Recherche fondamentale

240 hamsters syriens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections répétées de mélatonine, une autre subit une chirurgie d'implantation d'un système d'infusion continue d'hormones thyroïdiennes dans le cerveau, pour étudier la prolifération cellulaire saisonnière de l'hypothalamus. Le porteur indique que la chirurgie est douloureuse, que le passage en jours courts provoque une perte de poids d'environ 15 % et que l'isolement en cage individuelle peut générer du stress. Tous les animaux sont ensuite tués pour prélever le cerveau, le sang et les testicules.

Objectifs

L’hypothalamus est une partie du cerveau qui contrôle les fonctions métaboliques et reproductives. Chez les mammifères, il a été montré que les changements saisonniers des hormones thyroïdiennes et de la mélatonine régulent l’activité de l’hypothalamus pour ajuster les fonctions métaboliques et reproductives avec les saisons. Notre projet déterminera quel est le rôle des hormones saisonnières (mélatonine et hormones thyroïdiennes) dans la prolifération cellulaire saisonnière de l’hypothalamus du hamster syrien, un mammifère saisonnier. Des études chez le mouton ont montré que l'exposition à des jours courts d’hiver (avec un pic long de mélatonine), qui induit une activation de leur reproduction, est associée à une augmentation de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Nos données préliminaires chez le hamster syrien montrent que l'exposition à des jours courts (qui, à l’inverse du mouton, inhibent sa reproduction) induit également une prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ces observations suggèrent que la prolifération saisonnière des cellules hypothalamiques se produit en réponse au signal saisonnier, indépendamment de la stratégie de reproduction de l'animal. Notre projet testera quelles hormones saisonnières (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) induit la prolifération cellulaire hypothalamique en jours courts chez le hamster syrien mâle.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à mieux comprendre la nature du signal saisonnier endocrine (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) qui contrôle la prolifération cellulaire saisonnière dans l'hypothalamus du cerveau adulte d’un mammifère. Les résultats obtenus nous permettront ensuite d’envisager de futures expériences pour 1) établir la nature des cellules hypothalamiques nouvellement formées suite au changement des saisons, 2) analyser le rôle physiologique de la prolifération cellulaire adulte saisonnière et 3) d’étudier l’effet de perturbateurs saisonniers (réchauffement climatique, pollution lumineuse nocturne) sur la prolifération cellulaire saisonnière. Ces travaux ont des implications cliniques potentielles car des études récentes montrent que la physiologie humaine présente aussi des variations saisonnières d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance.

Procédures

Dans la première expérience où nous testons l’effet d’un allongement du pic nocturne de mélatonine en jours longs, chaque hamster recevra une injection de solvant ou de la mélatonine (durée de la préhension plus injection : 2 min) chaque jour pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Toutes les injections se feront sur animal vigile. Les hamsters seront stabulés à raison de de 3 individus par cage enrichie (tunnel, nid, bâton en bois). Dans la deuxième expérience où nous testons l’effet d’une augmentation des concentrations des hormones thyroïdiennes en jours courts, chaque hamster aura une chirurgie pour implanter un système permettant l’infusion continue de solvant ou d’hormones thyroïdiennes dans le cerveau (durée de la chirurgie sous anesthésie profonde : 30 min) pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Les hamsters seront stabulés en cages individuelles enrichies (tunnel, nid, bâton de bois) car la situation de jours courts les rend naturellement agressifs et les animaux pourraient s’attaquer les uns aux autres, notamment au niveau des plaies des implantations. A la fin de l'étude, tous les animaux seront mis à mort après anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Le hamster syrien peut être stressé par les manipulations/préhensions qu’il devra subir régulièrement. Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer une douleur locale mais de courte durée. L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse per se (douleur modérée) et peut également entrainer des inflammations. Le transfert en jours courts entraine naturellement une perte de poids d’environ 15%, mais il est possible que la perte de poids soit supérieure. Les hamsters opérés et leurs contrôles sont suite à l'impantation transférés en jours courts et sont placés en cage individuelle (car étant naturellement plus agressifs en jours courts, ils pourraient s’attaquer, notamment au niveau des plaies) ce qui peut conduire à un stress de l’isolement.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements 1) du cerveau post-mortem dans le but d’analyser la prolifération cellulaire grâce à la visualisation par une technique de coloration de cellules nouvelles nées par immunohistochimie ; 2) du sang pour doser les hormones de la reproduction, 3) des testicules dont la masse indique le statut reproducteur de l’animal.

Remplacement

Le projet vise à étudier l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ce sont des fonctions intégrées typiques des mammifères qui par conséquent ne peuvent pas être étudiées chez des organismes non-mammifères, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques, et qui nécessitent des organismes entiers. Dans ce contexte il n'est encore pas possible de proposer d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.

Réduction

Le nombre de animaux a été calculé sur des connaissances du modèle et une méthode mathématique en intégrant la variabilité inhérente au modèle et aux gestes réalisés. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests statistiques utilisés pour comparer les groupes ont été choisis pour permettre d’évaluer l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus.

Raffinement

Tous les hamsters seront dans des cages enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et tunnel de refuge. Avant et pendant les traitements, les hamsters, qui sont des animaux sociaux, seront placés en cage collective (3 individus par cage). Il y aura une exception pour les hamsters stabulés en jours et ayant eu une intervention chirurgicale qui seront isolés car il y a des risques qu’ils soient agressifs entre eux. Les hamsters soumis à des traitements seront traités avec des analgésiques et anesthésiques adaptés pour réduire leur souffrance induite par les procédures à un niveau minimum. Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des injections pour limiter le stress généré par celles-ci. Ils seront observés quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance. Des points-imites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance durant la durée de l’étude.

Choix des espèces

Le hamster syrien est un modèle de rongeur dont la physiologie saisonnière est bien caractérisée. Des résultats récents chez le hamster syrien ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique augmentée lors du transfert en jours courts type hiver. De plus les procédures expérimentales proposées chez cette espèce sont bien maitrisées, ce qui contribuera à en limiter les effets dommageables pour l’animal. Pour ce projet seuls les mâles seront utilisés car la bonne intégration de l’information photopériodique est facilement observable par la modification de la taille des testicules. Nous utiliserons des hamsters mâles post-pubères âgés entre 3 et 8 mois, car notre expérience nécessite que les hamsters aient un âge où la maturation sexuelle est optimale.

6 chevaux sains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants comme animaux d'enseignement. Chaque cheval subit une biopsie de la langue réalisée à travers la joue sous sédation et anesthésie locale, ainsi que des examens cliniques et des administrations orales de médicaments sur trois jours. Le porteur reconnaît que des complications modérées à sévères comme une hémorragie ou une anorexie peuvent survenir. Il présente cette étude comme une étape préliminaire "indispensable" avant des prélèvements sur des chevaux malades, pour améliorer le diagnostic de la maladie de l'herbe.

Objectifs

Démontrer la tolérance et la faisabilité de la technique de biopsie de langue réalisée à travers la joue, chez des chevaux vivants sains. Ce travail est une étape préliminaire indispensable à la réalisation des prélèvements chez des chevaux symptomatiques, dans un contexte clinique.

Bénéfices attendus

Permettre de valider la faisabilité et la tolérance d'une technique de biopsie linguale sur des chevaux debouts, afin d'améliorer le diagnostic et la prise en charge des chevaux atteints de la maladie de l'herbe. Le diagnostic précoce et fiable de cette maladie présente un réél enjeu éthique et financier.

Procédures

3 interventions : 3 examens cliniques par jour pendant 3 jours, soit 9 examens cliniques, 10 minutes par examen ; 2 administrations per os de médicaments par jour pendant 3 jours, soit 6 per os, 1 minute par administration ; la réalisation de la biopsie linguale transbuccale (à travers la jour) sous anesthésie locale et sédation.

Impact sur les animaux

Des complications modérées à sévères pourraient éventuellement survenir, telles qu'une hémorragie ou une anorexie (perte totale d'appétit). Des complications plus modérées pourraient éventuellement survenir, telles qu'une dysorexie (difficultée à manger, perte d'appétit partielle) les premiers jours après l'intervention, une inflammation douloureuse ou une infection du site d'incision de la joue, des symptômes de fièvre et d'infection généralisée.

Devenir

A l'issue de la première procédure, les 3 chevaux seront replacés pour l'enseignement de l'anatomie. A l'issue de la 2e procédure, les 3 chevaux seront conservés au sein de l'EU, en tant que chevaux d'enseignement clinique.

Remplacement

Une étude préliminaire a été effectuée sur des cadavres afin de garantir la faisabilité de la technique. Notre projet cherche maintenant à démontrer la faisabilité de cette procédure sur des chevaux vivants debouts, avec les difficultées que cela représente : comportement d'acceptation de la procédure, déglutition, mastication et mouvements de langue. La procédure vise également à recenser les complications éventuelles qui pourraient survenir. Aucun modèle inerte ne peut être utilisé pour cette étape du projet.

Réduction

Aucun projet ne s'est intéressé à la réalisation de biopsie linguale chez des chevaux vivants. La faisabilité de la procédure par approche transbuccale a été au préalable évaluée sur des cadavres et la technique a été améliorée au fur et à mesure des essais. Les analyses histologiques effectuées ont démontré la bonne qualité des prélèvements. La procédure a été optimisée avant d'être employée sur des chevaux vivants, permettant de réduire leur nombre. Aucun test statistique n'a été utilisé pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Nous optimisons la technique pour améliorer le bien-être des animaux. Les chevaux seront logés au box sur une litière paillée, avec une nourriture standard (foin et granulés), avec des congénères en visuel et sortis 2 fois par jour. Un enrichissement du milieu à l'aide de jeux, de pierres à sel et de pipolino sera effectué selon les individus et leur niveau d’habituation, afin de ne pas générer une source de stress supplémentaire. Pour la réalisation des biopsies, les chevaux seront tranquillisés, après l’administration d’antalgiques et des anesthésies locales seront réalisées pour tous les actes pouvant être inconfortables. Enfin, les chevaux seront remis au box et re-nourris dès que les effets de la sédation auront disparu. La procédure sera réalisée si le cheval supporte une sédation adéquate, sans agitation avec un arrêt de la mobilité de la langue, afin de prélever la biopsie dans des conditions optimales. Si tel n’est pas le cas, la procédure sera arrêtée et le cheval sorti du protocole.

Choix des espèces

Espèce cible pour la pathologie concernée Chevaux adultes. La maladie de l'herbe se déclare le plus souvent chez de jeunes adultes entre 2 et 7 ans. Notre projet vise à tester la faisabilité des biopsies chez des chevaux de taille adulte.

4320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections répétées d'anticorps et d'inhibiteurs deux à trois fois par semaine, avec un risque de nécrose de la tumeur, de cachexie et d'isolement. Le porteur, une société, indique évaluer l'efficacité anticancéreuse de ses anticorps monoclonaux en combinaison, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet ce test faute de système immunitaire fonctionnel. Les animaux dont la tumeur ne prend pas sont eux aussi mis à mort.

Objectifs

Ces dernières années l’immunothérapie a connu un essor important dans la prise en charge des cancers. Elle a montré une efficacité conséquente dans diverses indications, cependant un certain nombre de patients présentes des résistances spontanées ou acquises. Notre société développe des anticorps monoclonaux à visée thérapeutique dans le cancer. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’efficacité anti-cancéreuse des anticorps monoclonaux en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans des modèles de souris. L’objectif secondaire est d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps par l’évaluation des modulations du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Notre hypothèse est que nos cibles thérapeutiques jouent un rôle dans le développement tumoral. Notre société évalue l’effet anti-tumoral de thérapies ciblées seules ou en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans le cadre de plusieurs projets cliniques. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement des candidats médicaments et de leur fonctionnement en association avec des inhibiteurs de point de contrôle. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral, soit du jour d'inclusion dans un groupe de traitement jusqu'à l'obtention d'un point limite) et/ou inhibiteurs de point de contrôle (3 injections espacées de 4 jours à partir de l'inclusion des animaux dans les groupes de traitement). Une injection sous-cutannée de lignées cellulaires est réalisée lors de la greffe (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL. Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Impact sur les animaux

Dans les deux procédures il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Les individus concernés seront mis à mort. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles. Des mesures d'enrichissement du milieu et de nourriture semi-liquide dans la cage seront mises en œuvre dans un premier temps. Si les point limites sont atteints, les animaux seront mis à mort et une autopsie sera effectuer de manière à évaluer la présence potentielle de métastases. Si de telles observations sont avérées, les surveillances des animaux restants seront accrues.

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Des prélèvements tumoraux postmortem seront effectués afin d'analyser le mécanisme d'action des différentes combinaisons de traitements. Etant donné la variabilité de prise de greffe des différents modèles cellulaires, certains animaux peuvent ne pas présenter de tumeur. Ayant subi une injection de cellules, il ne peuvent être considérés comme naïfs de traitement et réutilisés dans d'autres procédures.Les animaux ne présentant pas de prise tumorale seront mis à mort 2 mois après la greffe, en fin de procédure. Des prélèvements biologiques postmortem pourrons également être réalisés sur ces animaux afin d'obtenir des tissus contrôles sains en référence de nos expérimentations

Remplacement

La présence de tous les acteurs micro-environnementaux est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité de nos anticorps monoclonaux. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs de point de contrôle car ils nécessitent la présence d'un système immunitaire fonctionnel.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ces modèles ainsi que pour de disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Pour les procédures 1 et 2) D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes sur souris immunocompétentes traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 12 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales, nous envisageons des groupes de 15 souris. Dans l’analyse des résultats, nous porterons une attention à la fréquence des animaux répondeurs. Une réduction a été opérée dans les différentes procédures en mutualisant les bras contrôle pour plusieurs lignes de traitement. Une réduction sera opérée dans la procédure 2 sur la base des réponses observées en procédure 1.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans toutes les procédures le volume tumoral sera évalué 2 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, amaigrissement, isolement social) seront surveillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 fois par semaine. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles. Des mesures d'enrichissement du milieu et de nourriture semi-liquide dans la cage seront mises en œuvre dans un premier temps. Si les point limites sont atteints, les animaux seront mis à mort et une autopsie sera effectuer de manière à évaluer la présence potentielle de métastases. Si de telles observations sont avérées, les surveillances des animaux restants seront accrues.

Choix des espèces

Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre des cibles de souris. La souris compétente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu de cette même espèce tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de inhibiteurs de point de contrôle. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. Par conséquent, les modèles immunocompétents tels que les souris BalbC ou C57b6 sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément aux modèles établis.

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie pour l'implantation d'un capteur sous-cutané porté dix-sept jours, toutes courent ou marchent sur un tapis, puis sont endormies profondément pour des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien. Le porteur indique que l'étude vise à savoir si certains neurones de la moelle épinière thoracique participent à la régulation cardiovasculaire, un objectif de connaissance fondamentale sans application annoncée. Les animaux sont mis à mort pour collecter un maximum de tissus.

Objectifs

Cette demande d’autorisation de protocole s’inscrit dans un projet plus large qui vise à déterminer si les neurones présents autour du canal central dans la moelle thoracique et qui sont en contact avec le liquide céphalorachidien (cellules appelées LCR-cNs) font partie du système nerveux autonome sympathique (SNAS) en charge, entre autres, de la régulation cardiovasculaire. L’objectif de ce projet sera donc de regarder la pression artérielle de base et sa modulation lors d’un exercice moteur chez des souris dont les LCR-cNs seront spécifiquement invalidés pour le gène codant pour une protéine appelée PKD2L1 qui leur confère une sensibilité aux déformations mécaniques et aux variations de pH. En parallèle de ces expériences, nous regarderons l’effet d’un exercice physique sur la composition du plasma sanguin et du LCR chez la souris. Les molécules identifiées seront alors testées sur l’activité des LCR-cNs en tranches par des approches électrophysiologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de savoir si l'activité de certains neurones de la moelle épinière thoracique sont capables de moduler la commande nerveuse du système nerveux autonome et de participer à la régulation du tonus cardiovasculaire. Ces neurones constitueraient ainsi un système sensoriel intrinsèque à la moelle épinière qui pourrait informer directement les réseaux neuronaux des changements métaboliques de l’organisme sans obligatoirement passer par les structures présentes dans l’encéphale. Les informations recueillies fourniront de nouvelles données sur l’organisation de la moelle épinière et son implication dans la régulation des fonctions vitales.

Procédures

Certains animaux subiront une chirurgie peu invasive d’une heure environ pour suivre leurs paramètres cardio-vasculaires dans le temps et courront sur un tapis, 15 minutes pendant 4 jours d’affilé (n=28) Ces animaux porteront un capteur en sous-cutané pendant 17 jours. D'autres marcheront (n=24) ou courront (n=48) à 2 vitesses différentes (24 animaux par vitesse), pendant 15 minutes. Enfin les 24 marcheurs, 48 coureurs et 24 sédentaires seront profondément endormis avant des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie peu invasive mais seront suivis avec une analgésie adaptée. Les animaux marcheront ou courreront pendant 15 minutes sur un tapis roulant après une phase d'entrainement où aucun système aversif ne sera utilisé

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures car nous travaillons à mieux comprendre des systèmes biologiques aujourd'hui mal connu et il est important de collecter un maximum d'information via les prélèvements de tissus.

Remplacement

Cette étude in-vivo fait suite à plusieurs années de recherche ex-vivo sur des moelles épinières extraites. Malgrès les nombreuses connaissances accumulées, il est impossible de mettre en évidence les interactions entre les populations de cellules de la moelle épinière étudiées ici et le reste de l'organisme sans réaliser des expérimentations in vivo.

Réduction

Afin de cibler très précisément des questions soulevées par le projet, des études préliminaires sur moelles extraites ont été faites et ont permis de grandement limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus le nombre d'animaux a été reduit au minimum afin d'avoir des résultats statistiquement viables à exploiter . Enfin pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté (télémétrie ). Ainsi, chacun des animaux sera son propre contrôle (avant et après exercise physique). Le nombre d’animaux a été établi sur la base des minimums nécessaires pour effectuer des tests statistiques robustes et des données bibliographiques dont nous disposons.

Raffinement

La technique de télémétrie permet à l'animal d'être libre de ses mouvements dans la cage. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (anesthésie et analgésie), les conditions d'asepsies seront respectées (stérilisation du matériel) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé . Les animaux seront vus quotidiennement et seront évalués suivant une méthode d'évaluation validée avec des points limites gradés et précis. Toutes les cages seront enrichies avec du matériel de nidification et un tunnel en carton.

Choix des espèces

La souris est une espèce dont le génome est parfaitement connu et que l'on peut très facilement manipuler. Ainsi dans le cadre de notre étude, la lignée cellulaire à étudier a été ciblée en supprimant un gène cible. De plus, la souris est une espèce dont la gestation et la phase juvénile est courte, permettant ainsi d'avoir régulièrement des animaux au génotype voulu. Les animaux seront utilisés adultes (autour de 7 semaines). Nous devons attendre que les animaux fassent 22gr pour leur implantation en télémétrie (recommandation du fabriquant) mais nous ne voulons pas avoir des animaux trop âgés par soucis technique (implantation facilitée chez les individus jeunes).