Recherche fondamentale

80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime riche en graisses induisant l'obésité, complété par une supplémentation en poudre de tomate, avec prises de sang par incision de la queue, perçage des oreilles, tests de tolérance au glucose et à l'insuline et isolement pour recueil des fèces. Il indique que l'isolement provoque un stress social et que l'incision et le perçage peuvent être douloureux, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'une supplémentation sur la santé métabolique ne s'envisage qu'in vivo.

Objectifs

La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de tomates et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit différents niveaux de stress hydrique et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (6 poudres différentes en tout) puis administrés à 80 souris C57Bl/6J males (8 groupes de 10 souris) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudres de tomate sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors d'un test de tolérance à l'insuline, d'un test oral de tolérance au glucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors de la distribution des doses de glucose pendant le test oral.

Devenir

Les animaux de cette prcédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet quei seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique sera appliquée localement lors du perçage des oreilles pour identification et avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Et une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

323 rats âgés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime de sous-nutrition provoquant une perte de masse musculaire, testé contre un probiotique, avec prises de sang sur animal vigile. Il indique que la mise à mort se fera par prélèvement d'une grande quantité de sang sous anesthésie jusqu'à l'arrêt cardiaque, une dérogation ayant été demandée pour éviter que l'anesthésique ne fausse les mesures. Sur le remplacement, il affirme que la fonte musculaire liée à l'âge est impossible à reproduire en culture cellulaire et que le rat est "la seule option possible".

Objectifs

La proportion des personnes âgées (60 ans et plus) est amenée à représenter un tiers de la population française à l’horizon 2050. Cette population est très hétérogène et se caractérise, pour les extrêmes, par des individus en bonne santé, actifs, en bon état nutritionnel, peu sarcopéniques (perte de masse et de fonction musculaire liée à l’âge) et vivant en général chez eux. A l’inverse, il existe (au même âge) une population âgée fortement sarcopénique, généralement dépendante et vivant en institution et en état de sous nutrition chronique. C’est à cette dernière population spécifique que le présent projet s’adresse avec l’objectif de limiter, par une stratégie nutritionnelle (développement d’un aliment fonctionnel), la survenue de la fonte musculaire liée à l’âge généralement associée à l’état de dépendance. Il a été observé, par un des partenaires du projet que certains lactobacilles étaient sur-représentées chez des individus ayant subi une résection de l’intestin. Un transfert de ces bactéries à des rats axéniques a montré une augmentation de l’efficacité d’utilisation de l’énergie et de l’absorption des nutriments alimentaires chez ces animaux, associées à une stimulation de la synthèse des peptides digestifs, une augmentation du trophisme intestinal et une augmentation de l’insulino sensibilité et de l’état nutritionnel des animaux en général. En parallèle, il a également été montré par un des partenaires du projet qu’une amélioration de la santé intestinale pouvait favoriser la redistribution des nutriments énergético-azotés de l’aire splanchnique (intestin/foie) vers les tissus périphériques dont le muscle.

Bénéfices attendus

Nous voulons donc faire la preuve de concept qu’il est possible, par une sélection de bactéries avec des modèles in vitro efficaces et complémentaires (cellules intestinales en culture et C Elegans), de maximiser l’utilisation de l’énergie alimentaire (par une stimulation de l’appétit et de l’efficacité énergétique) afin d’améliorer le statut nutritionnel et l’anabolisme musculaire chez des individus en situation de sous nutrition, en particulier des populations de personnes âgées dépendantes présentant souvent un statut nutritionnel altéré et une fonte musculaire importante. Nous réalisons donc une étude sur une période de 60 jours pour étudier l'impact de notre probiotique sur la masse musculaire (effet long terme) et, sur rats Wistar âgés, une étude plus mécanistique à plus court terme (30 jours) pour évaluer l'impact du probiotique sur la synthèse protéique musculaire (élément explicatif de la fonte musculaire et fortement régulé dans les premières semaines d'altération du statut nutritionnel).

Procédures

- prélèvements de sang sur animaux vigiles pour les tests de tolérance orale au glucose (une fois au début et à la fin de l'expérience pour les animaux de la procédure 2)- Une demande de dérogation a été faite concerant la mise à mort des animaux (tous les animaux de l'étude) car la surdose d'anesthésique modofoe les paramètres biologiques que nous mesurons (notamment le métabolisme énergétique). Par ailleurs, une mise à part par inhalation de CO2, commotion cérébrale ou décapitation ne permettrait pas de réplever le sang nécessaire aux analyses. Nous prélevons donc une grade quantité de sang sous anesthésie gazeuse et la mort survient suite à un arrêt cardiaque lié à l'hypovolémie. La mort de l'animal est vérifiée par absence de battement cardiaque et de respiration. En cas de signes de vie, l'animal subit une dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

L'effet de la sous-nutrition des animaux va induire nécessairement une perte de masse globale, de masse maigre et de masse grasse des animaux. Ces composantes, mesurables au cours de l'étude, permettront d'éviter une perte de masse des animaux trop importantes sur une durée courte. les quantités ingérées seront adaptées en cas de perte trop importante de poids des animaux (voir points limites). Les probiotiques utilisés sont des bactéries de familles que l'on retrouve dans des produits laitiers fermentés, il n'y a pas de base scientifique avarée permettant d'imqginer que ces bactéries puissent générer de réponse physiologique ou métabolique délétère chez les rongeurs.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car dans tous les cas des prélèvements de tissus ou de sang sont envisagés pour pesées et mesures ultérieures

Remplacement

Cette étude vise à déterminer comment, par une stratégie nutritionnelle, il est possible de limiter la fonte musculaire liée à l'âge. Cette sarcopénie est une condition physiologique impossible à reproduire sur des modèles expérimentaux plus simples comme la culture de tissus ou de cellules. De plus, les suppléments nutritionnels (probiotiques) apportés sont connus pour avoir des effets directs sur l'intestin mais également un effet indirect sur le métabolisme musculaire. La dimension intégrant la complexité des interactions entre micobiote, tissus et organes est donc importante, ce qui ne se retrouve que chez les animaux vivants. L'utilisation d'animaux (ici rats) est la seule option possible.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupes a été optimisé pour à la fois permettre d'obtenir des données potentiellement significatives mais sans utiliser plus d'animaux que nécessaire (test de chi2 pour estimer le nombre d'individus selon le nombre de ainsi que le nombre de groupes a été limité

Raffinement

Les méthodologies employées lors des mesures réalisées ont été employées afin de pouvoir utiliser les mêmes animaux pour des mesures répétées (analyses de la composition corporelles par Echo-MRI par exemple). Cette mesure, non invasive, permet de voir un effet de traitement sur une composante que l'on peut mesurer plusieurs fois sur le même animal. Par ce biais, on gagne fortement en puissance statistique en limitant la mise à mort des animaux pour des mesures intermédiaires. Elle permet également de préciser le moment le plus pertinent pour réaliser la mise à mort relativement à l'objectif visé (ici un effet sur la masse maigre). Par ailleurs, sur ces analyses en Echo-MRI, nous avons limité le temps de séjour des animaux dans l'appareil afin de limiter le stress des animaux au cours de la mesure. Par ailleurs, les animaux bénéficient d'un environnement enrichi (jouets en Inox). Enfin, les points limites ont été clairement définis : En cas d’apparition d’un point limite (absence toilettage, pilo-érection, posture anormale, porphyrine, hypo-activité, agressivité, trychophaghie, maigreur, vocalises, hypo-réactivité, comportement de fuite, automutilation, tumeur ou perte de poids>20%) l’animalier alertera les responsables de l’étude. Nous effectuerons une observation plus poussée de l’animal. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, il pourra être apporté à l'animal des soins (nettoyage de plaie, prise d’antalgique, d’anti-inflammatoires) ou, si les soins sont inefficaces ou que les soins ne peuvent pas être apportés, les animaux sont euthanasiés par inhalation de CO2. Ci dessous la liste des points limites notables : apparence sans manipulation (manque de toilettage, piloérection, posture anormale, porphyrine), comportement sans manipulation (hypoactivité, agressivité, trychophagie, maigreur, baisse d'ingestion), apprence lors de la manipulation (diarrhées, sang dans les urines ou féces, deshydratation), comportement lors de la manipulation (agressivité, vocalisation, hypo-réactivité, fuite anormale). La liste des points limites graves : mutilation, absence d'ingestion (supérieure à 2j), tumeur, perte de poids supérieure à 20%.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des rats Wistar âgés de 6-8 ou 18-20 mois. Afin d'étudier le métabolisme musculaire et l'effet potentiellement bénéfique de probiotiques chez le sujet adulte ou âgé, nous avons besoin d'un modèle animal dont le métabolisme soit proche de l'homme, dont la durée de vie est limitée afin d'avoir rapidement des animaux âgés et de taille raisonnable. Le rat est l'animal le plus approprié. De plus nous avons déjà fait des études du métabolisme musculaire en situations cataboliques chez le rat Wistar au laboratoire (Mercier et al, 2002; Magne et al, 2012). L'utilisation du rat Wistar adulte et âgé dans cette étude nous permettra de comparer les données par rapport à des études précédentes. Animaux adultes ayant fini leur croissance : adultes jeunes (6-8 mois) et animaux âgés (18-20 mois) couramment utilisés dans l'ensemble des études sur le vieillissement dans le laboratoire (Dardevet et al, 2012).

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une injection d'azoxyméthane déclenchant une cancérogenèse du côlon, suivie cent jours plus tard d'un jeûne de seize heures, d'un gavage et d'une prise de sang sous anesthésie, avant la mise à mort et le prélèvement du côlon. Il indique que les interventions peuvent provoquer du stress mais "pas de douleur" et que les lésions précancéreuses restent indolores. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune étude in vitro ne reproduit l'ensemble du développement d'un cancer colique.

Objectifs

Le contrôle de la perméabilité intestinale joue un rôle crucial dans le maintien d’une intégrité fonctionnelle et protectrice de l’intestin, face à de nombreux intrants alimentaires ou toxiques et face au contact permanent entre le microbiome et le tube digestif. De nombreux cas de fragilité ou de pathologies intestinales ont été associés à une augmentation de la perméabilité intestinale qui peut être observée de façon transitoire ou permanente. Cette perméabilité augmentée a été largement observée suite à des situations de stress, d’inflammations ou de cancers colorectaux (CRC) mais sa contribution dans la genèse ou l’entretien de pathologies intestinales reste à préciser. Ce projet étudiera la perméabilité intestinale de façon globale, in vivo mais aussi ex vivo sur des côlons prélevés post mortem, en comparant des rats mâles témoins à des rats dont la cancérogénèse colorectale a été chimio-induite 100 jours plus tôt par une injection d’azoxyméthane. Chez ces animaux traités, des lésions prénéoplasiques indolores se seront développées dans les côlons sans aller jusqu’au stade tumoral et sont de bons marqueurs de cancérogenèse qui sont largement acceptés par la communauté scientifique. Ces lésions seront dénombrées après mise à mort des animaux et la perméabilité intestinale sera détectée in vitro. Nous chercherons notamment à préciser en précisant l’abondance des zones perméables et leur proximité avec des lésions précancéreuses.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de préciser, notamment sur les côlons prélevés post mortem, où se situent les zones perméables du côlon et leur proximité des zones prénéoplasiques afin de mieux comprendre en quoi la perméabilité intestinale peut participer au processus de cancérisation du colon. La comparaison de la structure des côlons sains par rapport à celle des rats chimio-induits nous permettra d’identifier les lésions prénéoplasiques et de potentielles différences de perméabilité intestinale dans les zones saines ou précancéreuses.

Procédures

Sur une durée d’expérience de 100 jours, les rats vigiles seront soumis à J0 à une injection intrapéritonéale d’AOM, à J90 à une mise à jeun, avec accès libre à l'eau de boisson, puis gavage au FD4 et prélèvement de sang à la queue sous anesthésie à l'isoflurane, à J100 mise à mort sous anesthésie, par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Seules quelques interventions sur les animaux seront effectuées pouvant provoquer un peu de stress mais pas de douleur. A J0, 12 rats recevront une injection intrapéritonéale d’azoxyméthane (AOM) dilué dans du sérum physiologique sera effectué par une personne qualifiée, afin de réduire la douleur et le stress de l’animal. A J90, le gavage de FD4 sera effectué par un utilisateur expérimenté ainsi que la prise de sang qui sera effectuée sur animaux anesthésiés à l'isoflurane. Le jeûne de 16h, avant l’administration orale est long mais nécessaire pour vider le côlon de ses fèces et le rendre ainsi accessible au FD4. Avant cette expérience les animaux auront été habitués à la contention et au gavage pendant quelques jours pour diminuer leur ressenti de stress.

Devenir

Tous les animaux seront anesthésiés et mis à mort à la fin de l’expérimentation (J100 après injection d’azoxyméthane) et leur côlon sera prélevé.

Remplacement

Aucune étude in vitro ne permet d’évaluer l’ensemble des étapes de développement des cancers, au niveau de l’écosystème colique. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité physiologique du côlon, dans les différentes étapes de son fonctionnement et du développement de foyers cancéreux qui sont influencés par la consommation alimentaire, la formation de composés toxiques, le microbiote et qui sont en permanence régulés par les systèmes immunitaires, sanguins et nerveux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum (12 rats témoins et 12 rats traités à l’AOM) pour obtenir des résultats statistiquement solides et fiables dans l’appréciation de la relation entre l’installation de foyer prénéoplasiques dans le côlon et des modifications potentielles de la perméabilité intestinale.

Raffinement

Les rats seront maintenus à 2 par cage qui sera transparente pour ne pas souffrir d’isolement et dans laquelle un tunnel pour s'abriter sera ajouté pour raffinement. La température et l’hygrométrie seront maintenues constantes avec un cycle constant de lumière et obscurité de 12h chacune, un accès illimité à la nourriture et à l’eau et un change de litière hebdomadaire, pour leur confort. Les interventions sur les animaux (contention, injection d’AOM et gavage au FD4) seront réalisées par des techniciens expérimentés et après une habituation des rats, afin de limiter leur stress. La prise de sang sera effectuée sous anesthésie brève à l’isoflurane.

Choix des espèces

Le traitement de rats de la souche F344 à l’AOM induit dans leur côlon des carcinomes qui sont similaires aux carcinomes coliques humains sur de nombreux aspects comme la formation de foyers de cryptes aberrantes (ACF pour aberrant crypt foci) qui sont des lésions prénéoplasiques. Ces lésions sont précurseurs des adénomes ou carcinomes coliques chez l’homme et, chez le rat, permettent d’étudier la raison de la genèse des cancers colorectaux et de développer des thérapies préventives ou curatives. Rats adultes L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes. Ce projet vise à compléter les études précédentes des stratégies préventives sur le rôle du fer héminique dans l’effet promoteur de la cancérogenèse colorectale, il est important de rester au même stade de développement.