Recherche fondamentale

92 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime à 60 % de fructose et une perfusion d'angiotensine II par pompe implantée sous la peau pour installer un syndrome métabolique, avec transplantation fécale par gavage et prélèvements sanguins répétés sur huit semaines. Le porteur cherche à relier la restriction en sel, le microbiote intestinal et la fibrose cardiaque. Il affirme que l'usage d'un modèle de rat est "indispensable" pour une pathologie touchant de multiples organes.

Objectifs

Les maladies liées à la fibrose sont la cause chaque année de 800000 décès dans le monde parmi lesquels la majorité est liée à la fibrose pulmonaire et cardiaque. La fibrose cardiaque est responsable de plusieurs dysfonctionnements cardiaques pouvant éventuellement conduire au décès du patient. Diverses situations pathologiques favorisent la fibrose cardiaque, comme l’hypertension artérielle, l’insulinorésistance, l’obésité et le diabète de type 2, pathologies souvent associées dans le contexte du syndrome métabolique, qui affecte aujourd’hui 25 à 45% de la population dans les pays industrialisés. Plus qu’un simple regroupement de symptômes, le syndrome métabolique rassemble des facteurs de risque, prédisposant aux maladies cardiovasculaires et métaboliques. L’augmentation de ces troubles métaboliques va de pair avec une consommation excessive de sucres et notamment de fructose, très abondant dans le sirop de maïs, utilisé dans les boissons sucrées. Dans ce contexte nous avons pu montrer qu’un régime alimentaire appauvri en sel a des effets bénéfiques tant sur les anomalies métaboliques que cardio-vasculaires/rénales induite par le régime enrichi en fructose, ceci dans un modèle de syndrome métabolique chez le rat Sprague Dawley. Ce modèle animal consiste à nourrir les rats avec un régime alimentaire constitué de 60% de fructose associé à une perfusion sous-cutanée d’angiotensine II qui provoque une hypertension modérée, à l’aide de mini-pompes osmotiques implantées sous la peau. Nous souhaitons à présent étudier l’implication du microbiote intestinal dans la prévention de la fibrose cardiaque au cours du syndrome métabolique. Notre hypothèse est que la restriction sodée serait capable de moduler la composition du microbiote intestinal, ce qui contribuerait à ses effets bénéfiques sur le cœur des rats présentant un syndrome métabolique. En cas d’anomalies métaboliques, les Bacteroides deviennent majoritaires au détriment des Firmicutes et participent à l’installation de la métainflammation. Un régime riche en fructose modifie la composition du microbiote chez l’animal. Plus précisément, deux genres bactériens, Coprococcus et Ruminococcus, sont induits par le régime riche en fructose chez le rat et diminués par un traitement antibiotique ainsi qu’un transfert de fèces provenant d’animaux sous régime standard.

Bénéfices attendus

La restriction sodée a un effet bénéfique sur la plupart des modifications cardiovasculaires/ rénales et métaboliques présentes dans un contexte de syndrome métabolique. Nos travaux permettront ainsi de démontrer que la restriction sodée module la transition endothélio-mésenchymateuse et possiblement la composition du microbiote intestinal, deux phénomènes qui participeraient à ses effets bénéfiques sur la fibrose cardiaque. De plus, cette étude permettra d'identifier de nouveaux acteurs qui pourront conduire à des stratégies innovantes visant à prévenir la fibrose cardiaque s’installant très précocement lors de la dysfonction métabolique et l’hypertension observées au cours du syndrome métabolique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sur animaux vigiles (prélèvements sanguins à la queue, procédure d'une durée de 1h30 réalisée une fois dans la vie de l'animal, 7 prélèvements seront réalisés à 15 minutes d'intervalle), à une procédure chirurgicale (insertion de mini pompe osmotique en sous-cutané, incision de 1cm au niveau du dos refermée par 2 points de suture, procédure réalisée une fois dans la vie de l'animal, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront exprimenter de l'inconfort durant le gavage au cours de la transplantation fécale, qui durera le temps de la précédure (quelques minutes par rat) (procédure 1). Les animaux pourraient ressentir une douleur suite à l'insertion en sous cutané de la mini pompe osmotique (incision de 1cm environ, 2 points de suture) (Procédure 2).

Devenir

Les animaux sont maintenus en vie durant les 8 semaines que dure l'expérimentation, puis tous les animaux sont mis à mort.

Remplacement

Notre objectif est d’étudier l’implication du microbiote dans les effets d’un régime appauvri en sodium sur les dommages cardiaques au cours du syndrome métabolique, qui est une pathologie affectant de multiples organes. L’utilisation d’un modèle de rat nous paraît donc indispensable afin d’évaluer au mieux l’impact du régime appauvri en sel sur la composition du microbiote intestinal et les conséquences sur le cœur et les multiples tissus dysfonctionnels dans le syndrome métabolique.

Réduction

Dans une première expérimentation, le nombre de rats s'élèvera à 12 animaux par groupe (total 36 animaux) a pu être réduit à 8 animaux par groupe dans la seconde expérimentation (total 56 animaux) soit une réduction de 28 animaux.

Raffinement

Afin d’assurer leur bien-être, les animaux seront placés dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie agréée. Les rats feront l’objet d’une surveillance journalière avec la mise en place d’astreintes pour les samedis, dimanches et jours fériés. Le poids des animaux sera suivi toutes les semaines et les signes d’inconfort ou de souffrance seront recherchés. En particulier, lors de l'implantation des mini pompes, les animaux seront anesthésiés. De la lidocaine en spray sera appliquée pour

Choix des espèces

Dans le domaine des maladies métaboliques, les rongeurs sont les plus utilisés car ces derniers présentent un phénotype relativement proche de la maladie humaine. Le rat Sprague Dawley nourri avec un régime riche en fructose est un modèle établi de syndrome métabolique* sur lequel nous travaillons depuis de nombreuses années. Les rats seront utilisés à partir d’un stade de 6 semaines d’âge. Le régime alimentaire enrichi en fructose débutera à l’âge de 8 semaines, âge où la composition du microbiote se stabilise.

3 840 rongeurs, 1 920 souris et 1 920 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation douloureuse de la vessie est induite par injections répétées de cyclophosphamide, puis les animaux reçoivent des candidats médicaments et subissent des mesures de douleur viscérale et des tests aux filaments de von Frey appliqués entre l'anus et l'urètre. Le porteur reconnaît que la nuisance pour le bien-être des animaux sera importante, le besoin constant d'uriner et la douleur de la cystite interstitielle étant reproduits chez les rongeurs. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne prédit la fonction vésicale ni la douleur viscérale.

Objectifs

La cystite interstitielle (CI), désormais appelée « syndrome de la vessie douloureuse » est une maladie inflammatoire de la vessie qui se caractérise par des envies anormales d’uriner (envies pressantes et/ou fréquentes) et par des douleurs importantes dans le bas ventre et la vessie, au niveau de l’urètre ou au niveau du vagin chez les femmes, parfois accompagnées d’une difficulté à uriner. La sévérité des symptômes est variable d’une personne à l’autre mais dans le cas grave la maladie est très invalidante. Alors que la cystite « classique » est une inflammation de la vessie causée par des bactéries, la cystite interstitielle est une affection chronique, c’est-à-dire qu’elle dure dans le temps, dont les causes ne sont pas élucidées. Il est difficile de connaître le nombre exact de personnes atteintes par cette maladie, qui est probablement sous-diagnostiquée. La prévalence (nombre de cas dans une population donnée à un moment précis) varie selon les pays. En Europe, les estimations vont d’une personne atteinte sur 12 500 à une personne sur 1500. Si tout le monde peut être affecté, 90% des patients souffrant de cystite interstitielle sont des femmes. La maladie survient en moyenne entre 30 et 40 ans, et 25% des patients ont moins de 30 ans. On ne connaît pas encore les causes de cette maladie, qui a longtemps été considérée comme d’origine psychologique. Une des hypothèses avancées concerne l’altération de la perméabilité de la paroi vésicale. L’intérieur de la vessie est normalement tapissé par une couche de protéines (glycosaminoglycanes notamment) dont le rôle est de protéger la paroi des composants agressifs et toxiques de l’urine. Or cette couche protectrice est déficiente (et donc perméable) chez 70% des personnes atteintes de cystite interstitielle. Les éléments toxiques (par exemple le potassium concentré) pourraient alors pénétrer la paroi de la vessie, provoquer une inflammation et déclencher la pathologie. La cystite interstitielle, à cause des douleurs qu’elle engendre et l’envie incessante d’aller aux toilettes, nuit énormément à la qualité de vie des personnes atteintes. La communauté des patients et les urologues demandent une recherche plus active sur cette pathologie car les traitements proposés aujourd’hui ne sont pas efficaces. L’objectif de notre projet est de mettre en place un modèle expérimental de cystite interstitielle chez le rongeur, afin de pouvoir tester des candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui le médecin urologue ne dispose pas de médicaments spécifiques pour soigner cette maladie très invalidante. Il utilise donc des thérapies pour soulager la douleur, comme les antalgiques, ainsi que les antispasmodiques, les relaxants musculaires ou encore les anticonvulsivants. Le médecin peut introduire une solution stérile qui contient un ou plusieurs médicaments dans la vessie en insérant un cathéter dans l’urètre. Ces médicaments agissent alors directement sur la paroi de la vessie. Toutefois, l’efficacité de ces traitements est très limitée et de courte durée. Il est donc urgent de mettre au point de nouveau médicaments. Le but ultime de notre projet est de mettre en place un modèle de cystite interstitielle qui sera utilisé pour tester l’efficacité de nouveau médicaments ayant différent mécanismes d’action, afin de contribuer à mettre sur le marché des médicaments plus efficaces.

Procédures

1) Induction de la pathologie. Cette étape expérimentale est réalisée sur 6 jours par des injections intrapéritonéales répétées de cyclophosphamide sous anesthésie générale au jours 0- 3 - 6. La durée de cette procédure est de 5 minutes. 2) Prélèvement de sang: Un échantillon de sang sera prélevé 1 fois par jour pendant 3 jours par la veine de la queue afin de collecter des données de pharmacocinétique. La durée de cette procédure est de 10 minutes. 3) Administrations des candidats médicaments par voie systémique ou intravésicale. Le produit à tester sera injecté 1 fois/jour entre les jours 7 et 9 du protocole expérimental. La durée de cette procédure est de 5 minutes pour les voies systémiques et de 30 min pour la voie intravésicale. 4) Enregistrement des mictions en continu pendant 72 heures dans cage métabolique. 5) Enregistrement des scores de douleur viscérale. Cette procédure ne sera pas appliquée aux animaux utilisés pour les études en cage métabolique. Les rongeurs seront observés par un expérimentateur pendant 30 minutes pour déterminer un score de douleur viscérale. Ensuite un autre test sur animal vigile sera utilisé pour étudier la douleur référée liée à la vessie, par les mono-filaments de Von-Frey appliqués entre l’anus et l’urètre. Les mesures sont prises en utilisant la méthode ascendante avec une série de filaments. Les animaux sont d’abord acclimatés à l’environnement pendant 60 minutes chaque jour pendant 2 jours. Ensuite, après administration de cyclophosphamide, des stimulus sont appliqués. Chaque stimulus consiste en une application de 5 s du filament de von Frey à la région abdominale inférieure à des intervalles de 5 minutes. La durée de cette procédure est de 30 minutes.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale décrite dans ce projet a pour but d’induire une forte inflammation vésicale chez le rongeur qui puisse mimer la cystite interstitielle. Les symptômes de cette pathologie sont le besoin constant d’éliminer de très faibles quantités d’urine. Les patients ressentent la plupart du temps un besoin fréquent d’uriner, et ce jour et nuit. La douleur, constante ou intermittente, peut être très importante dans la CI : généralement elle s’intensifie lorsque la vessie est pleine, et diminue transitoirement après la miction. Il y aura donc les mêmes symptômes chez les rongeurs. La nuisance pour le bien-être des animaux sera donc importante. D'autres nuisances seront liées à l'administration repetée de candidats médicaments à tester, en utilisant différentes voies d'administration, c'est à dire voie orale (gavage) , voie intraperitoneale, voie sous-cutanée, voie intravésicale, voie intra-détrusoriale.

Devenir

A l'issue des Procédures 1 ou 2, tous les animaux seront euthanasiés car il ne sera plus possible de les reutiliser.

Remplacement

Le but de notre étude est de quantifier l’effet de molécules ayant des mécanismes d’actions différents sur la fonction vésicale chez le rongeur éveillé, donc l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro prédictifs de la fonctionnalité vésicale dans sa globalité, ni de la douleur viscérale.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 12, étant donné la variabilité interindividuelle de réponse à la cyclophosphamide. Un calcul de puissance statistique basé sur les données de la littérature pour ce modèle, nous a montré que l'utilisation de 12 animaux par groupe nous permettra de détecter une différence de 25% entre les animaux traités avec le solvant (contrôles )et les auimaux traités avec le candidat médicament. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 4 et 8 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupe égal à 12) seront comparés entre eux en utilisant un test two-way ANOVA, suivi par un post-test.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les animaux seront hébergés 2-4 (rats) ou 4-6 (souris) par cage, en fonction de leur poids corporel, avec de l’enrichissement dans les cages (tuyau, igloo, aspen brick et cocoon). Les cages sont de type IVC en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les cages resteront à une place fixe sur le portoir et seront bougées le moins possible. Les animaux seront manipulés à des fins expérimentales uniquement dans le laboratoire et non dans leur pièce d’hébergement pour éviter de stresser les autres animaux présents dans la pièce. En cas d’administration de médicaments par voie orale, les animaux seront gavés par un technicien expérimenté. Le jour de l’administration de cyclophosphamide, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane. L'examen quotidien des animaux permettra d'évaluer plusieurs paramètres de santé et bien-être, notamment changement de couleur et d'aspect des poils (poils hérissés), diminution de la prise de boisson et de nourriture, diminution de l’activité de toilettage et de l'activité exploratoire dans la cage, perte de poids. Si la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l'animal sera euthanasié. Dans le cas où un prélèvement de sang est nécessaire, les animaux seront manipulés sous anesthésie générale (isoflurane) afin de minimiser le stress et la douleur. Pendant le séjour dans les cages métaboliques pendant 72 heures, les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Les animaux seront en contact visuel et olfactif entre eux mais le matériel d’enrichissement au niveau du sol de la cage ne pourra pas être utilisé car il peut interférer avec la collecte des fèces et des urines.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour l’étude de la fonction vésicale. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés à la fonction vésicale sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats seront de souche Wistar ou Sprague-Dawley, les souris de souche Swiss ou C57Bl/6 car ces souches sont largement utilisées pour les études de la fonction vésicale (nombreuses références bibliographiques). D'autres modèles expérimentaux, notamment chez le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines d'âge (adulte) pour avoir une équivalence chez l'Homme.

7 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pendant huit jours puis une exposition à des polluants, benzo[a]pyrène ou pyrène, pendant sept jours, pour reproduire une maladie du foie gras et ses atteintes cérébrales. Le porteur décrit une nage plus faible ou anarchique comme effet attendu et renvoie au conditionnel un éventuel intérêt chez l'Homme. Il présente le poisson zèbre comme une alternative au modèle rongeur tout en jugeant l'expérimentation animale "indispensable".

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (25% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie et qui peut avoir des répercussions au niveau du cerveau avec le développement d'encéphalopathies. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux polluants environnementaux comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) est identifiée comme un facteur de risque. L’un de mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication crucial participant aux échanges entre le foie et le cerveau et favorisant la progression de ces maladies et l’apparition de dommages aux niveaux de ces organes. Il apparait donc important d’évaluer le rôle de ces vésicules dans ce contexte de NAFLD et d’exposition aux HAPs et en particulier sur les dommages hépatiques et cérébraux. Etant donné la nature complexe de ces pathologies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes, dont le foie et le cerveau, et différents types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous mettrons en place une approche expérimentale sur un modèle de poisson-zèbre afin de comprendre le rôle des vésicules extracellulaires dans la progression des NAFLD induite par une exposition aux HAPs.

Bénéfices attendus

Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le rôle des vésicules extracellulaires dans les effets néfastes d'une exposition à un polluant de l'environnement (benzo[a]pyrène ou pyrène) dans les maladies du foie et les dommages cérébraux associés. En outre, l'étude des potentiels effets protecteurs de molécules capables de réduire la production ou la capture de ces vésicules dans le cadre de ces pathologies pourra être une preuve de concept pertinente et permettre d'envisager d'autres études pour une éventuelle utilisation chez l'Homme.

Procédures

Alimentation avec un régime enrichi en graisse (8 jours) Exposition à des polluants de l'environnement (7 jours)

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques avec des complications au niveau du cerveau. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons : développement d'une steatohépatite et peut-être le développement des premiers signes d'une encéphalopathie hépatique. Cependant cet impact restera modèré puisque qu'à ce stade de maladie, aucun signe de souffrance ne devrait se manifester mais il se pourrait que le comportempent des poissons soit légèrement altéré (nage plus faible ou anarchique; recherche alimenataire plus lente).

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement) puisqu’il s’agit d’étudier le rôle des vésicules extracellulaires, un moyen de communication entre cellules et organes et qui circulent dans le sang. En particulier, l’un des objectifs de ce projet est d’évaluer si des vésicules émises par le foie peuvent induire des dommages au niveau du cerveau. Dans ce contexte, seul l’utilisation de modèles animaux permet d’appréhender la complexité de ces relations entre cellules et organes. Toutefois, l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. En effet, de par l’expérience que nous avons de ce modèle et des expériences que nous voulons réaliser, nous avons pu déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles malgré la variabilité liée à l’expérimentation animale.

Raffinement

Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale (suivi d’une grille d’évaluation de la souffrance adaptée au modèle). Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux (qualité de l’eau, accès à la nourriture, température, cycle jour/nuit, nombre de poisson par bac…). Si une souffrance excessive venait à être détectée, quelle qu’en soit la cause (hébergement, manipulation, impact des traitements), les expérimentations concernées seront arrêtées et les procédures seront révisées (modifications des conditions d’hébergement, réduction des doses d’exposition aux agents toxiques…). Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’impact des HAP sur l’appartion et la progression des NAFLD (maladies du foie allant de la stéatose vers un état pathologique, la stéatohépatite et qui peut se traduire également par complication au niveau cérébral). Le modèle de poisson zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et ainsi à l’avenir limiter l’utilisation de ces modèles mammifères. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude physio-pathologique avec l’Homme notamment concernant le foie et les NAFLD (types cellulaires et métabolisme) mais également au niveau de la neurotoxicité ; une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 4 et 12 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des NAFLD (induite par l’alimentation notamment) mais également pour évaluer la neurotoxicité de différents traitements.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies à une semaine d'intervalle pour l'ablation de cinq sixièmes des reins, puis un régime riche en phosphate pendant dix semaines afin d'installer une insuffisance rénale chronique avec calcifications vasculaires. Le porteur décrit une hypertension attendue chez 75 à 80 % des animaux opérés et précise que les prélèvements sont terminaux. Il présente ce projet comme un préliminaire "indispensable" à l'étude des mécanismes de la maladie et affirme que l'expérimentation sur animal entier est "indispensable" pour une pathologie systémique.

Objectifs

Un taux élevé de phosphate (Pi) sérique est associée au développement de calcifications vasculaires (CV) chez les personnes atteintes d'insuffisance rénale chronique (IRC) et dans la population générale, et peut être une situation potentiellement mortelle. En effet, l’IRC aboutit à une hyperphosphatémie qui déclenche la calcification de la paroi des vaisseaux, ce qui entraîne une rigidification du système vasculaire et contribue au développement des maladies cardiovasculaires. Des études sur la population ont montré que plus la fonction rénale est altérée plus les risques de mortalité sont élevés. Cependant, bien que le rôle des niveaux élevés de Pi dans le développement des CV est largement reconnu, son mode d'action est encore inconnu et ne peut donc pas être ciblé de manière appropriée. L'objectif global de notre projet de recherche est de découvrir les mécanismes d'action du Pi qui entraînent le développement des CV dans le contexte de l'IRC, et d'identifier des cibles thérapeutiques putatives capables de contrecarrer ses effets délétères. Les modèles animaux décrits dans la littérature ne sont pas adaptés à la question scientifique que nous posons. Ainsi, la première étape qui fait l’objet de cette demande d'autorisation, consiste à optimiser la mise au point d’un modèle de souris présentant une insuffisance rénale chronique avec CV associées. L’IRC sera induite par ablation de 5/6ème des reins, technique que le chirurgien impliqué dans ce projet maitrise parfaitement. Pour favoriser l’apparition de calcifications vasculaires, les souris ayant subi cette ablation seront soumises à un régime riche en phosphate pendant 10 semaines. L'apparitions des CV sera évaluée par coloration spécifique des arches aortiques prélevés à partir de nos modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet est un préliminaire indispensable permettant d’établir un modèle de souris optimisé pour pouvoir par la suite évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets toxiques de l’hyperphosphatémie chez les patients en IRC. Les connaissances sur les mécanismes responsables de l’évolution de cette pathologie et la gestion de l'IRC ont considérablement augmenté, et le contrôle du niveau de phosphate dans le sang à tous les stades de l'IRC est considéré comme l'un des aspects les plus importants pour améliorer les résultats cliniques de l'IRC. En effet, un taux élevé de Pi sérique est le plus important facteur de risque associé à la CV dans la population générale. Pour faire face à la toxicité du Pi et à ses conséquences sur les risques cardiovasculaires, la compréhension des actions moléculaires et cellulaires du Pi est d'une importance capitale. Elle permettra de contrôler les effets néfastes de la toxicité du Pi et de proposer des recommandations diététiques au niveau sociétal. Cela aura de grandes implications sociales et économiques en matière de bien-être et de vieillissement en bonne santé.

Procédures

Deux chirurgies à une semaine d'intervalle sont nécessaires pour induire l'IRC chez la souris. Deux prélèvements de 2-3 gouttes de sang, avant la chirurgie 1 (2-3 gouttes de sang à partir de la veine de la joue) et en fin de procédure expérimentale (prélèvement terminal sans réveil), seront réalisés.

Impact sur les animaux

L’insuffisance rénale chronique induite par néphrectomie des 5/6 est bien tolérée chez la souris. L’expérience du chirurgien en charge de l’opération porte sur plusieurs centaines d’animaux, sans mortalité observée dans les 3 mois suivant la chirurgie. Les niveaux d’insuffisance rénale obtenus par néphrectomie des 5/6 restent modérées grâce à l’hypertrophie de la portion résiduelle de rein. En effet la concentration plasmatique d’urée (un marqueur classique de la fonction rénale) est de 5-6 mmol/L chez les souris contrôle et de 18-25 mmol/L chez les souris néphrectomisée. Pour faire le parallèle avec la clinique humaine, nous avons par le passé mesuré la clairance de la créatinine chez ces animaux et pu grader l’insuffisance rénale comme correspondant à un stade 3-4 en clinique humaine (stades pour lesquels les stratégies de suppléance rénale ne sont pas encore mises en oeuvre). Les principales manifestations cliniques de l’insuffisance rénale chronique sont une hypertension artérielle qui survient chez 75 -80% des animaux néphrectomisés et une protéinurie. La supplémentation de l’eau de boisson des animaux néphrectomisés avec du bicarbonate de sodium (80 mM) permet d'empêcher les acidoses.

Devenir

des prélèvements terminaux sans réveil pour tous les animaux sont nécessaires pour évaluer l'apparition des calcifications vasculaires dans ce modèle.

Remplacement

S’agissant d’une maladie systémique (insuffisance rénale chronique), l’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude (72 souris) a été calculé au plus juste afin d’offrir la puissance statistique maximum. Pour calculer la taille des groupes et les analyses de puissance statistique, nous avons utilisé l'outil G*Power (erreur de type I = 0,05)

Raffinement

Le protocole chirurgical sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane offrant à la fois une bonne sécurité et un bon confort anesthésique. Un protocole d’analgésie (associant anesthésie locale per-opératoire et l’usage de dérivés morphiniques) et un système d'évaluation du bien être et de la douleur permettra, de prévenir et de contrôler efficacement les douleurs post-opératoires. Les conditions d'hébergement sont adaptées aux besoins des souris (regroupement par 5 souris maximum, température, enrichissement du milieu de vie avec du frisotis permettant aux souris de se fabriquer un nid)

Choix des espèces

Nous avons choisi de mettre en place ce modèle d’étude chez la souris car nous utiliserons dans un deuxième temps des souris génétiquement modifiées, toutes sur fond génétiques C56BL/6, pour des gènes importants pour l’homéostasie phosphocalcique afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires des effets du Pi dans l’IRC avec CV associées. Des souris adultes de 20 semaines seront utilisées pour pouvoir confronter nos résultats avec d'autres modèles décrits dans la littérature.

240 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules immunitaires humaines puis un vecteur de thérapie génique AAV, avec prélèvements sanguins hebdomadaires à la jugulaire pendant douze semaines, injections répétées de LPS, pompes implantées chirurgicalement sous le dos et anticorps injectés trois fois par semaine. Le porteur indique que les souris sont mises à mort par décapitation ou pentobarbital après un prélèvement terminal de sang et d'organes. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico ne rendent pas compte de la réponse immunitaire dans son ensemble et conclut que l'emploi d'un organisme vivant est "nécessaire".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser l’interleukine 34 (IL-34) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires impliqués naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. Dans la seconde stratégie, un anticorps anti- CD45RC sera utilisé pour moduler l’action des cellules exprimant fortement le marqueur CD45RC. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune préexistante dirigée contre le vecteur de thérapie génique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 12 semaines. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale sous anesthésie gazeuse. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 5 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de LPS à J+1, J+2, J+3 après l’injection IV du vecteur. Une injection en IP se fait en moins d’une minute. Des injections IP d’IL-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 12 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation. 48h avant injection de l’AAVr, des pompes Alzet rechargeables-iPrecio seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des souris permettant de diffuser de l’IL-34 sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge en IL-34, s’effectuera tous les 15 jours après palpation de l’orifice de la pompe rechargeable à travers la peau. La recharge s’effectue en moins de deux minute. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation B, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intraveineuse dans la veine caudale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. Les souris seront placées dans un tunnel de contention pendant 2 minutes le temps de l’injection. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse.

Impact sur les animaux

Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’utilisation de seringue à insuline équipée d’une petite aiguille de 30 G permet de limiter le désagrément de la piqûre. L’installation d’une pompe rechargeable-iPrecio nécessite une petite chirurgie pour la placer en sous-cutanée. L’animal sera sous analgésie en pré et post opératoire pendant 24h. Au-delà, aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (entre 1 et 3 mois maximum post-injection selon les réponses aux stratégies d’immunomodulations), jour de l’euthanasie et de la réalisation des prélèvements de tissus et d’organes. En ce qui concerne les animaux des différents groupes expérimentaux, notre protocole requiert un prélèvement terminal d'une grande quantité de sang sur lequel s'appuiera certaines analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques, mais également pour éliminer la plus grande majorité de sang des organes ou tissus tels que le foie, le cœur, la rate, les poumons, le cerveau, les reins ou encore les muscles squelettiques qui seront prélevés pour analyses. Les animaux subiront donc une anesthésie gazeuse préalable (isoflurane : induction 5%) suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine. Tous les animaux sont concernés par cette procédure exceptés les animaux inclus qui entrent dans le cadre de la procédure de perfusion du foie pour isolement des cellules. Dans le présent cas, le sang ne sera pas récupéré après perfusion hépatique, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane et mis à mort par injection de pentobarbital (Euthasol vet à la dose de 140 mg/kg en IV ou IC).

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de reproduire cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.

Réduction

Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains. Au maximum, 240 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.

Raffinement

Le souci du bien-être animal passera par : (i) De bonnes conditions d’hébergements. Par exemple pour les cages comportant plus de 2 souris, une bonne quantité de frisottis en carton est ajouté dans chaque cage pour enrichir l’environnement des animaux. Pour les cages comportant moins de 3 animaux, en plus des frisottis, est ajouté un igloo en cellulose. Des petits morceaux de bois à ronger sont distribués. Les litières sont changées 2 fois par semaine. Un suivi régulier des animaux, chaque cage est inspectée quotidiennement pour vérifier que les animaux se portent bien ainsi que pour contrôler le niveau de nourriture et d’eau. (ii)L’instauration de points limites pertinents et précoces. La détermination des points limites se basera sur la grille d'évaluation ci-dessous, adaptée aux procédures envisagées. En cas de 3 signes cliniques notables ou 1 signe clinique sévère, l'euthanasie sera décidée. -Signes cliniques notables : lésion sans effraction cutanée, agitation, hypomobilité, hyperréactivité, résistance à la manipulation, stéréotypie, poil piqué, gonflement abdominal, perte de 10% à 20% du poids, diminution ou absence de prise de nourriture/d'eau... -Signes cliniques sévères : lésion sévère, saignement incontrôlable, akinésie, convulsions, respiration difficile ou suffocation, absence de fèces ou fèces liquides, déshydratation, perte >20% du poids, douleur à la palpation… (iii)La mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie ou mise à mort par des méthodes reconnues).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par l'existence de plusieurs modèles murins humanisés ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Le modèle murin (NOD/SCID/HLA-A2) est couramment utilisé en transfert adoptif de cellules humaines, car il permet une bonne survie des cellules transférées. L'expression de l'allèle du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I HLA-A2.1 est indispensable car les cellules humaines transférées ont un répertoire restreint à cet allèle. La preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV préexistante étant faite chez la souris NSG HLA A2, le développement de stratégies d’immunomodulation dans ce modèle est privilégié. Les souris seront injectées entre 6 et 14 semaines d’âge. À ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie de transfert adoptif de cellules sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est implantée sous la peau, puis elles reçoivent par voie intraveineuse des formulations d'un photosensibilisateur avant prélèvement de sang et d'organes après mise à mort, pour comparer la diffusion de deux formes liposomales au produit de référence. Le porteur indique que les souris maintenues à l'obscurité jusqu'à 48 heures subissent un stress, la lumière étant évitée pour prévenir la photosensibilisation. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut être maintenu assez longtemps pour étudier cette diffusion dans l'"organisme entier".

Objectifs

La thérapie photodynamique est un traitement employé en cancérologie pour éradiquer les tumeurs de petite taille accessibles à la lumière. Le principe repose sur l’activation, en présence d’oxygène et de lumière, d’une molécule appelée photosensibilisateur qui se localise préférentiellement dans la tumeur. La meta-tétra(hydroxyphényl)-chlorine (mTHPC) connue sous le nom de Foscan® est approuvée en clinique pour le traitement alternatif à la chirurgie des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures mais étant peu soluble dans l’eau, elle persiste longtemps au niveau du site d’injection, freinant sa distribution aux organes et notamment à la tumeur, et entrainant des problèmes de photosensibilisation cutanée. Les objectifs de ce projet sont d’étudier le devenir au cours du temps dans le sang (pharmacocinétique) et la biodistribution au niveau tissulaire et intratumoral par imagerie de fluorescence de 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC en comparaison avec le Foscan® comme référence, administrés par voie intraveineuse chez la souris après induction d’une tumeur sous-cutanée. Lorsque la taille de la tumeur aura atteint le volume requis, les souris recevront par voie intraveineuse l’une des deux formulations liposomales ou le Foscan®. Les prélèvements de sang réalisés sous anesthésie, d’organes (peau, muscle, foie, reins, cœur, poumons et intestins) et de tumeurs réalisés après la mise à mort des animaux, seront effectués à différents temps après injection des 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC ou du Foscan®, avec 5 souris par temps de prélèvement et par produit injecté.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer la pharmacocinétique et la biodistribution tissulaire et intratumorale de 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC en comparaison avec le foscan®, composé à base de mTHPC utilisé en clinique. Le Foscan® est en effet utilisé pour le traitement alternatif à la chirurgie des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures mais étant peu soluble dans l’eau, il persiste longtemps au niveau du site d’injection, freinant sa distribution aux organes et notamment à la tumeur, et entrainant des problèmes de photosensibilisation cutanée. Les 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC développées devraient permettre une meilleure diffusion dans l’organisme au cours du temps afin de mieux cibler la tumeur et de limiter son accès aux organes, notamment au niveau de la peau pour limiter les problèmes de photosensibilisation cutanée. Les données issues de ce projet permettront d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC testées.

Procédures

Les 180 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à l’induction d’une tumeur sous-cutanée par injection d’une suspension de cellules tumorales effectuée une seule fois en moins d’une minute et sous anesthésie générale. Un suivi de la croissance tumorale sera effectué par mesure tous les 2 jours sur animal vigile de la taille de la tumeur, à l’aide d’un pied à coulisse, mesure effectuée en moins d’une minute. Une injection intraveineuse de formulations liposomales à évaluer ou du produit de référence utilisé (Foscan®) sera effectuée sous anesthésie générale sur les 180 souris, une seule fois et en une minute environ, lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (350 à 400 mm3), à la dose de 0,3 mg/kg pour 105 souris, et à la dose de 7,0 mg/kg pour 75 souris. Un prélèvement de sang de 0,5 ml sera effectué sur 105 des 180 souris par prélèvement intracardiaque sous anesthésie générale effectué une seule fois et en une minute environ, avant leur mise à mort, afin d’étudier le devenir au cours du temps dans le sang des formulations liposomales injectées par rapport à celui du composé de référence (Foscan®), puis d’étudier leur distribution dans différents organes et la tumeur qui seront prélevés après la mise à mort. Une injection intracardiaque d’un produit de contraste permettant de visualiser les vaisseaux sanguins au niveau de la tumeur sera effectuée sur 75 des 180 souris, une seule fois et en une minute environ, sous anesthésie générale, 7 minutes avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Un stress des animaux utilisés dans ce projet sera induit par le placement à l’obscurité après la réalisation de l’injection intraveineuse de formulations liposomales à base de mTHPC ou de Foscan® jusqu’à leur mise à mort, rendu nécessaire afin d’éviter les problèmes de photosensibilisation cutanée. Ce stress induit concernera les animaux qui seront mis à mort aux temps prolongés de la cinétique réalisée, correspondant donc aux temps 18 heures, 24 heures et 48 heures, soit 45 des 105 souris utilisées pour la partie pharmacocinétique et biodistribution tissulaire, et 30 des 45 souris utilisées pour la partie biodistribution intratumorale. Les autres animaux qui seront mis à mort aux temps courts de la cinétique réalisée, entre 30 minutes et 6 heures, le seront au cours du cycle normal jour/nuit auquel ils sont soumis. Pour ces raisons, et le fait également d’induire une tumeur sous-cutanée, de réaliser des injections de produits, sous anesthésies générales répétées mais de courte durée, la procédure expérimentale a été classée en sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, après ou non réalisation d’un prélèvement de sang, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement d’organes et de la tumeur, et de pouvoir ainsi réaliser un ensemble d’analyses permettant d’étudier la distribution au cours du temps des formulations liposomales et du produit de référence (Foscan®) qui auront été préalablement injectés.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules) ou ex vivo (organes isolés) qui ne pourraient d’ailleurs pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, afin d’étudier la diffusion dans l’organisme entier au cours du temps (pharmacocinétique) et dans des organes cibles (biodistribution) de composés injectés par voie générale. L’étude de la distribution intratumorale de molécules d’intérêt est nécessaire pour optimiser l’intervalle de temps entre l’injection et l’irradiation lumineuse (IDL = Intervalle Drogue-Lumière). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études antérieures, pour certaines publiées, ayant permis d’ajuster les temps de cinétique de prélèvements et montrer que 5 animaux par temps de prélèvement et par groupe de traitement était nécessaire et suffisant. D’autre part, l’objectif étant de comparer 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC au Foscan®, il n’est pas nécessaire d’utiliser de groupe d’animaux témoins recevant une formulation liposomale neutre, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les injections sous-cutanée de cellules tumorales et intraveineuse de formulations liposomales à base de mTHPC et de Foscan®, ainsi que le prélèvement sanguin, seront effectués sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, de déshydratation, de prostration prolongée, de non réponse à l’activité externe ou des modifications de leur comportement sont observés (difficultés à se déplacer, cachexie, vocalises, convulsions…), elles seront mis à mort dans des conditions éthiques. Une attention toute particulière sera portée aux animaux qui seront maintenus dans l’obscurité et mis à mort aux temps prolongés de la cinétique, 18 heures, 24 heures et 48 heures après injection des formulations liposomales à base de mTHPC et de Foscan®. Des boules de coton seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière

Choix des espèces

La souris Nude, présentant un système immunitaire déficient, est le modèle animal le plus approprié pour des études en cancérologie expérimentale, très utilisée et largement décrite dans la littérature scientifique, permettant d’injecter chez l’animal des cellules tumorales d’origine humaine sans risque de rejet. D’autre part, les études de pharmacocinétique et de distribution tissulaire et intratumorale sont principalement réalisées chez la souris car sa petite taille nécessite d’utiliser moins de composé à évaluer, composé dont le coût de développement peut être très important. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge moyen de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de pharmacocinétique et de biodistribution, et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats probants.