Recherche fondamentale

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hors animaux reproducteurs et de maintien de la lignée. Porteuses d'une mutation reproduisant l'ataxie de Friedreich, les homozygotes développent une ataxie vers trois mois et sont suivies par des tests comportementaux réguliers et des électromyogrammes, avant l'injection d'un vecteur de thérapie génique et une mise à mort à neuf mois pour analyses. Le porteur qualifie ces tests de comportement d'"indolores et sans stress" pour l'animal. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer cette approche et qu'une validation in vivo est "indispensable".

Objectifs

L’ataxie de Freidreich (AF) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une maladie neurologique avec une dégradation progressive des fonctions motrices et sensorielles qui conduit à une perte des mouvements volontaires. La maladie est dû a une perte de frataxine, une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Les approches thérapeutiques pharmacologiques développées ciblant principalement les effets secondaires sont à ce jour faiblement efficaces et l’AF reste une maladie incurable. Une approche de thérapie génique permettant de restaurer les taux physiologiques de frataxine est en cours de développement. Un nouveau modèle murin avec une mutation ponctuelle dans la frataxine a été généré, afin de mimer les effets d’une mutation ponctuelle identifiée chez certains patients. Ce modèle est en cours de caractérisation, mais nous savons que ce modèle développe un phénotype neurologique progressif entre 3 et 9 mois, similaire à la maladie humaine. Ce modèle murin nous permettra donc de comprendre les états précoces de la maladie, et de développer une approche préclinique de thérapie génique. Le projet a 2 axes : 1) caractériser le phénotype neurologique du modèle au cours du temps, notamment au cours des trois premiers mois et 2) appliquer et optimiser un protocole de thérapie génique avec un vecteur permettant d’exprimer la frataxine à des niveaux proches de l’endogène.

Bénéfices attendus

Il y a plusieurs bénéfices attendus de ce projet. Le premier sera de valider ce nouveau modèle qui présente des faibles taux de frataxine de façon ubiquitaire et une mutation retrouvée chez l’Homme. Ce modèle pourra être utiliser pour continuer à comprendre la pathophysiologie de la maladie afin de développer des nouvelles approches thérapeutiques. Le deuxième bénéfice sera de continuer à développer au niveau préclinique une approche de thérapie génique.

Procédures

A partir de la naissance les animaux seront observés 2x /semaine (pour surveiller leur poids et taille). Des tests de comportement indolores et sans stress pour l’animal, effectués par le même expérimentateur, nous permettront d’identifier avec précision les défauts locomoteurs et de suivre l’évolution du phénotype. Les tests seront utilisés en conformité avec la littérature et les procédures établies au laboratoire. Ces tests seront effectués tous les 15 jours jusqu’à 12 semaines, et ensuite 1 fois par mois jusqu’à l’âge de 9 mois. Des mesures d’électrophysiologie par électromyogramme (EMG) seront effectués afin de mesurer la réponse proprioceptive des animaux et de corréler ses résultats aux données comportementales à 2 et 3 mois, puis 1 fois tous les 2 mois. A 9 mois, les souris seront mises à mort et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques et histopathologiques. (Procédure 1) Une deuxième cohorte de souris sera générée pour le prélèvement de tissus pour une caractérisation biochimique et histopathologique, à différents temps (naissance, 7 jours, 3 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois), ce qui correspond à différentes phases clés dans la progression de la maladie. Le point de 9 mois sera obtenu à partir de la cohorte de la procédure 1. (Procédure 2) Enfin deux autres cohortes seront générées pour évaluer une approche de thérapie génique, d’abord en pré-symptomatique puis en postsymptomatique. Après injection intraveineuse du vecteur médicament (vecteur exprimant la frataxine) soit avant symptômes (Procédures 3) ou après l’apparition des symptômes (Procédure 4), des tests de comportements ainsi que des mesures d’électrophysiologie seront effectués comme en procédure 1 pour évaluer l’effet thérapeutique. A 9 mois, les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus pour des analyses.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées pour l'élevage sont maintenues à l’état hétérozygote, portant un seul allèle muté et un allèle sauvage. Elles n'ont pas de phénotype dommageable et ne nécessitent donc pas de surveillance particulière. Seuls les animaux homozygotes pour la mutation du gène de la frataxine issues des croisements entre deux souris hétérozygotes ont une réduction de la taille globale et développent des symptômes d’ataxie vers le 3ème mois, aspect qui nécessite d’être affiné. De la nourriture gélifiée sera proposée aux animaux dès l’apparition des signes de la maladie, détectés par les tests de comportement que nous effectuerons.

Devenir

Pour des analyses biochimiques et histologiques une mise à mort est nécessaire en fin de procédure en respectant les points limites et la progression de la maladie.

Remplacement

Ce projet vise à optimiser une approche de thérapie génique pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et de ralentir la progression de la maladie, voire la stopper de façon pérenne sans induire des effets secondaires invalidants. Tous les outils moléculaires utilisés ont été testés dans des cellules en culture mais il est indispensable de réaliser une validation in vivo sur un modèle murin de la maladie. Ce modèle est le premier modèle qui reproduit génétiquement une mutation ponctuelle retrouvée chez l’homme.

Réduction

Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans un maximum de 720 animaux hors animaux reproducteurs et maintien de la lignée. Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant en compte du nombre minimum nécessaire pour pouvoir appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires de nos collaborateurs nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (20 souris par condition pour les tests de comportement et 10 souris par condition pour les analyses biochimiques et histologiques). Autant que possible, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Si aucun phénotype moléculaire/histologique n'est observé à 6 semaines, les cohortes prévues pour les points plus précoces ne seront pas générés. En l’absence de différence entre les mâles et les femelles, les données seront combinées afin de diminuer de moitié l’effectif.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et leur poids et taille seront mesurés 2x / semaine. Dès les premiers signes cliniques (défauts à la locomotion ou perte de poids), de la nourriture gélifiée sera mise à leur disposition dans la cage. Des points limites prédictifs sont déjà établies et validés par la communauté scientifique avec un « scoring » adapté aux modèles d’ataxie.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes alternatives pour évaluer la pertinence d’une approche de thérapie génique pour le traitement de l'Ataxie de Friedreich, notamment de la composante neurologique de la maladie. Il est alors nécessaire d’utiliser un modèle animal pour comprendre et proposer des approches thérapeutiques de la pathologie. La frataxine humaine sauvage est capable de compenser l’absence de frataxine murine endogène dans des modèles cellulaires et murins. Malgré l’existence de modèles cellulaires, une étude chez l’animal est indispensable pour déterminer la pertinence de cette approche de thérapie génique et afin d’établir une preuve de concept et l’innocuité de cette stratégie. Cette étape préliminaire est cruciale avant de pouvoir considérer une application chez l’Homme. Les études aux stades post-nataux débuteront à la naissance et se termineront à 9 mois au plus tard, et avant d’atteindre les points limites fixés dans cette étude. Nos collaborateurs ont déjà établi que les animaux avaient un phénotype à 3 mois, mais n’ont pas testé les stades avant.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéficientes greffées de tumeurs humaines de sarcome, elles reçoivent deux injections par semaine d'anticorps ciblés et de chimiothérapie pendant tout le suivi tumoral, avec des nécroses de tumeur en surface et une cachexie possible menant à la mise à mort. Le porteur affirme que la diversité cellulaire des sarcomes ne se retrouve pas en culture mais seulement dans les greffes chez la souris. Il écarte d'autres modèles comme le poisson zèbre au motif que les schémas d'administration y sont moins standardisés.

Objectifs

Les sarcomes constituent une maladie rare qui touche environ 1000 personnes par an en France. Ils affectent majoritairement les sujets jeunes et présentent un profil métastatique et un taux de récurrence élevé, conduisant à un pronostic réservé . Actuellement les patients sont traités par amputation additionnée de chimiothérapie et/ou radiothérapie. Il convient donc de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques. L'objectif principal de ce projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie sur le développement de certaines formes de sarcomes dans des modèles humains greffés chez la souris. Les expérimentateurs en charge des animaux sont expérimentés dans la mise en œuvre des modèles animaux présents dans les 3 différentes procédures.

Bénéfices attendus

L'hypothèse de ce travail est que la cible thérapeutique étudiée joue un rôle dans le développement des sarcomes. Ceci est basé sur l'évaluation de l'expression de la protéine ciblée dans les tumeurs de patients atteints de cette maladie. Dans le cadre de cette étude, l’effet anti-tumoral d’une thérapie ciblée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie sera évalué dans des modèles murins. Un projet d’essai clinique portant sur le traitement de ces sarcomes avec la thérapie ciblée est actuellement à l’étude. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement du candidat médicament et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Injections sous-cutannées de lignées cellulaires (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL ou 200µL. Injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral) et/ou chimiothérapies (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral).

Impact sur les animaux

Dans les trois procédures il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les individus concernés seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Les animaux ne présentant pas de prise tumorale seront mis à mort 2 mois après la greffe.

Remplacement

Les sarcomes nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension des mécanismes d’action de notre thérapie ciblée. Les modèles retrouvés dans la littérature montrent que cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires mais uniquement dans les greffes chez la souris.

Réduction

Procédure 1) Un nombre de 5 souris par condition, selon 3 différentes conditions de greffe, est suffisant pour évaluer la prise de greffe des différentes lignées cellulaires. Les souris seront greffées dans chaque flanc pour réduire le nombre d’individus nécessaires. Ces expérimentations seront réalisées sur les six lignées cellulaires. Procédure 2) Les lignées ne montrant pas de prise tumorale en procédure 1 ne seront pas utilisées en procédure 2 et 3 conduisant à une réduction. D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 10 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales combinés au fait que nous ne connaissons pas encore l'efficacité de prise de ces modèles, nous envisageons des lots de 45 souris par expérience de manière à pouvoir répartir au moins 10 souris par groupe de traitement (retrait des 5 tumeurs n’ayant pas pris et/ou de trop grosses tumeurs à l’inclusion). Procédure 3) Une fois l’efficacité anti-tumorale déterminée, nous nous intéresserons aux mécanismes d’action de notre thérapie dans les temps précoces du traitement. La procédure 2 sera donc répétée pour les lignées montrant une efficacité anti-tumorale mais avec une mise à mort plus précoce (environ 500mm3) des animaux pour réaliser des analyses biologiques. Des expériences in vitro seront menées sur les lignées pour déterminer leur sensibilité aux agents de chimio thérapie. Ces résultats conditionneront le maintien ou non des conditions de traitement avec ces agents dans les procédures 2 et 3, pouvant ainsi conduire à une réduction. Les traitements seuls ou associés ne montrant pas d’efficacité anti-tumorale dans la procédure 2 ne seront pas utilisés en procédure 3, conduisant également à une réduction. Des statistiques adaptées seront utilisées.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans toutes les procédures le volume tumoral sera évalué 2 à 3 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, cachexie, isolement social) seront surveillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 à 3 fois par semaine.

Choix des espèces

La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l'activité anti-tumorale de la thérapie ciblée étudiée. La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu humain pour éviter les rejets tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps et chimiothérapies sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. La cible thérapeutique étudiée n'est pas exprimée dans certaines espèce. On retrouve une forte homologie entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, les outils destinés à l'analyse des tissus post mortem n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, puis un gavage cinq jours sur sept et des injections d'immuno-chimiothérapie, tout en étant contraintes de courir sur un tapis, pour tester si l'exercice améliore l'effet des traitements. Le porteur reconnaît que le gavage répété est stressant et que des ulcérations ou une tumeur trop grosse conduisent à la mise à mort. Il affirme n'avoir aucune autre possibilité que d'utiliser un "organisme entier".

Objectifs

Nous savons que réaliser de l’activité physique (AP) diminue la mortalité induite par différents types de cancer chez l’Homme. Cela a été montre dans des études chez l’humain et chez l’animal. Cependant, nous ne comprenons pas vraiment comment l’exercice agit pour diminuer la croissance de la tumeur. Notre projet chez la souris est associé à notre projet chez l’homme ou nous souhaitons voir si un exercice physique juste avant la prise des traitements anti-cancéreux améliorerait l’efficacité de ces traitements. Chez l’homme, nous ne pouvons pas souvent récupérer les tumeurs chez des patients en stade avances car il y a trop de risques pour les patients. Nous avons donc besoin de développer d’autres modèles pour étudier les effets sur la tumeur elle-même. L’exercice physique pourrait modifier la réaction du système immunitaire ou le nombre de vaisseaux sanguins sur la tumeur (vascularisation) et ainsi rendre la tumeur plus sensible aux traitements. Secondairement, nous savons que le cancer ainsi que les traitements contre cette maladie peuvent engendrer des effets secondaires. En particulier, il existe une fonte musculaire et une altération de leur fonctionnement. Cela diminue la qualité de vie des patients et serait synonyme d’un moins bon pronostic. Ainsi faire réaliser des exercices physiques aux patients permettraient de maintenir leur masse musculaire et améliorer les effets des traitements. Notre projet vise donc à étudier les effets d’un exercice physique aigu pré- traitements sur 1) le développement de la tumeur dans un modèle de cancer chez la souris ; 2) la fonte musculaire induite dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Le développement de la recherche dans le domaine de l'exercice appliqué à l’oncologie a permis de constituer une base de données importante sur le rôle de l’exercice physique dans la prévention et la gestion des effets indésirables du cancer. Néanmoins, il est essentiel de comprendre comment l'exercice diminue la progression tumorale. Sur le plan scientifique, ce projet permettra donc d’apporter des nouvelles données scientifiques sur les interactions entre l’exercice physique et les traitements anticancéreux des patients ainsi que les mécanismes potentiels par lesquels l’exercice physique pré-administration de l’immunochimiothérapie pourrait potentialiser l’efficacité des traitements. Aujourd’hui pour des questions de réduction de technique invasive chez les patients, de moins en moins de biopsie de la tumeur sont réalisées ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle murin à visée scientifique pour comprendre l’interaction biologique et moléculaire entre un exercice physique réalisé juste avant l’injection des traitements et le microenvironnement tumoral. Ce modèle nous permet donc d’accéder aux tumeurs et d’évaluer l’effet de l’exercice sur la taille de tumeur, les mécanismes immunitaire et vasculaire sous-jacent ainsi que le muscle squelettique. Grâce à cette étude nous pourrons rapidement apporter de précieuses données sur les interactions entre exercice et cancer. Sur le plan clinique, les mécanismes mis en évidence au cours de cette étude permettront d’envisager des essais cliniques futurs grandes ampleurs étudiant plus spécifiquement les effets de ce type d’intervention combiné sur le développement tumoral et la cachexie musculaire associée au cancer, deux paramètres majeurs dans la survie des patients. Ces résultats permettront ensuite de concevoir des essais cliniques plus poussées afin de déterminer et affiner la prescription de la dose d’exercice (durée, intensité, modalités) à utiliser en combinaison à un traitement anti-cancéreux. Ces différentes études permettront d’améliorer la prise en charge des patients et l’efficacité de la thérapie.

Procédures

Les animaux utilises dans ce projet seront tout d’abord soumis à une seule injection sous la peau au niveau du flan gauche de cellules capables de former une tumeur. Après avoir attendu quelques jours pour que la tumeur se forme, les animaux commenceront leurs traitements bases sur une immuno et chimiothérapie. Certains des animaux ne seront pas injectes avec des cellules tumorales et ne développeront pas de tumeurs. Ceux-ci correspondront aux groupes Non-Tumoraux (NT). Pour cela, les animaux recevront une fois par semaine une injection au niveau du ventre pour atteindre les organes (intrapéritonéale) ainsi qu’un gavage (insertion d’une sonde dans l’œsophage) quatre jours sur cinq pour recevoir la totalité des traitements. Une partie des animaux eux ne recevront pas le traitement mais un placebo. Au moment du début des traitements, les animaux commenceront de réaliser de l’exercice physique. Le premier exercice sera réalisé avant même l’injection des tumeurs pour établir le niveau de d’endurance physique des animaux grâce a un test de vitesse maximal de course (VMC) qui permettra d’adapter les exercices suivants. Ces derniers seront réalisés juste avant les traitements anti-cancéreux quatre jours sur cinq et dureront 50 minutes à une vitesse correspondant a 60% de la VMC. Ensuite une partie des animaux, seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs après quatre jours de traitement et/ou d’exercice. L’autre partie des animaux poursuivra le protocole (traitement + exercice) jusqu’à 30 jours. A la fin du protocole, une partie des animaux sera utilise pour évaluer si l’exercice a modifie la vascularisation des tumeurs, c’est-à-dire savoir si l’exercice a permis que la tumeur soit plus perfusée et reçoive plus de traitement. Pour cela, les animaux recevront une molécule capable de visualiser les zones qui ont une diminution de leur taux d’oxygène (hypoxie) qui est une caractéristique des tumeurs agressives. Après cette injection, soient les animaux resteront au repos soient ils seront mis à l’exercice, puis mis à mort pour récupérer les tumeurs. Une autre partie des animaux, sera utilise pour voir si la croissance tumorale et les traitements ont un impact négatif sur les muscles et étudier les mécanismes mis en jeu. Pour cela, nous testerons la capacite des souris à réaliser une contraction musculaire. Puis, les animaux seront mis a mort et les muscles récupérés pour être étudiés.

Impact sur les animaux

Le modèle de tumeur sous la peau ne présente pas de métastases ni d’atteintes musculaires trop importantes. De plus, la localisation sous-cutanée de l’implantation de la tumeur permet de minimiser les douleurs associées à la croissance tumorale de par l’espace disponible et l’élasticité de la peau. La douleur ou gêne occasionnée lors de celle-ci sera néanmoins surveillée, en particulier si les animaux en évaluant une possible gêne à se mouvoir ou a se nourrir. Il est possible que les animaux présentent une plaie au niveau de la tumeur et dans ce cas les animaux touches seront mis à mort dans les plus brefs délais pour arrêter leur souffrance. De même si la croissance tumorale est trop importante et que la tumeur atteint une taille trop importante, les animaux seront sacrifiés. Les intensités d’exercice sont modérées et se rapprochent des intensités utilisées chez des patients atteints de pathologies chroniques. Elles sont donc connues pour induire des adaptations physiologiques bénéfiques sans effets négatifs chez l’homme comme chez la souris. Les différents traitements utilisés au cours de ce protocole ont déjà été validés au cours d’études précédentes et permettent une réduction du volume tumoral tout en minimisant la toxicité liée au traitement. Les traitements sont administrés par gavage ou injection dans le ventre. Les animaux seront donc exposés au stress induit par la contention et à la douleur de la manipulation. Ces gestes seront de très courte durée pour minimiser l’impact négatif sur les animaux. Ces procédures ont été choisies car utilisées dans le modèle tumoral utilise et déjà valide et n’ont pas été modifié pour ne pas changer l’efficacité des traitements. Le gavage 5 jours sur 7 est reconnu comme stressant. L’injection IP altère les tissus autour de la zone d’injection mais celle-ci n’ayant lieu qu’une fois par semaine, cela limitera les effets délétères de ce geste. La mesure de la force chez l’animal est réalisée sous anesthésie générale afin de ne pas induire de stress chez l’animal. Les contractions des muscles induites lors du test n’entraînent pas d’altérations de la fonction et de l’intégrité du muscle squelettique (i.e. crampe et/ou déchirement musculaire).

Devenir

Les animaux seront mis à mort après l’expérimentation car l’utilisation des muscles et de la tumeur sont nécessaires pour répondre aux questions émises dans le projet.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les interactions complexes des traitements combinés immuno/chimiothérapie et de l’exercice physique au sein de la tumeur et le rôle joue par le système immunitaire. De plus le second objectif est d’évaluer l’altération des muscles induits par ces différentes interventions. Nous n’avons donc aucune autre possibilité que d’utiliser un organisme entier. Toutes les découvertes faites lors de ce projet feront ensuite l’objet d’approfondissement dans des modèles de cellules n’utilisant pas d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de nos expériences passées pour mettre en évidence des différences en utilisant le minimum d’animaux. Dès lors que nous obtiendrons des différences entre nos conditions, nous arrêterons les expérimentations chez l’animal afin de maintenir le nombre d’animaux utilises au strict minimum.

Raffinement

Nous veillerons à améliorer au mieux les conditions d’hébergement des animaux en leur donnant accès a des zones cachées pour s’isoler, des jeux et en favorisant les interactions entre les animaux. Si leur condition physique rend difficile leur accès a la nourriture ou à l’eau en hauteur, nous adapterons leur environnement en leur mettant a disposition eau et nourriture au sol. Pour être sûr que la croissance tumorale reste acceptable pour l’animal, nous surveilleront le développement de la tumeur et mettrons a mort les animaux si la tumeur devient trop grosse. Nous surveillerons aussi le poids des animaux pour veiller à ce qu’ils ne subissent pas une perte de poids trop importante et synonyme de leur souffrance. Dans le cas d’une trop forte perte de poids, les animaux concernes seront mis à mort. Le protocole d’exercice physique est d’intensité modérée (60% des capacités maximales). A la suite du test de vitesse maximale de course, la récupération des souris sera vérifiée par observation de leur capacite à bouger le jour de l’intervention et le suivant avec un intervalles de 2h entre deux observations. Les différentes procédures peuvent induire du stress et nous veillerons donc à adapter au mieux nos manipulations pour limiter les actes stressants. Par exemple, nous limiterons le nombre de fois où nous toucherons les animaux en réalisant au même moment la mesure de la taille de la tumeur et les injections des traitements anti-cancéreux ; ou lors du transfert des cages au tapis de course et inversement ou nous pouvons les transférer sans les toucher avec l’aide d’une petite boite. Normalement le modèle ne devrait pas induire de douleur particulière sauf lors de l’atteinte d’un point limite (ulcération ou taille tumorale trop importante) menant à la mise à mort des animaux. Cependant, dans le cas où il semble que les animaux souffrent, nous prendrons contact avec le vétérinaire réfèrent pour évaluer les possibilités d’utiliser des médicaments pour réduire la douleur.

Choix des espèces

Le modèle de cancer sous la peau et les traitements anti-cancéreux que nous utilisons ont été valides préalablement sur les souris. Ces animaux sont très souvent utilisés dans les études en cancérologie ou dans les études portant sur l’exercice physique. Ce modèle permet donc d’obtenir des résultats nouveaux sans avoir à répéter des expériences déjà réalisées avant (nous limitons donc le nombre d’animaux ainsi que les procédures subites par ces animaux). De plus, les outils techniques dont nous avons besoin pour répondre aux questions ont bien été valides chez l’animal augmentant la probabilité d’obtenir de nombreux résultats en utilisant un minimum d’animaux. L’âge des animaux a été déterminé par des études précédentes qui ont valide le modèle que nous utilisons. Nous savons qu’a cet âge, nous obtiendrons un développement de la tumeur suffisant pour répondre à notre question. A cet âge, les animaux ont une fonction musculaire bonne qui permet de diminuer le nombre d’animaux ne voulant pas courir (pourcentage augmentant avec l’âge). Ainsi, a ce stade nous pouvons répondre aux différents questionnements du projet.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales et subissent deux tests de saignement passant par une section de l'extrémité de la queue, pour créer un modèle d'auto-anticorps dirigés contre une protéine de la coagulation. La mise à mort sert à récupérer la totalité du sang et les organes pour doser ces anticorps. Le porteur affirme que ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris et qu'aucun modèle fiable n'existe chez des espèces jugées moins sensibles.

Objectifs

La présence d’auto-anticorps dirigé contre l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) a était historiquement décrit dans les lupus Erythematosus. Même si dans ces études il a était démontré que ces anticorps étaient dirigés contre le domaine catalytique, les techniques de l’époque n’ont pas permis de mettre en évidence un impact des anticorps sur les fonctions du tPA. D’autres études ont aussi montré la présence de ces autoanticorps dans le syndrome des antiphospholipides, une étude en particulier suggère que ces anticorps pourraient éventuellement inhiber l’activité du tPA et augmenterait ainsi le risque de thrombose. De façons plus intéressante, les travaux de Massimo Cugno et collaborateurs en 2010 ont montré que la thrombolyse de patients atteints d’infarctus du myocarde induit une réaction immunitaire qui amène à la production importante d’anticorps anti tPA. Les auteurs proposent ici que ces anticorps diminueraient les fonctions du tPA endogène à moyen terme. Dans ce contexte, au sein de notre laboratoire, nous avons développé un outil original permettant d’évaluer la quantité d’anticorps anti tPA circulant. Nous avons ainsi mis en évidence la présence de ces anticorps dans le plasma de 80 individus ayant donné leurs sangs à l’établissement français du sang. Ces résultats montrent des niveaux très hétérogènes et démontrent que certains individus présentent des taux très supérieurs. Nous avons aussi démontré un impact de ces auto anticorps sur certaines fonctions du tPA. Afin de mieux comprendre le rôle de ces auto anticorps nous avons aujourd’hui besoin de mettre en place un modèle chez la souris. Ce modèle reposerait sur l’immunisation active de souris c57b6 et de souris c57b6 tPA ko (souris tPA NULL).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la création d'un modèle original permettant de comprendre les fonctions de ces auto anticorps et de leur impact sur l’hémostase.

Procédures

- quatre injections intrapéritoneales (duree 5 min chacune) - deux tests de saignement (30 min chacun)

Impact sur les animaux

Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite des injections. Nous pouvons néanmoins nous attendre à du stresse lors de la manipulation de la contention, d’où l’importance de réaliser une habituation préalablement. Une réponse à l'immunisation est attendu avec une augmentation modérée de la température de l'animal. Par ailleurs dans nos expérimentations précédentes, les animaux ayant subi une section de l'extrémité de la queue n'ont pas présenté de signe de douleur ni de souffrance.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin d'évaluer la présence des auto anticorps dans le sang et dans les différents organes. Par ailleurs les études sur l'activité et la quantité de tPA circulant nécessite la totalité du sang de l'animal.

Remplacement

Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 56 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques c57b6 WT et c57b6 tPA Null. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme. Les souris tPA WT et tPA Null utilisées dans cette étude seront commandées à l'age de 8 semaines, à la fin de l'expérimentation les animaux seront âgés donc de 16 semaines correspondant à un stade jeune adulte (4 mois). Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation.

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. La description des procédures reste très générale et le porteur reconnaît des douleurs d'infection et un risque d'obstruction urétérale par les tumeurs. Il justifie ce nombre élevé par la nécessité d'organes intacts et affirme n'avoir "aucune autre alternative pertinente".

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles

1 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse ou dans la veine du foie, puis l'injection de radioéléments couplés à des vecteurs et jusqu'à huit prélèvements sanguins sur cinq mois, pour évaluer de nouveaux médicaments radioactifs contre le cancer. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être étudiés in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable". Les bénéfices annoncés, un transfert en clinique, restent formulés comme une perspective.

Objectifs

L’objectif principal de notre plateforme est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Nous disposons de différents vecteurs (Anticorps, affitines, liposomes, etc…) et de plusieurs radioéléments (Astate 211, Iode 131, zirconium, Yttrium 90 Scandium 47, cuivre 64 etc…), certains connus qui servent de références et des nouveaux, produits. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon « toxique » pour cette cellule. Il faut accrocher le radioélément à un ligand et à un vecteur afin de former un radiopharmaceutique qui doit cibler et détruire la cellule tumorale tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. Nos études suivent le même protocole. Le système vecteur- ligand-radioélément est d’abord testé sur des cellules tumorales en culture. Quand l’efficacité est démontrée, les cellules tumorales sont greffées à des souris. Le système vecteur- ligand-radioélément est injecté aux animaux porteurs de tumeurs pour étudier la distribution dans un organisme vivant, la fixation du radioélément sur la tumeur et tous les organes. La radiothérapie sera appliquée sur 2 types de modèles de métastases expérimentales : injection intraveineuse dans la veine latérale de la queue qui engendre un envahissement disséminé et injection dans la veine porte hépatique qui permet un envahissement du foie. Ces 2 procédures reflètent les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de produire un radiopharmaceutique capable de détruire les cellules tumorales dans des modèles précliniques. En vue d'un futur transfert à la clinique.

Procédures

Greffe de cellules tumorale en intraportale (Procédure 2) : Cette procédure reflète les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements. Injection unique. Concerne 700 souris sur souris analgésiées et anesthésiées. La procédure chirurgicale en elle même dure 15 minutes par souris. Les souris sont ensuite suivies jusqu'à 150jours. Prélèvement sanguins 50µl de sang à J-7,15,30,45,60,90,120, 150 pour évaluer toxicité hématologique (procédure 3). Lors des prises de sang, une goutte de tétracaïne 1% collyre unidose est appliquée au niveau de l’œil puis les souris sont anesthésiées sous isoflurane, et le sang est prélevé au niveau du sinus rétro orbital à l’aide d’un capillaire. Les prélèvements en eux mêmes ne durent qu'une trentaine de secondes et concernent 1750 souris.

Impact sur les animaux

Les procédures de modèles de métastases (procédure 1 et 2) sont modérées si les animaux sont bien suivis. Ils seront suivi quotidiennement selon une grille de score et de points limites (en annexe) qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. En palier 1 (un critère de la liste en annexe): AINS : Méloxicam 2.5 mg/kg/jour dans l’eau de boisson. En palier 2 (2 critères associés de la liste en annexe) : morphinique faible : Buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané matin et soir (soit 50 µL à 0,03 mg/mL pour une souris de 25 g). En palier 3 : mise à mort. La procédure de thérapie (3) pourrait entraîner des effets indésirables. Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Enfin, la procédure d'imagerie (4) n'entraine pas d'effet indésirable

Devenir

Porocédure 1 : 1050 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie. Procédure 2 : 700 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie.

Remplacement

Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des vecteurs est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.

Réduction

Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism. Nous utiliserons des T-tests non paramétriques pour les analyses intergroupes, et un test Logrank pour l’analyse des courbes de survie.

Raffinement

L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois ou cinq en fonction des protocoles, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé.

Choix des espèces

Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes. Les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe