Recherche fondamentale

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette demande ne couvre que la partie élevage d'un projet sur la sclérose latérale amyotrophique, les animaux ne subissant pas d'intervention active mais développant les altérations motrices de la maladie, suivies par une grille de score. Le porteur indique que le phénotype lui-même est dommageable et surveille de près la moitié des animaux. Le bénéfice avancé est une meilleure compréhension d'une maladie mortelle chez l'humain.

Objectifs

Cette DAP ne couvrira que la partie élevage du projet. La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homeostasie corporelle. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones cholinergiques qui sont moléculairement extremement proches des neurones qui commandent les muscles striés: les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caracterisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et au décès des patients par insuffissance respiratoire. Les causes précises de la degenerescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette degenerescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau de son partenaire synaptique: le muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du controle vasculaire et nerveux des muscles à la degenerescence des MNs. L' objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoses (avant l'apparition des symptomes moteurs) de la regulation sympathique sur un modele murin de la SLA, la souris SOD1 G93A.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la SLA. La maladie se déclare à l’âge adulte chez l'humain (40- 80 ans) et va évoluer, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient par paralysie des muscles respiratoires. Il est donc important pour les patients qu'on avance sur la connaissance de cette maladie (cause, détection de signes précoses, traitements, etc.)

Procédures

Les animaux ne subiront aucune procédure. Seul le phénotype sera dommageable et donc suivi dans le temps grâce à une feuille de scoring. L'ensemble des animaux du projet seront concernés (n=80)

Impact sur les animaux

La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude)

Devenir

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immunohistologiques.

Remplacement

le nombre d'animaux choisit pour l'étude est le minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiques fiables. Il est important de ne faire ni trop, ni trop peu afin de ne pas avoir à refaire l'ensemble de l'expérimentation. Ce nombre a été choisit sur la base de d'expériences précedentes du laboratoire et de la bibliographie dans ce domaine. Les tests utilisés seront d'abord un test de normalité afin de savoir si les courbes des données recueillies suivent la loi normale. En fonction, des tests paramétriques ou non seront faits afin de comparer nos lots.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations dans notre laboratoire sont faites ex vivo, sur cellules vivantes. Cela a permis d'obtenir un certain nombre de données en évitant toute souffrance animale. Toutefois, dans certains cas, il est indispensable de travailler dans un système intégré comme un organisme complet. Ainsi, il n'est, dans notre cas, pas possible de reproduire les modifications de commande nerveuse sympathique dans une modèle de maladie, avec uniquement des systèmes ex-vivo. Pour le traitement des données, nous utiliserons des tests ANOVA one and two ways.

Raffinement

Les individus porteurs de la mutation seront suivis régulierement. Un scoring sera fait toutes les semaines à partir de P60 puis tous les 3 jours à partir de P90. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé inutilement afin de préserver le caractère grégaire de la souris.

Choix des espèces

La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les mâles reproducteurs seront mis en accouplement dès 7 semaines à la descente des testicules. Les stades de prélèvements sont ceux habituellement utilisés dans la littérature pour l'évaluation de la SLA sur ce modele murin.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une irradiation localisée à forte dose au colorectum, à l'abdomen ou au thorax, jusqu'à 27 Gy, puis est maintenu sept jours avant euthanasie. Le porteur indique que l'irradiation entraîne des douleurs et une perte de poids, la mise à mort survenant si l'animal perd plus de 20 % de son poids. Cette phase vise à mettre au point l'isolement des cellules endothéliales et le choix du modèle d'irradiation.

Objectifs

Le projet que nous présentons ici s’inscrit dans le cadre de ce projet de développement des outils de prédiction des lésions tissulaires radio-induites, basé sur la réponse moléculaire des cellules endothéliales à l’irradiation in vitro en raison de leur rôle dans l’initiation et le développement des toxicités liées aux fortes doses d’irradiation localisée (Annexe 2). Pour évaluer les effets des nouvelles modalités d’irradiation en radiothérapie, notre programme de recherche s’appuie sur les mesures d’un ensemble de paramètres biologiques dans les cellules endothéliales cultivées in vitro comme l’expression de gènes, la sénescence ou le cycle cellulaire, pour comparer des rayonnements ionisants de différentes qualités. Des premières séries expérimentales sur des souris ont permis de confirmer ces différences de réponse pour des débits de dose différents in vivo (12). Pour rendre notre modèle plus robuste, nous souhaitons maintenant collecter et utiliser des données provenant de cellules endothéliales irradiées in vivo. La phase 1 des expériences in vivo est proposée dans ce protocole : il s’agira de mettre au point l’isolement des cellules endothéliales d’organes de souris contrôles et irradiées, condition nécessaire à l’étude de l’expression des gènes et des protéines de ces cellules, afin de comparer les rendements et qualités (notamment la viabilité) des cellules obtenues à partir de trois organes d’intérêt : colorectum, intestin et poumon. En effet, il se peut que certains organes soient mieux adaptés à l’obtention de quantités et de viabilités des cellules suffisantes pour la suite des expériences (cytométrie en flux et séquençage de l’ARN sur cellules uniques). Ce protocole permettra de faire le choix de l’organe pour la suite du projet. Dans la phase 2 du projet, il s’agira d’irradier l’organe choisi lors de la première étape à différentes énergies et différents débits de doses. Cette phase du projet sera proposée dans une future DAP. L’objectif du projet présenté ici (cf. Annexe 3) sera de réaliser des expériences pour choisir, parmi les modèles d’irradiation localisée au niveau du, de l’abdomen (intestin) ou du thorax (poumon), le modèle qui permettra de collecter le plus grand nombre de cellules endothéliales et dans le meilleur état possible (proportion de cellules vivantes supérieur à 80%).

Bénéfices attendus

L’objectif global de notre projet est l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales issues d’organes irradiés in vivo chez la souris. Le projet a pour but de contribuer à une meilleure prédiction des risques de séquelles à long terme liées aux traitements par la radiothérapie. Le bénéfice scientifique attendu de ce projet est la validation et le renforcement de notre modèle d’évaluation des risques de séquelles utilisant des cellules en culture (in vitro) en établissant des liens entre les jeux de données obtenus in vitro et ceux obtenus chez la souris par des analyses mathématiques et bio-informatiques. Une fois établi, notre modèle pourra permettre d’évaluer in vitro les risques sans recourir à l’expérimentation animale. Pour ce qui concerne le projet présenté ici, le bénéfice scientifique attendu est de pouvoir choisir l’organe optimal pour ces études. A plus long terme, le bénéfice attendu de ce projet sera principalement pour l’être humain : par l’établissement d’un modèle de prédiction in vitro du risque de séquelles lié aux nouvelles pratiques de la radiothérapie, nous comptons contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des patients après traitement anti-cancéreux, un objectif inscrit dans la stratégie décennale de lutte contre les cancers 2021-2030.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie, maintenus 7 jours en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis euthanasiés avant le prélèvement des différents organes (colorectum, intestin ou poumon – les animaux étant irradiés à 2.5 Gy/min, les durées d’irradiation des doses 17, 18 et 27 Gy seront respectivement de 6.8 min, 7.2 min et 13.5 min). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus seront occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Les 3 modèles d’irradiation localisée que nous utiliserons sont bien caractérisés dans notre laboratoire : irradiation au niveau du colorectum, irradiation au niveau de l’abdomen, irradiation du thorax. Le recul acquis par le laboratoire sur ces modèles n’a pas montré de dommage clinique nécessitant l’euthanasie anticipée des animaux. Pour les 3 modèles, l’irradiation entraîne des douleurs et une perte de poids. En revanche, le temps final de l’étude étant assez court (7 jours après l’irradiation), ces protocoles n’entrainent pas la mort des animaux.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements sous anesthésie terminale

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude.

Réduction

Cette étude est une mise au point. Pour les souris contrôles (non irradiées), nous prélèverons 3 organes différents sur le même animal (colorectum, intestin et poumon), ce qui limitera le nombre d’animaux. Dans l’étape 1, il s’agira de comparer les rendements en cellules endothéliales sur ces 3 organes, en condition non irradiée. Dans l’étape 2, le protocole de purification des cellules irradiées sera appliqué à des souris irradiées, en comparaison à des souris non irradiées.

Raffinement

Tous les animaux du projet seront surveillés quotidiennement avec une mesure de poids afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, diarrhée/constipation, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation des signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera une euthanasie anticipée. La connaissance du laboratoire dans les 3 modèles nous indique que les premiers signes apparaissent à J8-J10 post-irradiation, or les animaux seront euthanasiés à J7. Il n’est donc pas attendu de signes cliniques majeurs dans ce projet.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 10 à 12 semaines. Ceci correspondant au stade adulte, ce qui permet d’éviter l’hétérogénéité éventuelle liée à l’âge (il s’agit également de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée). La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, c’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation colorectale, intestinale et thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions radio-induites. Nous possédons donc un recul important sur les conséquences de l’irradiation pour chacun de ces trois modèles.

40 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après incision de l'abdomen, des cellules d'un cancer du foie de l'enfant, l'hépatoblastome, sont greffées dans leur foie, puis une partie reçoit une chimiothérapie au cisplatine suivie d'imagerie. Le porteur veut établir un modèle juvénile de ce cancer et affirme qu'aucune méthode alternative ne peut le remplacer. Les bénéfices annoncés se limitent à disposer d'un modèle pour tester de futurs médicaments.

Objectifs

L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à base de cisplatine. L’hépatoblastome est un cancer d’origine embryonnaire caractérisé par des mutations activatrices dans le gène bêta-caténine et une sur-activation de certaines voies oncogéniques (Wnt, MAPK/ERK…) mais les mécanismes biologiques responsables de son émergence après la naissance chez l’Homme restent très mal connus. La disponibilité d’un modèle juvénile de ce cancer du foie chez la souris permettrait d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de son apparition et également de tester l’efficacité de futurs médicaments dans un contexte physiopathologique plus en adéquation avec le très jeune âge des patients atteints de ce cancer.

Bénéfices attendus

Démontrer que les cellules d’hépatoblastome se développent parfaitement dans le foie de souris très jeunes et forment des tumeurs histologiquement similaires à celles décrites chez les patients. Montrer que ces cellules répondent à une chimiothérapie à base de cisplatine et donc que le modèle est pertinent pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle juvénile unique et pertinent pour étudier les mécanismes à l’origine de ce cancer d’origine embryonnaire.

Procédures

Implantation de cellules tumorales dans le foie après incision de la peau au niveau ventrale. Points de sutures au niveau ventrale. Administration de médicaments 2 fois par semaine. Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine. Pesée des souris deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec (1) une incision mineure de la peau ventrale pour accéder à une partie restreinte du foie, (2) la greffe de cellules tumorales dans un lobe hépatique, (3) une suture de la peau ventrale et (4) un suivi longitudinale et non-invasif de la formation de la tumeur par bioimagerie. Dans le groupe Cisplatine, une solution de Cisplatine sera administrée aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette drogue dans un contexte juvénile. Les souris seront également manipulées afin de mesurer la croissance des tumeurs par bioimagerie. La plupart des manipulations sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Les 40 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude, l’hépatoblastome. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). D’après Berndston et al. (J ANIM SCI 1991, 69:67-76), le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence inter lots avec 50% d’écart type intra lots est de 10. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si les résultats de nos analyses sont convaincants dès la première série d’expérience, celle-ci ne sera pas reconduite.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll » (Safe, France). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al. (Lab Animal 1998). Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre (cf. grille jointe en annexe). En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures (cf. paragraphe 4).

Choix des espèces

1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression (Shultz LD et al., Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol 174(10):6477-89 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5 .La pertinence des installations de l’Animalerie. Les souris seront utilisées à l'âge de 2 jours de vie. Les points limites adaptés pour le modèle de souris utilisé sont décrits dans l’annexe 1.

350 équidés vont être utilisés, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une fois par an une ponction folliculaire de 45 minutes et une chirurgie de transfert embryonnaire d'environ une heure, le porteur reconnaissant un risque d'infection et de douleurs post-opératoires. Le projet met au point la fécondation in vitro par ICSI, présentée comme un moyen de sauvegarder des races équines et asines menacées. Le porteur indique aussi que la filière pourra employer la technique pour reproduire des animaux peu ou pas fertiles.

Objectifs

L'objectif du projet est de mettre au point la technique d'ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) pour permettre la reproduction des animaux peu ou pas fertiles et sauvegarder ainsi des races équines et asines menacées d'extinction.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de mettre au point et développer la production d'embyons in vitro via l'ICSI. Cette technique sera utilisée pour préserver les races équines et asines menacées d'extinction. La filière pourra également utiliser cette technique pour reproduire des animaux peu ou pas fertiles.

Procédures

La synchronisation sera effectuée une fois par an par animal. La durée est le temps de l'injection soit quelques secondes. La ponction folliculaire sera également réalisée une fois par an par animal et dure 45 minutes. La chirurgie pour le transfert embryonnaire sera réalisée une fois par an par animal et l'intervention dure environ 1 heure.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer des infections et des douleurs post opératoire.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie

Remplacement

Notre objectif est de développer une technique de production in vitro de jeunes embryons équins pour la préservation du patrimoine génétique. Le développement de cette technique peut se faire en partie avec des ovocytes collectés sur des juments abattues dans des abattoirs commerciaux. Toutefois, les résultats obtenus avec des ovocytes collectés dans les abattoirs ou in vivo par ponction folliculaire sont parfois différents. Notre objectif étant de produire des embryons à partir de femelles de races menacées, nous devons mettre au point nos techniques sur des ovocytes collectés in vivo par ponction, sans abattage des animaux. Nous utiliserons des ovocytes collectés dans des abattoirs pour les premières mises au point, puis nous adapterons les techniques aux ovocytes collectés in vivo par ponction folliculaire. Les embryons équins seront transférés dans des juments receveuses car il n’existe pas actuellement de système in vitro permettant le développement embryonnaire au-delà de 6-7 jours.

Réduction

Depuis plusieurs années nous optimisons la technique de collecte d’ovocytes afin d’améliorer les rendements de collecte pour réduire le nombre de femelles utilisées.

Raffinement

Tous les animaux sont dans des groupes sociaux stables avec un enrichissement du milieu varié et renouvelé régulièrement ( morceaux de bois, brosses, cônes, sorties à l'herbes...). Pour les receveuses, les animaux seront placés pendant 5 jours dans un boxe aménagé de tapis, avec de la paille et équipé d'une caméra. Durant ces 5 jours, un suivi sera assuré deux fois par jours pour nettoyer la cicatrice, prendre la température et vérifier que l'animal se nourrit. Les animaux recevront 20ml d’antibiotiques (Depocilline) en intra-musculaire et un anti-inflammatoire non stéroïdien (flunixine meglumine, 5ml iv). Les expérimentateurs pourront injecter d'autres substances pour améliorer le confort de l'animal si nécessaire.

Choix des espèces

Notre objectif est de développer une technique de production in vitro de jeunes embryons équins. Nous devons donc prélever des gamètes équins, et transférer les embryons dans des femelles de la même espèce. Nous utiliserons des femelles adultes, pubères et cycliques pour collecter des ovocytes de bonne qualité, aptes à être fécondés, et pour disposer de femelles receveuses capables d’assumer le développement embryonnaire et la gestation.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent de modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et subissent chaque semaine une batterie de tests, suspension, force de préhension, marche sur tapis roulant, barre crantée, électromyographie et test de sensibilité mécanique de Von Frey. Le porteur teste une thérapie par croisement génétique visant à normaliser le niveau d'une protéine, la dynamine 2. Les bénéfices pour les 50 000 personnes touchées en France restent formulés au conditionnel.

Objectifs

Le but de cette étude est d’évaluer les conséquences d’une mutation au niveau du gène de la dynamine 2 responsable chez l’homme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) et d’apporter une thérapie par croisement génétique. La CMT est une maladie génétique qui affecte les nerfs périphériques et qui touche 50000 personnes en France. A ce jour, aucun traitement efficace n’est disponible. Nous avons démontré dans une étude antérieure une baisse de l’expression de la dynamine 2 chez l’animal portant la mutation responsable de la maladie de CMT. A présent nous souhaitons moduler le niveau de dynamine 2 dans des souris atteintes de CMT par croisement avec des animaux mutants myopathe qui présentent une sur expression de cette même protéine. De cette manière, les animaux issus de ce croisement génétique devraient montrés un niveau de dynamine 2 normal.

Bénéfices attendus

Par cette étude nous envisageons d’évaluer les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur la maladie, dans des nouveaux modèles de souris myopathes dont les mutations génétiques reproduisent fidèlement les symptômes musculaires de patients atteints de myopathies centronucléaires. De plus, cette étude vise à évaluer l'efficacité de la diminution de la protéine dynamine 2 chez la souris atteinte par la maladie de CMT.

Procédures

Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à l'âge de 7 à 8 semaines. Hanging test-Mesurer la force du corps. Les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 60 secondes maximum. La force des souris sera mesurée 1 fois/semaine, 3 essais/jour/souris, avec 15 minutes de pause entre chaque essai. 2. Grip-Mesurer la force des pattes. Le test sera effectué 3 fois/souris, avec un temps de repos de 15 minutes entre les différents essais. Le Grip test sera effectué une fois par semaine, sur 2 ou 4 pattes. 3. Gait-mesurer la position des pattes pendant le déplacement. L'animal est déposé sur un tapis roulant se déplaçant à une vitesse comprise entre 8 m/s et 14 m/s pendant 1 minute maximum. Ce test sera exécuté une fois par semaine. 4. Barre cranté-Mesurer l’habilité à se déplacer sur une barre cranté de 110 cm de long. Le test sera effectué 1 fois/semaine, 3 essais/jour/souris, avec un temps de repos de 15 minutes entre les différents essais. 5. EMG (Electromyographie)-Mesurer l’activité électrique musculaire. Ce test sera réalisé une seule fois. 6. VF (Von Frey)-Mesure de la sensibilité mécanique sur les pattes arrière de l’animal. Chaque patte arrière est mesurée 2 fois. Ce test sera réalisé une seule fois par semaines. 7. Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA). C'est une PE sans réveil.

Impact sur les animaux

Pour cette étude deux modèles murins seront utilisés, un modèle atteint de Myopathie Centro-Nucléaire (CNM) et un deuxième atteint de la maladie de CMT. La souris atteinte de CNM développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 6 semaines. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur au animaux contrôles. Aucune douleur n'est observée chez ces animaux. La souris atteinte de la maladie de CMT présente une légère perte de poids. Avant les mesures de conduction nerveuse, les souris seront anesthésiées afin d’éviter toute souffrance due à l'implantation des électrodes et tout mouvement. Lors de la mesure de la sensibilité mécanique les animaux seront placés individuellement dans une boite transparente sur une grille pendant 30 minutes environ. Le test consiste à appliquer un fil de nylon sur la voute plantaire de l’animal et de mesurer s’il réagit. Cette procédure ne nécessite pas de dispositif particulier pour limiter la souffrance car il s’agit d’un test indolore. En revanche, pour limiter l’isolement de l’animal, ce dernier est immédiatement replacé dans sa cage avec ses congénères dès la fin du test. En ce qui concerne les mesures des propriétés contractiles musculaires in situ (classe sans réveil), l’animal est fortement anesthésié avant de subir une opération chirurgicale consistant à d’une part isoler le nerf sciatique et d’autre part à libérer le muscle tibial antérieur.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie car les différents muscles et organes seront collectés pour une analyse histologique et biomoléculaire. Ces analyses nous permettront d'évaluer les potentielles effets bénéfiques de cette thérapie par croisement génétique et de mieux comprendre la maladie.

Remplacement

Pour caractériser cette maladie (CMT) et évaluer l’efficacité de ce croisement génétique nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, ce modèle animal nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part l’amélioration des symptômes apporté par la régulation de cette protéine par croisement génétique. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la force musculaire seraient impossibles à évaluer. D’autre part une étude sur culture de cellules mutante ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice de la force musculaire ne peut être mesuré (REMPLACEMENT).

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, les mâles et les femelles seront utilisés car cette maladie touche aussi bien les hommes que les femmes. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 15 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Cependant une première étude pilote sera réalisée avec 10 animaux, afin de vérifier le phénotype et le niveau de la protéine Dynamine 2. En tenant compte des géniteurs, des animaux d’expérience mâles et femelles, nous prévoyons 160 animaux pour cette étude (REDUCTION).

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée (RAFFINEMENT).

Choix des espèces

Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène DNM2 et les effets de ce croisement génétique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est différente. De plus, la souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologie humaine. Les souris seront testées à l'age adulte c'est à dire de 7 à 8 semaines. A cet âge le phénotype lié à la maladie de CMT et le bénéfice de la thérapie sur la maladie pourra être aisement évalué.