Recherche fondamentale

1 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe des tumeurs sous la peau, dans le côlon ou dans la rate, puis les infecte par des bactéries modifiées censées libérer des molécules anticancéreuses au contact de la tumeur. Il indique que la greffe et la croissance tumorale peuvent provoquer perte de poids, prostration et perte de poils en fin d'étude. Il affirme qu'aucune alternative en laboratoire ne permet de faire croître une tumeur tout en conservant la diversité de ses cellules.

Objectifs

Le projet consiste en une étude chez la souris, d’utilisation de bactéries non pathogènes issues de la flore intestinale, comme agents thérapeutiques anti-cancéreux. Dans ce but, les bactéries sont modifiées afin de libérer au niveau de la tumeur des molécules chimiques anti-cancéreuses. Ce projet sera réalisé dans deux modèles tumoraux : cancer colorectal et le fibrosarcome. Dans le cadre de nos recherches, nous avons travaillé sur la modification de lactobacilles qui, par leurs caractéristiques, se présentent comme une thérapie prometteuse. Notre objectif est de réaliser une étude d’infection par ces modèles bactériens afin de démontrer que leur utilisation est possible pour atteindre différents types de tumeurs et développer des molécules thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

La biologie permet aujourd’hui de concevoir et construire de nouveaux outils qui peuvent être utilisés afin de produire des composés d’intérêt ou de détecter des molécules (marqueurs ou contaminants environnementaux), d’assainir l’environnement et de créer de nouvelles thérapies. Notre projet s’inscrit dans ce dernier domaine et a pour objectif de développer de nouveaux modes de thérapie anti-tumorale. Les résultats attendus sont : (i) la validation de bactéries non pathogènes en tant qu’agent thérapeutique, (ii) la démonstration de l’efficacité anti-cancéreuse des molécules libérées par les bactéries au site tumoral et (iii) l’absence d’effets secondaires tels que ceux observés lors de chimiothérapies ou immunothérapies.

Procédures

Les animaux vigiles pourront être soumis à 3 types de procédures : - Greffe sous-cutanée, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 1) ou - Greffe intra caecale, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 2) ou Greffe intra splénique, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 3).

Impact sur les animaux

La procédure de greffe, le développement tumoral ou encore l’induction de molécules anti-tumorales peuvent entraîner : une perte de poids ou des effets indésirables chez les animaux tels que : prostration, dos courbé, ou perte des poils. Ces signes ne devraient apparaitre qu’en fin d’étude. Les animaux faisant l’objet d’un dépassement des points limites ou présentant des signes de souffrance clinique irréversibles seront systématiquement euthanasiés et sortis de l’étude.

Devenir

Tous les animaux ayant fait l’objet d’une des procédures seront euthanasiés par inhalation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale, réalisée par du personnel formé et compétent.

Remplacement

- « Remplacer » les modèles animaux : pour ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative en laboratoire permettant de faire croître une tumeur isolée à partir d’une lignée cellulaire tout en maintenant la diversité des cellules qui composent cette tumeur.

Réduction

« Réduire » le nombre d'animaux en expérimentation. Nous avons prévu prévu de réaliser une étude pilote puis d'utiliser un nombre minimum mais suffisant d’animaux pour garantir l’obtention de résultats pertinents et utilisables pour la génération de nouvelles thérapies bactériennes anti-cancer.

Raffinement

« Raffiner » la méthodologie utilisée, ce qui implique les notions d’élevage en milieu enrichi et de points limites (critères d'interruption de l’expérience). Afin d’améliorer la qualité de vie des souris, elles seront hébergées dans des cages d’une superficie de 500cm2. La litière sera enrichie avec des frisottis ou des carrés de cellulose. Nous porterons une attention particulière au bien-être de nos animaux qui feront l’objet d’un suivi quotidien. Pour les greffes de lignées de cellules cancéreuses, toutes les mesures d’asepsie, d’anesthésie, d’analgésie et de confort lors du réveil des souris, seront prises. Les souris seront ensuite traitées par les bactéries qui seront injectées par voie intra-tumorale, intraveineuse ou orale. L’évolution des traitements sera suivie par imagerie. .

Choix des espèces

L’étude de l’effet des thérapies bactériennes y compris sur le système immunitaire se fera sur des souris immunocompétentes C57Bl/6 greffées avec différents modèles tumoraux (colon et fibrosarcome). Les souris seront réceptionnées à l’âge de 4 semaines puis greffées 1 semaine plus tard (temps d’acclimatation minimum après réception).

1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe à des souris immunodéprimées des cellules humaines rendues cancéreuses, puis suit la prise de greffe par des ponctions dans le fémur sous anesthésie chaque mois, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Il indique surveiller la perte de poids, une croissance tumorale pouvant s'accompagner de nécrose ou d'ulcère cutané. Il affirme avoir "besoin" d'un "organisme entier" pour étudier le développement des tumeurs et conclut que la souris n'est remplaçable par aucune autre méthode.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la conception de deux modèles de cancer du sang, associés a des altérations chromosomiques, chez des souris immunodéprimées. Pour cela les souris recevront des cellules humaines exprimant, après manipulation, des acteurs clés de la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse. Ce projet se déroulera uniquement après validation in vitro du caractère cancéreux des cellules générées afin de limiter le nombre d'animaux nécessaires à ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra pour la première fois le développement de deux modèles de cancer du sang associés à des altérations chromosomiques. En mettant à jour le rôle clé de certaines molécules, iIl pourrait mettre en évidence de nouvelles combinaisons thérapeutiques. pour ces deux cancers.

Procédures

La greffe chez les souris recevant une injection par voie retro-orbitale sera suivie par ponction médullaire tous les mois. En pratique les souris sont anesthésiées sous anesthésie gazeuse, après désinfection à l'alcool de la patte, un trou est effectué dans le fémur, la ponction s'effectue par aspiration dans ce trou à l'aide de seringue . Au moment opportun les souris seront sacrifiées par dislocation cervicale pour être disséquées

Impact sur les animaux

La prise de greffe devra etre surveillée car elle peut engendrer une perte de poids importante et rapide et une modification du comportement des animaux. Une croissance tumorale en sous-cutanée peut etre également associée à une nécrose/ulcère de la peau. Ainsi, après toute application d'une procédure, les critères de surveillance généraux seront appliqués : une perte de poids atteignant les 20%, un comportement anormal grave, un arrêt d’alimentation, une baisse de la température corporelle ou un mutisme de plus de 24 h conduiront à un arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’animal sera immédiatement euthanasié.

Devenir

A la fin de l'expérimentation, euthanasie par dislocation cervicale.

Remplacement

La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable à aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Les expériences sur les souris ne sont faites que après avoir testé in vitro les differents ARN non codants et la translocation NPM_ALK. Seuls les « acteurs » ayant un intérêt biologique seront testés sur l'animal. Cette étape est nécessaire en cancérologie car il est crucial de connaitre le devenir des cellules cancéreuses dans un organisme entier afin d'étudier les risques de genèse, de metastases ou de rechutes après traitement.

Réduction

Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée afin d'optimiser nos protocoles pour réduire au maximum le nombre d'animaux. Des études statistiques nous permettent également de déterminer le nombre minimum de souris nécessaires afin que l'expérience ait une valeur scientifique et n'est pas besoin d'être reproduite.

Raffinement

L'évaluation quotidienne de la souffrance nous permet de déterminer si l'expérience doit être arrêtée. Pour cela des points limites et une methode d'évaluation pour la prise en charge des animaux sont identifiés. Les experimentations seront réalisées sous anesthésie et avec utilisation d'analgésie.

Choix des espèces

La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable par aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Ce modèle expérimental nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés (pour permettre la croissance des cellules humaines). La souches murine de référence pour l’implantation des cellules primaires humaine et les cancers hémathologiques est la souris NSG. Animaux adultes à partir de 6 semaines. L’utilisation d’animaux adultes est justifiée par le fait que les deux hémopathies malignes que nous étudions sont des cancers de l'adulte.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

544 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un modèle de dépression obtenu par corticostérone dans l'eau de boisson pendant cinq semaines, suivi d'injections de kétamine, de chirurgies stéréotaxiques cérébrales et de la pose de canules intracérébrales. Il indique que les animaux subissent une "batterie de tests comportementaux" dont il ne précise pas le détail, avant la mise à mort pour analyser les marqueurs cérébraux. Sur le remplacement, il affirme que la dépression ne peut être reproduite sur des lignées cellulaires et que la souris en offre un modèle proche de l'humain.

Objectifs

La découverte de propriété antidépresseur de la (±)-kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et a suscité l’espoir de nouvelles avancées thérapeutiques. En effet, alors que les antidépresseurs classiques ciblant les systèmes monoaminergiques mettent des semaines à agir et sont souvent inefficaces - 30 % des patients ne répondent pas au traitement - l'administration d'une dose subanesthésique unique de (±)-kétamine provoque des actions antidépresseurs rapides et robustes chez les patients souffrant de dépression pharmaco-résistante. Si ce pouvoir antidépresseur est fermement établi, plusieurs aspects du mode d'action de la (±)-kétamine restent mal caractérisés ou controversés, et son utilisation clinique est limitée par des effets psychomimétiques indésirables sévères. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent son efficacité antidépresseur rapide et ses caractéristiques psychomimétiques afin d’identifier de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique sûre dans les troubles dépressifs. Nous proposons qu'en remodelant l’organisation synaptique des récepteurs NMDA du glutamate (récepteurs majeurs de la neurotransmission excitatrice), la (±)-kétamine modulerait les réseaux neuronaux soutenant la récompense et l'humeur, et soulagerait ainsi les symptômes de la dépression.

Bénéfices attendus

En utilisant une combinaison de techniques d’imagerie de super-résolution, électrophysiologie, de biochimie et de comportement, nous évaluerons l'impact de la (±)-kétamine sur la dynamique, la stabilisation et l’organisation synaptique des récepteurs NMDA dans les réseaux corticaux et hippocampiques. Nous étudierons ensuite comment les redistributions des récepteurs NMDA induites par la (±)-kétamine peuvent soutenir les changements de connectivité au sein des réseaux cortico-mésolimbiques et mettrons en œuvre des tests comportementaux pour établir si moduler l’organisation des récepteurs NMDA aux synapses contrebalance ou imite les actions antidépresseur ou psychotomimétique de la (±)-kétamine.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions: -remplacement de l'eau de boisson par une eau de boisson supplémentée avec de la corticosterone pour generer un stress chronique chimique visant à créer un modéle de depression (5 semaines), qui sera reversé par l'injection intraperitonéale de Kétamine (1 min). -Les animaux subiront une batterie de tests comportementaux pour evaluer la depression et l'impact de la ketamine ou des anticorps bloquant la mobilité des récepteurs sur la depression. (12 jours). -Des injections intracerebrales de virus par chirurgie stéréotaxique (30 min) permettant d'identifier des changements de connections entre les réseaux neuronaux de la depression. -Installations par chirurgie des guides cannules intracérébrales (1h) et injection intracerebrale de molécules visant à manipuler les réseaux neuronaux de la depression (15 min) Avec l'euthanasie, notre saisine contient 6 procedures, mais tous les animaux ne subiront pas les 6 procédures.

Impact sur les animaux

Notre modèle de dépression chez la souris repose sur l’administration chronique de corticostérone dans l’eau de boisson pendant une période de 5 semaines. Ce traitement va donc générer un comportement anxieux et dépressif. Nous mettrons en œuvre également des approches chirurgicales, soit pour injecter des préparations d'ADN, soit pour poser des systèmes médicaux à demeure (canules d’injection) permettant l’injection intracérébrale locale. Ces approches chirurgicales pourront occasionner une gêne associée à la cicatrisation et la récupération post- chirugicale. Toutes ces nuisances sont suivies et pris en charge médicalement quand cela est possible

Devenir

A l'issu de chaque procédure, les animaux sont maintenus en vie pour participer à une autre procédure ou soient euthanasiés pour réaliser l'analyse des marqueurs moléculres de la depression

Remplacement

La dépression est une pathologie complexe, faisant intervenir plusieurs régions cérébrales et plusieurs systémes de neurotransmetteur. Il est impossible de mimer les changements cérébraux sur des modèles alternatives types lignées céllulaires. Les modèles murins offrent une opportunité unique d'étudier au plus prés de la pathologie humaine la depression

Réduction

Une planification précise des expériences a également été établie afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, tout en ayant des groupes suffisamment importants pour obtenir des statistiques solides (réduction).

Raffinement

Toutes les chirurgies s'accompagnent de l'injection de substances pharmacologiques permettant de réduire durablement la douleur et les souffrances pendant la chirurgie et les jours suivants, pendant la phase de récupération. Le stress des injections intracérébrales (IC) est réduit par une manipulation quotidienne des souris pour l'entretien des guides canules. Les effets secondaires potentiels seront évalués par un suivi des prises alimentaires. Des changements dans l’interaction des animaux avec les expérimentateurs seront contrôlés quotidiennement, 3 jours avant et pendant toute la période des injections. Si ces paramètres varient, ils seront consignés et provoqueront l'arrêt des injections. Les animaux seront maintenus par 4 afin de maintenir le comportement social, pour une cabane transparente rouge et un carré de coton seront ajoutés dans la cage pour enrichir l’environnement. Si nous observons un ou plusieurs des signes cliniques tels que la perte de poids, l'absence d'appétit, l'agressivité anormale à la manipulation, poils hérissé et dos vouté, indifférence par rapport au milieu extérieur). Une fiche de suivi quotidien est initiée pour un suivi sur au moins 5 jours (cf suivi chirurgie). Si les solutions de raffinement telles que le réchauffement de l'animal, l'apport de nourriture ramollie/en gel enrichi en glucose ne changent pas durablement l'état de santé de l'animal durant les 5 jours de suivi, nous procéderons à la mise à mort de l'animal. Le responsable de l'étude est le seul à pouvoir prendre la décision de mise à mort à ce stade.

Choix des espèces

Notre projet utilise des souris C57BL/6J principalement en raison de la forte homologie dans les mécanismes de base de la depression entre l'homme et la souris. Les réseaux neuronaux et les systémes de neurotransmetteurs mis en jeu sont similaire entre la souris et l'homme. De plus, les nombreuses stratégies thérapeutiques actuelles chez l'homme ont été développé ce qui permet d'illustrer la pertinence de ce modèle La depression est une pathologie qui touche tous les ages, sans réelle prépondérence en fonction de l'âge, c'est pourquoi nos études se feront sur les souris adultes (2-4 mois)