Recherche fondamentale

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sourdes de naissance ou rendues sourdes selon le protocole, et utilisées pour certaines dès leurs premiers jours, elles subissent jusqu'à quatre tests auditifs sous anesthésie et une chirurgie de la cochlée, sous anesthésie, pour y injecter un vecteur viral, précédée pour une partie d'entre elles d'une à trois injections de tamoxifène dans l'abdomen. Le projet doit établir la "preuve de concept" de vecteurs de thérapie génique contre des surdités héréditaires ou liées à l'âge, et selon le porteur il "pourrait poser les bases d'un développement clinique" si les résultats sont probants. Le porteur dit ne s'attendre à aucun signe de souffrance ou d'inconfort lié à la surdité, y compris quand la chirurgie peut faire baisser ou perdre l'audition de l'oreille injectée, cette surdité étant "unilatérale".

Objectifs

Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.

Bénéfices attendus

La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests auditifs au nombre de 1 à 4 avec un intervalle minimal d’au moins une semaine entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Des animaux seront soumis à des injections sur une semaine, 1 à 3 fois, par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes). L’injection de vecteur de thérapie génique sera réalisée après l’injection du tamoxifène. Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui sera réalisée une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’Isoflurane L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).

Devenir

Les animaux seront mis à mort car ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 8-21 jours après la naissance Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par la SBEA de l’Institut Pasteur.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du lithium et diverses molécules par gavage, injection intrapéritonéale, croquettes enrichies ou minipompe implantée sous la peau, avec passages en cage à métabolisme et injection rétro-orbitaire, avant d'être tuées pour analyse des reins. Le projet cherche à comprendre la toxicité rénale du lithium, que le porteur qualifie de traitement "incontournable" du trouble bipolaire. Les atteintes possibles décrites vont de la soif intense à la douleur liée aux injections et aux implantations chirurgicales.

Objectifs

Le trouble bipolaire est une affection à la fois fréquente, touchant 1 à 4% de la population mondiale, et grave, puisque les accès maniaques et dépressifs engagent le pronostic vital en raison du risque suicidaire. Le traitement le plus efficace à ce jour est le Carbonate de Lithium. Cette efficacité incontestée est contrebalancée par des effets secondaires à long terme, et en particulier rénaux. Ceux-ci se manifestent d’abord par une incapacité à concentrer les urines et donc une soif intense, puis à plus long terme par une insuffisance rénale avec l'apparition de microkystes rénaux, pouvant évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Le mécanisme impliquerait un type de cellules particulières du rein, les cellules principales du canal collecteur responsables de l'équilibre de l'eau et du sel, et donc du milieu intérieur, dans l'organisme. Les données de la littérature ont montré une prolifération de ces cellules suite à une exposition à doses thérapeutiques au lithium. Cette prolifération semble médiée par le GDF15, facteur de croissance précédemment connu du laboratoire pour son effet en situation d’acidose. Notre projet vise à déterminer in vitro (sur des cultures cellulaires, dont sphéroïdes 3D) et in vivo sur un modèle d’exposition à long terme (jusqu’à 6 mois) le rôle et les mécanismes de la prolifération de ces cellules dans la progression vers l’insuffisance rénale. L’objectif de ce projet est ainsi de mieux comprendre la toxicité rénale du lithium et de mettre en évidence des pistes thérapeutiques préventives et curatives sur un modèle expérimental avant le développement d’essais cliniques.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiopathologie. Il vise à élucider certains mécanismes qui sous-tendent la toxicité rénale d’un traitement incontournable de la maladie bipolaire et de proposer des traitements préventifs.

Procédures

Un groupe de 80 souris sera soumis à une mise en cage métabolique pendant une durée de 4heures, chez un animal vigile, à 15 jours, 1 mois, 3 mois et 6 mois du début de la procédure : soit 4 fois par souris. Ces mêmes souris seront soumises à une mesure de DFG : injection rétro-orbitaire de FITC-inuline sous anesthésie à l'isoflurane, puis prélèvements microcapillaires à la queue à 3, 7, 10, 15, 20, 40 et 60 minutes, qui seront réalisées à 1 mois, 3 mois et 6 mois, soit 3 fois par souris. Un groupe de 40 souris sera soumis à un gavage gastrique de mubritinib sur animal vigile quotidien pendant 4 semaines. Un groupe de 40 souris sera soumis à une injection intrapéritonéale de canertinib sur animal vigile quotidienne pendant 4 semaines. Enfin, un groupe de 80 souris sera soumis à une intervention chirurgicale consistant à la pose de minipompes osmotiques sous-cutanées sous anesthésie générale (réalisée par injection intrapéritonéale) : une pose par souris. Les minipompes seront laissées pendant une durée de 4 semaines. Enfin, 400 souris seront nourries par des croquettes enrichies en médicaments données au long cours aux humains (amiloride et lithium) sans autre intervention que le prélèvement d'urines par simple contention et la surveillance de la prise de boissons, d'aliments et du poids.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l'animal et utilisés chez l'homme. Le traitement par carbonate de lithium induit une augmentation de la consommation d'eau et de la diurèse ; le traitement par mubritinib peut être responsable d'un inconfort lié au gavage gastrique, il est par ailleurs bien toléré ; le traitement par canertinib peut entraîner du fait de sa voie d'administration des douleurs liées à l'injection intrapéritonéale, il est bien toléré par ailleurs. Le traitement par tolvaptan peut entraîner des douleurs liées à l'implantation sous-cutanée des minipompes. Il est responsable également d'une augmentation de la diurèse et d'une augmentation de la consommation d'eau. La mise en cages métaboliques peut entrainer un stress chez la souris. La mesure du débit de filtration glomérulaire peut entraîner des douleurs au point d'injection du produit.

Devenir

Les souris sont euthanasiées car les prélèvements et analyses sont nécessaires sur les tissus afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur l'architecture des reins, la présence de microkystes et de fibrose, et ceci n'est pas possible avec le maintien en vie.

Remplacement

Le projet vise élucider des mécanismes responsables de l’homéostasie cellulaire du rein en réponse à des stimuli physiopathologiques. Ces stimuli sont transduits au niveau de différents tissus/organes en messages hormonaux, humoraux et/ou physiques qui sont perçus par le rein. La réponse rénale quant à elle intègre plusieurs types cellulaires, avec des interactions para et endocrines entre elles. L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes entiers.

Réduction

Pour toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre, le nombre de souris par groupe sera de 10, avec un nombre total de 640 animaux. Ce chiffre correspond à la taille des effectifs établis grâce au calcul du nombre d'animaux nécessaires pour que les tests statistiques soient interprétables.

Raffinement

Afin de réduire au maximum la souffrance des animaux, nous prévoyons de mettre en place des critères d’interruption des procédures expérimentales basés sur des paramètres non invasifs représentatifs de l’évolution de la pathologie tels que la mesure de la variation du poids corporel (Perte de poids de plus de 10 % par rapport à la dernière pesée), la pression artérielle et la surveillance quotidienne du comportement des animaux (paralysie des membres postérieurs, epistaxis, animal prostré, ne bougeant plus). La procédure en cage métabolique concernant la plus faible proportion de souris possible, et sera réalisée après habituation des souris à la procédure sur une très courte période (6h). Enfin, pour limiter la douleur dans la procédure de mesure du débit de filtration glomérulaire (procédure 6), la sédation à l’isoflurane est privilégiée.

Choix des espèces

L’intérêt d’utiliser des souris pour cette procédure est que nous maîtrisons la transgénèse chez ces animaux, et que les modèles transgéniques sont déjà disponibles, sans nécessité de nouveaux élevages et croisement dans une autre espèce. Les expériences sont réalisées chez des souris adultes de 8 semaines pesant 25-30g au début de l’expérimentation. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse soit totalement terminée. Les animaux sont étudiés jeunes car une exposition longue (6 mois) est prévue dans un groupe d’étude.

2 300 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un centre de ressources les produit et les élève pour approvisionner des laboratoires, injectant des hormones à 1 900 femelles pour stimuler la ponte et pratiquant sur 400 autres jusqu'à quatre laparotomies pour prélever des fragments d'ovaire. Les femelles hormonées peuvent être réutilisées, celles opérées à répétition étant ensuite réutilisées pour l'enseignement ou tuées. Le porteur revendique le xénope comme "organisme modèle de choix" et met en avant sa longévité, jusqu'à trente ans, comme argument de réutilisation.

Objectifs

La plateforme est au service de la communauté scientifique travaillant avec le modèle xénope. Elle reprend les activités du Centre de Ressources Biologiques Xénopes qui servait près de 60 équipes de recherche en France depuis 20 ans. Notre unité d’appui à la recherche a pour mission de fournir des animaux à différents stades de développement (œufs, têtards, juvéniles ou adultes) à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Pour cela, le centre devra produire, maintenir et élever des animaux propres à la vente. Aucun apport extérieur ne sera réalisé, nous maintiendrons le cheptel minimum nécessaire aux besoins de la communauté. Les animaux pourront être produits par reproduction semi-naturelle ou par fécondation in vitro, pour lesquelles des injections d'hormones chez la femelle sont nécessaires. Ces hormones stimulent la ponte et permettent d'obtenir un grand nombre d'oeufs. Par ailleurs, pour répondre aux besoins de certains laboratoires utilisateurs concernant les fragments d'ovaires, il est nécessaire de pratiquer sur les femelles une laparotomie (ouverture de l'abdomen par une incision) sous anesthésie générale. Une fois suturée, les femelles feront l'objet d'une surveillance post-opératoire afin de détecter un éventuel signe de souffance.

Bénéfices attendus

Notre unité d’appui à la recherche a pour mission de fournir des animaux à différents stades de développement (œufs, têtards, juvéniles ou adultes) à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes.

Procédures

Puçage (tous) Injection d'hormones (1900) ou prélèvement de fragment d'ovaire par laparotomie (ouverture de l'abdomen par une incision) (400)

Impact sur les animaux

La présence d’un stress est tout de suite visible par l’émission de venin par les glandes épithéliales. Dans ce cas l’expérience est arrêtée immédiatement et l’animal est mis en observation. Après manipulation, les femelles retournent en stabulation dans les animaleries. Le personnel animalier s’assure que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général. En cas de comportement anormal (perte de poids rapide ou progressive de au moins 20%, état de choc associé à de la prostration, nage anormale, lésions ou changement de couleur de la peau entraine la mise à mort de l'animal), le responsable du bien-être des animaux fait intervenir le vétérinaire référent pour décider de la marche à suivre (administration d’analgésiques pour soulager la douleur, ou décision d’euthanasie si l’état ne s’améliore pas au bout de 4 jours).

Devenir

Les femelles xénopes issues de la procédure 1 pourront être réutilisées dans un autre projet ou à des fins d'enseignement : en effet, la durée de vie de ces animaux est très longue (jusqu'à 30 ans) Les femelles issues de la procédure pourront, après avoir subi 4 laparotomies, être réutilisées à des fins d'enseignement ou seront euthanasiées.

Remplacement

les applications des recherches réalisées sur les xénopes nécessitent des observations sur un tissu ou individu entier. Il n’existe pas de modèle mathématique ou in vitro et pour certaines investigations, le xénope s’avère être le modèle le plus adapté (biotechnologies spécifiques disponibles uniquement chez ce modèle).

Réduction

Pour réduire le cheptel nécessaire aux différents besoins de nos utilisateurs, nous pourrons : 1) mutualiser les commandes pour que cela ne nécessite qu’une seule manipulation 2) opérer 3 à 4 fois maximum un seul individu (opérations espacées de quelques mois) et ensuite le destiner à des fins d’enseignement. 3) faire correspondre les pontes demandées par nos utilisateurs au renouvellement des stocks d’individus dans l’animalerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal (ne pas isoler longtemps un animal, cacher des aliments “bonus” pour satisfaire leur instinct de recherche de nourriture, installation de cachette). Lors des chirurgies, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques appropriés.

Choix des espèces

Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Par ailleurs, pour l’étude fonctionnelle de canaux ioniques, de récepteurs ou transporteurs, le modèle xénope est très intéressant car les ovocytes sont capables d’exprimer de nombreuses protéines qu’il est ensuite aisé de caractériser grâce, entre autre, à des méthodes d’électrophysiologie. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 2 ans environ pour X. laevis et 6 mois pour X. tropicalis (le temps de développement de cette espèce est plus rapide).

Livrées "supposées gestantes" au deuxième jour de gestation, 4 664 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour provoquer chez elles une prééclampsie, une hypertension de la grossesse, et tester sur elles des traitements. Elles subissent une chirurgie, la pose d'une pompe osmotique sous la peau ou la ligature des artères utérines, 18 heures en cage à urine, douze jours de mesures quotidiennes de la pression par brassard à la queue, une méthode que le porteur dit "légèrement stressante", et des injections sous-cutanées quotidiennes pendant quatre à douze jours ou une injection intraveineuse. Toutes sont tuées au CO2 dans le dernier tiers de leur gestation, pour récupérer leur sang par ponction cardiaque, leurs fœtus, leurs placentas et leurs reins. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d'un organisme entier", aucune méthode in vitro ne reproduisant selon lui la prééclampsie.

Objectifs

La prééclampsie est une maladie qui survient pendant la grossesse et qui provoque une hypertension artérielle chez la mère. Les complications pouvant être graves pour la mère et le fœtus, la prééclampsie peut nécessiter le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Les femmes ayant souffert de prééclampsie et les adultes nés prématurément ont un risque augmenté de maladies cardiovasculaires. Il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie. Des études cliniques ont mis en évidence une augmentation (avant même le diagnostic) de la vasopressine (ou AVP) et une diminution de l’apeline circulant dans le sang des mères atteintes de prééclampsie, suggérant fortement que l'AVP et l'apeline jouent un rôle dans le développement de la maladie. De plus, des études chez le rongeur suggèrent un rôle spécifique d’un récepteur, le V2R, dans la maladie et montrent que l'administration préventive d'apeline améliore les symptômes liés à la prééclampsie. Le premier objectif sera donc de comprendre le rôle de l'AVP et de l'apeline dans la physiopathologie de la prééclampsie chez le rat. Pour cela, i) nous évaluerons le rôle de chacun des récepteurs de l'AVP dans la prééclampsie en comparant le modèle préexistant par infusion d'AVP (qui active les trois récepteurs de l'AVP) à un nouveau modèle par infusion de dDAVP (qui a une affinité très élevée pour le V2R), et ii) nous étudierons le rôle du récepteur de l'apeline dans la prééclampsie en utilisant l'antagoniste MM 54, et nous décrirons le rôle de chaque ligand endogène du récepteur de l'apeline. Le second objectif sera d'évaluer le potentiel impact thérapeutique d’un antagoniste du V2R ou/et d’un agoniste du récepteur de l'apeline chez le rongeur atteint de prééclampsie. Pour ce faire, nous utiliserons des peptides qui ne traversent pas la barrière placentaire, c’est-à-dire sans risque pour le fœtus, et qui présentent une haute affinité et une sélectivité absolue pour le V2R ou le récepteur de l'apeline.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la prééclampsie qui demeure, à ce jour, incertaine. En particulier, ce projet va clarifier le rôle des récepteurs de la vasopressine et l’apeline dans la prééclampsie. Malheureusement, il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie, ce qui nécessite le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Ce projet va donc chercher à développer une stratégie thérapeutique contre la prééclampsie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale qui consistera soit en une intervention courte de 5-10 minutes de pose d’une pompe osmotique sous-cutanée soit en une intervention plus longue de 20 minutes de ligature des artères utérines. Les animaux seront également soumis à un seul prélèvement urinaire qui aura lieu durant 18 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines. Les animaux seront aussi soumis à un enregistrement de la pression artérielle par une méthode non-invasive (une fois par jour pendant 30 minutes maximum) durant une période de 12 jours consécutifs. Enfin les animaux seront soumis soit à des injections sous-cutanées répétées (une fois par jour) s’étalant sur 4 à 12 jours maximum, soit à une seule injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs aux chirurgies (implantation d’une pompe osmotique sous-cutanée ou ligature des artères utérines) sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie, soit 7 jours après la livraison des rates gestantes, et ne devront pas s’étendre au-delà de 72h après la chirurgie. Pour éviter ces effets indésirables la zone sera désinfectée abondamment avec de la Vétidine, un analgésique local injectable sera appliqué au niveau du site chirurgical (Lidocaïne/Laocaïne) et un antidouleur global à action diffuse par voie sous-cutanée (Buprénorphine) sera injecté. Cependant, si une infection est décelée et perdure au-delà de 72h, l’animal sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire de l’installation. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets débuteront 7 jours après la livraison des rates gestantes jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Pour éviter ces effets indésirables i) une pommade analgésique local sera appliquée, au préalable, sur le site d’injection, ii) la localisation du site d’injection variera quotidiennement et iii) les injections seront faites dans une pièce au calme sans passage. Les effets indésirables liés aux molécules administrées (inhibiteur de nitrique oxyde synthase, antagoniste du récepteur de l’apeline, AVP, dDAVP, antagoniste du récepteur de l’AVP, agoniste du récepteur de l’apeline) sont décrits dans la littérature et dans nos précédentes études « preuve de concept » et de « toxicité ». Les doses sélectionnées dans ce projet ont été choisies afin de ne pas induire d’effets indésirables chez les animaux.

Devenir

Les rates seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation par euthanasie gazeuse au CO2 à la fin de chacune des procédures expérimentales afin de récupérer du sang par ponction cardiaque et des tissus d’intérêts (fœtus, placentas, reins) pour des analyses complémentaires.

Remplacement

Nous avons étudié in vitro des molécules d’intérêts pour traiter la prééclampsie (antagonistes du récepteur de l’AVP de type 2 et agonistes du récepteur de l’apeline) afin de sélectionner le plus petit nombre possible de molécules à tester in vivo. Il est indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d’un organisme entier car il n’existe pas de modèle in vitro de prééclampsie et car cette étude s’inscrit dans le cadre d’une phase préclinique d’un nouveau traitement d’une pathologie chez l'Homme.

Réduction

Le projet s’intéresse au développement de la préécleampsie dont le paramètre caractéristique est la pression artérielle. Or, la pression artérielle est un paramètre très variable. De ce fait, le nombre minimum d’animaux par groupe calculé afin d’obtenir la puissance statistique nécessaire s’élève à 8 rongeurs par condition différentes. Une des procédures expérimentales a pour but de mesurer la capacité des molécules d’intérêt à passer la barrière materno-fœtale et donc de sélectionner les molécules non-toxiques pour l’embryon, c’est-à-dire celles ne franchissant pas cette barrière. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse pour cette procédure. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum. De plus, nous allons essentiellement réaliser notre étude sur des modèles déjà publiés et bien décrits dans la littérature de prééclampsie, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point de modèles. Enfin, si une des doses de molécule étudiée parait adéquate, toutes les doses indiquées ne seront pas nécessairement testées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pendant 7 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations sous-cutanées quotidiennes, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’injection, la localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, une analgésie locale injectable par voie sous-cutanée (laocaïne) sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse par voie sous-cutanée (buprénorphine). Pendant toute chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Pour réduire ou supprimer la douleur relative aux enregistrements de pression artérielle, nous utiliserons une méthode non-invasive qui consiste à mesurer la pression artérielle et le rythme cardiaque des rongeurs à l’aide d’un brassard placé au niveau de la queue des rongeurs. Cette méthode non-invasive est toutefois légèrement stressante pour l’animal. Pour réduire ou supprimer le stress relatif à cette méthode nous entrainerons donc les animaux quotidiennement entre le treizième jour et le vingtième jour de gestation pendant un temps n’excédant pas 30 minutes par jour. Enfin, bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, de souffrance et d’angoisse associées à l’administration des composés, une étroite surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de scoring associée.

Choix des espèces

Le rat est une espèce pertinente pour l’étude de la prééclampsie car plusieurs modèles préexistants ont déjà été publiés et sont largement décrits. De plus, nous avons déjà étudié chez le rat dans des études « preuve de concept » et dans des études de « toxicité » les molécules d’intérêts que nous souhaitons utiliser pour traiter la prééclampsie. Les animaux utilisés seront des rates gestantes. Les rates seront commandées et livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation. Les rates seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison, soit entre le neuvième jour et le vingtième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation.