Recherche fondamentale
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- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
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Evaluation d’une nouvelle méthode de réanimation cardiopulmonaire par entrainement électrique externe dans un modèle d’arrêt cardiaque par asystolie chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
8 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porc subit une chirurgie de deux heures puis un arrêt cardio-respiratoire provoqué de dix minutes, avec deux prélèvements sanguins, pour tester un prototype de stimulation électrique externe pendant la réanimation cardiopulmonaire. Le porteur indique que les animaux restent anesthésiés en permanence et que la profondeur de l'anesthésie est vérifiée régulièrement. Le bénéfice annoncé, une meilleure reprise de l'activité cardiaque, est formulé au conditionnel.
Objectifs
L'arrêt cardiaque extra-hospitalier correspond à l'arrêt brutal et inattendu des battements du cœur, souvent appelé "crise cardiaque". Cette situation frappe environ 40.000 personnes par an en France et 300.000 à 400.000 en Europe. Lorsque cela survient, l'urgence est la mise en place de soins de réanimation cardiopulmonaire, s'appuyant sur un massage cardiaque, l'appel des secours et l'usage d'un défibrillateur semi-automatique. Une fois les services de secours médicalisés sur place, une réanimation cardiopulmonaire avancée est mise en place, incluant une intubation endo-trachéale (sonde dans la trachée) et une ventilation mécanique (respiration) du patient par des machines spécifiques. Des molécules peuvent aussi être administrées pour essayer de faire repartire le coeur. Dans certains cas, ces soins ne suffisent pas. Dans ce contexte, le but de l’étude est d’évaluer l’impact d’un nouveau prototype de stimulation électrique transthoracique (pacing). Ce dispositif pourrait permettre d'augmenter la performance d'un massage cardiaque lors d'une réanimation avec certains rythmes cardiaques particuliers (très faible fréquence cardiaque sans contraction effective). Pour montrer cette amélioration de la performance de la réanimation, il faut étudier la pression de perfusion coronarienne. Il nous faudra déterminer si le pacing permet d’obtenir une pression de perfusion coronarienne dépassant le seuil critique de 20mmHg pour obtenir une réanimation cardiaque efficace sur les animaux. Nous utiliserons un modèle porcin d’arrêt cardiaque présentant des rythmes ne nécessitant pas de choc électrique.
Bénéfices attendus
L’utilisation du prototype de stimulation transthoracique pendant la réanimation cardiopulmonaire permettrait une amélioration de la performance du massage cardiaque et in fine la reprise d’une activité électrique et contractile.
Procédures
Nous utiliserons 8 porcs. Pour cela, tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 2 heures et à un arrêt cardio-respiratoire d'une durée de 10 minutes. Deux prélèvements sanguins à l'état anesthésié seront réalisés pendant la procédure. Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés tout le long de la procédure. Nous vérifierons très régulièrement la profondeur de l’anesthésie afin de s’assurer qu’aucune souffrance ne soit possible pour l’animal. La profondeur de l'anesthésie est évaluée par la disparition du réflexe palpébral , une relaxation de la mâchoire et l'absence de réflexes de retrait de la patte.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole.
Remplacement
L’arrêt cardiaque est une situation qui induit une dysfonction de plusieurs organes après la réanimation. Le caractère intégratif de l’affection ne permet pas de la reproduire in vitro ou in silico (absence de Remplacement possible). L’étude de médicaments ou dispositif permettant de lutter contre ses séquelles doit se faire une vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.
Réduction
S’agissant d’une étude de preuve de concept, cette étude inclura uniquement 4 animaux par groupe (un groupe Témoin et un groupe "Pacing")Le critère de jugement principal sera la pression de perfusion coronarienne, calculée au cours du massage cardiaque comme la différence entre la pression artérielle systémique et la pression atriale droite en fin de décompression. Ce critère permettra d’évaluer le prototype de stimulation électrique transthoracique. Les critères secondaires d’investigation seront les pressions artérielles systémiques systoliques, diastoliques au cours du massage cardiaque et la pression atriale droite. Nous comptabiliserons simplement le nombre d’animaux pour lesquels une pression de perfusion coronarienne supérieure à 20 mmHg peut être observée lors du pacing. Si cela se présente sur un seul animal, cela pourra justifier des études complémentaires sur un nom. Ce chiffre est plus lié à un nombre suffisant au-delà duquel, s’il n’est pas possible d’atteindre le seuil de 20mmHg de pressions coronarienne sur au moins un animal, nous pourrons estimer que le bénéfice est trop « rare » pour mériter des investigations plus lourdes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des boxes individuels « contigus » avec la possibilité d’interagir (se sentir, s’entendre, se « renifler » à travers les grilles …). Si besoin, les jouets peuvent être renouvelés. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques. Porcs de 30 kg.
Mise en évidence in vivo de l’activité de ligands du récepteur à la ghréline sur la sécrétion d’hormone de croissance, la prise alimentaire et l’homéostasie glucidique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 192
960 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux reçoivent une à deux injections de ghréline et de ligands, avec une à trois gouttes de sang prélevées à la queue, pour caractériser l'effet de ces molécules sur l'hormone de croissance, la prise alimentaire et la glycémie. Le porteur indique que les nuisances se limitent au stress de la contention et des piqûres. Quarante-huit souris servant à la mise au point sont d'abord réutilisées, puis tous les animaux sont euthanasiés.
Objectifs
La Ghréline ou hormone de la faim stimule l'appêtit en signalant au cerveau qu'il est l'heure de manger. Elle contribue également à la régulation du glucose et de l'insuline et donc maintien l'équilibre du métabolisme. Elle stimule également la sécrétion de l'hormone de croissance. Ce projet vise à apporter une vision intégrée de la chimie, de la pharmacologie in vitro des ligands du récepteur et leurs effets biologiques in vivo. Plusieurs résultats remarquables sont issus de cette approche dont notamment la mise sur le marché aux USA et en Europe de la macimoréline pour le diagnostic des déficits de sécrétion de l'hormone de croissance. La découverte de nouveaux ligands pourrait conduire à de nouveaux médicaments permettant également de réguler les dysfonctionnements alimentaires chez l'homme.
Bénéfices attendus
L’activité des molécules agonistes sera caractérisée pour leur capacité à induire la sécrétion d'hormone de croissance, augmenter la prise alimentaire, diminuer la tolérance au glucose et augmenter la glycémie à jeun ou non à jeun. L’activité des molécules antagonistes sera caractérisée par leur capacité à bloquer l’induction d'hormone de croissance, l’augmentation de la prise alimentaire, la diminution de la tolérance au glucose et l’augmentation de la glycémie à jeun et non à jeun induites par la ghréline.
Procédures
Un analgésique local sera appliqué sur la queue de l'animal une heure avant le prélèvement de sang. Les animaux seront soumis à 1 ou 2 injections intrapéritonéales ou sous cutanées (injection de la ghréline et du ligand à 10 mn d'intervalle). Un à 3 prélèvements d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale seront réalisés à 15 min d'intervalle (selon les procédures 1,3,4,5) . Les injections intrapéritonéales prennent moins de 3 minutes et le prélèvement d'1 goutte de sang 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir un stress du à la contention pour l'injection (piqure de l'aiguille au niveau de l'abdomen ou en sous cutanée) et lors de la prise d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale
Devenir
48 souris utilisées dans la mise au point des conditions d’administration de la ghréline (procédure 1) seront gardées en vie pour être réutilisées dans les autres procédures (2 à 5) pour la mise au point des conditions d’administration de la ghréline . Ensuite tous les animaux de l'étude seront euthanasiés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de réaliser une preuve de concept in vivo de l’activité de ligands de synthèse du récepteur à la ghréline. Il n’existe pas de méthode alternative permettant de répondre à cet objectif.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, seuls les ligands les plus actifs in vitro seront évalués in vivo (sélectionnés vis-à-vis de leurs affinités et activités sur des cellules en culture). A chaque fois que cela sera possible, nous réaliserons des co-administrations afin de limiter à une seule injection l’administration des ligands testés en association avec la ghréline.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la contention plusieurs jours avant le début de la procédure afin de limiter leur stress. Une crème anesthésiante (EMLA® lidocaïne, prilocaïne) sera appliquée sur la queue de l’animal au moins une heure avant l’expérimentation sur la région où sera prélevé le sang. Les traitements seront effectués en aigu (c'est à dire sur une courte durée) limitant les complications potentielles liées à des administrations chroniques.
Choix des espèces
Dans la littérature les tests d’activité in vivo des ligands du récepteur à la ghréline sont réalisés majoritairement chez le jeune rat et la souris. Aussi, la preuve de concept de l’activité des ligands synthétiques sur la sécrétion d'hormone de croissance chez 2 modèles d’études (rat et souris) est essentielle afin d’écarter une éventuelle sélectivité d’espèces. En effet, des études menées au laboratoire sur des modèles cellulaires alternatifs in vitro montrent que l’affinité et la puissance de certains ligands varient en fonction de la séquence du récepteur (humain / rat). Enfin, les faibles rendements de synthèse de certains ligands nécessitent plutôt l’utilisation de souris afin de réduire la quantité de produit à administrer. Lors des expériences, les rats seront âgés de 3 à 5 semaines. A cet âge, les niveaux de sécrétion d’hormone de croissance plasmatique sont relativement élevés et cette sécrétion est plus sensible aux agonistes du récepteur de la ghréline. Les souris seront âgées de 1 à 2 mois conformément aux données de la littérature.
Rôle du gène BAHCC1 dans la croissance in vivo de mélanome
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.
Objectifs
Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.
Bénéfices attendus
Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.
Procédures
Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.
Impact sur les animaux
Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.
Devenir
Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).
Remplacement
Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.
Réduction
Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.
Raffinement
Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.
Choix des espèces
Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.
Etude du rôle de l’autophagie dans le métabolisme et la résistance des leucémies aiguës myéloïdes.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections d'un composé supprimant l'autophagie, puis une injection de cellules leucémiques, des prélèvements sanguins répétés, parfois une ponction osseuse, et un traitement oral ou intrapéritonéal, pour étudier le rôle de l'autophagie dans la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur indique des effets possibles comme du stress, une perte de poids ou une gêne de mobilité après ponction osseuse. Les souris sont tuées par prélèvement sanguin intracardiaque sous anesthésie pour les analyses.
Objectifs
Malgré un taux élevé de rémission après un traitement conventionnel par chimiothérapie, les rechutes sont fréquentes chez les patients atteints de leucémies aigües myeloïdes (LAM). Comme pour d'autres types de cancer, l'un des mécanisme impliqués dans la résistance des LAM est la reprogrammation métabolique. L’autophagie est un processus catabolique impliqué dans la dégradation et le recyclage des organelles et protéines endommagées pour participer au métabolisme. La dérégulation de l’autophagie est impliquée dans de nombreuses maladies telles que le cancer. Récemment, l’importance de l’autophagie dans les cellules du microenvironnement tumoral a également été mis en évidence. En effet, cette autophagie de l’hôte favorise la croissance des mélanomes, cancer du poumon ou cancer du pancréas en fournissant les substrats nécessaires aux cellules cancéreuses. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie de l’hôte dans la régulation du métabolisme des cellules de LAM et leur chimiorésistance.L
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le dévelopement et la résistance des LAM et les mécanismes moléculaires exacts impliqués. Cette meilleure compréhension pourra permettre le développement de thérapies ciblant directement l'autophagie ou des voies moléculaires régulées par ce mécanisme. Ce projet permettra également la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 injections d'un composé permettant d'induire une déplétion de l'autophagie dans l'ensemble des organes de la souris. Les animaux seront ensuite soumis à une injection unique de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis à des prélèvements de sang sous anesthésie espacés de plusieurs semaines afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique (plasma) pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement de durée variable selon le type de thérapie, allant de une à quatre semaines, par voie orale ou intrapéritonéale. Les animaux seront soumis à une présence humaine quotidienne afin d'observer leur état de bien-être et manipulés de façon hebdomadaire pour un suivi pondéral.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, une perte de poids, une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne par exemple. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir un gêne temporaire au niveau de la mobilité même si la douleur est inhibée avec l'analgésie. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque étude contenant plusieurs procédures. Pour les procédures suivantes: injedction intraveineuse, intrapéritonéale, orale ainsi que le prélèvement sanguin mandibulaire et jugulaire, les animaux seront gardés en vie pour continuer l'étude. Pour la procédure de prélèvement de sang par voie intracardiaque sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés sans réveil après la procédure.
Remplacement
Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans le développement leucémique et la résistance thérapeutiques, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier de façon fidèle les interactions entre la tumeur et son microenvironnement ainsi que son évolution au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro (notamment de co-culture) permettent d’obtenir une première compréhension des mécanismes, ils ne sont pas suffisants. Par exemple, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse in vitro et in vivo à l’AraC, rendant nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo.
Réduction
Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l'outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d'optimiser le nombre d'animaux et le nombre d'échantillons issu de l'animal.
Raffinement
L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des ainmaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites. La plupart des procédures décrites dans ce projet ont déjà obtenu l'accord d'un comité d'éthique pour l'expérimentation animale.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du cancer et du rôle de l’autophagie dans de nombreuses pathologies. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements et à la compréhension des fonctions de l’autophagie. Ils présentent des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Dans l’étude de la LAM, nous utilisons des souris immunodéficientes et immunocompétentes contrôle ou déficiente en autophagie systémique afin d’étudier l’importance de la composante immunitaire. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe leucémique. Le traitement au tamoxifène pour induire la délétion est également plus efficace à cet âge-là. De plus, les souris de cet âge sont moins susceptibles de ressentir la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Etude du microbiote et du métabolome chez le poulet de chair co-infecté par Campylobacter et Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
205 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont infectés par voie orale avec les bactéries Campylobacter et Salmonella, seules ou combinées, pour étudier leur effet sur le microbiote intestinal. Le porteur affirme que ces bactéries sont asymptomatiques chez le poulet et qu'aucun effet indésirable n'est attendu. Tous les animaux sont pourtant tués, par dislocation cervicale pour les poussins et par électronarcose puis saignée pour les plus âgés, afin de prélever leurs organes.
Objectifs
Campylobacter et Salmonella sont responsables des deux zoonoses bactériennes d’origine alimentaire majoritaires en Europe, avec respectivement, 220 682 et 87 923 cas humains en 2019 et la viande de volaille est identifiée comme principale source de contamination. Par ailleurs, au cours d’un précédent travail mené par le laboratoire, il a été montré in vitro que la présence de Salmonella permettait d'améliorer la survie de Campylobacter en condition aérobie. A notre connaissance, l'impact de la présence simultanée des deux bactéries n'a jamais été évalué chez le poulet de chair. Par ailleurs, si le microbiote gastro-intestinal est modifié lors de la contamination des poulets par l’une de ces deux bactéries, aucune étude n’a décrit sa modulation au cours d’une co-infection Salmonella / Campylobacter. Plusieurs études ont aussi démontré des modifications au niveau de l’ensemble des métabolites (petites molécules) présents dans le sérum de l’hôte à la suite d’une infection intestinale, en partie causées par l’altération du microbiote, mais aucune donnée n'est disponible pour le poulet de chair lors d'une infection ou co-infection par ces bactéries. Les objectifs de ce projet sont donc : (1) d'étudier si une interaction peut exister entre ces deux bactéries dans le tube digestif des poulets, et impacter les niveaux de colonisation de chacune d'elles ; (2) d'étudier l'effet d'une co-infection sur la composition et la structure du microbiote intestinal ; (3) explorer les modifications d’expression l’ensemble des métabolites présents dans le sérum de l’hôte en réponse à ces bactéries seules ou en co-infection.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de générer des données sur le comportement de Campylobacter et Salmonella en co-infection et leur impact sur le microbiote intestinal et l’ensemble des métabolites présent dans le serum du poulet de chair. Ces données n’ont jusqu’alors jamais été décrites, mais sont nécéssaires pour l’acquisition de connaissance sur leur comportement dans un système complexe prenant en compte leur niche écologique, afin d’adapter ou donner lieu au développement de nouveaux moyens de lutte. Plus précisément, les données nouvelles porteront sur : - le comportement de Salmonella et Campylobacter en co-infection chez le poulet de chair, et leur potentielle interaction. - la modulation du microbiote intestinal ainsi que les modifications de l’ensemble des métabolites sériques induites par une co-infection de Salmonella et Campylobacter chez le poulet de chair. - l’analyse conjointe des données hétérogènes issues de l’analyse du microbiote intestinal et des métabolites présents dans le sérum dans ce contexte de co-infection. -l'identification de potentiels biomarqueurs spécifiques aux infections par Salmonella et Campylobacter mais aussi à leur co-infection chez le poulet de chair
Procédures
Inoculation (per os) de Campylobacter jejuni contenu dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 1 à J1 Inoculation (per os) de Salmonella thyphimurium contenu dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 2 à J1 Inoculation (per os) de Salmonella typhimurium et Campylobacter jejuni contenus dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 3 à J1 Administration per os 100 µl de tryptone-sel pour le lot 4 à J1
Impact sur les animaux
Chez le poulet, Campylobacter jejuni est considérée comme une bactérie commensale, et est à ce titre asymptomatique. Il en est de même pour la souche de Salmonella typhimurium selectionnée. Par ailleurs, ces deux souches ont déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo au sein de notre laboratoire et aucun effet indésirable n’a jusqu’alors été observé. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, nous limiterons la manipulation d’animaux vigiles en réalisant les prélèvements de sang lors d’une saignée à la veine jugulaire après mise à mort. Il n’est donc attendu aucun effet indésirable tout au long de l’essai.
Devenir
Les prélèvements d’organes nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, par dislocation cervicale les jeunes poussins (poids < 250 g) et pour les poussins plus âgés et les poulets adultes après une anesthésie par électronarcose suivie d’une saignée à la veine jugulaire.
Remplacement
La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose et de salmonellose pour l’homme. Afin de lutter au mieux contre ces zoonoses, il est indispensable de mieux comprendre leur interaction avec les bactéries du microbiote intestinal et leur conséquence sur l’ensemble des métabolites (petites molécules dosées dans le sang) produits par l’hôte. Dans ce contexte, et en l’absence de lignée cellulaire ou d’organoïdes pouvant mimer l’intéraction des bactéries de la flore commensale aviaire avec Campylobacter et Salmonella, et leur impact sur l’ensemble des métabolites produits par l’hôte, l’utilisation de test in vitro ou in silico n’est pas possible. C’est pourquoi il est nécessaire de travailler sur un modèle intégré que seule le modèle in vivo permet. Afin de se rapprocher au maximum des conditions du terrain il convient de réaliser cette étude sur le poulet de chair qui est le premier réservoir de Salmonella et Campylobacter. Le poulet de chair est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure.
Réduction
Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En raison de la variabilité interindividuelle importante du microbiote intestinale, et afin d’évaluer au mieux l’évolution de ce microbiote caecal au cours du temps, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe était nécessaire pour chaque temps donné. Des tests de comparaison de moyennes seront effectués pour analyser les résultats des différents lots à chaque date de prélèvement. Des tests paramétriques (Student ou Anova) seront utilisés lorsque les critères de normalité et d’homogénéité des variances seront réunis. Sinon des tests non paramétriques (Kolgomorov-Smirnov ou Kruskall Wallis) seront utilisés.
Raffinement
Dans nos expériences précédentes, d’inoculation avec ces souches de Campylobacter jejuni et Salmonella Typhimurium utilisées, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés. Le protocole a été établi pour limiter au maximum le nombre de manipulation vigile. Ainsi l’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, les prélèvements de sang auront lieu lors de la saignée à la veine jugulaire après mise à mort des animaux et non sur animaux vivants. Aucun effet indésirable n’est donc attendu au cours de cet essai. Néanmoins, les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter. Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Quatre animaleries de type A2 seront utilisées en dépression (légère ou moyenne). Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol de 4 m² entourés par des panneaux grillagés en inox de 1 m de haut. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge. Afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie, des alvéoles en carton de plateaux d’oeufs seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires. Les alvéoles en cartons servent également d’éléments de grattage et de picotage. L’évolution pondérale sera obtenue par des pesées individuelles à l'installation des animaux dans les animaleries, et au moment des mises à mort.
Choix des espèces
La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose et de salmonellose pour l’homme. Afin de lutter au mieux contre ces zoonoses, il est indispensable de mieux comprendre leur interaction avec le microbiote intestinal et leur conséquence sur les métabolites sériques produits par l’hôte. Afin de se rapprocher au maximum des conditions du terrain il convient de réaliser cette étude sur le poulet de chair qui est le premier réservoir de Salmonella et Campylobacter. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 35 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre la modulation du microbiote et l’influence sur le métabolome à la suite d’une infection à J1 par Campylobacter, par Salmonella ou d’un coinfection Campylobacter + Salmonella
Développement et fonction du système olfactif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès la naissance, du matériel génétique est injecté dans leur cerveau, puis une fenêtre d'observation est implantée sur le crâne et une narine est obstruée, pour étudier le développement du système olfactif sous microscope. Le porteur indique que l'électroporation sous anesthésie par le froid entraîne une faible mortalité et que l'occlusion nasale gêne la respiration et l'olfaction. Les souris sont tuées par perfusion d'un fixateur dans le cœur pour conserver le cerveau.
Objectifs
L'olfaction joue un rôle majeur dans le comportement des animaux et leur adaptation à environnement. A ce titre, le système olfactif représente un modèle très attractif pour étudier une question centrale en neurosciences : comment le cerveau traite les signaux issus de notre environnement sensoriel et comment ces signaux influencent le développement neuronal. Au cours des dix dernières années, le développement d'approches d'imagerie fonctionnelle in vivo chez le rongeur a permis de commencer à comprendre ces différents mécanismes. Néanmoins, le manque de marqueurs et d'outils a empêché l’étude du développement du système olfactif et la délimitation de rôles précis pour plusieurs des populations neuronales impliquées. Le but de ce projet est de mieux comprendre le développement et le fonctionnement du système olfactif. Nous étudierons dans un premier temps le rôle de l’environnement sensoriel olfactif dans le développement du système bulbe olfactif. Nous nous intéresserons ensuite à la représentation neuronale des odeurs et de leur concentration dans le bulbe olfactif.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le role d'activité sensoriel dans le développement cérébral en condition physiologique. Cela nous permettra également de mieux comprendre comment la concentration des odeurs est codées dans le cerveau.
Procédures
Pour la partie 1 (40 animaux), du matériel génétique est injecté le jour de la naissance dans le cerveau. Quatre semaines plus tard, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Une narine est également obstruée à ce moment. Les animaux sont ensuite observés toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Cette observation dure moins d'une heure. Pour la partie 2 (40 animaux), du matériel génétique est injecté le jour de la naissance dans le cerveau. Quatre semaines plus tard, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Une narine est également obstruée à ce moment. Les animaux sont ensuite observés toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Cette observation dure moins d'une heure. Au bout de 4 semaines d'observation la narine est débouchée. Les animaux sont alors observés à nouveau toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Pour la partie 3 (50 animaux), dans une période comprise entre 2 et 12 mois, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Après une semaine de récupération les animaux commencent à être enregistrés « tête-fixée » anesthésiés (injection combinée de xylazine (10 mg/kg) et de kétamine (100 mg/kg) par voie intrapéritonéale (0.1ml pour 10g) sous le microscope lors de session durant au maximum 1h et où ils sont exposés brièvement à des odeurs pendant 3s (x 6 concentrations, 40 secondes entre les concentrations) et jusqu’à 3 odeurs différentes (total 54 stimulations). Pour mesurer la stabilité des réponses aux odeurs dans le temps, les animaux sont placés à nouveau sous le microscope sous anesthésie 1 jour, 1 semaine et 1 mois plus tard.
Impact sur les animaux
L’électroporation in vivo sur de jeunes animaux postnataux est exécutée sous anesthésie par le froid qui peut malheureusement induire un très faible taux de mortalité. Consécutif à l’implantation d’une fenêtre crânienne la présence d’une barre de contention pourra potentiellement entrainer une gêne dans les mouvements des animaux. L’occlusion nasale unilatérale entrainera une gène au niveau respiratoire et une perturbation de l’olfaction.
Devenir
Les cerveaux des animaux sera conservés pour analyse complémentaire potentiel. La burprenorphine (0.05mg/kg, en SC) est injecté 30 minutes avant une anesthésie profonde à l’aide d’un mélange ketamine (150 mg/kg) et xylazine (15 mg/kg) par IP puis d’une perfusion de para-formaldéhyde par voie intracardiaque » »
Remplacement
L’étude du système olfactif, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peut pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme.
Réduction
Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. -la méthode d’électroporation et les vecteurs d’expression ont été optimisés pour limiter le nombre d’animaux. -Les étapes de validation fonctionnelle générant des résultats quantitatifs utiliseront des outils statistiques (p
Raffinement
-L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. -Enrichissement des cages avec des carrés de coton et des bâtons de bois. -Hébergement des animaux en groupes sociaux. -Chaque intervention chirurgicale ( chirugie cranienne, occlusion nasale) est réalisée sous anesthésie générale (ketamine 125 mg/kg + xylazine 12,5 mg/kg par IP) en présence d’analgésique : analgésie locale (Lidocaine) lors de l’injection d’ADN avant électroporation in vivo ou lors de l’occlusion nasale. Analgésie générale : Dès la fin de la chirurgie, les animaux reçoivent par injection sous-cutanée, du carprofène (10mg/kg). Cette injection est renouvelée pendant 3 jours. -Pour la perfusion intracardiaque, pour éviter toute souffrance, la buprénorphine (0.05mg/kg, en SC) est injectée 30 minutes avant la perfusion et les doses de Ketamine/Xylazine (150 mg/kg et 15 mg/kgrespectivement) utilisées pour anesthésier les animaux sont sub-létales (et la procédure n’est enclenchée qu’après s’être assuré que l’animal est sans réaction. -Etablissement des points limites les plus précoces possibles. En cas d'infection de la narine de la pommade antibiotique dermaflon est appliquée pendant plusieurs jours. -en cas d’observation de souffrance les animaux seront injectés avec la buprénorphine (0.05mg/kg, en SC) de façon journalière. Si la souffrance persiste malgré la buprénorphine ou après 3 jours de traitement à la buprénorphine alors l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
L’étude du système olfactif, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal comme la souris peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d'étudier le développement et la fonction du système olfactif. Notre projet utilisera des animaux à partir de la naissance et jusqu'à 12 mois. Il semble qu'il y ait une diminution des performances olfactives passé cet age.
Caractérisation des déterminants physiologiques de la circulation intra-parenchymateuse du liquide cérébro-spinal et influence des agents anesthésiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit jusqu'à quatre chirurgies sous anesthésie générale, avec pose d'une prothèse crânienne et d'une canule dans le cerveau, pour mesurer l'effet de différents anesthésiques sur la circulation du liquide cérébro-spinal. Le porteur indique un risque de douleur lié aux chirurgies et de stress lié aux examens sur animal vigile. Il précise que la lourdeur des interventions interdit toute réutilisation, réhabilitation ou adoption, tous les animaux étant euthanasiés pour une étude histologique du cerveau.
Objectifs
L'hypothèse de travail de ce projet est que les agents anesthésiques ont une influence sur le fonctionnement du glymphatique et que cet effet est dépendant de l'agent hypnotique utilisé et/ou de ces conséquences pharmacodynamiques. Dans ce projet, nous avons pour objectif de déterminer et de quantifier l'effet sur la circulation intra-cérébrale du liquide cérébro-spinal (LCS) de différents agents anesthésiques ayant tous un pouvoir hypnotique mais dont le mode d'action et les cibles cérébrales sont différentes.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont un effet non univoque de l'anesthésie générale sur la circulation intra-cérébrale du LCS dépendant de l'agent anesthésique utilisé et de ses conséquences physiologiques. Cet effet étant, selon nous, très dépendant de ces mêmes conséquences pharmacodynamiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont: - sur le plan pré-clinique: une meilleure connaissance des mécanismes influençants la circulation intra-cérébrale du liquide cérébro-spinale. Cette approche fondamentale est essentielle au développement d'hypothèses physiopathologiques qui permettraient le développement d'éventuelles propositions de prévention ou de thérapeutiques. - sur le plan clinique: cette approche pharmacodynamique des agents anesthésiques est inedite et originale. In fine, nos conclusions pourraient jouer un rôle en pratiques cliniques avec la determination de protocoles d'anesthésies dont les agents anesthésiques choisis seraient les moins à risque d'aggraver le pronostic de patients dont le système dit glymphatique semble déjà compromis, comme dans l'hémorragie méningée ou la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Procédures chirurgicales: maximum 4 procédures par animal, toutes réalisées sous anesthésie générale, durée moyenne d'une procédure: 15min. Les procédures: mise en place d'une prothèse crânienne, mise en place d'une canule intra-cisternale, mise en place d'une voie veineuse périphérique, mise en place d'un catheter de pression artérielle invasive (groupe contrôle). Procédure vigile: imagerie vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux sont exposés au risque de douleur en lien avec les procédures chirurgicales, au risque de stress lié aux manipulations et aux examens réalisés en vigile. Ce protocole considère ces risques et prévoit les prises en charge à réaliser en fonction des situations possibles.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à l'issu des procédures en raison d'une étude histologique cérébrale prévue. Tous les animaux de ce projet vont subir des procédures de classe sévère avec notamment la mise en place d'une prothèse crânienne et d'une canule intra-cisternale n'autorisant ni à les réutiliser ni à les replacer ni à les proposer à l'adoption.
Remplacement
Ce projet n'est à l'heure actuelle pas remplaçable par un autre modèle expériemental que l'animal. La complexité des mécanismes sous-tendant la physiologie cérébrale ne peuvent être reproduit par un modèle informatique ni par un modèle in vitro. Le caractère expérimental et invasif rend impossible ce projet sur volontaire humain. La souris est par ailleurs l’animal indiqué pour cette expérimentation. C’est chez cette espèce que l’existence du système glymphatique a été montrée et que son fonctionnement a été le plus étudié. La physiologie cérébrale est également parfaitement connue chez cette espèce et comparable à celle du cerveau humain dans ces grands principes. Enfin, la méthodologie expérimentale requise par ce projet est également parfaitement décrite dans la littérature pour le modèle murin.
Réduction
Ce projet nécessite 160 souris. Nous avons calculé ce nombre de sujet nécessaire qui permettrait l’obtention de résultats significatifs à partir de nos données locales, en y ajoutant des pertes estimées de 10% (échec de la procédure) et en tenant compte du principe de réduction du nombre d'animaux. Il s’agit donc du nombre maximum d’animaux prévus pour ce projet ; en l’absence d’échec le nombre minimum est de 148 animaux.
Raffinement
Ce protocole a été pensé et organisé afin d’optimiser l’expérimentation sans minimiser nos chances d’obtenir des résultats significatifs. Les principes éthiques et les standards de raffinement y sont respectés de la naissance à la mort de l’animal : le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel formé. Ils seront hébergés dans des locaux agréés où température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux) et durée du cycle de lumière inversé (12h/12h) sont maitrisées. La réalisation des procédures sera réalisée durant la phase d'activité physiologique de l'animal. L'alimentation et l'eau seront fournies ad libidum. Le raffinement de nos procédure sera assuré par un souci constant du confort et de l’analgésie des animaux, notamment : l’hébergement de tous les animaux dans des cages standards aux normes européennes. L’habituation à la manipulation sera engagée précocement afin de réduire le stress lié au contact avec l’homme avant le début du protocole. Une analgésie efficace sera garantie avec le recours à un antalgique morphinique de durée d’action longue associé à un antalgique non morphinique, le paracétamol, et à des mesures non pharmacologiques telles qu’un environnement enrichi avec de la ouate en post-opératoire. L’hébergement post-opératoire sera réalisé en cage individuelle après la pose de la prothèse crânienne afin de prévenir tout risque d’arrachement du matériel en lien avec une bagarre entre animaux. Cet hébergement isolé sera enrichi et d’une durée la plus réduite possible avant la procédure (10 jours maximum) afin de prévenir le stress chez un animal isolé. L’accès à l’eau et à la nourriture sera adapté au besoin (croquette dans une coupelle humide). Les souris, préalablement habituées à la manipulation, seront habituées à la contention et au bruit de l’IRM durant 6 jours avec des durées croissantes (de 10 minutes à 60 minutes) afin de diminuer leur stress lié à l’expérimentation. Des bouchons d’oreilles seront placés afin de limiter le bruit de l’appareil. Ajouté à ces précautionsont été défini des points limites adaptés à chaque étape de notre protocole avec une escalade des prises en charge aboutissant à la mise à mort de l’animal en cas de détresse ou souffrance ne pouvant être soulagée dans des délais brefs.
Choix des espèces
La souris Swiss est le meilleur compromis entre remplacement et pertinence. Sans reprendre les agruments avancés plus haut, ses caractéristiques physiologiques et anatomiques parfaitement connues, son poids et sa taille classiquement supérieurs à ceux d'autre souche, la facilité d'un abord vasculaire et trachéal et son hétérogénéité génétique en fond un candidat de choix pour ce projet. Les expériences seront réalisées chez des animaux de 8 semaines, ce qui correspond à un stade jeune adulte, âge auquel le système glymphatique est considéré mature et pleinement efficient. Ils seront commandés à 6 semaines pour anticiper les étapes d'habituation à la manipulation et à la contention.
Caractérisation d’un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire liée à SPG4 en vue d’une thérapie.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées à l'issue et une partie conservée pour la reproduction de la lignée. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur AAV censé rétablir la protéine spastine, avec des prélèvements de muscles et de sang sous anesthésie, pour caractériser un modèle de paraplégie spastique héréditaire. Le porteur indique que l'injection n'est pas censée nuire, mais qu'une bulle d'air pourrait provoquer une mort instantanée et que l'effet des vecteurs reste mal connu. Les animaux sont ensuite tués par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque pour les analyses.
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires (PSH) sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par une spasticité et une faiblesse des membres inférieurs. Ce groupe de maladies, a une prévalence dans le monde de 5 pour 100 000 personnes et est lié à des mutations sur plus de 90 gènes qui peuvent avoir de fonctions et localisations différentes au sein de la cellule. La majorité des cas (40%) de PSH à transmission autosomique dominante sont dû à des mutations d’un gène nommé SPG4 qui code pour la protéine spastine dont la fonction principale est de couper les microtubules. Le gène SPG4 grâce à deux codons d’initiation, code pour deux isoformes de la protéine : une forme longue et une forme courte avec différentes localisations subcellulaires. Les défauts d’expression de la spastine, dus à ses mutations, se traduisent par une axonopathie des motoneurones supérieurs au niveau de la moelle épinière qui cause la pathologie. Bien que le mécanisme moléculaire de la spastine soit bien documenté les véritables causes qui amènent à la pathologie ne sont pas connues. A ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible. Le but de ce projet est de développer une approche de thérapie génique afin de rétablir l’expression d’une protéine spastine fonctionnelle qui permettrait de corriger les symptômes de la maladie.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun traitement n’existe pour les paraplégies spastiques héréditaires. Les objectifs ainsi que les bénéfices de ce projet sont multiples : tout d’abord éclaircir sur l’implications d’autres protéines partenaires de spastine dans l’évolution de la maladie. En absence d’un traitement efficace pour corriger les symptômes, le deuxième objectif est de développer une stratégie thérapeutique qui rétablirait une expression de la spastine fonctionnelle à l’aide d’un vecteur AAV. Le bénéfice pourrait se traduire par l’amélioration des signes pathologiques chez le modèle murin SPG4-KO ce qui apporterait une preuve de l’efficacité de cette approche pour traiter des patients et améliorer leurs conditions de vie.
Procédures
Dans la PE1: mise à mort par dislocation cervicale. Dans la PE2: une seule injection intraveineuse d’AAV via la veine caudale. Au cours de la PE2 des prélèvements ante-mortem des muscles et du sang seront effectués sous effet anesthésique de la souris. Mise à mort par dislocation cervicale pour les analyses biochimiques et moléculaires et perfusion intracardiaque à l'aide d'une pompe pour les analyses histochimiques.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors du projet sont liés à l’acte de l’injection nécessaire pour administrer la thérapie mais cette procédure n’est pas censée induire d’effets négatifs. Néanmoins, dans le cas où l’injection comporte l’introduction imprévue d’un bulle d’air comme effet indésirable, il pourrait y avoir une mort instantanée de l’animal. Un autre effet indésirable pourrait être causée par l’expression de la protéine spastine par le biais des deux vecteurs administrés dont nous n’avons pas des informations.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les animaux seront gardés pour d’autres accouplements ou mis à mort si les accouplements ne sont plus nécessaires. A la fin de la procédure 2, tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque à l'aide d'une pompe afin d’effectuer les prélèvements des organes et faire les analyses post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas de moyen de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’étude d’une stratégie thérapeutique dont l’administration ne peut faire que par voie systémique et qui peut avoir des conséquences sur son efficacité à traiter correctement les symptômes. Une étude sur des cultures primaires de neurones issus de souris SPG4-KO ou d’autres modèles cellulaires déficient en spastine, peuvent permettre uniquement une meilleure compréhension de la physiopathologie et la confirmation/identification de certains marqueurs moléculaires pour cette pathologie. Ces marqueurs ont été préalablement identifiés à la fois dans des modèles cellulaires d’origine humaine ou la protéine spastine a été réduite/supprimée par siRNA et ainsi que dans le cerveau et la moelle épinière des modèles murins.
Réduction
Les souris hétérozygotes (SPG4-HE) issues des croisements seront utilisées pour les croisements nécessaires au maintien de l’élevage. Les paraplégies spastiques héréditaires affectent indifféremment les hommes et les femmes : des souris des deux sexes seront donc utilisées. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés par groupe, le nombre de souris nécessaire a été estimé à 224 souris par une étude statistiques prédictive (test paramétrique unilatéral de comparaison des moyennes) suite à la compilation des données en littérature avec des expériences précliniques issues de notre équipe. Des tests in vitro ont été préalablement réalisés afin de tester plusieurs cassettes d’expression et de n’en sélectionner que 2 pour l’application in vivo. A notre connaissance, notre étude serait la première à tester la piste thérapeutique avec AAV pour les PSH-SPG4 et permettrait non seulement de valider la stratégie de thérapie génique mais aussi de vérifier l’absence d’effets secondaires inattendus. Nous avons aussi décider de réduire à deux temps d’analyses notre étude afin de regarder les effets à court terme (3 mois post injection) et à plus long terme (11 mois post injection).
Raffinement
Raffinement pour les animaux injectés avec des vecteurs viraux. Les procédures ne sont pas censées induire d’effets négatifs. Cependant, c’est la première fois qu’une injection de vecteurs pour remplacer l’expression de la protéine Spastine sera faite dans ce modèle. C’est pourquoi l’observation et le suivi de poids sera effectué deux fois par semaine pendant 15 jours post-injection puis une fois par semaine. Concernant les prélèvements de muscles et de sang dans la PE2 , les prélèvements seront anticipés par l’administration d’une anesthésie et la profondeur de l’anesthésie sera contrôlée avec le début de l’acte chirurgical (absence de réflexe palpébral, absence de réflexe de retrait ou pincement de la queue et présence d’une respiration affaiblit (fréquence respiratoire 55-65/min) et essentiellement abdominale). Pour l’infusion cardiaque, elle sera précédée d’une injection par voie sous-cutanée d’un mélange de deux anesthésiques à raison de 100µl/20g de poids: la kétamine (aux propriétés anesthésiques et analgésiques (100 mg/kg,Virbac, Carros)) et la xylazine (aux propriétés anesthésiques, sédatives, myorelaxantes et analgésiques (10 mg/kg, Rompun® 2%, Bayer)). La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée avec le début de l’acte chirurgical (absence de réflexe palpébral, absence de réflexe de retrait ou pincement de la queue et présence d’une respiration affaiblit (fréquence respiratoire 55-65/min) et essentiellement abdominale). Nous estimons qu’il faut environ 2 minutes pour l’installation de l’animal sur le plan de travail. Puis le temps passé entre l’ouverture de la cage thoracique et le début de la perfusion est estimé à 1 minute suivi par une perfusion intracardiaque d’une solution au PBS puis du fixateur au PFA, qui sera réalisée dans les 5 minutes selon la taille de la souris. L’opérateur pourra suivre l’efficacité de la procédure via l’observation de l’animal : la correcte fixation de l’aldéhyde aux nerf et aux muscles sera évidente par un tremblement des extrémités. Pour l’ensemble de la PE2: avant toute anesthésie, un examen préopératoire sera effectué pour vérifier l’état de l’animal qui sera ensuite pesé afin de calculer la dose exacte d’anesthésiant/analgésique à injecter. De plus le stress des animaux en attente sera évité car ces procédures seront réalisées dans une pièce à part.
Choix des espèces
Le modèle murin SPG4-KO reproduit des phénotypes pathologiques spécifiques qui ont été aussi observés chez l’homme. Ce modèle ainsi que d’autres, selon les données en littérature disponibles à ce jour, reproduisent des signes tels que l’apparition des dilatations axonales au niveau de la moelle épinière, des défauts de comportement moteurs ainsi qu’une augmentation de nombre de cellules gliales dans le cortex. La correction de l’ensemble ou d’une partie des défauts pathologiques pourra être utile pour estimer l’avantage de ce type d’approche thérapeutique pour le traitement de paraplégies spastiques liées au gène SPG4. Dans la première procédure expérimentale nous allons mettre en accouplement des souris hétérozygotes pour SPG4 (SPG4-HE). Les souris seront mises en accouplement entre l’âge de 6 semaines et de 6 mois. Il n’y a pas de point limite à prendre en compte car les souris SPG4-HE ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans la deuxième procédure expérimentale nous allons utiliser des souris SPG4-KO âgées de quatre semaines, avant l’apparition des premières manifestations pathologiques (4 mois) afin d’étudier l’expression de la protéine spastine, leur bio-distribution et le niveau d’expression de la protéine SPG4 dans les tissus d’intérêt mais aussi sélectionner la dose optimale des vecteurs afin d’avoir un niveau d’expression physiologique de la protéine d’intérêt. Le phénotype de ces animaux n’est pas dommageable mais les points limites seront surveillés dans le cadre des injections.
Mécanismes physiologiques des effets du soluté de lactate de sodium molaire sur la fonction cardiaque et énergétique au cours du sespis
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance qualifiés de légers à sévères. Un choc septique est provoqué par ligature et ponction du cæcum au cours d'une laparotomie, avec pose d'un cathéter dans la jugulaire, pour étudier les effets du lactate de sodium sur la fonction cardiaque. Le porteur indique que le processus inflammatoire peut conduire à une défaillance multiviscérale. Les rats sont ensuite euthanasiés pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les travaux de notre laboratoire ont mis en évidence les effets bénéfiques du lactate en situation septique, nous n’avons pas pu explorer les mécanismes sous-tendant ces effets. L’objectif de présent projet expérimental est donc d’explorer ceux-ci par des approches in vivo et ex vivo.
Bénéfices attendus
Pour les patients atteints d'une pathologie, lié à une septicemie, les résultats préliminaires de notre étude apporteront une meilleure prise en charge thérapeutique, par l'amélioration de la compréhension des mécanismes pathologiques en jeu et du bénéfice d'un traitement au lactate.
Procédures
Les animaux auront une opération chirurgicale, de type"laparotomie", en vue de réaliser une ligature et une ponction caecale, pour l'induction d'un choc septique. De plus, nous ferons une cervicotomie, dans le but de poser un catheter sur la jugulaire droite, dans un but de perfusion. La durée totale de cette chirurgie sera de 30 minutes.
Impact sur les animaux
les nuisances principales sont principalement un processus inflammatoire, pouvant conduire à une défaillance multiviscérale.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés (Euthoxin en IP), afin de réaliser les prélèvement d'organes
Remplacement
Ce projet se propose d’étudier l’impact du lactate de sodium molaire au cours du sepsis expérimental induit par ligature et perforation caecale (CLP), dans des conditions de physiologie et de physiopathologie intégrées. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est optimal et minimal pour l'analyse et les outils statistiques.
Raffinement
Les données obtenues chez des animaux témoins (non-opérés) ou contrôles seront réutilisées autant que possible dans des études complémentaires ultérieures. Par exemple, des échantillons d’organes et des coupes histologiques seront préservés dans le laboratoire pour être réutilisés au cours d’autres protocoles. Les animaux seront observés régulièrement pendant les 6 premières heures suivant la chirurgie puis 1 fois par jour durant toute la durée du maintien en vie (1 mois). Les deux critères permettront indépendamment l’un de l’autre de définir des points limites pour cette étude. A savoir : 1 - une perte de poids importante (10% du poids du corps), des signes physiologiques ou comportementaux fortement modifiés, ou l’apparition d’une infection urinaire sévère modifiant la diurèse, 2 – un score (grimace sclae) basé sur l’expression faciale supérieur à 4. Une observation quotidienne sera tout de même effectué, afin d'oberver les animaux et d'utiliser l'outil de diagnostic , basé sur "le grimace scale": Définition de l'indice grimace faciale ou grimace scale; il est basé sur l'observation de 4 caratéristiques faciales marquant la souffrance , à savoir le resserrement orbital, le renflement du nez ou le renflement des joues, la position des oreilles et le changement des vibrisses. chaque signe clinique établi un score, voici le tableau définissant la méthode: 0-aucun signe De 1 à 3 : signes modérés, a ce stade, l'administrtion de morphinque sera réalisé (Buprecare), afin de limitre la souffrance. A partir de 4: ces signes évidents de caractéristiques de la souffrance, nous conduisent à l'euthnasie de l'animal ( une injection d'une dose léthale d'Euthoxin sera réalisé en IP)
Choix des espèces
Nous allons utiliser pour ce projet des rats de souche wistar. Ce choix se justifie par l’abondante littérature basée sur le sepsis expérimentale et l’expérience du laboratoire. Les animaux adultes mâles (10+/-2 semaines) seront utilisés à un poids compris entre 400 et 500g afin de faciliter la procédure expérimentale.
Création d’un modèle tumoral orthotopique pancréatique chez des souris CD169-DTR
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie pour accéder au pancréas et y créer une tumeur, ainsi que trois injections intrapéritonéales, pour étudier le stroma de l'adénocarcinome pancréatique. Le porteur indique des risques d'infection, d'hypothermie liée à la durée de la chirurgie et d'effets digestifs de la tumeur. Toutes les souris sont tuées pour prélever des organes vitaux.
Objectifs
L’adénocarcinome pancréatique (ADK) qui a un taux de survie global de 2-9%, est actuellement la quatrième cause principale de décès liés au cancer dans le monde industrialisé et d’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunités de traitements thérapeutiques. La plupart des approches thérapeutiques jusqu’à présent se sont intéressées à cibler directement les cellules tumorales et ont jusqu’à récemment, ignoré les réactions stromales adjacentes qui sont une des caractéristiques importantes des cancers pancréatiques humains. Depuis quelques années, le dépôt de ce stroma massif a émergé en tant qu'acteur nouveau et contributeur dans l'initiation et la progression pancréatique de la tumeur. Il a été mis en évidence la présence d’une sous-population cellulaire souche péricytaire dans le stroma du pancréas de souris atteintes d’ADK. Ces cellules ont été isolées et mises à proliférer en culture pour établir une lignée permettant son étude. Par ailleurs, il a été montré une augmentation significative de macrophages spécifique dans différents modèles de cancer pancréatique. Cette population a été décrite comme pro-tumoral dans le cancer du sein et du poumon. Nous pensons que ces macrophages spécifique jouent un rôle important dans la mise en place de l’immunosuppression présente dès le début du cancer pancréatique en étant recrutés et programmés par les cellules entourant le cancer, notamment les cellules stromal. Nos objectifs seront 1) de dépléter ces macrophages spécifiques via l’utilisation de souris génétiquement modifiées 2) D’étudier cette déplétion au niveau de la masse tumorale mais aussi de l’infiltrat immunitaire.
Bénéfices attendus
On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en croissance dans les pays développés. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux (Thérapie ciblée, immunothérapie, chimiothérapie). L’accès des traitements antitumoraux au sein de la tumeur est empêché par la nature du microenvironnement qui soutient les cellules cancéreuses mutées. Ce microenvironement est modifié par les macrophages. Ces derniers représentent près de 40% des cellules immunitaires infiltrées, comprendre le rôle d’une population potentiellement immunosuppressive de macrophages permettrait de développer de futur traitement contre le cancer du pancréas.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale ainsi qu’une procédure chirurgicale de laparotomie permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à 3 injections intra-péritonéale 1 avant la chirurgie, 2 après la chirurgie, chacune dure environ 1 minute. Chaque souris sera soumise à une laparotomie permettant d’accéder au pancréas. La durée estimée est entre 15 et 20 minutes.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables dues à l’injection intra-péritonéale peuvent être ressentis. Les autres principaux risques sont l’infection due à la chirurgie ainsi que l’hypothermie due à la durée de l’acte chirurgicale. Également, la tumeur peut avoir des effets sur la souris, notamment sur son système digestif.
Devenir
L’ensemble des animaux étant soumis aux procédures seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Des études in vitro ont préalablement été effectué afin de déterminer le rôle des cellules stromal dans la différenciation des macrophages spécifique ainsi que le rôle de ces macrophages spécifique. Ainsi, l'utilisation d'un modèle murin afin de vérifier si ces observations ont lieu dans un environnement complexes ne peut être remplacé.
Réduction
Le nombre de souris sera réduit à minima pour permettre une analyse statistique et l’obtention de conclusions interprétables qui conduiront à ne pas répéter les expériences que nous mettons en place sur les animaux.
Raffinement
Afin de respecter le bien-être animal, les souris sont dans des cages avec un milieu enrichi et du coton pour qu’elles se fassent un nid (quotidien de l’animalerie). Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Les animaux seront observés au minimum 3 fois par semaine durant la durée de l’expérience afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse et ainsi améliorer leur bien être Afin de maximiser l’obtention des données scientifiques et raffiner nos approches expérimentales, nous établirons un suivi attentif des souris et fixerons des points limites pour réduire au maximum la souffrance des animaux et éviter l’apparition de tout signe de souffrance Dans ce cadre, un analgésique sera également utilisé dans les procédures de chirurgie afin d’enrayer la douleur chez l’animal.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études en cancérologie du fait de l’existence de nombreux modèles bien caractérisés. Spécifiquement, il n’existe pas d’autre espèce que la souris permettant une déplétion conditionnelle des macrophages spécifique. Les souris adultes de 6 semaines ayant un système immunitaire compétent et un pancréas développé et fonctionnel seront utilisées pour ce projet.
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle de cicatrisation de la peau
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
2700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est d'abord induit chez des souris NOD SCID, puis les mêmes animaux servent à un modèle de cicatrisation cutanée, avec des prélèvements sanguins répétés et une biopsie de peau. Le porteur indique que la biopsie cutanée provoque des douleurs inflammatoires. Les animaux sont tués en fin de protocole pour prélever la peau des plaies et analyser l'effet de molécules candidates.
Objectifs
Le processus de cicatrisation des plaies est complexe et dynamique et souvent multifactoriel qui implique des phases coordonnées et superposées, notamment la coagulation, l'inflammation, la prolifération et le remodelage visant à restaurer la fonction barrière et l'intégrité mécanique de la peau. Nous savons aujourd’hui que le diabète ralentit la cicatrisation des plaies, rendant le processus de guérison plus difficile que la normale. Cet état entraine en même temps une plus grande prédisposition au développement de plaies chroniques (délai de cicatrisation allongé, au delà de 4 semaines). En France, plus de 20.000 patients diabétiques porteurs de plaies, sont hospitalisées chaque année et près de 8.000 seront amputées d’un membre inférieur. L’objectif de ce projet est d’étudier de nouvelles molécules susceptibles d’accélérer la cicatrisation des plaies chez des souris contrôles non diabétiques en comparaison avec des souris diabétiques afin de réduire les complications liées au diabète qui sont couteuses sur le plan humain et économique.
Bénéfices attendus
Nous savons aujourd’hui que le diabète ralentit la cicatrisation des plaies, rendant le processus de guérison plus difficile que la normale. Cet état entraine en même temps une plus grande prédisposition au développement de plaies chroniques. La phase préclinique consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur qui est une étape essentielle dans le développement de médicaments à visée thérapeutique. Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules sur le processus de cicatrisation (molécules aux propriétés cicatrisantes, réparatrices ou agissant sur le remodelage tissulaire ou la migration cellulaire) chez des souris diabétiques en comparaison avec des souris non diabétiques afin de réduire les complications liées au diabète.
Procédures
Prélèvements au jour 0, 5, 10, 15 et 20 au niveau de la veine caudale ou submandibulaire (20μL; durée du prélèvement 5-10 secondes) afin de suivre l'évolution de la glycémie durant 20 jours environ chez les souirs NOD SCID (Procédure 1). Prélèvements de sang rétro orbital (500μL; durée du prélèvement 30 secondes) sous isoflurane (2%) juste avant la mise à mort (Procédure 2)
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées à la biopsie cutanée. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation.
Devenir
Les animaux de la Procédure 1 "Induction du diabète de type 1 chez les souris NOD SCID" sont tous réutilisés dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation". Tous les animaux de la Procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation" sont mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de prélever la peau au niveau des plaies pour effectuer une analyse histologique, des dosages de cytokines, qPCR. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées.
Remplacement
Remplacement : le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de l’inflammation et de la cicatrisation ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Le processus de cicatrisation des plaies est complexe et dynamique et souvent multifactoriel qui implique des phases coordonnées et superposées, notamment la coagulation, l'inflammation, la prolifération et le remodelage visant à restaurer la fonction barrière et l'intégrité mécanique de la peau. Le système vasculaire et de nombreux types cellulaires, cytokines et médiateurs sont impliqués dans ce processus. Les modèles animaux de cicatrisation sont indispensables pour la compréhension de la physiopathologie de la maladie et la validation préclinique des composés. Des études préliminaires in vitro peuvent être réalisées sur des kératinocytes afin de sélectionner des candidats médicaments mais dans ce projet l'animal est indispensable pour relier cicatrisation et diabète.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé pour déterminer les différences entre chaque groupe va changer selon la distribution des échantillons : - Si les échantillons suivent une loi Normale : l’ANOVA de rang suivi d’un post test de Bonferroni sera effectué. - Si les échantillons ne suivent pas une distribution normale : le test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post-test de Dunns de comparaison multiple sera utilisé.
Raffinement
Les plaies seront effectuées sous anesthésie générale xylazine/kétamine et une injection de lidocaine sera effectuée quelques minutes avant la réalisation des plaies. Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être des animaux et pour détecter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux montrent des signes de souffrance (point limite décrit dans la Procédure), de la buprénorphine ou le la Tolfédine pourront être administrées (si score cumulé de 2 atteint) ou ils seront mis à mort (si score cumulé atteint 4 ou si un des scores atteint 2 pour un même critère). Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron ainsi que du Sizzle-Nest en continu dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris C57BL/6 ou BALB/c est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Ces souches sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les souris BALB/c offrent une réponse immunitaire exacerbée ce qui permet une meilleure quantification des molécules exprimées lors de cette réponse. De plus nous utiliserons des souris NOD SCID rendues diabétiques car il a été démontré l'impact de ce paramètre sur la cicatrisation dans plusieurs articles. Cette lignée immunodéficiente n'a pas de phénotype dommageable autre que le diabète développé après induction au STZ. Notre modèle est développé à partir de données littéraires permettant de réduire le nombre d'études de mise au point. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation" afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’inflammation et son mécanisme, une souris juvénile ou trop âgée induira un biais dans l’expérimentation. Les animaux de la procédure 1 "Induction du diabète de type 1 chez les souris NOD SCID" pourront être utilisés à partir de 5 semaines pour bénéficier d'animaux qui auront minimum 7 semaines dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation".
Radiothérapie X d’un modèle d’épilepsie focale chez la souris par irradiation fractionnée spatialement
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour être réutilisées dans d'autres enregistrements. Rendues épileptiques, elles sont irradiées par microfaisceaux de rayons X sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, pour tester une alternative à la chirurgie du foyer épileptique. Le porteur indique qu'un animal perdant plus de 20 % de son poids ou présentant une akinésie est mis à mort, et qu'un surdosage d'irradiation entraîne aussi l'euthanasie. Les bénéfices annoncés pour les patients épileptiques restent renvoyés à une éventuelle application chez l'humain.
Objectifs
Le traitement pharmacologique des différents types d’épilepsie est complexe et doit répondre au mieux aux différents types de crises présentées par les patients. Il n’est efficace que chez 70 % des patients. L’épilepsie Mésio-Temporale (MesioTemporal Lobe Epilepsy ou MTLE) est la forme d’épilepsie focale la plus fréquente en clinique parmi celles qui ne répondent pas aux traitements pharmacologiques par les anti-épileptiques de référence. La MTLE est le plus souvent caractérisée sur le plan histologique par une sclérose de l’hippocampe (dispersion des cellules granulaires du gyrus denté et mort des neurones pyramidaux au niveau de la corne d’Ammon, CA1 et CA3). La résection chirurgicale du foyer épileptique ou zone épileptogène (ZE) est l’unique possibilité, à l’heure actuelle, de guérir les patients atteints de MTLE. Cette chirurgie nécessite une craniotomie pour enlever le foyer épileptique. C’est une méthode efficace dans 50 à 70 % des cas, mais qui comporte plusieurs risques (infection, effets secondaires, troubles cognitifs) et représente un coût hospitalier important (plus de 10 jours d’hospitalisation et suivi pendant plusieurs mois). L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013). L’objectif de ce projet est donc de développer sur un modèle de MTLE chez la souris (Riban et al, 2002 ; Heinrich et al, 2011) un protocole de MRT qui permette de rendre moins invasive la prise en charge des patient atteints d’une épilepsie focale.
Bénéfices attendus
L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013).
Procédures
- Pendant l’irradiation les souris seront anesthésiées et, après vérification de l’absence de réflexe du retrait de la patte, elles seront fixées dans un cadre stéréotaxique afin d’éviter tout mouvement de la tête et les précautions suivantes seront prises afin de limiter le stress et la douleur: - Anesthésie générale: Kétamine + Xylazine (voir ci-dessous) d’environ 40 min. - Anesthésie locale: baume à la lidocaïne 2% au niveau des oreilles.
Impact sur les animaux
Comme le développement d’une épilepsie et le traitement par MRT peuvent altérer la prise alimentaire, notre point limite se basera à la fois sur le poids de l’animal et sur son comportement général. Un animal sera immédiatement euthanasié si l’un des signes suivants est observé: perte de poids > 20% du poids mesuré le jour de l’irradiation, akinésie, rotation (voir Annexe 3). La radiothérapie peut être une source de souffrance si la dose délivrée est trop élevée. Les choix concernant les champs d’irradiation et les doses délivrées à la peau ont donc été effectuées en fonction des connaissances actuelles et de notre expertise. En cas d’erreur ou de problème technique au moment de l’irradiation d’un animal et notamment de surdosage, l’animal sera euthanasié immédiatement par surdosage de pentobarbital (150 mg/kg). Après radiothérapie, des effets secondaires invalidants (hyper ou hypo-locomotion, modification de la prise de nourriture, nécrose de la peau, ischémie cérébrale) peuvent apparaitre avec des délais différents selon les animaux
Devenir
L’ensemble des animaux seront gardés en vie à la suite de la manipulation. Ils seront rapatriés dans l’animalerie du GIN afin de réaliser les enregistrements de leurs crises, leur comportement et les contrôles histologiques. Ces procédures font l’objet d’une demande d’autorisation gérée par le comité d’éthique du GIN.
Remplacement
L’utilisation de l’animal dans son intégrité est nécessaire pour répondre à notre question. Il n’existe aucun modèle cellulaire qui permette de mettre en évidence un foyer épileptique dans le cerveau ni de le traiter par irradiation et l’utilisation d’irradiation fractionnée spatialement n’est pas encore possible chez l’homme. Le développement d’une stratégie thérapeutique telle qu’envisagée dans cette étude nécessite d’avoir recours à un modèle animal dans lequel le développement d’un foyer épileptogène a été clairement caractérisé et mis en évidence. Dans cette étude, la souris sera utilisée, malgré sa petite taille, en complément de l’étude effectuée chez le rat en parallèle. En effet, le modèle souris d’épilepsie mésiotemporale présente une plus grande stabilité, une évolution plus rapide de la pathologie, une fréquence de crises plus importante et une plus grande similitude des symptômes avec la clinique humaine. L’utilisation des modèles souris et rat sera ainsi très complémentaire et permettra d’obtenir des résultats plus fiables pour la préparation des essais cliniques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant une exploitation statistique rigoureuse des résultats. Pour cela, en fonction de l’expérience acquise en modélisation animale des épilepsies, nous estimons que 396 animaux au total seront utilisés pendant 5 ans dans les quatre séries d’expériences de ce projet.
Raffinement
Nous veillerons à suivre les animaux quotidiennement de façon à intervenir immédiatement dès qu’un signe évocateur de douleur serait observé. Pour réduire toute douleur, souffrance ou anxiété, ils seront anesthésiés et analgésiés de façon profonde durant toutes les interventions (chirurgie, IRM, irradiation) et les techniques d’imagerie que nous utiliserons dans nos procédures sont sans douleur pour l’animal et permettent de répéter les acquisitions chez le même animal. Les animaux seront maintenus avec de la nourriture et de la boisson à volonté, ainsi que des objets en carton et du coton. Il seront habitués à la manipulation par des expérimentateurs agrémentés. A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés par surdosage de pentobarbital.
Choix des espèces
Le modèle d’épilepsie KA-MTLE chez la souris et chez le rat sont actuellement les modèles de référence les plus proches des conditions observées chez l’homme, aussi bien sur le plan électrophysiologique, histologique que pharmacologique. Malgré sa taille réduite nous souhaitons utiliser l’espèce souris, en complément de l’étude sur le rat, en raison de sa plus grande prédictivité et sa plus grande stabilité dans le temps que le modèle rat. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. Ils auront 8 semaines en début d’expérience et 12 à 15 semaines lorsqu’ils seront irradiés à l’ESRF. Le modèle de souris KA-MTLE a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long de la procédure.