Recherche fondamentale
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Impact de l’épilepsie sur un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 083 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Des souris transgéniques Alzheimer reçoivent une injection de kaïnate pour déclencher des crises d'épilepsie, avec pour certaines l'implantation chirurgicale d'électrodes ou d'une pompe sous-cutanée, les crises pouvant provoquer des morsures de la langue et, dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque. Le porteur indique que l'euthanasie est "incontournable" pour étudier le cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif validé pour étudier ensemble épilepsie, neurodégénérescence et déclin cognitif.
Objectifs
L'association entre crise épileptique et mort neuronale (ou neurodégénérescence) a été observé à maintes reprises en clinique. Les sujets épileptiques présentent des troubles de la mémoire, de l’attention, mais aussi des déficits dans les fonctions d’exécution (comme la gestion du temps et de l'espace, l'élaboration de stratégies...). Dans la maladie d'Alzheimer, l’état de mal ou des crises épileptiques mal contrôlées pourraient servir de déclencheur. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles de crises épileptiques avec des modèles de la maladie d’Alzheimer. De plus, aucun mécanisme ou cible pharmacologique n’a été proposé pour limiter la progression de la maladie d'Alzheimer dans le contexte de crises épileptiques. Ce projet permettra de tester les hypothèses suivantes: 1-les crises épileptiques suffisent à déclencher de la neurodégénérescence dans le cerveau. 2-ces effets sont plus sévères avec l’âge (cette exploration est importante, à la vue de l’incidence importante et croissante des épilepsies chez les personnes âgées). 3-les crises épileptiques sont capables d’accélérer la mort neuronal dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer. Un traitement pharmacologique spécifique et adapté pourrait freiner le développement de la maladie d'Alzheimer associé à l’épilepsie.
Bénéfices attendus
En terme de santé publique, aucune étude n’a encore établi un lien de cause à effet entre une crise épileptique aigue et l’apparition de signes associés à des processus neurodégénératifs chez un même patient. Par contre, il est bien connu, qu’un état de mal épileptique peut entrainer des séquelles neurologiques à long terme. L’absence de connaissances fondamentales sur la prédiction de la trajectoire neurologique et du suivi clinique est un réel problème après l’apparition d’une première crise épileptique sans cause définie. Nous connaissons, néanmoins, l’existence d’un lien entre crises et neurodégénérescence dans la maladie d’Alzheimer car l’état épileptique a été démontré comme un facteur de risque chez l’homme. Avec cette étude, nous posons donc l’hypothèse d’un mécanisme reliant l’hyperactivité des neurones aux processus neurodégénératifs associés à la maladie d’Alzheimer. Ce projet nous permettra d’en appréhender les mécanismes fonctionnels et biochimiques sur le long terme et de tester le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules ciblant les principales hormones endogènes anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions selon leur groupe, soit des procédures chirurgicales (< à 35 min), soit des injections intrapéritonéales, soit des analyses comportementales et enfin la mise à mort pour analyses des tissus cérébraux: implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (120 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (288 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate (288 animaux) - implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (160 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (128 animaux). Les animaux seront suivi au maximum pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
L'induction de l'épilepsie sur la souris engendre des décharges neuronales fortes et incontrolables. Ces crises « épileptiques », comme chez l’homme, peuvent entrainer l'animal à se blesser (morsure de la langue). Dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque peut également survenir. Si les crises devaient perdurer au dela des 2 heures suivant l'induction de l'épilepsie, une injection intrapéritonéale d’un calmant (le diazépam) permettra de diminuer l’apparition des crises. Cette injection induit une somnolence prolongée de l’animal, entrainant une possible déshydratation, qui est anticipée de façon systématique par l’injection intraperitonéale d’une solution saline stérile. Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. La pose d'un implant crânien pour le suivi électroencéphalographique, ou de la pompe osmotique, peut entrainer un inconfort temporaire, et être associé à un grattage plus intense au niveau de la zone de cicatrisation.
Devenir
Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.
Remplacement
De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier les crises épileptiques, la neurodégénérescence et le déclin cognitif (e.g., maladie d’Alzheimer) dans leur globalité.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaire est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe . Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress le jour de l'expérimentation (en particulier au moment des tests comportementaux), mais également afin de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront leur comportement général, ainsi que leur apparence. Toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmises à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > à 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…). Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. Tous les tests seront réalisés dans une pièce dédiée et les animaux y seront placés au minimum 30 minutes avant les tests. La chirurgie sera réalisée sous anethésie générale et afin de minimiser la douleur liée à la chirurgie, un analgésique sera injecté en amont.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer et de l’épilepsie. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Une première caractérisation sera effectuée à l’âge de 3, 6 et 9 mois sur le modèle de souris Alzheimer. La caractérisation comportementale a déjà été effectuée sur ce modèle dans notre laboratoire et des déficits de mémoire apparaissent dès l’âge de 3 mois. Nous nous baserons donc sur ces résultats obtenus et sur les résultats obtenus aux âges de 3, 6 et 9 mois, pour choisir l’âge le plus pertinent afin de tester des traitements préventifs et/ou curatifs.
Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines virales en utilisant des souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.
Objectifs
Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).
Bénéfices attendus
Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.
Procédures
Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.
Impact sur les animaux
La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.
Devenir
Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.
Réduction
Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)
Choix des espèces
La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance
Apports postnataux en gangliosides : effets sur l’absorption intestinale des oméga-3 et leur incorporation dans la rétine.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
96 rats vont être utilisés, tués au sevrage vers le vingt-et-unième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les ratons sont nourris à la pipette chaque jour de leur quatrième au vingt-et-unième jour de vie, puis reçoivent un gavage intragastrique de marqueurs suivi d'un prélèvement de sang à la queue. Le porteur reconnaît que le gavage peut induire de rares fausses routes et que la prise de sang provoque une douleur qu'il qualifie de légère. Il affirme que seul un modèle animal rend compte de la complexité des fonctions en jeu, les retombées visant les formulations infantiles.
Objectifs
Les gangliosides sont des composants majeurs des membranes plasmiques, notamment des cellules intestinales, dont la composition varie au cours du développement. Ils régulent leurs propriétés et divers évènements de signalisation. En particulier, ils servent de récepteurs aux virus, bactéries et toxines et sont ainsi impliqués dans la mise en place de l’immunité intestinale chez le jeune. Très peu de données concernent leur rôle dans la fonction absorptive. Seul un travail ex vivo semble indiquer que les gangliosides favoriseraient l’absorption intestinale des lipides (Birecki, 2006). Les gangliosides sont naturellement présents dans l’alimentation, en particulier le lait maternel dont les composants bioactifs sont connus pour influencer la maturation intestinale et la mise en place de la fonction absorptive. Parmi les nutriments dont l’absorption intestinale est particulièrement critique en période post-natale figurent les acides gras polyinsaturés oméga-3. La rétine est un tissu particulièrement sensible aux apports alimentaires en période périnatale, notamment en oméga-3 qui sont fondamentaux pour le bon développement des fonctions visuelles. Chez l’enfant, des études cliniques ont montré que la consommation de formulations infantiles pauvres en acide linoléique et dépourvues en acide docosahexanoique (DHA) du fait de l’origine végétale des lipides, conduisait à une baisse d’environ 40% des taux de DHA dans le système nerveux et les globules rouges associée à une baisse significative de l’acuité visuelle et un retard de maturation des photorécepteurs (cellules rétiniennes en charge de la conversion du signal lumineux en signal nerveux) et une baisse significative de l’acuité visuelle ont été montrés, en comparaison des nouveau-nés allaités. Nous formulons l’hypothèse que les gangliosides apportés en période postnatale pourraient jouer un rôle dans la maturation intestinale et moduler l’absorption lipidique, notamment des oméga-3, favorisant ainsi leur incorporation dans la rétine. L’objectif de ce projet est de déterminer l’impact des apports postnataux en gangliosides sur les capacités d’absorption intestinale des oméga-3 et les conséquences sur leur incorporation dans la rétine.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de vérifier les impacts positifs potentiels des apports postnataux en gangliosides sur les capacités de la muqueuse intestinale à absorber efficacement les oméga-3, ainsi que sur l’incorporation rétinienne des oméga-3, connus pour leurs bénéfices dans ce tissu en période de développement. De plus, mâles et femelles seront étudiés de façon à documenter un éventuel effet du sexe. Ainsi, ce projet devrait permettre de soutenir l’importance des apports en gangliosides dans le développement post-natal et le fait que les gangliosides font partie des composants bioactifs du lait maternel à considérer dans les questions de nutrition infantile. Il pourrait ouvrir la voie à des travaux visant une prise en compte des gangliosides dans les formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, à l’instar de ce qui s’est mis en place auparavant pour les oméga-3.
Procédures
Les animaux seront "biberonnées" un fois par jour entre J4 et J21, à l'aide d'une pipette souple par des solutions nutritionnelles (volumes adaptés à leur âge). Un gavage intra-gastrique de marqueurs de perméabilité intestinale suivi par un prélèvement de sang à la queue (quelques gouttes, environ 60 uL) sont prévus une seule fois dans la vie des ratons (J19/J20).
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet sont de classe légère. Des nuisances peuvent être attendues lors du gavage intra-gastrique de la solution permettant la mesure de la perméabilité intetsinale ion vivo ainsi qu'au moment du prélèvement d'une goutte de sang à la queue pour les dosages. Le gavage intra-gastrique peut induire des fausses routes mais c'est extrêmement rare chez les ratons de 20 jours et lorsque réalisé par du personnel compétent. Le prévèlement de sang à la queue peut induire une douleur qui reste légère car la zone est peu innervée.
Devenir
Les aniamaux sont gardés en vie à l'issu de chaque procédure et seront mis à mort à l'âge du sevrage à J21/22.
Remplacement
L’objectif de cette expérimentation est d’évaluer les effets d’une supplémentation nutritionnelle post-natale sur l’accrétion lipidique de la rétine. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité des différents fonctions physiologiques qui interviennent (digestion, absorption intestinale, distribution et incorporations tissulaires). L’expérimentation animale ne peut donc pas être remplacée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été estimé à 10 par groupe sur la base d’un calcul d’effectif à partir de données bibliographiques permettant d’estimer l’effet attendu (sur l’accrétion en oméga-3 dans la rétine mais également sur les voies mécanistiques explorées telles que la perméabilité intestinale et la mesure d’expression de transporteurs lipidiques), pour une puissance de test statistique de 90% et un risque d’erreur de 5%. Toutes les analyses seront réalisées à partir d’un seul animal. L’utilisation des mâles et des femelles dans les groupes expérimentaux valorise au maximum les animaux obtenus à la mise bas.
Raffinement
L’environnement des mères gestantes et allaitantes sera enrichi (matériau cellulosique pour le nid, tunnel, bâton à ronger). Les procédures prévues relèvent toutes de la classe de sévérité « légère » : biberonnage selon réflexe de tétée des nouveau-nés, administration orale de marqueurs de perméabilité intestinale. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale. Les protocoles ne devraient pas entraîner de souffrance pour les animaux, cependant ils feront l’objet d’une visite quotidienne, y compris le week-end. Les points limites clairement définis conduiront à la mise à mort des animaux le cas échéant.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans notre laboratoire et bien adaptée à nos recherches. La taille des ratons facilite la manipulation et le biberonnage. Cette espèce, en particulier la souche choisie, possède également des qualités maternelles qui participeront de la réussite de l’expérimentation. La taille des organes d’intérêts des ratons au sevrage fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1 de gestation) et 10 d’entre elles seront gardées pendant toute la période de lactation. Les petits seront utilisés de la naissance au sevrage (J21) puisque l’expérimentation vise à déterminer les effets de la supplémentation post-natale pendant la durée de la lactation.
Immunisations de souris pour étudier le role des cytokines IL-2 et IL-15 dans la réponse immunitaire humorale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des souris génétiquement modifiées reçoivent une ou deux injections péritonéales d'un agent immunisant, puis sont anesthésiées pour un prélèvement de sang intracardiaque terminal avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit un stress bref lié à l'injection et affirme que le modèle de culture cellulaire utilisé auparavant n'imite que partiellement ce qui se déroule dans l'organisme vivant. Il présente cette recherche fondamentale comme une étape "indispensable" à la compréhension des immunodéficiences et des cancers.
Objectifs
Notre laboratoire s’intéresse aux lymphomes, des maladies qui se développent à partir des lymphocytes B : cellules du sang qui ont perdu leur capacité à devenir des cellules appelées plasmocytes et dont le rôle est de protéger l’organisme contre les infections par des agents extérieurs. Leur incidence est en constante augmentation et ces maladies restent incurables en dépit de nouvelles thérapeutiques. Notre projet de recherche vise à identifier les étapes critiques et les molécules clefs qui régissent le destin (la différenciation) du lymphocyte B jusqu’au plasmocyte et qui pourraient contribuer au développement ou au maintien de ces lymphomes. Les travaux du laboratoire ont démontré l’importance de molécules, l’interleukine 2 (IL-2) et l’IL-15, dans ce processus par des études menées hors de l’organisme (in vitro). Cependant cela ne permet pas de déterminer quand et comment ces molécules agissent au sein des organes lymphoïdes secondaire où se déroule la différenciation des lymphocytes B. A l’heure actuelle il n’existe pas d’étude menée chez l’animal démontrant leur rôle dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Notre objectif est d’étudier le rôle de l'IL-2 et l'IL-15 chez des souris modifiées dans lesquelles les lymphocytes B sont insensibles à ces molécules (souris déficientes pour le gène Il2rb). Pour cela nous immuniserons au maximum 1020 souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécule, bactéries) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes capables de produire des anticorps qui reconnaissent et neutralisent l’agent étranger. Cela nous permettra d’évaluer le rôle de l’IL-2 et IL-15 dans la différenciation des lymphocytes B.
Bénéfices attendus
Ce projet fera avancer les connaissances fondamentales sur la différenciation plasmocytaire normale, étape indispensable à la compréhension des mécanismes à l'origine d'immunodéficiences et de cancers.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 ou maximum 2 injections peritonéales de l'agent immunisant, distantes de 28 jours. Le geste est réalisé par une personne experimentée, ce geste rapide et précis ne durera pas plus de 2 minutes. En fin d'étude, les animaux recevront un traitement analgésique et seront anesthesiés pour prélèvement de sang intra-cardiaque (5 minutes maximum) puis euthanasiés selon une méthode reglementaire.
Impact sur les animaux
Nous immuniserons les souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécule, bactéries) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes capables de produire des anticorps qui reconnaissent et neutralisent l’agent étranger. Ces procédures n’entraineront pas de stress, en dehors du stress bref et modéré lie a l'injection péritonéale, sans forte douleur pour les souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prelever les organes et réaliser les analyses sur les différents tissus.
Remplacement
Lors de nos précédents travaux, nous avons utilisé un modèle de culture de cellules. Ce modèle nous a permis de comprendre plus finement la biologie du lymphocyte B au cours de son activation, puis de sa différenciation pour produire des anticorps. Malgré tout, ce modèle n’imite que partiellement ce qui se déroule au sein de l'organisme vivant lors d’une infection et il devient nécessaire pour nous d’étudier ce phénomène dans l'animal. La souris est un modèle de choix pour l'étude des réponses immunitaires. C'est pourquoi nous allons utiliser des animaux transgéniques nous permettant d’invalider de manière contrôlé dans le temps l’expression du récepteur à l’interleukine-2 et 15 et de suivre les réponses immunes suite aux immunisations.
Réduction
Dans l’intérêt de réduire le nombre d’animaux utilisé, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible, en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, ganglions, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Enfin les protocoles d'immunisations seront réalisés successivement afin de définir les meilleures conditions expérimentales pour notre étude et uniquement si les résultats obtenus justifient de réaliser un autre type d'immunisation. Pour chaque étude, des groupes de 8 animaux par genotype (sauvage ou muté) nous permettra d'obtenir des statistiques fiables et publiables. Les statistiques seront réalisés à l'aide de tests non paramétriques, le test de Mann et Whitney sera appliqué pour deux échantillons et celui de Kruskal et Wallis pour un nombre quelconque d'échantillons.
Raffinement
Toutes les lignées de souris déjà existantes n'induisent pas de phenotype douloureux. La littérature décrit les protocoles d’immunisation spécifiques aux agents immunogènes qui seront appliqués dans cette étude. Les animaux seront surveillés après immunisation pour détecter l'apparition d'une éventuelle douleur et l'inconfort provoqué sera soulagé. De plus les animaux sont élevés dans des conditions adaptées: locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage.
Choix des espèces
Le modèle animal murin est très utilisé en immunologie. Des protocoles d’immunisation standardisés et des protocoles d’analyses éprouvés sont disponibles. La possibilité d'invalider des gènes spécifiquement dans un type cellulaire et de manière temporelle est importante pour évaluer finement les évènements et les mécanismes impliqués. Les souris avec un potentiel conditionnel pour le gène IL2rb ont été générées. Elles ont été croisées en retour avec la lignée C57BL/6N sur 8 générations. Enfin le croisement avec la lignée CD19-Cre a permis d’inactiver la signalisation IL-2 et IL-15 spécifiquement dans les lymphocytes B. L’acquisition des cellules effectrices étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des études sera effectué sur des animaux adultes (8-12 semaines).
Etude de l’effet des conopeptides dans les neuropathies induites par constriction chronique du nerf sciatique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 344 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit la pose chirurgicale d'un manchon autour du nerf sciatique qui provoque une douleur neuropathique pendant quatre à six semaines, avec de possibles conséquences anxio-dépressives, avant des tests de douleur quotidiens. Les rats ayant reçu les conopeptides ou subi la chirurgie sont tués à l'issue, les rats naïfs sous placebo pouvant être réutilisés. Le porteur revendique un "réel besoin" de nouvelles molécules antalgiques et affirme qu'il est impossible de se passer de sujets vivants dotés d'un cortex développé.
Objectifs
Les douleurs chroniques affectent 30% de la population mondiale et ont un impact socio-économique considérable dans notre société moderne. A côté des symptômes douloureux traduisant l’hypersensibilité du système nerveux, elles génèrent un véritable handicap de vie en induisant des comorbidités anxieuses, dépressives, cognitives et des troubles psychosociaux. Les mécanismes sous-jacents à ces douleurs chroniques sont encore mal compris, et leur traitement clinique est souvent insuffisant. Ainsi, 2 patients sur 3 estiment que la prise en charge de leur douleur est insuffisante. Les traitements classiques recommandés pour les douleurs chroniques sont en effet souvent inefficaces, parfois source d’effets adverses dont l’accoutumance. Il est donc nécessaire d’identifier et développer de nouvelles molécules antalgiques capables de soulager les douleurs chroniques car elles sont très fréquemment réfractaires aux traitements disponibles. Les conopeptides contenus dans les venins de cones marins font partie des molécules antalgiques prometteuses dans ce domaine. L’un d’entre eux, le ziconotide (Prialt) est utilisé en clinique pour traiter les douleurs neuropathiques refractaires. Le projet sur 5 ans vise donc à caractériser les effets antalgiques de conopeptides contenus dans des extraits préparés à partir de différentes espèces de cones marins et préalablement testés dans des modèles in vitro.
Bénéfices attendus
Les antalgiques classiques opioidergiques utilisés pour les douleurs réfractaires, et notamment pour les douleurs neuropathiques sont inefficaces chez 2/3 des patients. Il existe donc un réel besoin de trouver de nouvelles molécules antalgiques pour traiter ce type de douleur. Ce projet cherche à caractériser le bénéfice analgésique de 3 extraits de conopeptides, administrés par 2 différentes voies, dans un modèle murin de douleur neuropathique par compression du nerf sciatique.
Procédures
Une partie des animaux subiront une chirurgie pour induire une douleur neuropathique par la pose d'un manchon de polyetylène sur la branche principale du nerf sciatique. La chirurgie est rapide et dure entre 5 et 10min par animal. Elle provoque des douleurs neuropathiques pendant 4 à 6 semaines, avec de potentiels conséquences anxio-dépressives. Ain de monitorer l'évolution des symptomes douloureux et anxio-dépressifs, les animaux subiront des test nociceptifs (une fois par jour, test rapides durant de 15min pour les tests mécaniques et 30min pour les tests thermiques et induisent peu d'anxieté chez l'animal ) et anxio dépressif (une fois par semaine, durant une dizaine de minute par animal).
Impact sur les animaux
La chirurgie du cuff provoque le développement d'une douleur chronique chez l'animal, ainsi que de potentiel comorbidités de comportements anxieux et dépressifs. L'injection de conopeptides peut comporter des risques de légères paralysie musculaire et difficultés respiratoires. Ces effets ne sont cependant pas attendus au vu des doses prévues pour ce projet. Aucun effet secondaire n’est attendu suite aux injections intrathécales.
Devenir
A la fin du protocole de tests comportementaux, les animaux ayant reçu les conopeptides et les animaux ayant subi une chirurgie seront mis à mort. Les animaux naïfs ayant reçu le placebo pourront être réutilisés si la demande est faite conformément aux usages du chronobiotron.
Remplacement
Le projet portant sur la perception de l'information douloureuse par le système nerveux et les propriétés analgésiques des molécules d’intérêt, il est actuellement impossible de se passer de sujets vivants et dotés d’un cortex développé. Les extraits de conopeptides auront été testé in vitro au préalable afin de déterminer les doses efficaces sans causer de toxicité.
Réduction
Le nombre d’animaux prend en compte i) les risques liés à la chirurgie du cuff, ii) les risques liés aux différentes injections de conopeptides et iii) les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests statistiques significatifs et robustes.
Raffinement
Raffinement par hébergement en cages collectives enrichies (frisure, bâton de bois et tunnel) après sevrage et maintien des fratries selon les sexes dans le but de préserver les interactions sociales entre congénères. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie et analgésie. Les injections entre les vertèbres seront également effectuées sous anesthésie. Des points-limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le rat est un standard en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Notre équipe travaille sur la transmission nociceptive chez cet animal, ce qui permettra une analyse appropriée des résultats et une qualité optimale des mesures effectuées et de l’interprétation des résultats. L’étude du projet portant sur les douleurs neuropathiques chez l’adulte, nous utiliserons des animaux adultes. La bonne analyse des données implique que le réseau nociceptif soit totalement mature.
Respir’Ante: Etude de l’alvéolisation chez la souris en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au modéré. Les mères gestantes reçoivent un régime appauvri en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance, et une partie des souriceaux subit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant dix jours avant d'être tués pour prélever leurs poumons entiers, d'autres étant anesthésiés puis curarisés pour explorer leur fonction respiratoire. Le porteur affirme que ce régime est le modèle le moins invasif et que l'étude d'un organe aussi complexe que le poumon ne permet pas pour le moment de méthode de remplacement. Les retombées annoncées, un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains, sont renvoyées au moyen terme.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir une alvéolisation pulmonaire anormale chez le nouveau-né prématuré. L'alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de souris en étudiant la morphométrie et la fonction respiratoire ii) de mieux caractériser les différents types cellulaires dans le poumon et leur répartition grâce à la technique du Single Cell RNA seq et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des analogues de la voie PPAR ou SREBP (Sterol Response Element Binding Protein) en se basant sur une culture cellulaire en 3D créant in vitro un poumon aussi appelé organoïde alvéolaire.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les souris femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des souriceaux (n=32 sera anesthésiée puis curarisée pour explorer leur fonction respiratoire (âge aux eplorations fonctionnelles: 21 à 60 jours, durée des explorations: 1 jour). Une partie des souriceaux (n=288) recevra du premier jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse de 100µL maximum (injections une fois par jour pendant 10 jours) . Les animaux seront mis à mort ensuite pour analyser leurs poumons entiers en utilisant des organoïdes alvéolaires. Le reste des animaux (n= 200) sera anesthésiée avant mise à mort pour analyse de poumons selon les différentes techniques proposées (ScRNAseq, morphométrie ou organoïdes alvéolaires) (Mise à mort au 120ème jour de vie maximum sans procédure durant leur vivant).
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication observée pour elles-mêmes ou leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur induite par l'injection elle-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les souriceaux seront mis à mort.
Devenir
Les souris gestantes seront gardées en vie à la fin de la procédure 1 (régime) pendant au moins 3 semaines. Les souriceaux recevant les injections (procédure 3) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les souriceaux de la procédure 2 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les animaux seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de l'ensemble des poumons.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation à un modèle de restriction protidique LPD ou à un régime contrôle. Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des souriceaux (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les souriceaux seront euthanasiés. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de plus de 20 % de poids, la souris gestante sera sortie de l'expérimentation et euthanasiée (CO2).
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer chez la souris et aller plus loin dans les analyses moléculaires. En effet, les possibilités d’analyse avec des anticorps sont plus importantes chez la souris et la mise au point de KO est plus développée chez la souris que chez le rat.
Intérêt des facteurs de croissance hépatocytaires à la phase aigüe de l’accident vasculaire cérébral chez le rat (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
92 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Une première phase pharmacologique porte sur 30 rats ensuite réutilisés dans d'autres projets, une seconde induit chirurgicalement un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère pendant 90 minutes avec suivi par IRM, ces animaux étant mis à mort à 24 heures pour prélèvement du cerveau et du coeur. Le projet teste un facteur de croissance censé réduire les lésions de l'AVC. Le porteur indique que l'AVC ischémique n'induit pas de douleur en soi et affirme que l'imagerie in vivo et le mécanisme d'action rendent l'animal vivant nécessaire.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aigüe d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation). La recanalisation artérielle entraîne une restauration du flux sanguin au sein d’un territoire qui en était privé. Cette reperfusion du tissu cérébral est nécessaire, mais elle déclenche des cascades pathologiques qui contribuent aussi aux séquelles de l’AVC. L’un des enjeux du développement de nouvelles approches thérapeutique dans l’AVC, en complément des traitements actuels, serait de combattre les dommages liés à la reperfusion. L’objectif de ce projet est de déterminer si une protéine d’intérêt appelé Hepatocyte Growth Factor (HGF) permet de diminuer la taille et les conséquences de l’AVC. Il s’agit d’un élément majeur en santé publique car la taille de l’AVC est directement reliée au handicap et à la mortalité. Les données de la littérature sont croissantes depuis une dizaine d’année. Notre hypothèse est en faveur d’une diminution de la taille de l’infarctus et une amélioration de la fonction cérébrale lorsque HGF est utilisé dans l’AVC.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun traitement visant à protéger le tissu cérébral (neuroprotection) n’a démontré d’efficacité chez l’Homme. Ce projet de recherche a pour objectif de tester un nouveau traitement de neuroprotection dans les premières heures suivant la survenue d’un AVC liée à l’occlusion d’une artère cérébrale. La molécule testée a déjà montré des bénéfices dans l’attaque cardiaque. Si notre étude apporte des preuves d’efficacité, un essai clinique pourrait être mis en place rapidement pour évaluer cette nouvelle approche thérapeutique chez les patients. L’évaluation de nouveaux traitements dans un modèle d’AVC ischémique chez le rongeur est une étape nécessaire pour pouvoir concevoir correctement de futurs essais cliniques.
Procédures
Ce projet multisite se découpera en 2 procédures : 1) Etude pharmacologique de N Acetyl Heparin sous anesthésie gazeuse profonde à l’isoflurane - classe légère : La veine caudale est cathétérisée puis le produit est injecté par voie intraveineuse à différentes posologies, soit uniquement en bolus, soit par bolus puis perfusion continue pendant une heure (anesthésie de 10 minutes pour les injections en bolus seul, de 1h10 pour les injections en bolus puis anesthésie). Les animaux auront des prises de sang régulières, par voie caudale, de 50 μL : avant injection de NAH, à 10 minutes, à 1h puis à 24h (le prélèvement réalisé à une heure chez les animaux ayant uniquement un bolus intraveineux et celui réalisé à 24h seront réalisés après anesthésie locale caudale). 2) induction chirurgicale de l’AVC et administration des traitements - classe modérée : - (H0) Induction chirurgicale de l’AVC - (H1) Examen IRM basal afin de vérifier la bonne efficacité de la ligature artérielle - (H1,5) : le filament est laissé en place pendant 90 minutes (ischémie), après quoi il est retiré (reperfusion), et l’animal peut être définitivement suturé à l’aide de fils stériles. Le traitement est administré par voie intraveineuse (cathéter caudal) 5 minutes avant la reperfusion (HGF, NAH ou NaCl). Les animaux sont anesthésiés pendant 1h30. La durée de la chirurgie en elle-même est d’environ 30 minutes. - (H23) Examen fonctionnel : Evaluation du Neuroscore - (H24) Examen IRM final : imagerie IRM à 24h sous anesthésie générale. Les animaux sont anesthésiés une quinzaine de minutes pour l’acquisition des différentes séquences.
Impact sur les animaux
L’induction d’un AVC ischémique chez le rat nécessite une procédure de classe modérée avec une chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes. L’AVC ischémique n’induit pas de douleur en soi (de même que chez les patients, le parenchyme cérébral étant dépourvu d’innervation). Une des complications, rare, est l’œdème cérébral malin. Par ailleurs, le modèle animal induit des déficits sensoriels et moteurs reproduisant la physiopathologie humaine. Les cerveaux et les cœurs seront prélevés en fin de procédure afin d’évaluer les mécanismes d’action du traitement sur le cerveau et, à distance, sur le coeur. Un nombre total de 92 rats au maximum seront utilisés au cours de ce projet (phase 1 + phase 2), afin de disposer d’une étude statistique robuste.
Devenir
Les animaux issus de la phase 1, utilisés pour l’étude pharmacologique de N Acetyl Heparin, pourront être réutilisés dans d’autres projets de recherche utilisant des rats. Les animaux issus de la phase 2 seront mis à mort à 24h afin de pouvoir analyser les mécanismes d’action en jeux. Les différentes techniques d’analyse nécessitent d’utiliser le cerveau et le coeur des rats après sacrifice des animaux pour analyses en laboratoire.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des données expérimentales déjà publiées. En effet l’activation des cellules cérébrales par la protéine HGF les protégeraient de la mort cellulaire. L’utilisation d’animaux vivants est justifiée d’une part par le rôle central de l’imagerie « in vivo » dans nos procédures, grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie par résonance magnétique (IRM) dédiés aux petits animaux, afin de reproduire la prise en charge de l’AVC chez l’Homme ; et d’autre part le mécanisme d’action de NAH qui n’est pas reproductible « in vitro ».
Réduction
Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. L’imagerie « in vivo » permet un suivi longitudinal sans avoir à mettre à mort des animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Tous les animaux utilisés lors de la phase 1 seront réutilisés dans d’autres projets. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé par un biostatisticien. Nous avons utilisé un test satistique spécifique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
La chirurgie et les examens d’imagerie sont entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec couverture analgésique adaptée. Les animaux sont surveillés de façon rapprochée avec utilisation de grilles de score pour évaluer le bien-être et prise de poids quotidienne (même en l’absence de chirurgie). Ils ont un accès facilité à la nourriture et à l’eau en période post-opératoire.
Choix des espèces
Le rat (souche Sprague-Dawley) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation. De plus nos méthodes d’imagerie et d’évaluation neurocomportementale sont bien validées entre nos mains chez le rat et pour cette souche. Il s'agira de jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre. Cette fourchette de poids est par ailleurs celle utilisée dans les études antérieures et sur lesquelles s’appuient notre retour d’expérience et nos statistiques.
Evaluation ex vivo des effets pharmacologiques de molécules sur un modèle d’inflammation par injection d’adjuvant complet de Freund chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1800
3 600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour le compte de clients pharmaceutiques. Une injection d'adjuvant complet de Freund dans une patte provoque une inflammation douloureuse, certains animaux étant en outre génétiquement modifiés ou injectés deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, avant une mise à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque pour prélèvement d'organes. L'objet est de tester ex vivo des molécules contre la douleur. Le porteur reconnaît que l'adjuvant provoque des douleurs et que les animaux modifiés ne peuvent échapper à leur phénotype, tout en jugeant l'organisme vivant nécessaire.
Objectifs
Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. Par ailleurs, pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ou de cellules nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour se faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le Patch-Clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de douleurs induit par une inflammation périphérique. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule a des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies de douleur du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), chaque animal peut être son propre contrôle puisque une seule patte est lésée; - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.
Procédures
Durée : injections deux fois par jour (6min/injection), trois mois au maximum. Les animaux vigiles seront injectés pour assurer une exposition in vivo. Les contentions répétées génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée, soit intrapéritonéale ou soit intramusculaire. Durée : Hébergés trois mois maximum. Si les animaux sont génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas par définition échapper à leur phénotype dommageable. Nous travaillerons uniquement sur des animaux asymptomatiques. Durée : une seule injection (6 min) Ils seront tous injectés, une seule fois, par une solution d’un agent inflammatoire, en sous cutanée dans une patte postérieure. Tous les animaux seront mis à mort par deux techniques, en fonction de leur âge : durée instantanée par décapitation rapide après anesthésie gazeuse ou par perfusion intracardiaque (durée = 3 min) sous anesthésie gazeuse au plus tard 48h après le déclenchement de l’inflammation.
Impact sur les animaux
Notre procédure amène des effets indésirables: *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-l’injection d’adjuvant inflammatoire provoque des douleurs ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress pre-mortem important.
Devenir
A l’issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.
Remplacement
Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.
Réduction
Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition, la possibilité que chaque animal soit son propre contrôle diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant l’étape par quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes ou 2 rats adultes/cage). Ils bénéficient d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et au maximum un mois de temps d’hébergement avant le début de la procédure. Il se fera en en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptômes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe.
Choix des espèces
La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. Toutefois, les symptômes ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limites modifiés pour pallier des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des adultes ou plus âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (douleurs chroniques ou aigues). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.
Etude d’un modèle murin de myélofibrose primitive
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
891 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. Souris doubles mutantes prédisposées aux tumeurs à partir de six mois, elles subissent des prélèvements sanguins réguliers sous anesthésie, une irradiation létale suivie d'une greffe de moelle osseuse, ou des traitements par inhibiteurs, avant d'être mises à mort. Le projet étudie un modèle de myélofibrose primitive, une maladie du sang du sujet âgé. Le porteur indique n'avoir pas réalisé de calcul statistique du nombre d'animaux, l'ayant estimé d'après son expérience, et affirme qu'il faut replacer la cellule souche dans son contexte par le recours aux modèles murins.
Objectifs
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines, subit des défauts fonctionnels au cours du vieillissement, provoquant des maladies du sang comme la myélofibrose primitive (MFP). LA MFP se développe chez les personnes âgées et est caractérisée par une moelle osseuse défectueuse en raison de la présence anormale de fibres, un nombre anormal de cellules dans le sang et une splénomégalie. Dans 90% des cas, cette maladie résulte de mutations connues, alors que dans 10% des patients, l’origine de la maladie reste inconnue. Dans le cadre d’un précédent projet, nous avons développé un modèle de souris porteuses d'une double mutation (des gènes Cdkn2a et PLZF , Cf projet #5645 joint) basé sur nos travaux antérieurs ayant validé que PLZF (codé par le gène Zbtb16lu/lu ) est impliqué dans la régulation du vieillissement du système sanguin, et par ailleurs il est connu que les souris Cdkn2a-/- sont prédisposées à l’apparition de tumeurs. Ces dernières années, nous avons donc pu analyser le phénotype associé à cette double mutation et montré que les animaux doubles mutants présentaient une proportion très augmentée de néoplasmes sanguins ayant toutes les caractéristiques de la MFP. Il apparaît donc important maintenant d'étudier l'effet de la double mutation sur les différents acteurs de la maladie et de définir les voies de régulation altérées. Nous souhaitons pour cela étudier en détail les différents types de cellules sanguines ainsi que leurs altérations moléculaires et fonctionnelles.
Bénéfices attendus
Nous attendons des résultats de ce projet qu’ils révèlent de nouveaux acteurs dans le développement de la myélofibrose primitive, qui pourraient potentiellement être utilisés comme cibles thérapeutiques et / ou marqueurs de la production anormale de cellules sanguines dans cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins tous les 15 jours, sous anesthésie, le temps de la procédure. Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation léthale et une transplantation de moelle osseuse . Les animaux de la procédure 3 seront soumis à des traitements inhibiteurs (durée 4 semaines, injections 3 fois / semaine)
Impact sur les animaux
Les principaux effets délétères attendus correspondent à l'apparition spontanée de tumeurs liée à la mutation Cdkn2a-/-. Nos souris Cdkn2a-/- et Cdkn2a-/- Zbtb16lu/lu sont donc prédisposées à l’apparition de tumeurs au delà de 6 mois d'âge. Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment par le suivi des formules sanguines grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire disponibles au sein de l’animalerie. Lors des transferts adoptifs, l'irradiation et la greffe reconstitutive qui s'ensuit entraînent une période de fragilité immunitaire des animaux récipients, que nous compenserons par l'administration d'une antibiothérapie (amoxicilline fournie dans l'eau de boisson) maintenue sur une durée de deux semaines à 1 mois après la greffe. Lors des traitements par les inhibiteurs des potentiels candidats, nous prendrons soin de nous assurer de la bonne tolérance des animaux à ces drogues et d'optimiser les doses administrées.
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre les processus conduisant à certaines pathologies sanguines. Ces pathologies sont le fait de mécanismes propres aux cellules souches du système sanguin , mais aussi d'une communication avec des facteurs microenvironnementaux dans la moelle osseuse. Ces deux types de mécanismes sont entièrement imbriqués du fait d’un dialogue permanent entre les cellules sanguines et les cellules de soutien de la moelle. Il est donc nécessaire de replacer la cellule souche dans son contexte et d’avoir recours aux modèles murins. Cependant, dans la mesure du possible, nous testerons in vitro les inhibiteurs candidats retenus, en nous assurant au préalable de leur absence de toxicité aux doses recommandées dans la littérature sur des lignées cellulaires.
Réduction
Bien que le recours aux modèles murins soit rendu nécessaire par l’existence reconnue de mécanismes de régulation des cellules du sang par le microenvironnement, nous limiterons au maximum le nombre d'animaux. Pour cela, nous utiliserons les techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Par ailleurs, nos souches murines génétiquement altérées ont été «backcrossées» sur un fond pur afin d’atteindre un nombre de générations suffisant pour considérer que les animaux issus de ces croisements puissent être utilisés comme contrôles, ceci dans un souci de réduction. Nous avons estimé le nombre d’animaux à produire pour les 4 génotypes d’intérêt sur la base de notre expérience passée du modèle, c’est la raison pour laquelle nous n’avons pas réalisé de test statistique.
Raffinement
Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment par le suivi des formules sanguines grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire disponibles au sein de l’animalerie, les prélèvements étant réalisés sous anesthésie. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique.
Choix des espèces
Bien que des formes ancestrales de systèmes sanguins aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés, parmi lesquels la souris est l'un des modèles génétiques les mieux caractérisés. La disponibilité des modèles souris dans l’étude des pathologies sanguines ainsi que notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes: Les souris des 4 génotypes d'intérêt seront âgées de 6 à 12 mois, ce qui correspond à la fenêtre d'apparition des hémopathies dans notre modèle Cdkn2a-/- Zbtb16lu/lu. Les greffes par transfert adoptif s'effectuent sur des animaux receveurs C57BL6/J Ly5.1 agés de 8 à 10 semaines, qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe.
Évaluation de l’administration d’immunostimulants sur l’infection par le parasite protozoaire intestinal Cryptosporidium chez la souris.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souriceaux de trois jours et adultes reçoivent le parasite Cryptosporidium par voie orale puis des immunostimulants par injection intrapéritonéale, avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Le projet évalue des immunostimulants contre cette infection responsable de diarrhées. Le porteur signale que le stress de certaines lignées favorise le cannibalisme des portées, et affirme que l'étude de l'immunité intestinale ne peut se faire sans animaux, les modèles in vitro ignorant selon lui la complexité de l'environnement intestinal.
Objectifs
Les infections par le protozoaire Cryptosporidium sont très fréquentes à travers le monde. Elles conduisent à des pertes économiques importantes en santé vétérinaire puisque cette maladie provoque des diarrhées sévères chez les ruminants dès la naissance et affectent aussi la santé humaine (notamment les enfants de moins de 5 ans - 2ème cause de mortalité due aux diarrhées dans les pays en voie de développement). En absence de vaccins ou de traitements autorisés et efficaces, l’objectif du projet est d’évaluer l’effet protecteur de différents immunostimulants de l’immunité innée et de décrire les mécanismes immunologiques mis en jeu lors de ces traitements.
Bénéfices attendus
En l’absence de vaccin ou de traitements efficaces qui pourraient induire des résistances, l'utilisation d’immunostimulants pour stimuler de manière non spécifique les cellules de l’immunité est une approche très prometteuse qui pourrait être bénéfique pour toute autre infection en période néonatale puisqu’elle n’est pas basée sur une réponse spécifique vers l’agent pathogène (comme les vaccins).
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite, (une fois à l’âge de 3 jours pour les souriceaux, et une fois entre 7-12 semaines pour les adultes) puis à une administration intra-péritonéale des immunostimulants (5 jours après l’infection) (introduction aiguille) sur animaux vigiles sous contention.
Impact sur les animaux
Il est possible que la conjonction des traitements : infection et déficience génétique, immunostimulation et traitement antibiotique, puisse altérer l’état général de l‘animal.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude de l’immunologie et de la muqueuse intestinale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement intestinal (flore bactérienne et antigènes alimentaires).
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par la PFIE). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. Pour analyser les données (charge parasitaire ; cytokines ; % cellules immunitaires), nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement immunostimulant) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données (ex : pour la charge parasitaire avec un effet protecteur des immunostimulants d’environ 40% (faible) : puissance estimée à 95% avec un risque de 0.05% avec 6 animaux par lots). Deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux) (indépendamment de l’infection ou d’un traitement).
Raffinement
Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas
Choix des espèces
Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également utilisée dans la présente demande pour comprendre la spécificité du mécanisme de protection chez le jeune. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Notre établissement élève de nombreuses lignées de souris transgéniques (gènes rapporteurs, déficientes, invalidation fonctionnelle etc.) pour parvenir à cet objectif. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours. Les souris adultes seront également utilisées et âgées entre 7-12 semaines.
Evaluation de la fonction musculaire après injection intra-musculaire d’une toxine chez le rat
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 870 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance est déclarée légère. Une toxine est injectée dans un muscle de la patte après incision de la peau refermée par une agrafe, puis la faiblesse musculaire est évaluée en soulevant l'animal éveillé pour observer l'écartement des doigts, sur plusieurs semaines. L'objet est de tester des toxines botuliques destinées au traitement de la spasticité. Le porteur indique que l'injection peut entraîner une perte de poids suivie comme point limite, et affirme que l'efficacité ne peut à ce stade être évaluée que sur l'animal vigile.
Objectifs
Chez l’homme, la toxine botulique est utilisée dans le traitement des maladies neurologiques caractérisées par une contraction exagérée d’un muscle entraînant des troubles des mouvements et/ou de posture qui peuvent être chroniques et douloureux (spasticité des membres, torticolis, le pied bot équin, contractions de la mâchoire, contraction des paupières entraînant la fermeture répétitive et incontrôlée des paupières…). Le traitement consiste en l'injection de petites quantités de toxine botulique dans les muscles atteints empêchant la stimulation du muscle par le nerf associé. La toxine botulique induit alors une faiblesse des muscles hyperactifs injectés. Ce traitement est efficace mais n’agit qu’après quelques jours et doit être renouvelé après plusieurs mois. Des recherches sont donc faites pour améliorer la puissance, la rapidité et la durée d’action des toxines. L’activité des toxines est testée selon un processus qui débute par une évaluation in vitro (mesure de l’activité de la toxine sur sa cible) puis sur des cultures de différents types cellulaires et ensuite différents types de muscles isolés de rongeurs. Le recours aux animaux n’est fait que si les toxines ainsi testées répondent aux critères recherchés. Elles seront alors testées sur le rat. Ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de toxines sur la fonction musculaire spontanée de la patte en utilisant une méthode largement décrite et utilisée.
Bénéfices attendus
La toxine botulique est efficace dans le traitement de la spasticité mais nécessite des injections régulières. L'amélioration des caractéristiques (puissance, rapidité d'action et durée d'action) des toxines à des fins thérapeutiques permettra une meilleure efficacité.
Procédures
Tout d’abord, le composé ou son solvant est injecté dans un muscle de la patte arrière gauche du rat anesthésié. Cette injection est faite après une petite incision de la peau ceci afin de bien identifier le muscle d’intérêt. L’incision est refermée par une agrafe et suivie lors de la surveillance quotidienne de l’état de santé des animaux. La faiblesse musculaire spontanée de la patte injectée est ensuite évaluée par simple observation et quantification de l’écartement reflexe des doigts lorsque l’animal éveillé est soulevé (score) 1 fois par jour pendant 5 jours puis éventuellement prolongé 3 fois par semaine pendant maximum 6 semaines. Un suivi pondéral quotidien est réalisé.
Impact sur les animaux
L'injection des toxines peut entrainer, à certaines doses, une perte de poids des animaux : un suivi pondéral journalier est mis en place pour suivre ce point limite.
Devenir
L'effet des toxines sur l'animal n'étant pas prévisible, il n'est pas envisageable de réutiliser les animaux à la fin de la procédure. Tous seront mis à mort.
Remplacement
Nos activités s’inscrivent dans le respect de la règle des « 3R » pour l’expérimentation animale. Si des méthodes alternatives existent lors des phases précoces de développement d’une toxine (une évaluation in vitro puis sur cultures cellulaires et ensuite sur muscles isolés de rongeurs), l’avancement de la caractérisation de la molécule d’intérêt ne permet pas à l’heure actuelle de remplacer l’étude de son efficacité chez l’animal vigile.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est Réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes.
Raffinement
Notre activité permet néanmoins de Raffiner les conditions d’utilisation des animaux en les hébergeant conformément à la réglementation dans des salles à atmosphère contrôlée (température : 22 ± 2°C) sous un cycle jour/nuit de 12 heures (lumière de 06:30 à 18:30) avec eau et nourriture (Rat/Souris Entretien A04 Safe, Epinay/Orge, France) ad libitum. Un enrichissement du milieu (briquettes à ronger et tunnel) est apporté aux animaux. Les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir de l’injection de toxine et un suivi pondéral journalier sera mis en place.
Choix des espèces
L’utilisation du rat se justifie par la taille et la réponse de l’animal qui permet une évaluation de l’effet de la toxine ainsi qu’une injection précise dans le muscle péroneus. Le modèle décrit dans ce projet est largement utilisé chez le rat pour lequel le matériel est adapté et des résultats de référence disponibles. Des rats adultes de poids 170-190g le jour de l’injection de toxine sont utilisés. A ce stade les animaux permettent: * Une manipulation facile * Leur taille est bien adaptée aux matériels utilisés * L’évolution de leur prise de poids facile à suivre L’utilisation d’une gamme de poids restreinte contribue à réduire la variabilité des résultats et ainsi le nombre d’animaux utilisé. Cette gamme de poids est utilisée dans l’article référence pour ce test.
Effets de la perturbation du rythme circadien sur le fonctionnement de l’axe reproducteur chez la souris femelle
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
217 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et les femelles peuvent subir jusqu'à deux frottis vaginaux par jour pendant treize semaines au plus, ainsi que neuf prélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours. Elles sont aussi soumises à trois semaines de décalage horaire chronique, des avances et des retards successifs de la phase d'obscurité qui perturbent leur sommeil, pour imiter le travail posté. Le porteur prévoit le stress de l'isolement pour les femelles gestantes, une irritation modérée du vagin due aux frottis répétés et une douleur modérée due à l'incision du bout de la queue, et indique que 170 souris seront tuées, les 47 autres étant gardées en vie pour d'autres expériences ou tuées à défaut. Les retombées pour les femmes en travail posté sont renvoyées au "plus long terme", sous la forme de recommandations auxquelles l'étude doit seulement "ouvrir la voie".
Objectifs
La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.
Bénéfices attendus
A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.
Devenir
Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 170 animaux. 47 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.
Réduction
Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.