteur affirme que le projet ne comporte, hors le régime appauvri en fer, "aucune procédure pouvant nuire au bon développement" des souris, tout en envisageant un déficit nerveux chez les souriceaux d'une lignée plus sensible. Il annonce trois lignées dans ses objectifs et quatre dans son calcul d'effectifs. Il exclut toute réutilisation ou adoption, en écrivant devoir envisager que les effets du régime "puissent se développer plus tard".
Objectifs
L'objectif principal de ce projet IronTWIK1 est de montrer que le canal ionique TWIK1 joue un rôle central dans la maturation des fibres nerveuses et que cette fonction est liée au métabolisme du fer par les neurones concernés. Pour cela, nous souhaitons soumettre les femelles gestantes de 3 lignées de souris exprimant ou non des formes différentes du canal TWIK1 (absent, sélectif pour le potassium, non-sélectif pour le potassium) à deux régimes alimentaires se distinguant par des teneurs en fer différentes ; un dit « haut Fer » et un dit « bas Fer ». Nous sacrifierons les souriceaux à différents stades de leur développement pour analyser les niveaux de maturation des fibres nerveuses concernées ainsi que le développement du système nerveux de la peau.
Bénéfices attendus
Le canal TWIK1 participe avec les autres membres de la famille des canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) au maintien du potentiel de repos des cellules excitables et à la protection neuronale. Les neurones liés au toucher et qui constituent les afférences principales des mécanorécepteurs de la peau et des poils sont caractérisés par la présence d’une couche de myéline. Bien qu'on ne s'explique toujours pas le rôle qu'il puisse y jouer, le canal TWIK1 apparait comme le mieux exprimé de sa famille dans ce type de fibres nerveuses. Or, ce canal potassique partage avec les protéines essentielles à la maturation et la myélinisation de ces même fibres nerveuses une localisation subcellulaire et une dépendance au pH qui laisse supposer qu'il pourrait en contrôler l’activité et la maturation. Une telle mise en évidence permettrait d’envisager un contrôle pharmacologique de cette maturation par le contrôle de l’activité ou de la sélectivité de ce canal potassique. Si cette hypothèse était avérée, ce projet, ouvrirait une porte encore jamais utilisée pour comprendre les mécanismes de la maturation des fibres nerveuses ni dans le traitement des maladies neurodégénératives par la pharmacologie liée à ces canaux ioniques.
Procédures
Tous prélèvement prévus dans ce projet sera effectué sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
Outre l’exposition des mères gestantes à un régime appauvri en fer, ce projet ne propose aucune procédure pouvant nuire au bon développement et au bien-être des animaux. Il est possible toutefois qu’une des trois lignées étudiées soit plus sensible que les autres à cette diminution du taux de fer dans la nourriture et que cette sensibilité différente se manifeste par un déficit nerveux altérant le développement normal des souriceaux. Le cas échéant, nous procéderons à l’application des règles établies pour les points critiques qui peuvent aller jusqu’à l'arrêt de la procédure et l'euthanasie des animaux.
Devenir
Nous ne savons pas à l'heure actuelle les effets que peut avoir un régime appauvri en Fer sur les souris génétiquement modifiées pour le canal TWIK1. Même si ces effets ne sont pas visibles en fin de procédure, nous devons envisager que ceux-ci puissent se développer plus tard c'est pourquoi nous ne pouvons pas choisir l'option de réutiliser, replacer ou adopter les animaux.
Remplacement
Le remplacement des souris, par l’utilisation de cultures cellulaires par exemple, a déjà largement été employé dans l’étude de ce canal. L’observation de TWIK1 a débuté par son clonage en 1996. En 2012, les mécanismes de changement de sélectivité lors d'une exposition à des pH acides ont été étudiés dans les ovocytes de Xénopes. Le canal TWIK1 est un canal fonctionnel pour lequel il est à présent indispensable d’étudier le mode de fonctionnement in vivo et son rôle physiologique. L’implication de TWIK1 dans la maturation des fibres nerveuses liées au toucher et à la proprioception nécessite l’utilisation d’un modèle animal car pour le moment, aucun système in vitro ne permet de reproduire l’ensemble des mécanismes physiologiques d’un organisme entier. De par ses similarités avec la physiologie humaine, et parce ce que nous possédons trois modèles murin génétiquement modifié pour TWIK1, la souris constitue le meilleur modèle pour adresser cette question. De plus, la caractérisation de cette maturation doit tenir compte du développement de l'animal et doit donc se faire sur un animal entier.
Réduction
Les 4 lignées de souris concernées par ce projet sont déjà disponibles dans le laboratoire où elles font l’objet d’une étude sur le rôle du canal TWIK1 dans la perception de la douleur et dont les procédures ont été validées par les instances ministèrielles. Ici, nous utiliserons indifféremment les animaux mâles et femelles. Une large recherche bibliographique nous a permis d’optimiser le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir une réponse statistiquement significative. La maturation du système nerveux périphérique s’évalue d’une part par la mise en place des fibres spécialisées et d’autre part par la mesure de l’épaisseur de la gaine de myéline des fibres myélinisées. Cette dernière mesure, comparée à l’épaisseur de la fibre nerveuse sans la myéline, constitue un paramètre appelé rapport-g (ou g-ratio). Celui-ci constitue dans ce projet notre variable d’intérêt. Une consultation de la littérature traitant de ce sujet nous a permis, par un calcul de puissance statistique de déterminer la taille d’effectif la plus juste en tenant compte des conditions expérimentales (2 régimes différents, 2 sexes, 4 génotypes). Le calcul effectué dans ces conditions renvoie des effectifs de 6 souris par groupe. Sur tout animal qui entrera dans l’étude nous prélèverons le cerveau, le duodénum, certains neurones de la moelle épinière, les nerfs sciatiques et une section de peau correspondant à la partie haute du dos.
Raffinement
Nous savons que les 3 lignées de souris TWIK1 sont parfaitement viables, qu’elles se reproduisent normalement et que leurs descendances ne présentent aucun signe de mauvais développement. Néanmoins, il n’est pas exclu qu’en présence d’un régime appauvri en Fer la qualité du lait des mères soit modifiée et qu’en fonction de leur génotype, les souriceaux présentent des troubles visibles du développement. Les animaux seront donc observés de façon bihebdomadaire afin de rechercher des signes cliniques indicateurs des différentes conséquences d’un tel régime sur l’organisme. Une feuille d’observation, incluant une grille de score, a été établie qui permettra également d’identifier précocement tout signe de stress ou de douleur. Cette grille de score contient des points limites précis. La mort n’étant pas un point limite acceptable, nous sortirons les souris de l’étude lorsqu’un des points limites sera atteint.
Choix des espèces
L'étude que nous souhaitons mener vise à déterminer l'impact d'un canal TWIK1 excitateur ou inhibiteur sur des structures cérébrales complexes (Cerveau, duodenum, nerfs sciatique et peau velue...). En outre, les analyses de tissus que nous souhaitons réaliser doivent être faites à différents stades du développement. Elles ne peuvent donc pas être faites in vitro au niveau cellulaire car elles requièrent l'intégralité de l'animal. L'espèce animale utilisée sera la souris (Mus Musculus) car c'est le modèle le plus classiquement utilisé pour les manipulations génétiques. De plus, ce modèle présente de fortes similitudes avec l'humain pour les fonctions étudiées. En outre, des souris transgéniques issues du fond génétique des C57Bl6-J exprimant des formes différentes du canal TWIK1, sont déjà disponibles dans notre institut. Celles-ci sont parfaitement viables et ne montrent aucun signe délétère de leur développement. Ce projet concerne 4 lignées. Chaque lignée sera soumise à deux régimes : un dit à « haut Fer » et un dit à « bas fer ». Pour chacune nous prélèverons les embryons au stade E15 (15 jours après la fécondation), les nouveau-nés à P1 puis à P15, à P30 et à P60 (respectivement 1 puis 15 puis 30 puis 60 jours après la naissance). Dans certains neurones de la moelle épinière (DRG), la mesure des niveaux d’expression des gènes codant les marqueurs spécifiques des différents types de fibres sensitives montre que dès le stade E13 (13ème jour après la fécondation), les neurones qui nous intéressent sont déjà différenciés. En choisissant le stade embryonnaire E15 (15 jours après la fécondation), nous pourrons facilement cibler les neurones où le canal TWIK1 est le mieux exprimé. Le stade P1 (1 jour après la naissance) nous permettra de visualiser le niveau d’innervation et la maturation des fibres nerveuses au moment de la naissance. Nous proposons les stades P15 et P30 (respectivement 15 et 30 jours après la naissance) car une étude montre qu’en absence des transporteurs du Fer, la myélinisation des fibres nerveuses est altérée à ces deux stades P15 et P30 puis est compensée pour revenir à un niveau normal. Lors de nos observations de la croissance des souris TWIK1-KO, nous avons observé une alopécie transitoire entre la 3ème et la 8ème semaine après la naissance. En choisissant P60 (60 jours après la naissance), nous sous assurons d’être au-delà de cette 8ème semaine et de pouvoir observer ces éventuels phénomènes de compensation.
Optimisation des greffons en transplantation utérine : intérêt de la machine de perfusion dans un modèle porcin d’hétérotranplantation
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Pour savoir si une machine de perfusion hypothermique conserve mieux un utérus destiné à la greffe, 40 truies Large White de 6 mois vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures menées en partie sans réveil et en partie d'un niveau de souffrance modéré. Vingt truies donneuses, dont dix subissent d'abord une ligature de l'aorte abdominale pour priver l'utérus de sang pendant 30 minutes, sont opérées et tuées sous anesthésie sans réveil après le prélèvement de leur utérus. Les utérus, conservés douze heures au froid, sont greffés sur vingt autres truies, réveillées puis opérées une seconde fois 48 heures plus tard, sans réveil cette fois, pour le prélèvement final du greffon avant leur mise à mort. Le porteur ne mentionne comme effet que d'"éventuelles douleurs au réveil" et annonce des "critères d'arrêt de souffrance" sans en décrire aucun.
Objectifs
La transplantation utérine est une procédure chirurgicale très novatrice et récente. Les utérus implantés proviennent généralement de donneuses en état de mort encéphalique, ce qui implique très souvent un stress du greffon entre la mort et le prélèvement puis entre le prélèvement et l’implantation chez la receveuse. En transplantation rénale ou hépatique, une machine de perfusion hypothermique est utilisée pour conserver l’organe entre son prélèvement et la greffe, mais l’intérêt de cette machine dans le cadre de la greffe utérine n’est pas connu, notamment pour des temps de conservation longue de l’organe (>6h). L'objectif de ce travail est de savoir si en transplantation utérine la machine de perfusion permettrait d’optimiser la qualité du greffon.
Bénéfices attendus
La mise en évidence d'une optimisation de la qualité du greffon grâce à l'usage d'une machine de perfusion hypothermique en transplantation utérine permettrait d'implémenter cette pratique en clinique de manière à accepter un plus grand nombre de greffons issus de donneuses en état de mort encéphalique.
Procédures
Quarante truies pubères de race Large White (6 mois) seront utilisées pour ce projet : 20 donneuses chez lesquelles l’utérus sera prélevé en vue d’une transplantation chez 20 receveuses. La moitié des truies donneuses (N=10) subira une ligature de l’aorte abdominale 30 min avant le prélèvement de l’utérus (hystérectomie), afin de mimer un déficit d’irrigation sanguine à température corporelle (ischémie chaude ou IC). Après prélèvement de l’utérus, les greffons avec (+IC) ou sans (-IC) ischémie chaude seront ensuite répartis équitablement en deux traitements différents d’ischémie froide (IF) pendant 12 heures (pas d’irrigation sanguine et conservation à froid) : un rinçage simple (RS) avec une solution spécifique à 4°C ou bien une perfusion hypothermique oxygénée (HOP) avec une machine dédiée. Les truies receveuses seront donc réparties en 4 groupes : RS+IC, RS-IC, HOP+IC, HOP-IC. Différents paramètres biologiques seront enregistrés avant et à différents temps durant l’IF. Les truies receveuses seront réveillées avant de subir 48h plus tard une nouvelle chirurgie sans réveil qui permettra d’étudier différents paramètres de viabilité du greffon utérin.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de ce protocole sont d'éventuelles douleurs au réveil après la chirurgie chez les truies receveuses, mais qui seront prises en charge selon un protocole d'analgésie approprié.
Devenir
Les truies donneuses d'utérus sont euthanasiés sous anesthésie suite au prélèvement de l'utérus. Les truies receveuses sont gardées en vie durant 48h après la transplantation utérine avant d'être anesthésiées pour prélèvement utérin final et euthanasie. Il s'agit d'évaluer le statut du greffon prélevé puis transplanté.
Remplacement
Cette expérimentation préclinique est indispensable à la génération de données in vivo permettant l’extrapolation à l’humain des effets de la machine de perfusion hypothermique. Le modèle porcin est un modèle déjà validé au laboratoire, qui a fait l’objet de publications antérieures. Son remplacement par un modèle rongeur ne serait pas adapté puisqu’il s’agit de rechercher la plus grande proximité biologique et anatomique possible entre le modèle animal et l’humain. Pour cette étude, il n’est évidemment pas possible d’envisager des approches in vitro ou in silico.
Réduction
Les effectifs calculés pour cette étude (N=5 par groupe) représentent un strict minimum en considérant les paramètres biologiques étudiés et les actes chirurgicaux envisagés. Comme dans le précédent article publié sur ce modèle (Dion et al. 2021), nous utiliserons des tests non paramétriques de type Kruskal-Wallis et Mann-Whitney pour les comparaisons entre groupes (données indépendantes) et des tests de Friedman et Wilcoxon pour les données répétées ou dépendantes.
Raffinement
Toutes les chirurgies seront réalisées par des chirurgiens spécialisés ayant déjà procédé à de telles interventions sur le modèle porcin lors d’un précédent projet validé. Des stratégies d’anesthésie et d’analgésie adéquates et préalablement validées chez cette espèce dans le contexte de la transplantation utérine seront utilisées pour ce projet. L’utilisation de la machine de perfusion hypothermique correspond justement à une optimisation des pratiques chirurgicales, pour accroître la viabilité du greffon et donc les chances de réussite de cette intervention complexe. Des limites adaptées et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis. Une grille d'évaluation de la douleur et du bien-être sera en outre utilisée pour le suivi post-opératoire des animaux.
Choix des espèces
Le gabarit du porc fait de lui un gros animal et l’anatomie de celui-ci est proche de celle de l’Homme. La réalisation de la transplantation utérine chez la truie est donc pertinente pour pouvoir transposer les résultats à l’humain. Les animaux seront pubères, âgés de 6 mois, de façon à ce que l’endomètre ait acquis les transformations physiologiques induites par de la puberté et que les résultats soient interprétables en termes de potentiel de nidation.
Impact d’une infection à Listeria monocytogenes du cerveau sur l’immunité cérébrale et la neurodégénérescence.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Infectées par la bactérie Listeria monocytogenes par gavage, par injection dans le cerveau sous anesthésie ou par voie intraveineuse, puis traitées par trois injections d'antibiotiques, 1 250 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes sont tuées à la fin pour l'étude de leurs organes. Dans un groupe, une encéphalite auto-immune est ensuite déclenchée par des injections, et des souris transgéniques 5xFAD, qui développent des troubles proches de la maladie d'Alzheimer, passent tous les quinze jours pendant sept mois un labyrinthe de Barnes et un test sur cylindre rotatif. Le projet cherche comment les cellules immunitaires du cerveau, après une infection, favorisent ou freinent des maladies neurodégénératives, et n'évoque des cibles thérapeutiques qu'au conditionnel. Le porteur déclare un niveau léger à modéré, et décrit une infection qui peut paralyser les pattes et une encéphalite qui peut priver les souris de mobilité pendant 7 à 15 jours.
Objectifs
Nous cherchons à définir l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur la santé cérébrale après l’infection. En effet, les altérations du système immunitaire cérébral sont susceptibles de favoriser ou au contraire protéger le cerveau contre des dommages ultérieurs, notamment les maladies neuronales et neurodégénératives telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Ce projet permettra à la fois d’étudier comment s’effectue la réparation du système immunitaire cérébral après la résolution d’une infection ainsi que les mécanismes menant à une sensibilité accrue ou diminuée aux futurs dommages neuronaux.
Bénéfices attendus
Sur un plan des connaissances scientifiques, nous chercherons à déterminer les rôles respectifs du système immunitaire cérébral (microglie) et périphérique (monocytes provenant du sang) dans la réponse aux infections du système nerveux central, ainsi que leur rôle dans l’apparition de troubles cognitifs après l’infection. La comparaison des séquelles neurologiques induites en présence ou absence de la microglie et/ou des monocytes permettra de mettre en évidence le rôle de chacune de ces populations immunitaires dans les séquelles neurologiques apparaissant après la guérison de l’infection. Nous chercherons à mettre en évidence les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’apparition de ces troubles cognitifs, pour comprendre comment les cellules immunitaires ayant joué un rôle dans la résolution de l’infection cérébrale (microglie ou monocytes recrutés) peuvent ensuite adopter un phénotype dommageable pour le bon fonctionnement cérébral. L’identification de ces mécanismes permettrait de mettre en évidence des cibles thérapeutiques utiles dans le traitement des séquelles neurologiques post-infectieuses.
Procédures
Procédure 1 : les animaux seront soumis soit à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), soit à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (durée d’environ 10 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Procédure 2 : les animaux seront soumis à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils subiront 1 injection cutanée et intrapéritonéale sous anesthésie gazeuse (générale, durée des 2 injections : environ 5 minutes) pour induire la réponse auto-immune, et une dernière injection intrapéritonéale (durée d’environ 30 secondes) pour achever l’induction de la réponse autoimmune, sur animal vigile. Procédure 3 : les animaux seront soumis à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils seront soumis à des tests cognitifs tous les 15 jours pendant 7 mois, consistant en un test de mémoire (trouver la bonne sortie parmi plusieurs qui se ressemblent, un test durant environ 30 minutes) et un test moteur (rester le plus longtemps possible sur un cylindre rotatif, durée d’environ 15 minutes).
Impact sur les animaux
Dans l’ensemble des procédures l’infection induit un degré de souffrance : perte de poids, « sickness behaviour » et atteinte cérébrale qui peut parfois induire des paralysies des pattes des souris. Dans la procédure n°1, un niveau de douleur modéré sera à prendre en compte suite à l’inoculation intracraniale de bactéries, qui sera pris en charge par antalgiques. Dans la procédure n°2, l’induction d’encéphalite autoimmune est susceptible d’engendrer une perte de mobilité par paralysie des membres, d’une durée variable entre 7 et 15 jours selon la littérature. Dans la procédure n°3, au cours du vieillissement des souris de souche 5xFAD on notera l’apparition de signes associés à la maladie d’Alzheimer tels qu’une perte de mémoire et des capacités d’interaction sociale diminuée. Ces troubles apparaissent progressivement, à partir de 6 mois d’âge environ.
Devenir
Les procédures nécessitent toutes une mise à mort des animaux à la fin de la procédure afin d’étudier leurs organes par diverses techniques. Il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin du projet.
Remplacement
L’étude de l’interaction entre le système immunitaire et le fonctionnement du système nerveux central nécessite un hôte animal car les mécanismes d’interaction entre ces 2 systèmes cellulaires complexes ne peuvent pour l’instant pas être modélisés in vitro. En particulier pour comprendre les séquelles induites par une infection et les conséquences à long terme, il est absolument nécessaire de mener les études dans un hôte animal qui est capable de régénérer les tissus altérés.
Réduction
Pour l’observation du comportement des animaux, nous suivrons dans le temps les mêmes individus, ce qui permet 1) d’augmenter la puissance statistique de l’étude et 2) éviter de mettre à mort un animal après un unique test comportemental (sauf pour le test du labyrinthe de Barnes car les animaux s’habituent à ce test au fil du temps) . Pour les études de la réponse immunitaire au sein du cerveau, le cerveau des souris disséquées sera séparé en 2 hémisphères, un hémisphère étant utilisé pour l’analyse histologique par immunofluorescence et l’autre pour la cytométrie en flux. Cela permettra de diminuer par 2 le nombre de souris nécessaire pour ces expériences. Afin de vérifier que les 2 hémisphères cérébraux ne réagissent pas de manière différente à l’infection nous vérifierons l’absence de différence entre les analyses effectuées sur les hémisphères droits et gauches. Nous utiliserons également des souches de Listeria monocytogenes dites « fortement neuroinvasive » qui induisent de manière très reproductible une infection du système nerveux central après gavage. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux inoculés par rapport à l’inoculation des classiques souches de laboratoire de Listeria qui n’induisent une infection du système nerveux central que dans une petite proportion des animaux inoculés. Les effectifs des populations de souris auxquelles nous aurons recours sont établis en tenant compte des tests statistiques permettant d’obtenir une significativité du résultat obtenu (test de Mann-Whitney (deux groupes non appariés), Wilcoxon (deux groupes appariés) ou ANOVA (plus de deux groupes) pour les comparaisons de valeur avec faible effectif, se basant sur une distribution non gaussienne des résultats).
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. L’état général des animaux sera suivi. Les paramètres observés seront : poil ébouriffé, apparence corporelle/body condition, expression faciale/mouvement. Une aide à la thermorégulation sera mise en place dans toutes les cages pour éviter l’hypothermie : abri en carton, matériel de nidification (coton/papier) et chaufferettes. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) et mise à disposition d’eau gélifiée sera entreprise pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané). Les animaux présentant un état pathologique trop avancé (score de 2 pour un paramètre de la grille proposée par le comité d’éthique, ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou un score d’encéphalite ≥ 4) seront mis à mort. La douleur induite par l’injection intracrâniale sera limitée en injectant les souris avec un antidouleur (buprénorphine) avant et après l’injection, qui se fera sous anesthésie gazeuse et en appliquant un anesthésique local sur la zone à injecter. Le stress induit par l’encéphalite autoimmune (paralysie → difficulté d’accès à la nourriture, de thermorégulation, de nettoyage) sera limité en multipliant les source d’accès à la nourriture et à de la gélose hydratante au niveau du sol de la cage, ainsi qu’en chauffant les cages avec des chaufferettes pour aider la thermorégulation des souris. Les animaux seront pesés le jour précédant l’infection puis, au minimum, à partir du jour 3 quand les animaux commencent à perdre du poids du fait de l’infection. La pesée aux deux premiers jours ne sera pas systématique et dépendra de l’état apparent de l’animal. Cela permettra de limiter les manipulations à un moment où les animaux ne perdent pas de poids d’après notre expérience.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, un grand nombre d’outils et de lignées transgéniques ayant été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Il s’agit également d’un bon modèle en neurosciences, les souris ayant certaines capacités cognitives suffisamment développées pour étudier l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur des fonctions neuronales ciblées pour ce mammifère. Nous utiliserons des souris adultes, pour ne pas interférer avec les phénomènes de neurodéveloppement dans notre étude. Les souris adultes seront âgées de 2 à 9 mois, les plus âgées (6 à 9 mois) seront utilisées pour 1) le suivi à long-terme des conséquences de l’infection, et 2) pour étudier le phénomène de neurodégénerescence dans les souris 5xFAD qui commencent à développer des troubles à partir de l’âge de 6 mois.
Modélisation de la maladie de Stargardt chez un rongeur diurne
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
48 Psammomys obesus, rongeurs diurnes, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des rétines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Leur gène est inactivé par CRISPR-Cas9 dans un œil pour reproduire une dégénérescence maculaire, puis leur vision est suivie par imagerie sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique que la perte de photorécepteurs ne touche qu'un œil et n'attend aucun autre effet indésirable. Il justifie ce rongeur, dont la rétine compte 40 % de cônes, par l'échec des modèles souris à reproduire cette maladie.
Objectifs
Ce projet a pour but de créer et caractériser un nouveau modèle animal de la maladie de Stargardt, dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente, touchant des personnes jeunes et provoquant un handicap visuel lourd dû à la perte de la rétine centrale, appelée macula. Le gène impliqué a été identifié, mais son inactivation chez la souris n'entraine aucune des lésions rencontrées chez les patients. Le rongeur diurne Psammomys obesus présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, ayant une structure rétinienne ressemblant à celle de la macula humaine. La technologie « CRISPR-Cas9 » sera utilisée pour bloquer l'expression du gène à l'origine de la maladie dans les yeux des Psammomys. Un suivi ophtalmologique longitudinal sera ensuite effectué, avec des techniques d'imagerie non invasives (tomographie par cohérence optique, fond d'œil, angiographie). Il sera suivi d’analyses cellulaires et moléculaires post-mortem. Nous espérons ainsi obtenir le premier modèle fidèle de la maladie de Stargardt, et ainsi ouvrir la voie à des approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La suppression du gène Abca4 dans l’œil de Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme la macula humaine, devrait permettre l’obtention d’un modèle animal de la maladie de Stargardt récapitulant les atteintes affectant les patients, et donc de déterminer les mécanismes conduisant à la perte des cônes dans cette maladie et ainsi d'ouvrir des perspectives thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Une anesthésie gazeuse sera utilisée afin d’obtenir l’immobilité des animaux au moment des examens ophtalmologiques (imagerie OCT et fond d’œil). La durée d'anesthésie sera de 10-15 minutes pour chacun des points du suivi longitudinal. Ce suivi comprendra au moins 3 points (1, 2 et 4 semaines après injection) avec la possibilité de un à deux points supplémentaires (2 et 3 mois après injection), selon l'évolution des symptômes.
Impact sur les animaux
L’inactivation du gène à l’origine de la maladie humaine devrait entrainer une perte localisée des photorécepteurs de la rétine. Cette perte ne concernera qu’un seul des deux yeux de l’animal. Aucun effet indésirable n’est attendu à l’issue des procédures expérimentales, basées sur de l’imagerie sans contact et pratiquée au cours d’une anesthésie de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque étape de cette procédure, les animaux retournent dans leur établissement d'origine. Ils y seront euthanasiés après la dernière étape pour prélèvements des rétines afin d'effectuer des analyses moléculaires et cellulaires complémentaires.
Remplacement
Nous cherchons à modéliser une maladie complexe - maladie de Stargardt, forme de dégénérescence maculaire précoce. Pour ce faire, il est nécessaire de pouvoir disposer d'une rétine dont la structure est proche de celle de l'homme (le modèle souris a montré ses limites pour cette maladie, le rat ne semble pas mieux adapté avec seulement 1% de cônes, contre 3% chez la souris et 40% chez Psammomys obesus), avec des interactions maintenues avec l'épithélium pigmentaire sur une durée d'un mois ou plus. Aucun modèle in vitro disponible à l’heure actuelle ne permet de reproduire ces conditions.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, l’approche Crispr-Cas9 a été validée par analyse génomique puis sur des cellules. Chaque animal sera son propre contrôle. Avec la précision de l’imagerie OCT, 12 animaux par condition (traitement, sexe) ceci permettra de valider les résultats avec une puissance statistique satisfaisante (>90%) même en cas d’un amincissement rétinienne de l’ordre de 10%, en nous basant sur la variabilité inter-animal observée chez le rat. Au cours de la maladie de Stargardt, une réaction inflammatoire est observée. Afin de vérifier si une inhibition précoce de cette inflammation permettrait de limiter les atteintes rétiniennes, la moitié des animaux sera placée sous traitement anti-inflammatoire dès l’inactivation du gène. Ceci fait donc un total de 48 animaux (24 mâles, 24 femelles).
Raffinement
OCT et fond d’œil sont des méthodes d’imagerie non invasives. Elles sont réalisées sous anesthésie chez les animaux uniquement afin d’obtenir leur immobilité sur le temps d’observation. Chez l’homme, elles sont réalisées avec des équipements comparables sans anesthésie ou analgésie. Une anesthésie gazeuse est préférée à une anesthésie par injection intra-péritonéale, car la durée d’anesthésie peut être maintenue au minimum nécessaire, avec un réveil rapide. Les deux examens seront effectués de manière bilatérale sur la même anesthésie. Comme le réflexe de clignement est absent sous anesthésie, la cornée sera maintenue hydratée grâce à du gel ophtalmique pendant toute la durée de perte de connaissance. Les animaux seront placés sur un coussin chauffant afin de maintenir leur température corporelle. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet.
Choix des espèces
Les études sur modèles murins n’ont pas permis de reproduire les symptômes de la maladie de Stargardt. La souris, rongeur nocturne avec seulement 3% de photorécepteurs cônes (3% des photorécepteurs). Nous utiliserons ici un modèle rongeur diurne, Psammomys obesus, dont la rétine est enrichie en cônes (40% des photorécepteurs), ce qui rapproche sa structure de la macula humaine. Le gène à l’origine de la maladie de Stargardt sera inactivé à partir du 15ème jour postnatal, car c’est à ce stade (équivalent à 7-12 ans) que la maladie se déclare chez l’homme. Les examens ophtalmologiques commenceront une semaine après. Ils seront répétés une puis deux semaines plus tard, puis si nécessaire de mois en mois jusqu’à stabilisation des atteintes rétiniennes.
Etude du potentiel thérapeutique du blocage des protéines X et Y dans le lymphome T chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules de lymphome T sous anesthésie, puis trois à cinq injections intra-péritonéales de molécules ou de placebo, pour tester le blocage de deux protéines de surface. Le porteur décrit un modèle "sans phénotype dommageable" et une "angoisse légère et de courte durée", formulation en retrait de la gravité modérée déclarée. Il présente cette portée comme "translationnelle" et le recours à la souris comme la seule voie de validation faute de systèmes in vitro fiables.
Objectifs
Les lymphomes T constituent une famille de cancers hématologiques. Les patients atteints de lymphomes T sont traités par poly-chimiothérapies ; toutefois ces traitements sont peu efficaces et il n’existe que très peu d’alternatives thérapeutiques. L’utilisation des immunothérapies, qui ont révolutionné la prise en charges de nombreux types de cancers, est à ce jour quasi-inexistante dans les lymphomes T du fait de l’absence de cibles thérapeutiques bien établies. Nos travaux réalisés chez l’homme in vitro, suggèrent que deux molécules de surface exprimées par les cellules tumorales, nommées X et Y pourraient constituer des cibles intéressantes. Pour valider leur potentiel thérapeutique, nous souhaitons désormais évaluer l’effet de leur blocage dans deux modèles de lymphomes T chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces travaux ont avant tout une portée translationnelle, puisqu’ils pourraient permettre d’établir X et /ou Y comme des cibles potentielles d’immunothérapie chez les patients atteints de lymphomes T.
Procédures
-1 injection de cellules (lymphome T) par voie intraveineuse, sous anesthésie isofluorane (30 secondes/souris) -3 à 5 injections par voie intra-péritonéale, de molécules thérapeutiques (ou de leur placebo) dans un volume total de 100µL. (3 à 5x30 secondes/souris)
Impact sur les animaux
Nos modèles murins ne présentent pas de phénotype dommageable. L’injection de cellules de lymphomes T n’induit pas d’effets secondaires détectables dans la fenêtre de temps de l’étude. Chez la souris, l’injection des thérapies que nous souhaitons tester n’induit pas d’effets secondaires délétères détectables. Les souris reçoivent au total 3 à 5 injections de médicament ou de placebo par voie intra-péritonéale. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et foies seront prélevées pour pesée et analyse du phénotype immunitaire .
Remplacement
Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un replicat expérimental sera réalisé si la première exépérience est concluante, afin de renforcer la signification statsitique des données, et de pallier à un problème technique éventuel (ce réplicat ne sera pas fait si les résutlats de la première expérience sont négatifs).
Raffinement
Certaines procédures peuvent induire une douleur légère (injections intraveineuses et intra-péritonéales). Les protocoles d’injection que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de lignées de lymphomes T et de réactifs bloquant nos cibles thérapeutiques d’intérêt, qui a notre connaissance n'ont pas été devéloppés dans d'autres modèles pré-cliniques. De plus notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 12 semaines.
Évaluation d’un traitement anticancéreux par hyperthermie localisée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du foie leur est greffée sous la peau ou induite par injection intraveineuse, puis chauffée à 43-45 °C par des nanoparticules activées au laser ou par champ magnétique, sous suivi d'imagerie. Le porteur qualifie les effets secondaires de "très limités" et renvoie l'amélioration de la prise en charge des patients au conditionnel. Il présente le recours à un "organisme entier" comme un "passage obligé" avant tout transfert vers l'humain.
Objectifs
Les cancers hépatobiliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA) sont difficiles à traiter. Le développement de la nanomédecine permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’utilisation de nanoparticules activables à distance par un rayonnement lumineux dans le proche infrarouge permet de contrôler l’action thérapeutique à la fois dans le temps et dans l’espace. Le projet propose l’évaluation d’une thérapie anticancéreuse localisée par échauffement de nanoparticules sous rayonnement électromagnétique non ionisant, (lumière dans le proche infrarouge ou champ magnétique alternatif) en association ou non avec une immunothérapie ou une thérapie ciblée anti-EGFR. Cette évaluation sera réalisée sur un modèle murin après injection sous cutanée de cellules murines de cancer de CCA. L’échauffement de la tumeur sera modulé par la puissance du laser/champ magnétique et réduit aux zones d’accumulation des nanoparticules. On visera une hyperthermie modérée (43°C à 45°C pendant 30 min, répétée 2 ou 3 fois à 24h d’intervalle au moins) de manière à moduler thermiquement le microenvironnement tumoral et le rendre plus permissif aux chimiothérapies. L’évolution de la masse tumorale sera suivie par échographie, modalité qui est intégrée au module d’Imagerie Photoacoustique. L’imagerie permettra un suivi longitudinal de la biodistribution/dégradation/élimination de nanoparticules utilisées, en complément des caractérisations ex vivo. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux de meilleur potentiel thérapeutique associé une biodistribution favorable, biodégradable et sans effet indésirable à long terme.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de développer des stratégies thérapeutiques loco-régionales pour traiter le cholangiocarcinomes qui présentent une toxicité moindre en comparaison aux traitements anticancéreux systémiques. Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients en combinant une thérapie loco-régionale et systémique en administrant des doses plus faibles de drogues, réduisant les effets systémiques toxiques secondaires.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers du foie et à leurs traitements. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Pour cela, une première partie des animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales ectopiques, sous la peau (injection sous-cutanée sur animal vigile ou anesthésié). Une seconde partie des animaux subiront une injection hydrodynamique (injection intraveineuse animal vigile) de vecteurs plasmidiques afin d’induire une tumeur dans le foie (moins d’une minute). Les animaux seront ensuite impliqués dans différents traitements seul ou en combinaison : traitement par nanohyperthermie sous anesthésie, injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 à 40 minutes maximum selon les traitements). Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale (20 minutes maximum). Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet qui vise à trouver des traitements innovants du cholangiocarcinomes. Les traitements mis en œuvre devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possibles effets secondaires mais qui restent très limités (inflammation locale et toxicité hépatique et/ou biliaire).
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=4032) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour tester des nouvelles stratégies antitumorales in vivo. C’est un passage obligé demandé par les industries pharmaceutiques ou les compagnies de valorisation (pour dépôt de brevet) avant un éventuel transfert à l’Homme. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la croissance tumorale. L’effet antitumoral et la dégradabilité de nanoparticules utilisées in vivo seront au préalable testés et optimisés in vitro sur des modèles cellulaires 2D ou 3D ou encore dans des milieux mimant l’environnement biologique (remplacer).
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Au total ce projet impliquera 4032 souris immunocompétentes ou immunodéficiences en fonction des questions scientifiques. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. L’utilisation de cette technique d’imagerie non invasive combinée à la mutualisation de tissus pour les caractérisations ex vivo permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (réduire).
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Ainsi, l’hébergement, les soins et l’ensemble des procédures expérimentales sur les animaux seront effectués dans le respect du bien-être animal avec la définition de points limites au-delà desquels l’expérience sera interrompue (raffiner).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est le modèle classique des expériences et études en cancérologie ; sa taille et son poids autorisent en outre d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques. La disponibilité de souches consanguines exprimant de façon stable des phénotypes immuno-supprimés permet de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. La disponibilité de souris non immunodéprimées permet également de réaliser des greffes syngéniques avec des cellules tumorales de la même espèce permettant ainsi d’étudier le système immunitaire et de tester des drogues anti-tumorales basées sur l’utilisation d’anticorps. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche Athymic Nude-Foxnu. Nous utiliserons également les souris C57BL/6J pour les greffes syngéniques (pour greffer sous la peau des cellules cancéreuses murines) et pour induire une tumeur dans le foie par injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques dans la veine de la queue. Justification du stade : Les animaux sont utilisés au stade adulte (5-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.