Recherche fondamentale

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine jugulaire par chirurgie sous anesthésie, puis s'auto-administre de l'héroïne pendant vingt jours en cage opérante, jusqu'à six heures par jour, pour identifier des facteurs de vulnérabilité à l'addiction et à la rechute. Les rats sont ensuite mis à mort pour prélever le sang et le cerveau. Le porteur affirme que les méthodes alternatives sont "impossibles" et présente le rat comme un "modèle de référence" dans le domaine des addictions.

Objectifs

Notre étude se focalise sur l'identification: 1) Des facteurs biologiques de vulnérabilité à développer une addiction à l’héroïne. Pour cela nous identifierons des marqueurs sanguins reflétant des modifications cérébrales, qui pourraient ultérieurement être utilisés comme outils de diagnostic et de pronostic dans les études cliniques; 2) Des facteurs de vulnérabilité à la rechute et des facteurs de variabilité à la réponse thérapeutique afin de pronostiquer l’efficacité des traitements de substitution aux opioïdes. Pour cela nous identifierons des marqueurs sanguins, reflétant des modifications cérébrales, qui pourront là aussi être utilisés comme outils de diagnostic et de pronostic dans les études cliniques. De plus, parallélement à l’identification de facteurs de variabilité et vulnérabilité, grâce à des études morphologiques et de transcriptomique sur les cerveaux des animaux, nous pourrons identifier de nouvelles voies de signalisation cellulaire jouant un rôle critique dans les différentes étapes du processus d’addiction (mise en place du comportement, et rechutes), offrant la possibilité de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. L’ensemble de projet permettra donc d’affiner la prise en charge des personnes dépendantes aux opioïdes, d’assurer un meilleur suivi en abordant la problématique des rechutes qui sont malheureusement très fréquentes en clinique humaine, et d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale a plusieurs bénéfices attendus sur la base de nos objectifs qui sont : L’identification des facteurs biologiques de vulnérabilité à développer une addiction à l’héroïne; L’identification des facteurs de vulnérabilité à la rechute et des facteurs de variabilité à la réponse thérapeutique afin de pronostiquer l’efficacité des traitements de substitution aux opioïdes; l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce rojet nous permettra, grâce à l’identification de marqueurs sanguins reflétant ce qui peut être observé au niveau central, d’affiner la prise en charge des personnes dépendantes aux opioïdes. Ce projet permettra également d’assurer un meilleur suivi de l’efficacité des traitements de substitution, en étudiant la problématique des rechutes, qui sont malheureusement très fréquentes en clinique humaine. Et enfin, l’ensemble des résultats qui seront obtenus au niveau central, permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prise en charge des patients dépendants aux opioïdes.

Procédures

Tous les animaux du protocole (N= 1344) seront soumis à une anesthésie générale, pour poser un cathéter dans la veine jugulaire. durant cette anesthésie, 0,6 ml de sang seront prélevés via le cathéter pour éviter la souffrance à l'animal. Cette chirurgie dure environ 45 min. Tous les animaux ayant reçu le cathéter (N=1344), seront soumis au protocole d'auto-administration d'héroïne pendant 20 jours. Pour cela, tous les jours, les animaux sont placés en cage opérante pendant 1heure pour la moitié des rats, ou pendant 6 heures, pour l'autre moitié. Le nombre d'injections d'héroïne, directement par le cathéter, est variable en fonction des animaux. En effet l'injection suit l'appui sur un levier qui est une action que le rat exerce librement dans la cage opérante. Immédiatement après les jours d'auto-administration, 1260 rats seront soumis à une nouvelle anesthésie générale pour la pose en sous-cutanée d’une pompe permettant la libération prolongée d’un traitement pharmacologique. Lors de cette nouvelle anesthésie générale, 0,6 ml de sang seront prélevés via le cathéter. Cette chirurgie dure entre 5 et 10 min.

Impact sur les animaux

Les procédures qui seront réalisées le sont déjà dans des projets antérieurs. La pose du cathéter endovasculaire et des pompes osmotiques sera réalisée sous anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur pré-et post-opératoire. Le protocole d’auto-administration d’héroïne pendant 20 jours peut entrainer une prise de poids un peu moins forte des animaux au cours de l’expérience, mais avec des différences qui restent inférieures à 10% par rapport aux contrôles (sauf atteinte d’un point limite). Dès l’arrêt du protocole d’auto-administration, les animaux reprennent une courbe de prise de poids tout à fait identique à celle des rats contrôles. A la fin des 20 jours d’auto-administration, les animaux recevront une pompe osmotique, permettant le mise en place d’un traitement de substitution. Ce traitement permet d’éviter les symptômes de sevrage. Chez les animaux contrôles ces symptômes pourront être observés (mobilité réduite, diminution des toilettages, courbe de reprise de poids un peu plus lente que chez les rats sous substitution). Au bout de 48 - 72 heures ces symptômes disparaissent spontanément.

Devenir

Induction d'une anesthésie profonde, puis mise à mort, pour récupération d'échantillons sanguins et récupération des cerveaux post-mortem. Ces échantillons sont indispensables pour identifier des marqueurs sanguins de vulnérabilité et de variabilité comme décrit dans nos objectifs, et pour les études morphologiques et transcriptomiques des cerveaux qui seront réalisées à la suite.

Remplacement

Ce projet ayant pour but d’étudier des phénomènes psychiatriques associés à des modifications comportementales d’auto-administration de drogue, les méthodes alternatives actuelles (e.g., modélisation, études in vitro) sont impossibles. Ce projet a pour but d’étudier des modifications cérébrales complexes et des modifications comportementales qui s’inscrivent dans le cadre d’une étude intégrée. L'objectif est également de rechercher des biomarqueurs périphériques prédictifs de la réponse aux traitements de substitution, et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être pertinentes dans la prise en charge des patients dépendants aux opioïdes. Il doit donc être réalisé sur des animaux vivants.

Réduction

Pour réduire au miminum le nombre de rats utilisés, nous avons estimé la taille de échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données obtenues lors de projets précédents. Chaque groupe sera constitué de 14 animaux pour révéler des différences inter-individuelles comportementales.

Raffinement

L’hébergement s’effectuera dans un environnement enrichi (nids végétaux et un tunnel opaque où ils pourront s’isoler). Les rats seront également logés à deux par cage d’habitation permettant un enrichissement social tout en assurant un espace d’hébergement suffisant. Pour réduire au maximum l’angoisse des animaux ils seront habitués à l’expérimentateur par une manipulation quotidienne de 7 jours avant la chirurgie. La chirurgie endovasculaire et l’implantation des pompes osmotiques seront réalisées par une personne compétente ayant suivie la formation réglementaire de chirurgie. Pour éviter la souffrance, les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale Les études expériences comportementales commenceront après récupération totale des animaux, au moins 7 jours après la chirurgie endovasculaire.

Choix des espèces

L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’homme pour pouvoir reproduire la maladie. Le rat est un modèle de référence dans le domaine des addictions. Il possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. De plus, il est idéal pour les études comportementales. Le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Enfin, le rat présente un certain nombre de similitudes de séquences génétiques et de régulations géniques avec l’Homme, ce qui en fait un modèle très intéressant lors de l’étude des régulateurs génétiques. Les animaux testés seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne sont pas testés avant leur 8ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour pouvoir éviter le facteur confondant de l’âge sur les facteurs comportementaux mesurées. En effet, l’âge peut influencer de manière significative l’état émotionnel et le comportement de l’animal, un animal vieux pourra ainsi présenter un déclin cognitif ou une diminution de l’exploration par exemple. De même un rat adolescent pourra présenter un comportement différent de l’adulte (exploration plus importante, une prise de risque et une recherche de la nouveauté plus importantes).

158 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de quatre heures pour poser une prothèse, puis un isolement pouvant durer soixante jours et plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour mesurer le couplage neurovasculaire par TEP et ultrasons en neuropharmacologie. Le porteur indique que la fenêtre crânienne empêche de regrouper ou d'adopter les rats, qui sont donc euthanasiés dès la dernière acquisition. Il juge "indispensable" le recours à des animaux vivants, la modélisation et l'in vitro ne restituant pas ces interactions.

Objectifs

La tomographie par émission de positons (TEP) est une modalité d’imagerie qui permet d’étudier la fixation d’un médicament sur sa cible cérébrale. L’imagerie ultrasonore (US) permet quant à elle d’étudier les variations du débit sanguin cérébral qui sont la conséquence de l’effet des médicaments sur le cerveau (réponse hémodynamique). L’objectif de ce projet est d’associer ces deux modalités de neuro-imagerie innovantes de manière simultanée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau. Le phénomène de pharmacorésistance ou la tolérance à certains médicaments pourrait s’expliquer par une réponse hémodynamique atténuée lors de l’interaction du médicament avec sa cible. Cela pourrait s’expliquer par un déficit des mécanismes de couplage entre les cibles neuronales et la réponse hémodynamique, c’est-à-dire le couplage neuro-vasculaire. On pense que la qualité du couplage neuro-vasculaire peut être appréciée in vivo en mesurant les paramètres TEP et US de manière simultanée. L’imagerie hybride TEP/US sera réalisée chez le rats témoins. Certains animaux recevront un médicament testé à dose unique et/ou après un traitement prolongé. L’os du crâne atténue les US. Une « fenêtre » chirurgicale devra donc être mise en place sur chaque animal. Cela consiste à ôter et remplacer une partie de l’os du crâne par une résine dans des conditions d’asepsie et sans générer de douleur. La chirurgie et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Au total, 158 rats seront utilisés sur 5 ans. Cela permettra d’optimiser les conditions expérimentales et de suivre les effets de 4 protocoles de traitements médicamenteux différents. Compte tenu des contraintes techniques liées aux traitements et aux modalités d’imagerie, la taille des groupes a été fixée à 8 rats par groupe. Les traitements étudiés sont des médicaments parfaitement connus, déjà utilisés chez l’animal voire chez l’Homme: ils n’induisent pas de toxicité. Les animaux seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine. Ils feront aussi l’objet de mesures de comportement simples et peu génératrices de stress comme la mesure de l’activité locomotrice. Ce protocole ne peut pas être remplacé par des études de pharmacologie in vitro qui permettent seulement de mettre en évidence l’interaction d’une molécule isolée avec une cible ou un système biologique isolé. Seules les expériences in vivo récapitulent la complexité et l’ensemble des effets des médicaments sur le cerveau.

Bénéfices attendus

Actuellement, chacune de ces techniques est utilisée séparément en routine en recherche préclinique. Réalisées en même temps, elles permettront de diviser au moins par 2 le nombre d’animaux nécessaires par rapport à l’utilisation de l’imagerie TEP puis US isolées. Surtout l’approche simultanée TEP-US ne nécessite pas le sacrifice de l’animal, il sera donc possible de réaliser plusieurs sessions d’imagerie chez un même animal pour mesurer l’évolution de l’effet des médicaments au cours du temps. Cela permettra de diminuer encore plus le nombre d’animaux grâce à la puissance des tests statistiques appariés. A terme, ce protocole devrait permettre d’offrir une méthode d’imagerie optimisée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau et de mettre en évidence des mécanismes de tolérance ou de résistance.

Procédures

1. Procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie. Temps=4h 2. Isolement à 1 animal par cage afin de préserver l’intégrité de la prothèse, pendant 60 jours maximum avant euthanasie (le temps de réaliser les traitements et les sessions d’imagerie, en prenant en compte un risque d’échec de radiosynthèse du traceur et la reprogrammation des examens). 3. Les animaux utilisés pour la mise au point de l’acquisition US pourront participer à 5 acquisitions US de 90 min maximum, sous anesthésie générale, espacées de 48h au minimum. 4. Maximum 2 acquisitions espacées de 7 jours au minimum en TEP-US sous anesthésie générale incluant injections i.v par cathéter caudal Temps 90 min 5. 1 traitement chronique, quelques minutes quotidiennement, sur animal vigile pendant 15 jours maximum 6. Etude du comportement pendant 15 min, au maximum 2 fois par jour pendant la durée du traitement (15 jours maximum).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale est conduite sous anesthésie générale et des analgésiques sont également utilisés. La récupération post-opératoire inclut un traitement antalgique. Aucune douleur n’est attendue. Les injections nécessaires à l’enregistrement TEP-US se font également sous anesthésie générale à l’isoflurane. Pas de douleur attendue. Les animaux ne peuvent pas s’arracher la prothèse crânienne qui est parfaitement solidaire de l’os et qu’ils ne peuvent pas voir ou sentir. Cependant, afin de les protéger des conflits avec leurs congénères, les animaux opérés sont hébergés individuellement par cage, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’hébergement individuel en cage transparente et ouverte, à côté d’autres cage, permet ainsi un partage de l’odorat et du visuel avec les autres animaux présents dans le cages voisines afin de minimiser l’effet négatif sur le bien-être animal. De plus, un enrichissement supplémentaire tel qu’un deuxième matériel de nidification sera ajouté. Les médicaments testés auront vraisemblablement un effet sur le comportement (apathie, diminution ou augmentation de l’activité locomotrice) mais ne sont aucunement toxiques pour l’animal aux doses testées. Le stress induit par l’administration des médicaments sur animal non anesthésié est limité par une habituation à la manipulation préalable. Pour les injections répétées, les sites d’injection parentérale seront alternés afin de ne pas induite de lésion au point d’injection.

Devenir

La présence d’un volet chirurgical au niveau du crâne empêche le rassemblement avec d’autres rats et une adoption ultérieure : les animaux opérés seront donc euthanasiés dès que possible, soit immédiatement après la dernière acquisition TEP-US.

Remplacement

Ni la modélisation informatique ni l’expérimentation sur cellules in vitro ne permettent encore d’appréhender les processus complexes relevant de mécanismes impliquant des interactions entre neurones, cellules gliales et réseau vasculaire, dans un contexte de régulation circulatoire sanguine. Il est donc indispensable d’utiliser des animaux vivants capables d’exprimer les troubles neurologiques et de valider les biomarqueurs d’imagerie étudiés. Au maximum, toutes les adaptations possibles de l’imagerie US (sensibilité, résolution spatiale, résolution temporelle…) seront mises au point au préalable sur des objets en plastique remplis d’eau ou de gel qui miment les propriétés physiques de la tête et du cerveau. Néanmoins, 30 rats seront tout de même nécessaires pour finaliser la mise au point de cette nouvelle technique d’imagerie : les données collectées sur ces animaux serviront à l’élaboration d’un référentiel (animaux non traités), ce qui permettra au final de réduire le nombre de sujets nécessaires. La réalisation d’une imagerie US sur tout la profondeur du cerveau directement chez l’Homme n’est pas possible à ce jour du fait de l’épaisseur de la boite crânienne.

Réduction

L’utilisation conjointe des deux techniques (imagerie TEP et ultrasonore (US)) permet de diviser par deux le nombre d’animaux actuellement nécessaire à la collecte séparée de données TEP et US indépendamment l’une de l’autre. De plus, ces techniques d’imagerie permettent d’étudier plusieurs régions cérébrales en même temps, dans l’ensemble du cerveau. Pour la mise au point de la méthode : 30 rats serviront à l’apprentissage de la technique chirurgicale et à la mise au point des paramètres physiques de la méthode TEP-US. Ce nombre pourra être revu à la baisse si les objectifs sont atteints avec un nombre inférieur d’animaux. Pour l’étude de l’effet de 4 traitements dont la tolérance chez l’animal voire chez l’Homme est parfaitement connue, le nombre d’animaux nécessaires à cette étude a été calculé grâce à une planification précise afin d’en réduire au maximum le nombre. Il a été estimé à 128 pour les 5 ans à venir. Ce nombre est un minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant chirurgie : Les animaux seront acclimatés pendant les 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d’humidité de l’animalerie. Ils seront deux par cage (enrichie en tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et papier Kraft). Il y aura une période d’habituation des animaux aux manipulations par les personnes intervenantes sur ce projet avant toute expérimentation. Après chirurgie : Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et en étant vigilant sur les conditions d’asepsie. Une surveillance continue de l’état de l’animal aura lieu de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux seront observés individuellement tous les jours et pesés 3 fois par semaine. Le traitement sera administré en fonction du poids des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats adultes jeunes et matures sexuellement (180-250g au début de l’étude). Ils pourront être étudiés pendant un maximum de 3 mois après la réalisation de la chirurgie. Cet âge a été choisi car les animaux sont suffisamment matures dans leur développement mais leur taille reste compatible avec les outils d’acquisition qui sont réalisés dans un espace restreint.

338 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une irradiation sublétale sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse, d'autres des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pendant quatre mois, pour étudier le rôle du microenvironnement médullaire dans la leucémie aiguë lymphoblastique B. Le porteur décrit un développement leucémique spontané pouvant entraîner une paralysie de l'arrière-train et des tumeurs ganglionnaires, et toutes les souris sont mises à mort. Il affirme que la coopération des cellules et le rôle du stroma ne peuvent être reproduits in vitro de façon satisfaisante.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques de type B (LAL-B), équivalents pathologiques des lymphocytes B (LB) en développement, sont la cause principale de cancer chez l’enfant, et bien que moins fréquentes, concernent un nombre de cas similaires chez l’adulte. Malgré l’amélioration des traitements de chimiothérapie, le pronostic reste mauvais dès le diagnostic chez l’adulte, et à la rechute chez l’enfant. De nombreuses études montrent que des cellules du microenvironnement de la moelle osseuse sont impliquées dans les mécanismes de résistance aux traitements mais leur identité précise et les mécanismes de protection mis en jeu restent mal connus. Pour ce type d’étude, puisqu’il est actuellement impossible d'obtenir des conclusions fiables in vitro nous ne pouvons pas nous passer des expérimentations conduites sur des animaux pouvant simuler les principales propriétés biologiques des leucémies humaines. Nos études précédentes nous ont permis de montrer que les cellules du microenvironnement qui soutiennent le développement des LB présentes de fortes similitudes entre l’homme et la souris. Peu de données sont par contre disponibles concernant l’influence de ce microenvironnement sur l’acquisition de mutations lors du développement pathologique des LB et sur son rôle de soutien de la leucémogénèse. Dans la présente demande d’autorisation, nous étudierons l’impact d'un facteur - produit par le microenvironnement et impliqué dans la prolifération des LB normaux – sur le développement leucémique.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus auront un impact sur la santé humaine. En effet, la littérature montre clairement l'influence du microenvironnement sur le développement des LAL-B mais ces données restent parcellaires et peu de cibles thérapeutiques ont été identifiées. Nos travaux s'appuie sur la découverte par notre équipe d'une protéine produite dans la moelle osseuse sur la prolifération d'un sous type de LAL-B. L'utilisation du modèle de souris humanisé de développement leucémique nous permettra de comprendre les mécanismes de régulation et l'identification à moyen terme de facteurs représentant des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Trois types d'intervention seront effectuées sur les animaux. Pour le suivi du développement leucémique, des prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro orbital ou de la veine faciale afin d’espacer au maximum les prélèvements à un même site et permettre ainsi une parfaite cicatrisation. Ces prélèvements seront espacés de 2-3 semaines sur un maximum de 4 mois et seront effectués sur 248 animaux. Des transplantations de cellules de moelle osseuse seront aussi effectuées sur 108 souris. Le protocole implique tout d'abord une irradiation sublétale sur animaux vigiles suivie le lendemain d'une injection intra veineuse des cellules de moelle au niveau du sinus rétro orbital sous anesthésie gazeuse. Ce geste ne sera effectué qu'une fois pour chaque souris.

Impact sur les animaux

Notre projet implique des souris génétiquement modifiées (expression d'une protéine de fusion identifiée dans des LAL-B humaines) pour lesquelles on observe un développement leucémique spontané. Les symptomes les plus couramment observés sont une paralysie du train arrière ou des tumeurs ganglionnaires visibles. Le développement leucémique peut aussi s'accompagner d'une diminution du taux d'hématocrite. La cinétique de développement leucémique dans ce modèle étant connue, nous effectuerons des prélèvements sanguins de suivi avant l'apparition de ces symptômes pour limiter tant que possible l'inconfort de l'animal. Ces sympômes seront considérés comme points limites et seront de plus complétés par une grille de score tenant compte des éventuels changement de poids corporel, de l'apparence physique, de signes cliniques objectifs, de comportement non provoqué et des réponses comportementales aux stimuli.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures

Remplacement

La régulation de l’hématopoïèse normale et pathologique implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules hématopoïétiques (intrinsèques). Seuls ces derniers peuvent être appréhendés in vitro. Ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, du contexte cytokinique, sont cruciaux et ne peuvent actuellement pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.

Réduction

Réduction du nombre d'animaux: lorsque possible et utile, un calcul d’effectif pour chaque groupe a été réalisé sur le site BiostaTGV (voir partie 3.4.10, justification du nombre d’animaux). Réduction du stress: présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton), maintien des animaux en groupes de 4-5 afin d’éviter l’isolement et les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris dans la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation.

Raffinement

la détection précoce et encore asymptomatique du développement leucémique se fera à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront suivis quotidiennement. Ainsi, l’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score de douleur spécifique de ces modèles de pathologies hématologiques. Afin de réduire le stress et d’améliorer le cadre de vie des animaux, nous optimiserons les conditions de leur hébergement, par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et/ou coton), et par le maintien des animaux en groupes de 4 à 5 afin de respecter leur instinct grégaire.

Choix des espèces

Le modèle souris est celui utilisé majoritairement par la communauté scientifique pour mimer les altérations génétiques à l’origine des leucémies chez l’homme. Ainsi, dans le modèle de souris que nous utiliserons, il a été démontré que les lymphocytes B qui se développent en cellules leucémiques acquièrent les même mutations que chez l’homme. Par ailleurs, nous avons montré que les cellules qui supportent le développement des lymphocytes B sont similaires entre l’homme et la souris. Ces résultats montrent la relevance du modèle souris pour l’étude de la biologie des LAL-B humaines. Les études proposées nécessiteront l’utilisation d’animaux avant l’apparition de symptômes, c’est à dire entre 4 et 8 semaines et dans la tranche d’âge ou apparaissent les symptômes c’est-à-dire entre 13 et 34 semaines. Nous pourrons également utiliser des cellules issues de ces animaux pour tester des thérapeutiques innovantes en accord avec leurs altérations génétiques. Ces cellules seront issues d'animaux pré-leucémiques (avant 8 semaines) ou leucémiques (après 13 semaines).

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur mammaire greffée, reçoit des injections répétées de luciférine et des séances d'imagerie sous anesthésie pendant deux semaines et demie, pour étudier le rôle de la MMP11 des adipocytes dans la croissance tumorale. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale ou au CO2 pour prélever les tumeurs. Le porteur affirme que l'animal est "nécessaire" pour reproduire la croissance tumorale du cancer du sein sur "l'organisme entier".

Objectifs

Dans ce projet, nous allons étudier le rôle de la métalloprotéase matricielle-11 (MMP11) sécrétée par les adipocytes dans la croissance tumorale par imagerie en bioluminescence. Au début du projet, après avoir répété la même expérience 3 fois, il a été montré que la MMP11 sécrétée par les adipocytes accélère de manière significative la croissance tumorale à un stade précoce du développement tumoral. Pour montrer cela, nous avons implanté des cellules cancéreuses mammaires en localisation orthotopique dans la glande mammaire des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 dans le tissu adipeux. Puis, nous avons mesurer le volume des tumeurs mammaires dans ces souris à l'aide d'un pied à coulisse durant 2 semaines et demi. Etant donné que la MMP11 agit à un stade précoce du développement tumoral, nous souhaitons analyser précisément ce qui se passe au stade précoce grâce à une méthode d'imagerie sensible qui détecte les tumeurs à un stade infra clinique. Cette méthode nous permet donc de quantifier précisément les tumeurs de petite taille, de visualiser et de suivre en temps réel et de manière non invasive les cellules cancéreuses bioluminescentes afin de compléter les données obtenues avec le pied à coulisse. Nous pouvons ainsi visualiser de manière beaucoup plus précoce et fonctionnelle, la cinétique de développement des tumeurs à partir des cellules cancéreuses, ainsi que la dissémination locale des cellules tumorales. Nous n'attendons pas de dissémination à distance des tumeurs formées (métastases) car notre expérience se limite au stade précoce du développement tumoral.

Bénéfices attendus

Cette procédure permettra d'avoir une vision beaucoup plus précoce et fonctionnelle des tumeurs obtenues à partir des cellules mammaires cancéreuses, en présence et en absence de la MMP11, dans la quatrième glande mammaire inguinale des souris et ainsi de mettre en évidence la contribution des adipocytes dans la progression des tumeurs mammaires.

Procédures

Lors de ce projet, les souris seront soumises à un total de 3 interventions réalisées par le manipulateur : 1. L'acquisition d'images bioluminescentes par l'imageur nécessite d'endormir les souris grâce à un mélange d'isoflurane et d'oxygène dans une boîte à induction en plexiglas puis de maintenir cette anesthésie durant toute la période d'imagerie (30 minutes maximum). 2. Afin d'imager les souris, pour une souris de 20-25g, 100µL de luciférine est injecté par voie intrapéritonéale afin d'injecter environ 3.3mg de luciférine par souris pour une dose de 150mg/kg. 3. Pour finir, au bout de 2 semaines et demi, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale par une personne habilitée ou par inhalation de CO2, afin de prélever les tumeurs pour réaliser des analyses moléculaires.

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées de luciférine, nous n'attendons pas d'effets indésirables de la luciférine mais du fait de la répétition des injections, par précaution, nous surveillerons les animaux. Notre protocole d'observation des tumeurs est établi sur une courte durée (2 semaines et demi) ce qui permet d'observer les premières étapes de la cancérogénèse, ainsi les tumeurs seront de petite taille durant tout le protocole, et nous ne devrions pas observer d'effets indésirables (nécroses, métastases etc), mais les tumeurs seront tout de même surveillées tout au long du projet.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie pour un suivi de la croissance tumorale durant 2 semaines et demi, puis les souris seront sacrifiées afin de prélever les tumeurs pour réaliser des analyses moléculaires. Aucun animal sera donc maintenu en vie au terme de ce projet.

Remplacement

L'utilisation des animaux est nécessaire pour mimer le plus fidèlement possible la croissance tumorale observée chez les femmes atteintes d'un cancer du sein, notamment du fait de la présence de glandes mammaires différenciées et fonctionnelles présentant du tissu adipeux, mais également du fait que la progression tumorale implique tout l'organisme et que les souris présentent un système immunitaire fonctionnel qu'il est impossible de récapituler in vitro. C'est pourquoi nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de croissance tumorale est semblable à celui de la femme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude.

Réduction

Au début du projet, après avoir répété la même expérience 3 fois, il a été montré que la MMP11 sécrétée par les adipocytes accélère de manière significative la croissance tumorale à un stade très précoce du développement tumoral. Ces résultats solides permettent la mise en place d'une expérience complémentaire sur un nombre limité de souris qui viendront compléter et confirmer les données obtenues. Cela signifie également que les modèles de souris génétiquement modifiées sont déjà disponibles. Les paramètres mesurés nécessitant l'utilisation de tests statistiques sont la taille des tumeurs et le poids de l'animal. Ces paramètres seront mesurés 2 jours par semaine pendant 2 semaines et demi après l'injection des cellules cancéreuses, et les analyses statistiques se feront de manière indépendante pour chacun de ces jours. Vu que nous travaillons seulement avec des groupes de 5 souris, nous utilisons un test non paramétrique (Mann-Whitney) de comparaison entre deux groupes (souris mutantes et souris contrôles appariées) avec le logiciel PRISM qui s'appliquent aux petits échantillons.

Raffinement

Les animaux seront placés dans des cages leur assurant un bien-être avec de la sciure de bois comme litière. Celle-ci est remplacée de manière hebdomadaire pour une hygiène optimale. Le stress est diminué au maximum en hébergeant les souris dans des cages transparentes permettant la visualisation des autres souris et en les habituant à la vue de l'opérateur expérimental qualifié pour les procédures liées à l'expérimentation animale. La taille de l'aiguille permettant l'injection de la luciférine sera adaptée au poids de l'animal afin de réduire le risque de lésion induite par l'aiguille. L'occurence de blessure éventuelle et le risque d'infection au niveau de la zone d'administration de la luciférine seront pris en considération. Pendant l'imagerie, les souris sont anesthésiées afin d'éviter tout stress. De plus, les souris seront placées sur un support chauffant afin d’éviter toute déperdition de chaleur causée par l’anesthésie. Elles seront ensuite suivies dans les heures suivant l'injection. Des visites quotidiennes seront effectuées afin de vérifier le niveau d'inconfort et les signes de douleur des animaux dans la cage (diminution des comportements d'exploration, diminution de la prise de boisson et/ou de nourriture, perte de poids, posture voutée, etc...). Autrement, nous n'attendons pas de signes cliniques péjoratifs lors de la procédure expérimentale, mais nous surveillerons tout de même : la réaction des souris suite à des injections répétées de luciférine, l'aspect des tumeurs, la difficulté des souris à se déplacer à cause d'une gêne occasionnée par la taille et la localisation des tumeurs. En cas de souffrance visible ou de douleur apparente des animaux, un avis vétérinaire sera sollicité pour décider de la continuité ou de l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle de souris a été retenu car c'est le seul pour lequel il est possible de manipuler le niveau d’expression de la MMP11 en employant des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 de manière tissu-spécifique. Ces modèles permettent de répondre directement à notre objectif. A notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle animal plus simple permettant de répondre à la problématique inhérente à ce projet. Les souris utilisées pour ce projet seront âgées de 8 semaines au moment de l’expérimentation de manière à étudier la progression tumorale mammaire dans un organe différencié et fonctionnel.

2 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à trois injections et une greffe de cellules tumorales pour induire un mélanome, la plupart des injections étant faites sans anesthésie, que le porteur juge plus traumatisante que l'acte lui-même. Il décrit comme principal risque l'ulcération de la tumeur, et toutes les souris sont mises à mort en fin d'étude pour des analyses post-mortem. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'existe et que ces expériences sont "indispensables" car les interactions in situ ne peuvent être modélisées in vitro.

Objectifs

Notre projet vise à déterminer le rôle précis d’un récepteur de signal de danger dans les réponses immunitaires anti-tumorales dans un modèle de mélanome chez la souris. Pour cela nous utiliserons des modèles de souris conditionnellement déficientes pour ce récepteur et nous leur injecterons des cellules tumorales suivi ou non de transfert adoptif de lymphocytes T protégeant ou attaquant la tumeur et nous étudierons la pousse tumorale, le phénotype des cellules immunitaires recrutées au sein de la tumeur et des ganglions drainants. Enfin nous évaluerons l’influence de traitements immunothérapeutiques dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé publique majeur, et la 2ème cause de mortalité dans le monde. Récemment, des traitements développés chez la souris visant à lever les phénomènes de tolérance immunitaire contre le cancer ont prouvés leur efficacité chez l’Homme et redonnés un espoir de réduire la mortalité liée à cette maladie. Ces traitements n’ont néanmoins pas encore permis d’éradiquer la maladie. Ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer les immunothérapies visant à inhiber la tolérance immunitaire aux tumeurs et augmenter l’efficacité des vaccins contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des Injections sous cutanées, intra péritonéales, intraveineuses. Chaque animal recevra entre 1 et 3 injections selon la procédure: procédure 1 : 1 seule injection sous-cutanée; procédure 2: une injection sous-cutanée et une injection intraveineuse (sur animal anesthésié) 1 à 3 jours plus tard; procédure 3: 1 injection sous-cutanée et 2 injections intrapéritonéales, chacune à 7 jours d'intervalle. Sauf cas indiqué, les procédures ne justifient pas l’utilisation d’anesthésiques. Une procédure de sédation rendrait en effet l’ensemble de la procédure plus traumatisante pour l'animal que la procédure expérimentale elle-même.

Impact sur les animaux

Les procédures de notre projet sont bien établies et réalisées par du personnel expérimenté pour leur réalisation. Les nuisances et effets indésirables possibles ont donc peu de chance de se produire. Etant donné les précautions prises dans l’exécution du projet, les risques comportent principalement l’ulcération de la tumeur chez les animaux porteurs de tumeurs et les éventuelles réactions secondaires (irritations cutanées, diarrhées, poil hirsute, perte de poids) aux traitements immunothérapeutiques. Pour éviter leur apparition, le comportement des animaux sera contrôlé régulièrement (tous les jours par le zootechnicien et 3 fois par semaine par l’expérimentateur). Nous serons vigilants aux changements de comportement et d’aspect des souris et les évalueront au moins 3 fois par semaine à l’aide d’un système de scoring détaillé. L’apparition de nuisance ou d’effet indésirables donnera lieu à une réponse graduée en fonction du score. Parmi les actions à prendre, figurent le traitement des animaux par des analgésiques ou la mise à mort des animaux qui atteidraient un point limite.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique que l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’étude de façon éthique par des personnes expérimentées.

Remplacement

En termes de remplacement, aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'étant disponible pour cette recherche, ces expériences chez la souris sont indispensables car les interactions complexes se déroulant in situ ne peuvent être modélisées in vitro. Mais pour les tests fonctionnels nous remplacerons chaque fois que possible l’utilisation des animaux par des tests in vitro. Il est à noter que parmi les 10 molécules les plus efficaces en cancérologie développées depuis 20 ans, toutes ont été découvertes grâce aux modèles murins. En particulier les découvertes de James Allison et de Tasuku Honjo leur ont valu le Prix Nobel en 2018, signe que l’immunothérapie est un espoir contre le cancer et que les avancées majeures passent par l’étude de modèles animaux.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons établi des procédures expérimentales tenant compte de l'effectif minimal pour atteindre une puissance statistique suffisante. L’utilisation de techniques modernes de phénotypage et les tests in vitro développés par notre équipe permettra également de réduire le nombre de souris utilisées. Des études exploratoires sur un petit nombre de souris seront réalisées pour sélectionner les meilleures stratégies avant d’évaluer leur impact sur un nombre plus important d’animaux. Pour mener à bien le projet sur l'ensemble des lignées, 2860 souris seront étudiées.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous avons mis en place des points limites précis et un système de score afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par du personnel formé et compétent afin de détecter les changements de poids d’aspect et l’apparition de comportements associés à la douleur. En cas de signes précoces d’ulcération tumorale ou de souffrance, les animaux recevront des antidouleurs, et s’ils présentent de l’hypothermie ou des difficultés à se nourrir, ils seront placés dans des cages chauffées ou en présence de nourriture humidifiée respectivement. Ils seront mis à mort si le diamètre tumoral dépasse une valeur seuil ou s’ils perdent une valeur seuil de leur poids. Les souris âgées de 7 à 15 semaines seront hébergées en groupe en accord avec la législation en vigueur avec un nombre maximum de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (lanières de papier permettant la nidification) avec un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson au sein d’une animalerie A2 avec surveillance informatique du respect des paramètres environnementaux (température, hygrométrie). Les animaux seront anesthésiés pour la réalisation des procédures les plus stressantes pour l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle valide en immunologie, en immunologie des tumeurs et particulièrement dans les études visant à mieux décrire une voie de signalisation. L’homme et la souris ont un système immunitaire proche et partagent les mêmes sous-populations de cellules immunitaires. Les modèles mimant le développement tumoral existent et sont très bien caractérisés. Nous pourrons facilement implémenter ces modèles et ainsi minimiser le nombre de souris nécessaires pour notre étude. Par ailleurs, le modèle souris offre l’avantage de pouvoir utiliser des outils immunologiques puissants permettant de suivre les cellules spécifiques d’antigène. Du fait de l’utilisation de ces modèles très spécifiques, le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Nous utiliserons des souris adultes de 7 à 15 semaines d’âge, conditions favorables permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total.

500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un trou est foré dans le crâne de chaque animal sous anesthésie et une sonde y est scellée au ciment dentaire et à trois vis, avant des recueils de liquide céphalorachidien pouvant durer neuf heures, pour mesurer l'effet de molécules à tester sur les neurotransmetteurs. Le porteur signale des nuisances liées à l'opération et à l'hébergement individuel, et les rats sont ensuite tués au CO2 pour prélever le cerveau et vérifier la position de la sonde. Il justifie le recours au rat par la "nécessité" de tester les molécules sur un système nerveux "intègre".

Objectifs

La technique de microdialyse va permettre de vérifier l'activité sur différents systèmes neurochimiques centraux d'une molécule à tester. Ceci permettra de comprendre son mode d'action mais également de vérifier son innocuité, son absence d'effets indésirables sur certaines zones du cerveau. On pourra ainsi confirmer des effets comportementaux observés, cibler certaines pathologies ou alors s'assurer par exemple que les nouvelles molécules testées n'interagissent pas avec les circuits de la récompense et n'aient pas de propriétés addictives.

Bénéfices attendus

La mise en place de ce projet va permettre de comprendre les mécanismes fins d'action de nos nouvelles molécules au niveau synaptique, d'établir des corrélations avec des observations comportementales. Ce projet permettra de cibler certaines pathologies présentant des altérations neurochimiques bien déterminées (Alzheimer, Parkinson, schizophrénie...) ou alors s'assurer par exemple que les nouvelles molécules testées n'interagissent pas avec les circuits de la récompense et n'aient pas de propriétés addictives.

Procédures

La technique de microdialyse se décompose en 2 phases: - implantation d'un guide canule au niveau du cerveau : l'animal est anesthésié (kétamine/xylazine), un trou est foré au niveau du crâne et la sonde est positionnée et scellé avec du ciment dentaire et 3 vis. L'ensemble de la procédure dure maximum 45 minutes. - recueil des dialysats : l'animal est placé dans une enceinte, une sonde est insérée dans le guide canule et du liquide céphalo-rachidien artificiel mis à circuler à un débit déterminé (0.5 à 2 µl/min). Un échantillon de liquide céphalo-rachidien est collecté toutes les 20 à 30 minutes sur une durée de 9h maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux peuvent avoir plusieurs origines : - nuisances liées aux suites de l'opération d'implantation (mauvaise récupération post anesthésie, plaie sur le crâne mal cicatrisée) - Hébergement individualisé - Lors du recueil, problème de tolérance au nouveau produit à tester.

Devenir

Les animaux issus des sessions de recueils sont sacrifiés à l'aide d'une concentration croissante de CO2, les cerveaux sont prélevés afin de vérifier la bonne implantation des sondes.

Remplacement

L’utilisation de rats en microdialyse est justifiée par la nécessité de pouvoir tester sur un système nerveux intègre l'effet de nouvelles molécules. En effet, l'objectif de la microdialyse est de mesurer l'évolution au cours du temps de la quantité de différents neurotransmetteurs au niveau de la fente synaptique. Cette libération de neurotransmetteurs peut être influencée par les nombreuses interactions des systèmes neurochimiques situés dans d'autres structures que celle recevant la sonde de microdialyse.

Réduction

L'intérêt de la microdialyse est qu'elle permet notamment d'observer les effets d'un traitement sur un animal vigile avec plusieurs observations au cours du temps, cet animal étant son propre témoin. Cette technique permet ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Un effort important a été réalisé afin d'optimiser l'anesthésie des animaux au moment de l'implantation du guide canule. L'association kétamine / xylazine permet une sédation et une analgésie correcte et couvrant largement le temps de l'opération. Jusqu’à 3 jours après l’implantation, si l’animal présente des signes de mal être (poils hérissé, yeux mi-clos, prostration) alors il reçoit une administration de carprofène (une administration s.c. par jour maximum, 5 mg/kg, 1ml/kg, Carprofelican, Dechra, 50 mg/mL, dilué 10 fois). Si après 3 jours, nous ne constatons pas d’évolution de l’état du rat alors il est euthanasié. Si nous constatons dans les 3 jours que la plaie ne cicatrise pas (présence de saignements / croutes, boursouflures) l’animal peut être à nouveau réanesthésié (isoflurane) afin de refaire des points de sutures. Si 5 jours après le réveil de l’anesthésie, un animal n’a pas repris de poids, alors il est euthanasié. Pour compenser l'hébergement individualisé des animaux, un enrichissement du milieu (balles, blocs de bois, lambeaux de papier) est ajouté dans la cage. Les cages d'hébergement en polycarbonate transparent sont placées côte à côte afin de favoriser le contact visuel entre animaux.

Choix des espèces

- La taille adéquat de l’animal : ni trop petit pour des microdissections de structures déterminées du cerveau, ni trop gros pour des problèmes de gestion et d’organisation d’un laboratoire. - Le rat est déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et il a un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée chez le rat et il existe de très bons atlas stéréotaxiques permettant des implantations précises (par ex : Paxinos et Watson, 1996). Les animaux sont utilisés à l'âge adulte. En effet, les coordonnées stéréotaxiques des structures d'intérêt sont obtenues à partir d'atlas stéréotaxiques déterminés pour des animaux adultes.