Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Effets d’un élevage en milieu enrichi sur le développement des marqueurs de la Maladie d’Alzheimer chez des souris 5xFAD modèle de la Maladie d’Alzheimer.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour développer les plaques amyloïdes de la maladie d'Alzheimer dès l'âge de deux mois, elles sont réparties dans trois conditions d'hébergement plus ou moins enrichi, puis perfusées sous anesthésie profonde pour prélever leur cerveau. Le porteur déclare n'attendre aucun effet indésirable et présente l'usage de cette lignée comme "indispensable". L'étude porte sur l'effet de l'aménagement de la cage sur une pathologie que les souris sont programmées pour développer.
Objectifs
Effets d'un élevage en milieu enrichi sur le développement des marqueurs de la Maladie d'Alzheimer chez des souris 5xFAD modèle de la Maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
Si ce n'est d'empêcher; les effets d'un élevage en milieu enrichi chez les souris 5xFAD, en comparaison à d'autres souris 5xFAD élevées en milieu appauvri ou seulement socialement enrichi, devraient différer le développement de la maladie chez ces souris programmées pour développer génétiquement cette pathologie.
Procédures
A la fiin de la procédure, tous les animaux sont perfusés sous anesthésie profonde au mélange kétamine (150mg/kg) et xylazine (15mg/kg). Cette dose est 30 % supérieure à la dose utilisée habituellement, ce qui permet d'avoir une anesthésie beaucoup plus profonde. La durée de la perfusion est de l'ordre de 5 à 10 minutes.
Impact sur les animaux
Aucun
Devenir
A la fiin de la procédure, tous les animaux sont perfusés sous anesthésie profonde au mélange kétamine (150mg/kg) et xylazine (15mg/kg). Cette dose est 30 % supérieure à la dose utilisée habituellement, ce qui permet d'avoir une anesthésie beaucoup plus profonde. Le choix de la perfusion à l'aide d'une pompe péristaltique est justifié par la necessité de vider l'animal de son sang circulant, rincer au PBS et passer le produit de fixation pour procéder à des études immunohistochimique sur des tranches de cerveau.
Remplacement
Le but du projet étant d'étudier l'impact de l'enrichissement du microenvironnement de la souris 5xFAD sur la chronologie de développement des signes de la maladie d'Alzheimer, l'utilisation de la souris modèle de la maladie d'Alzheimer est indispensable.
Réduction
Uniquement 10 souris par lot et 3 situations expérimentales sont nécessaires (30 souris au total) pour effectuer des statistiques de comparaison.
Raffinement
La procédure 1 de ce projet qui consiste à étudier l'effet de 3 situations différentes d'enrichissement ne présente aucune souffrance animale. Tous les animaux utilisés sont hébergés à 5 souris par cage. Les cages sont enrichies : 1- cages (taille des cages : 35cm x 19cm, h = 14cm) enrichies par l'enrichissement de base utilisé à l'animalerie (un igloo rouge transparent), 2 -cages de Marlau (taille : 58 cmm x 40 cm x h : 32 cm) enrichies par l'enrichissement de bas utilisé à l'animalerie, 3 - cage de Marlau enrichies avec des des tunnels. La procédure 2 : les animaux sont perfusés sous anesthésie Kétamine (150mg/kg) et Xylazine (15mg/kg).
Choix des espèces
La Souris 5xFAD utilisée dans ce projet est un modèle précoce reconnu du développement de la Maladie d'Alzheimer. L'objet du projet est l'étude de l'effet de trois types d'enrichissement sur l'expression de la maladie d'Alzheimer. Du sevrage jusu'à l'âge de trois mois. Les souris 5xFAD développent les plaques amyloïdes (lésios caractériqtiques de la maladie d'Alzheimer) dès l'âge de 2 mois. Nous étudierons les effets de l'enrichissement à 3 mois.
Les 3R dans l’études du micro-environnement tumoral sur le modèle souris: bases empiriques de la réglementation éthique
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur, reçoivent des injections de cisplatine et, pour 72 d'entre elles, subissent sous anesthésie une lésion musculaire provoquée par le froid. Le projet se présente comme une contribution aux 3R, censé vérifier si des cultures cellulaires pourraient un jour remplacer la souris, mais le porteur précise que les souris ne seront pas remplacées ici et que la comparaison avec le modèle animal reste "nécessaire". Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus.
Objectifs
Il est évident que les cellules tumorales sont dans un environnement tridimensionnel dans les organismes vivants, recréer l’architecture correcte de tissu in vitro pour imiter l’effet du microenvironnement tumoral (TME) n’est pas une entreprise simple. Malgrès d'importants efforts qui ont été fait dans la création de modèle 2D et 3D dans ces analyses, ces methodes montrent encore d'importantes limitations. Les lignes directrices actuelles recommandent que les chercheurs qui utilisent l’expérimentation animale doivent se demander si et par quelle configuration alternative les animaux qu’ils envisagent d’utiliser pourraient être remplacés, si et comment leur nombre peut être réduit, et si et comment l’expérimentation animale pourrait être raffinée, c’est-à-dire être plus fiable avec la réduction du stress animale tout en obtenant une meilleure information avec un nombre inférieur d’animaux. Dans le but de fournir des bases empiriques à la recherche épistémologique, nous allons utiliser en parallèle des modèles animaux et cellulaires pour étudier la même question, c.a.d. comment le TME peut influencer la réponse tumorale aux agents chimiothérapiques. Nos resultats permettront de savoir si l'etude du TME des cellules cancereuses fait chez l'animale peut etre remplacer par des études in vitro.
Bénéfices attendus
La pertinence du TME pour les études cliniques et biologiques sur la pathophysiologie tumorale est maintenant établie, bien qu’étant une réalisation récente. En effet, le comportement des tumeurs et leur interaction avec l’hôte, allant de la réponse immunitaire à la cachexie induite par le cancer, sont si profondément affectés par le TME, que les études actuelles sur la progression du cancer et la réponse à la chimiothérapie ne peuvent plus ignorer cette question. Afin d'étudier la reproductibilité des modèles par des cultures cellulaires et tirer des conclusions de la comparaison de résultats issus de modèles in vitro et in vivo, nous avons la nécessité de l’utilisation des modèles animaux. Le but majeur de notre étude est de vérifier si les effets de la cisplatine sur la tumeur sont reproductible d'un modèle in vivo à un modèle in vitro, même en présence d’un microenvironnement tumoral assai réduit ou simplifié in vitro. La comparaison avec le modèle in vivo joue un rôle central dans les conclusions de l’étude et cela est le but premier de notre projet. Cela permettra d'établir des critères plus précis et spécifiques suivant les modalités des 3r, cad le remplacement (total avec le modèle in vitro), la reduction (nombre de souris), et le raffinement.
Procédures
Les souris seront soumis à differents types d'interventions: 1 injection de solution en SC sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 4 injections en IP (à jours 7,11, 14 et 17) sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 1 chirurgie, une blessure par le froid sous anesthesie à jours 14, la chirurgie est estimée à 6 min et le reveil entre 30 et 40 min. Elle concerne 72 animaux.
Impact sur les animaux
Les nuissances attendus chez les souris sont: masse tumorale dans la region dorsale des souris, fatigue et un stress, toxicité de la cisplatine, douleur musulaire suite à la blessure par le froid dans les premiers jour suivant l'intervention. Ces effets indésirables seront surveillés quotidiennement selon nos critères de point limite afin de mieux gérer le bien-etre des animaux.
Devenir
Toute le souris sont mises à mort à la fin de la procédure 1. La mise à mort se fera selon la réglementions européenne en vigueur. Afin de valider l'hypothèse qui est de savoir si les études fait chez l'animale peut être remplacer par des études in vitro dans l’analyse du microenvironnement tumorale(TME) des cellules cancéreuses, l'analyse des diffèrent tissus post mortem obtenu sur ces animaux est nécessaire afin de les comparer aux résultats que nous obtiendrons sur les études de culture cellulaire.
Remplacement
L'objectif général du projet est d'étudier la reproductibilité du modèles souris par rapport au modèle de cultures cellulaire. Nos objectifs spécifiques sont de voir si on peut mesurer les mêmes effets d’un puissant agent chimio thérapeutique, la cisplatine, sur les cellules tumorales in vivo et in vivo, en comparant les résultats obtenus sur un modèle souris porteur de tumeur aux résultats sur une culture de cellules isolées. Pour cela, nous allons développer un système de cultures cellulaires C26 en 2D ainsi que 3D lesquelles permettront de se rapprocher le plus possible au microenvironnement tumoral in vivo. Les souris ne seront pas remplacées dans cette étude. En revanche, les résultats nous dirons si et jusqu’à quel point dans le future nous pourrons remplacer le modele animal, dans des études similaires futures
Réduction
Pour estimer le nombre minimum d'animaux nécessaire, nous avons effectué un calcul statistique réitératif. De plus, nous disposons de l’expérience préalable formalisé dans l’appréciation rétrospective avec ce même modèle animal. De cette approche, nous avions prévu que 18 souris pour chaque condition expérimentale pour un totale de 216 souris, avec un niveau de confiance du 95% et une puissance de 80. Les outils statistiques et informatiques que nous mettons en place sur la base de notre expérience avec ce type de modèle permettront de réduire le nombre de manipulations en exploitant au mieux les données obtenus par chaque expérience.
Raffinement
Pour améliorer les conditions de vie des souris et leur éviter le stress, les pratiques suivantes seront mises en place. Nous avons défini les variables et la méthode d’évaluation quantitative du point limite au-delà duquel les animaux recevront un analgésique ou seront euthanasiés : des intervention différentes (de l’administration d’analgésique jusqu’au l’euthanasie) seront mises en place selon le score obtenue. A savoir que ce modèle expérimental a une cinétique de développent de la pathologie très bien connue, permettant de programmer les expériences de maniere à ne pas arriver aux points limites. Pour des pratiques plus invasives, tel que la génération d’un dommage musculaire afin d’étudier la régénération , l’anesthésie totale sera pratiquée, suivie d’un traitement analgésique. L’expérimentation animale sera effectuée par une équipe entrainée à cette technique. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité (3 souris par cage minimum). L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid. Afin de diminuer le stress des animaux, une maison en carton sera ajoutée dans la cage. Enfin, les animaux seront manipulés quotidiennement afin de les habituer aux manipulations et ainsi diminuer leurs stress le jour des experimentations.
Choix des espèces
La souche BALB/c est la seule compatible avec la tumeur 26, qui a été sélectionné car non métastatique, et sur cette base nous avons privilégié cette souche.. La connaissance détaillée du modèle nous permet d’une part d’exploiter au maximum les informations expérimentales obtenues et d’autre parte d’avoir une sensibilité particulaire pour évaluer tout signe de souffrance ou malaise de ces souris en présence de tumeur.
CIME – Caractérisation en Imagerie du Muscle squelettique de souris par Elastographie
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
20 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles subissent une imagerie échographique puis une IRM des pattes antérieures pour comparer les propriétés mécaniques des muscles de souris saines et de souris déficientes pour le gène KLF10. Le porteur souligne le caractère peu invasif de l'imagerie, l'anesthésie servant surtout à immobiliser l'animal, mais prévoit une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie en fin de procédure. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit un muscle fonctionnel et que la souris est le seul animal porteur de cette déficience génétique.
Objectifs
Chez l’homme, le gène étudié a une influence majeure sur le développement et le fonctionnement du cerveau, du pancréas, des os ainsi que des muscles, du sein et des ovaires. Son expression anormale a une influence sur le développement de cancers, de maladies osseuses et de pathologies cardiaques. Toutefois, alors que fortement exprimé dans les muscles, son lien avec le fonctionnement musculaire reste aujourd’hui encore sous-étudié et incompris. Dans ce contexte, dans ce projet, nous comparons le développement des muscles chez des sujets sains avec des sujets chez qui le gène étudié ne s’exprime pas (lignées de souris présentant la déficience de ce gène) afin d’en isoler l’influence. La comparaison entre sujet sain et déficient s’effectuera alors grâce à des approches in vivo par imagerie médicales, par IRM et par ultrasons (approche nommée élastographie), afin de comparer les propriétés mécaniques des muscles des pattes antérieures. A l’exception de l’anesthésie, non utilisée chez les patients humains mais nécessaire pour immobiliser temporairement les animaux, ces approches in vivo, non invasives et sans douleur par imagerie ici adaptées aux petits animaux sont couramment utilisées dans différents services hospitaliers en routine clinique.
Bénéfices attendus
Le rôle du gène étudié a été mis à jour initialement dans les cellules osseuses. Compte tenu de l'avancée des découvertes actuelles, le gène KLF10 pourrait avoir une très grande importance dans de nombreuses maladies musculaires (telle que la myopathie de Duchenne caractérisée par des lésions musculaires importantes) et pendant la cicatrisation musculaire. La perspective de cette étude sera de caractériser le rôle étudié dans les pathologies musculaires pour aboutir à moyen terme à un protocole de diagnostic sans douleur basé sur l’imagerie médicale et à plus long terme à de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes incluses dans la procédure expérimentale effectuée successivement sur chaque animal : 1) Imagerie échographique des pattes antérieures de l’animal sur une machine commerciale clinique pour imagerie anatomique et mesure des caractéristiques mécaniques des muscles. (procédure de 30 minutes) 2) Installation dans un imageur IRM petit animal pour l'imagerie de l’anatomie, de l’orientation des fibres musculaires et des propriétés mécaniques des muscles par élastographie (procédure de 30 minutes). Ces acquisition seront effectuées sous anesthésie monitorée des animaux, en imageant deux sortes de muscles afin d’en dissocier les caractéristiques : un muscle aux fibres rapides et un muscle aux fibres lentes.
Impact sur les animaux
De par la nature minimalement invasive du protocole d'imagerie (au maximum insertion d'une aiguille d'acupunture), les effets indésirables correspondent exclusivement à un potentiel inconfort lié à l'anesthésie, incluant un possible refroidissement, et au potentiel stress pouvant être ressenti par l'animal avant expérimentation. Afin d'y remédier au maximum, une période d'acclimatation sera respectée, le milieu enrichi par du papier cardé, les armoires régulés en température et en humidité et un tapis chauffant sera utilisé pendant la durée totale de l’expérimentation. Les seuls effets indésirables notables sont liés à la souche utilisée. L’inhibition de ce gène est susceptible d’engendrer des changements structurels des muscles squelettiques tels que de l'hypertrophie, le passage de fibres à contractions lentes en fibres à contractions rapides ou encore des changements dans la masse musculaire.
Devenir
A l'issu de chaque procédure d'imagerie, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie. Cette méthode sera appliquée en fin de procédure ou en cas d’atteinte des points limites. La vérification de la mort se fera par observation de l’arrêt respiratoire et cardiaque, ainsi que par observation de l’opacité des yeux.
Remplacement
Bien qu'un modèle alternatif tissulaire de muscle in vitro soit en cours de développement, il ne peut reproduire les phénomènes que nous souhaitons étudier. L’utilisation d’un animal est donc une nécessité et ne saurait être remplacé à l'heure actuelle.
Réduction
Nous utiliserons des tests statistiques nous permettant d’évaluer le rôle du gène étudié dans le fonctionnement du muscle. Le nombre d’animaux tient compte des besoins expérimentaux et statistiques tout en réduisant le nombre d’animaux au minimum.
Raffinement
Concernant les souris KLF10-KO, le phénotype ne présente aucune douleur/souffrance aux animaux. Toutes les souris seront acclimatées à l'animalerie 4 à 8 j avant le début des expérimentations. Les souris disposeront de nourriture et d’eau à volonté, avec un maximum de 2 animaux par cage. L’environnement est contrôlé (température et humidité), avec un éclairage artificiel avec photopériodes 7h-19h. Du papier cardé sera disposé dans les cages afin d'enrichir le milieu. Le jour de la procédure, les animaux seront anesthésiés individuellement par voie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le réflexe palpébral. L’hypothermie due à l’anesthésie sera évitée grâce à un tapis chauffant pendant la durée totale de l’expérimentation. De l'ocrygel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Toute la procédure sera effectuée avec l'objectif de maximiser le bien-être des animaux et de limiter la souffrance et la détresse. Nous avons mis en place un suivi des animaux et des traitements de la douleur.
Choix des espèces
Il n'existe à l'heure actuelle aucune modèle alternatif permettant de reproduire un muscle fonctionnel (lent ou rapide). Nos précédentes études nous ont permis d'établir la robustesse et l'intérêt pour cette problématique de santé public de ce modèle de souris inhibant l'expression du gène étudié. La souris constitue aujourd'hui le seul animal présentant un modèle avec inhibition de l'expression de ce gène. Les tests seront effectués sur les muscles squelettiques de souris adultes (3 mois, phénotype non dommageable dans cette tranche d’âge). Ce stade a été choisi pour rester dans la continuité de précédents travaux déjà publiés. Un des objectifs majeurs de nos travaux est de développer un modèle numérique du muscle de souris sain et avec déficience du gène étudié (modèle essentiellement basé sur les données acquises par imagerie médicale) pour la compréhension puis le diagnostic des effets de ce gène.
Système Respiratoire
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Rats : 3000
Cochons d'Inde : 2000
5 500 animaux non-humains vont être utilisés, 3 000 rats, 2 000 cobayes et 500 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est placé plusieurs heures dans une chambre de pléthysmographie, reçoit une substance à tester, parfois après pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, avant un prélèvement de sang terminal. Le porteur mène ces tests de pharmacologie de sécurité respiratoire comme prérequis réglementaire à la mise sur le marché de médicaments, et prévoit de tuer les animaux prélevés ou exposés à des substances mal connues, les autres cobayes étant remis en stock. Il affirme que ces effets sur la fonction respiratoire de l'animal vigile ne peuvent être observés par des méthodes alternatives.
Objectifs
Ce projet permet l'évaluation de l'effet des substances sur le système respiratoire: effet secondaire dans le contexte de la pharmacologie de sécurité ou modèle d'efficacité tel que des modèles d'asthme par exemple. L’objectif du projet est d’étudier les effets pharmacologiques principaux des substances étudiées, par rapport aux cibles thérapeutiques visées et d’établir le profil de sécurité de nouvelles substances médicamenteuses avant leur passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché. Les tests utilisés dans ce cas sont des modèles prédictifs pour l’évaluation des risques au niveau du système respiratoire chez l’animal conscient et non restreint. La substance est généralement administrée à dose unique. Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les tests décrits dans l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisés de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mis en œuvre au sein du laboratoire. Par ailleurs, la méthode de pléthysmographie peut également être un outil de choix pour l’étude de la fonction respiratoire sur des modèles animaux physiopathologiques tels que les souris transgéniques ou des modèles de bronchoconstriction ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. L’intérêt sociétal est évident puisqu’il s’agit de prérequis réglementaires pour l’enregistrement de nouveaux médicaments. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (ICH S7A guideline, 2001).
Bénéfices attendus
Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnées avec attention in vitro. Néanmoins, les procédures utilisées dans ce projet ont été étudiées attentivement et caractérisées de façon extensive par une bibliographie approfondie. Ainsi, les techniques utilisées dans ce projet ont été optimisées, afin d’assurer un maximum de bien- être pour l’animal dans le strict respect des 3Rs.
Procédures
Lors l'expérience, les animaux sont pesés puis installés dans la chambre de pléthysmographie (un animal par chambre) pendant une durée de 3 heures (temps d'habituation et de stabilisation). Ils sont ensuite sortis de la chambre, administrés puis remis dans la chambre. Pour certaines administrations en intraveineuse, les animaux subissent une chirurgie de courte durée pour la pose d'un cathéter au niveau de la veine jugulaire. Cette intervention est réalisée quelques jours avant le test. A la fin de l'expérience, les animaux sont observés. Un prélèvement de sang terminal est réalisé soit au niveau de la veine sublinguale sur animaux vigiles, soit en intracardiaque sur animaux anesthésiés de façon à pouvoir effectuer les analyses nécessaires sur les mêmes lots. Cela permet de ne pas inclure des animaux satellites pour la vérification de paramètres complémentaires.
Impact sur les animaux
Il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas d’effet sur l’animal. Il est également à noter que des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Une procédure spécifique est toutefois présente dans ce dossier pour prendre en compte ce cas rare ou lorsque les prélèvements vivo sont importants. La pléthysmographie corps entier permet de suivre les paramètres respiratoires sur plusieurs heures sur l’animal vigile en leur laissant une liberté de mouvements.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, s’il y a un prélèvement, les animaux sont tous sacrifiés. S’il n’y a pas de prélèvement les animaux ayant reçu des substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont sacrifiés. Les animaux n’ayant pas reçu de substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont remis en stock.
Remplacement
L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres respiratoires des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux étant largement décrits chez le rat, la souris et le cobaye. Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la fonction respiratoire des animaux vigiles. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.
Réduction
Huit animaux par groupe sont classiquement inclus dans ces expériences. Les analyses de puissance ne sont pas réalisées car il serait nécessaire de générer de nombreuses études. Si cela est pertinent et afin de réduire le nombre d’animaux, tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront réalisées à la fin des évaluations pharmacologiques (et non sur des animaux surnuméraires satellites). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des mesures. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux peuvent être réutilisés à la stricte condition qu’ils n’aient pas subis de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Un soin particulier dans le raffinement des méthodes est assuré et garantit l’utilisation systématique du modèle apportant le maximum de réponses scientifiques et le minimum de souffrance pour l’animal. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, des yeux, la posture, les réactions de l'animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l'appétit, l'état d'hydratation, les tremblements ou convulsions), afin d’assurer d’une part, un bon suivi des animaux et d’autre part, une fin sans souffrance ou angoisse lorsque nécessaire. Les méthodes d’euthanasie choisies, le cas échéant, sont sélectionnées pour supprimer toute forme d’angoisse, de stress ou de douleur. .). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment et il est mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des mesures.
Choix des espèces
Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (Touvay et le Mosquet, 2000 ; ICH S7A guideline, 2001). Cette technique a montré toute sa pertinence pour détecter les effets broncho-stimulants de nouvelles substances qui augmentent la fréquence respiratoire et la ventilation/minute (De Sanctis et al., 1991) ou bien des effets broncho-constricteurs allergiques ou non-allergiques en augmentant le paramètre de pause augmentée, pris comme index d'obstruction des voies aériennes chez le Rat (Kirschvink et al., 2005), la Souris (Delorme and Moss, 2002; Hamelmann et al., 1997) et le Cobaye (Chong et al., 1998) ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris (Murphy, 2003)..
Rôle de la Mécanique dans l’auto-organisation embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
90 cailles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère, pour créer cinq lignées transgéniques sur cinq ans. Le porteur étudie les forces mécaniques qui façonnent l'embryon de vertébré, en exploitant le développement externe de l'œuf de caille. Il juge un phénotype dommageable improbable mais prévoit de surveiller les générations F1 et F2, une perte de poids de 20 % constituant un point limite pouvant entraîner la mise à mort. Il affirme que l'étude d'embryons vivants est une "exigence absolue" et retient la caille pour sa petite taille et son cycle court.
Objectifs
L’objectif du projet est de comprendre comment signaux mécaniques et moléculaires interagissent pour permettre l’auto-organisation d’un embryon de vertébré. Pour ce faire nous proposons de créer plusieurs lignées de cailles transgénique exprimant des gènes rapporteurs de manière à étudier les processus qui sous-tendent le potentiel hautement régulé et auto-organisant de l’embryon de vertébré et le rôle de la mécanique dans ce contexte. En particulier, nous avons pour but de : 1. Sonder les propriétés mécaniques (viscosité, élasticité) de l’embryon précoce et identifier les processus cellulaires sous-jacents. 2. Perturber l’état mécanique des tissus embryonnaires et mesurer l’impact de ces perturbations sur l’expression génique et le destin cellulaire. 3. Dériver un modèle théorique et prédictif pour l’autorganisation de l’embryon et la régulation embryonnaire.
Bénéfices attendus
L’embryon de caille par son accessibilité et son développement externe, se prête remarquablement aux études dynamiques (par vidéo-microscopie) et aux perturbations mécaniques. Nous anticipons des bénéfices sur des concepts fondamentaux concernant la coopération entre signaux moléculaires et mécaniques qui sous-tendent l’auto-organisation des embryons d’amniotes (i.e. reptiles, oiseaux et mammifères, dont l’humain) qui ne sont pas atteignables chez d’autres espèces telles que la souris en raison du développement intra-utérin qui limite l’accessibilité de l’embryon. Notamment sur la manière les forces mécaniques modulent l’activité des facteurs de croissance par des processus de mécano-transduction et de rétroaction sur la génétique de manière auto-organisant. Au-delà de l’avancement de la connaissance du développement embryonnaire, ce projet aura des implications sur la compréhension des processus cancéreux et de régénération qui impliquent également forces mécaniques et redirection de destin cellulaire.
Procédures
Observation et manipulation des poussins (aspect, poids, taille, .....) pour l'évaluation de phénotype dommageable (quelques minutes, quotidiennement).
Impact sur les animaux
Ce projet implique la création de 5 lignées de cailles transgéniques en 5 ans. Les modifications génétiques proposées pour ces lignées ne sont pas susceptibles d’engendrer de phénotype dommageable et ne comportent, à priori, pas de risque pour les cailles impliquées dans ce projet. Cependant la survenue d’effet délétère est possible et sera surveillée pendant les générations F1 et F2, comme demandé dans le document de travail sur les animaux transgéniques complémentant la directive 2010/63/EU.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, car ils ne peuvent être ni réutilisés ni placés.
Remplacement
En raison de la nature des questions biologiques soulevées dans les études proposées, visant à comprendre les événements cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la formation d’un embryon in vivo, l'utilisation d'embryons vivants est une exigence absolue et ne peut donc pas être remplacée par d'autres méthodes non-animales.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour la génération d’une ligné transgénique est : En génération F1 : 6 cailles transgéniques hétérozygotes. En génération F2 : 12 cailles transgéniques issus des croisements (F1xWT) qui seront menées jusqu’à éclosion dans le but d’obtenir 6 males qui seront croisés chacun avec 4 femelles sauvages. Une seule lignée montrant l’expression la plus forte sera gardée et utilisée pour la génération d’individus en génération F3. Les animaux F1 et F2 seront suivis pour vérifier que la modification génétqiue n’a pas créé de phénotype dommageable. Évènement hautement improbable mais possible. Si les animaux ne montrent aucun phénotype dommageable, la procédure est terminée, le simple l’élevage de caille génétiquement modifiées passé la génération F2 ne constituant pas une procédure en soi. Les cailles sont utilisées dans ce projet pour produire des œufs et des lignées transgéniques, et ne peuvent pas être réutilisées dans un autre objectif.
Raffinement
Comme Indiqué ci-dessus, l’apparition d’un phénotype dommageable n’est pas souhaitée et peu probable. Cependant et comme indiqué dans le document de travail sur les animaux transgéniques complémentant la directive 2010/63/EU, nous évaluerons l’apparition d’un phénotype dommageable chez les animaux génétiquement modifiés en évaluant : -L’apparence générale : la morphologie de l’animal sera évaluée. Par exemple, la présence de tous les membres, en bonne proportion, des yeux, du bec à l’éclosion. -La taille et la croissance des individus. Les animaux adultes (>8semaines) pèsent en moyenne 360g pour les femelles et 311 g pour les males. Un écart de poids de -20% serait indicateur de souffrance et constituerait un point limite. -Le plumage : Apparence anormale de la morphologie et de l’implantation des plumes, à distinguer des problèmes de picage. -Le comportement : la posture, l’activité et l’interaction avec l’environnement seront vérifiés, (ex. acquisition de la marche après éclosion, nourrissage et abreuvement normaux qui pourraient être évocateur de l’affaiblissement de l’animal). -La présence de signe clinique évidents indicateurs d’une souffrance (ex. boiterie) Un taux de mortalité anormal. Une évaluation jugée anormale de l’un de ces critères, par comparaison avec des animaux contrôles d’un même groupe, serait révélatrice d’un phénotype dommageable qui constituerait un point limite et entrainerait la mise à mort de l’animal et la fin de la procédure concernant cette lignée/insertion.
Choix des espèces
La caille japonaise (Coturnix japonica). Les embryons d’oiseaux par leur accessibilité et leur développement externe, se prêtent remarquablement aux études dynamiques (par vidéo-microscopie) et aux perturbations mécaniques contrairement aux mammifères dont le développement intra-utérin limite la réalisation de telles approches. Sa petite taille et son temps de génération très court font de la caille un modèle génétique idéal parmi les oiseaux. -La procédure d’injection de particule lentivirale s’effectue sur des œufs fécondés mais non incubés. A ce stade il est possible de cibler de manière efficace les cellules précurseurs des cellules reproductrices et donc d’obtenir une transmission germinale. -La procédure de génération de lignée (évaluation de la présence de phénotype dommageable) s’étend sur 2 générations de l’éclosion jusqu’à la transmission dans les cellules reproductrices.
Evaluation in vivo de l’efficacité anticancéreuse des gels à base de nanomédicaments véhiculant des dérivées de la doxorubicine et de la vitamine E pour le traitement du glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
187 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies du crâne, une greffe de tumeur cérébrale puis une résection, avec administration locale d'un gel de nanomédicaments dérivés d'un anticancéreux. Le porteur décrit une craniotomie sous anesthésie, un risque d'hémorragie pendant la résection et un suivi jusqu'à l'atteinte de points limites, les souris sans signe à 120 jours étant considérées comme "guéries". Il affirme qu'aucune alternative ne reproduit les interactions entre l'organisme et la tumeur, et retient la souris pour comparer ses résultats à la littérature.
Objectifs
Le glioblastome est une tumeur cérébrale dont le pronostic est très péjoratif avec une survie médiane de 15 mois malgré un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie, ce qui nécessite de trouver rapidement de nouvelles solutions thérapeutiques. Deux facteurs importants limitant l’efficacité des agents anti-cancéreux dans le cadre de la prise en charge du glioblastome sont : (i) la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui limite l’accès des molécules thérapeutiques au niveau de la tumeur, et (ii) la présence de cellules tumorales infiltrantes et chimiorésistantes. Après résection chirurgicale et traitement, la totalité des patients développe des récidives tumorales très agressives qui se forment, dans le 90% des cas, à quelques centimètres des bords de la résection chirurgicale. Il a été récemment émis l’hypothèse que les réponses physiologiques du cerveau après résection chirurgicale peuvent créer un microenvironnement qui favorise la formation des récidives tumorales locales. Parmi les stratégies qui ont été développées pour contrecarrer les effets dévastateurs du GBM, deux sont particulièrement prometteuses : la délivrance locale d'agents chimiothérapeutiques (grâce aux implants, gels, pâtes) et l'utilisation des nanomédicaments. La première approche permet d'obtenir des concentrations thérapeutiques au site d'action en contournant les barrières du système nerveux central et de libérer le médicament de manière contrôlée pendant une longue période. La deuxième approche utilise des vecteurs de médicaments de dimensions nanométriques afin de protéger la molécule active, de cibler les cellules tumorales, de contourner les mécanismes de résistance et de réduire les effets secondaires.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse d’un nouveau traitement local à base de nanomédicaments véhiculant des dérivées de l’agent chimiothérapeutique Doxorubicine et de la vitamine E pour le glioblastome. L'étape de validation in vivo est indispensable avant toute évaluation clinique chez le patient. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux chirurgies (1) greffe tumorale ; 2) résection tumorale/ou de tissu sain et administration locale d'un traitement). Certains d'entre eux (lot 2) subiront des prélévements sanguins (max 150 µl par semaine) en retro-orbitaire à l’aide des micro-tubes à hématocrite (64 µl ; Vitrex Medical) sous anesthésie halogénée isoflurane (induction en cage à induction à 5%, phase de maintien à 1.5%) juste avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe intracérébrale et la résection chirurgicale. Les animaux seront soumis à une craniotomie, sous anesthésie générale. Les sources de stress potentielles avant/pendant l’acte chirurgical sont l’induction anesthésique, la mise en place sur cadre stéréotaxique, l’incision de la peau et le réveil. Un anesthétique local sera administré en sous-cutanée au point d’incision. Une surveillance anesthésique continue sera effectuée : fréquence respiratoire, type de respiration, réflexes, réponse à un stimulus douloureux. La résection peut induire des hémorragies locales, qui seront contrôlés par l'insertion de triangles hémostatiques dans la cavité de résection jusqu'à ce que le saignement s'arrête. La durée de la procédure n’excèdera pas les 30 minutes et le crâne sera maintenu humide avec du sérum physiologique stérile pendant l'opération. A la suite de l’intervention chirurgicale, chaque animal restera sous lampe chauffante infrarouge jusqu’à son réveil pour éviter l’hypothermie induite par l’anesthésie. La limitation partielle des mouvements de la tête à cause des points de suture peut créer une nuisance aux animaux en post-opératoire et jusqu’à la cicatrisation, mais ne limite pas généralement leur accès à l’eau et à la nourriture. Tous les animaux seront suivis quotidiennement (week-end compris) avant, durant et après les chirurgies pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de souffrance (en regardant, par exemple, leur consommation d'eau et de nourriture, la locomotion et la construction de nids suite à la chirurgie).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Les souris du lot 1 sont soit gardés en vie jusqu’à que l'un des points limites sera atteint (normalement quelques semaines/mois après la résection). S'ils n'auront pas atteint les points limites au jour 120 post-greffe tumorale, ils seront considérés comme guéri et leur mise à mort sera effectuée par dislocation cervicale. Les souris du lots 2 et 3 seront mis à mort à des temps prédéfinis (lot 2 : avant greffe ; 15 jours post-greffe avant ou après résection chirurgicale ; 72h, 7 jours ou 14 jours après résection et traitement. lot 3 : 1 semaine, 2 mois et 6 mois après chirurgie et traitement). Les temps de la mise à mort ont été sélectionnés grâce à des études précédentes qui ont permis de définir les temps clés pour le recrutement des cellules immunitaires et la formation des récidives tumorales sur ce modèle expérimentale (lot 2) et qui ont evalué la tolérabilité des gels à base de nanomédicaments similaires a celui presenté dans cette étude (lot 3). Les animaux du lot 2 seront utilisés pour des prélèvements sanguins (numération de la formule sanguine, évaluation des cytokines du sérum) et euthanasiés au temps établis pour les études post-mortem (cytométrie en flux ou immunohistochimie).
Remplacement
Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes expérimentales sur la base des résultats in vitro et in vivo obtenus préalablement. Cette étude ne peut être conduite que chez l'animal, aucune alternative ne pouvant remplacer les interactions complexes entre l'organisme hôte et la tumeur.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de l’efficacité des différentes formulations a été déterminé selon des protocoles précédemment décrits. Nous avons utilisé une méthode statistique pour réaliser le calcul d'effectif permettant d’obtenir une différence statistiquement significative entre les groupes étudiés. Le risque de première espèce a été fixé à 5% et la puissance à 80%. Le nombre de 10 animaux par groupe tiens aussi compte de l'hétérogénéité de la réponse à la greffe tumorale des cellules GL261 et des éventuelles pertes. La méthode de Kaplan-Meier sera appliquée afin de comparer la survie des animaux des différents groupes.
Raffinement
Cinq souris seront hébergées dans chaque cage avec un enrichissement. Après 7 jours d’acclimatation, les animaux seront anesthésiés avant la chirurgie (lidocaine en site d’incision ; mix d'anésthetiques pour craniotomies) et en péri- et post-opératoire une analgésie est prévue (buprenorphine).
Choix des espèces
Le modèle souris (avec le modèle rat) représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Le modèle de tumeur que nous étudions (cellules de glioblastome GL261 sur souris C57BL/6) est un des modèles syngéniques les plus utilisés dans la littérature pour des études des mécanismes immunitaires et la délivrance des médicaments pour le traitement du glioblastome. Les différents travaux scientifiques dans ce domaine ont utilisé très majoritairement des souris C57BL/6 de 5 à 8 semaines : afin de pouvoir confronter nos résultats avec la littérature nous avons choisi d’utiliser des souris de 7 semaines.
Etude des marqueurs de la rémission dans l’anorexie mentale dans un modèle murin de restriction alimentaire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une restriction alimentaire chronique à la moitié de leur ration pendant deux à six semaines, parfois avec une roue d'activité, ainsi qu'à des prélèvements de sang et des injections répétées, pour modéliser l'anorexie mentale. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et indique la corriger en 24 heures si elle dépasse le seuil prévu. Il affirme qu'une approche intégrée chez l'animal est "indispensable" et ne peut être remplacée par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et des complications somatiques et psychiatriques sévères. Parmi les troubles psychiatriques, l’AM a le taux de mortalité le plus élevé et un taux de rechute important. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’AM et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené chez des souris, est de montrer l’impact d’une restriction alimentaire chronique associée ou non à de l’activité physique volontaire sur l’évolution de biomarqueurs du métabolisme. En clinique, les patients qui souffrent d’AM de type restrictif présentent de manière surprenante une adaptation efficace de la glycémie qui reste relativement stable sur la durée. Nous nous intéressons à une hormone produite en réponse à l'état de dénutrition et dont les concentrations plasmatiques sont élevées chez les patientes souffrant d'AM. Nous nous intéressons notamment à deux isoformes de cette hormone et leur implication dans la modulation de la prise alimentaire, la glycémie et de la motivation à l’activité physique. Nous évaluerons donc comment un modèle murin conçu pour s'approcher au mieux du contexte de survenue et de chronicisation des symptômes de l'AM peut permettre la mise en évidence de biomarqueurs pertinents qui seront utilisés en clinique comme potentiels facteurs de diagnostic et surtout de pronostic de l’évolution de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet, en parallèle des études menées en clinique, nous permettra de préciser les adaptations métaboliques observées en situation de restriction alimentaire et/ou de renutrition et de valider des biomarqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie.
Procédures
Restriction alimentaire chronique (50% de la quantité délivrée en ad libitum) entre deux et six semaines. Prélévements sur animaux vigiles : prélévements d'une goutte de sang à la queue pour vérifier l'état glycémique de l'animal au cours de la restriction alimentaire, tous les 2-3 jours. Injection unique en intrapéritonéal : glucose, glycérol, pyruvate, glutamine, insuline (évaluation de la régulation glucidique). Injection en sous-cutané (sub-scapulaire) en aigu (injection unique) : isoformes de la ghréline (implication dans la régulation de la prise alimentaire et de la glycémie)
Impact sur les animaux
Nous utilisons ce modèle de restriction alimentaire depuis plusieurs années. La perte de poids induite par la restriction alimentaire est le principal effet indésirable. Toutefois, le protocole permet une perte de poids progressive et contrôlée, et l'état général des animaux est surveillé de manière quotidienne. Aussi, une perte de poids plus importante que celle habituellement observée sera régularisée dans les 24h en ajoutant une quantité de nourriture plus importante, permettant une reprise rapide de poids. Afin d'obtenir l'activité physique individuelle, certaines souris seront temporairement maintenues en cage individuelle équipée d'une roue d'activité, et ce pendant 4 jours.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à chaque fin de procédure.
Remplacement
Ce projet ayant pour objectif d’étudier des altérations cérébrales et comportementales (émotions, cognition et physiologie glucidique) complexes mimant la pathologie humaine, une approche intégrée chez l’animal est indispensable qui ne peut absolument pas être substituée par des approches in vitro ou in silico
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés (réduction) lors des explorations in vivo, nous répéterons différentes procédures sur le même animal lorsque cela se justifie sur le plan expérimental. Les animaux seront ensuite mis à mort pour les analyses biochimiques et/ou moléculaires.
Raffinement
Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, l’état général des animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal, évalué à l’aide de points limites bien définis, sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre en cas de points limites atteints (utilisation d’un analgésique, arrêt du protocole ou mise à mort). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.
Choix des espèces
Le modèle murin est ici un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire dans des conditions particulières de restriction chronique, des processus addictifs et du métabolisme énergétique. Les régulations métaboliques, hormonales et neurobiologiques mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant de très nombreuses similitudes avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet une investigation anatomique et fonctionnelle plus élaborée que ce que peuvent nous procurer les approches par imagerie chez l’humain. De plus, ces modèles bien décrits par les expériences ultérieures menées dans notre laboratoire permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies moléculaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Les troubles alimentaires et en particulier l’AM font partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets jeunes adultes et des adolescents. Dans notre projet, la majorité des procédures sera réalisée chez de jeunes souris adolescentes, sexuellement matures, à partir de l’âge de 5-7 semaines. Comme l’AM est une maladie chronique, les paradigmes expérimentaux que nous avons choisis nécessitent un suivi longitudinal de plusieurs semaines, ainsi certaines souris pourront être utilisées jusqu’à l’âge de 15-20 semaines.
Caractérisation des progéniteurs hématopoïétiques qui colonisent le thymus, chez les embryons de souris de laboratoire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une greffe de lobes thymiques sous la capsule du rein par chirurgie, d'autres une irradiation létale suivie d'une reconstitution du système sanguin, et le projet emploie aussi des embryons et des nouveau-nés. Le porteur indique des douleurs et un stress dans les jours suivant la chirurgie, une anémie et un possible passage de bactéries après irradiation, avec une perte de poids attendue pendant deux semaines. Il affirme qu'aucun système in vitro ne peut remplacer l'étude d'un système immunitaire complexe et retient la souris pour sa proximité avec l'humain.
Objectifs
Le thymus produit en permanence des lymphocytes T qui sont essentiels à la protection contre les agents pathogènes de l'environnement. Cette fonction repose sur la génération d'un répertoire diversifié de récepteurs d'antigènes qui devront être sélectionnés pour éviter l'auto-reconnaissance (tolérance). Les premières cellules hématopoïétiques qui colonisent le thymus présentent une capacité unique à générer des cellules inductrices du tissu lymphoïde (LTi) et des cellules T invariantes qui, ensemble, sont nécessaires au développement normal de l'architecture thymique. La fonction thymique est assurée par un ensemble de sous-ensembles de cellules épithéliales qui fournissent les conditions nécessaires au développement et à la sélection des lymphocytes T. En effet, le déclin de la production de cellules T au cours du vieillissement ou dans certaines conditions pathologiques résulte de la perte de fonction de ces cellules épithéliales. Nos résultats récents et nos données préliminaires ont montré que, pendant la vie embryonnaire, les cellules T invariantes et les LTi proviennent d'une vague transitoire unique de progéniteurs. Cependant, à l'heure actuelle, le programme de développement de ces progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires reste largement inconnu et le rôle des cellules T invariantes et des LTi thymiques dans l'établissement du système immunitaire adulte et dans le maintien de la tolérance n'a pas été caractérisé à ce jour. Identifier l'origine des cellules qui façonnent l'architecture thymique est essentiel pour comprendre la fonction thymique normal et, par conséquent, pour développer des stratégies visant à inverser l'involution thymique. Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1. Identifier les événements moléculaires spécifiques qui se produisent dans le temps et l'espace au cours du développement embryonnaire et qui conduisent à la génération de LTi et de cellules T invariantes, 2. Caractériser le rôle de ces cellules dans la maturation des cellules épithéliales thymiques et 3. Étudier leur rôle dans l'établissement et le maintien de la tolérance périphérique et leur implication dans l'involution thymique.
Bénéfices attendus
Le projet vise à comprendre les aspects fondamentaux de la biologie du thymus et en particulier, les propriétés moléculaires et fonctionnelles des sous-ensembles lymphoïdes qui assurent le développement normal de l'architecture thymique. Les connaissances acquises auront des impacts majeurs sur la santé publique : a) Meilleure compréhension de la tolérance immunitaire b) Amélioration des réponses immunitaires c) En raison de leur rôle important dans l'intégrité et l'homéostasie des tissus, la compréhension des voies de développement menant à la génération des premières cellules lymphoïdes pourrait offrir de nouvelles stratégies pour contrer le remodelage tissulaire négatif dans les maladies inflammatoires chroniques. d) L'augmentation sans précédent de l'espérance de vie observée au cours du siècle dernier a des implications cruciales pour les politiques et pratiques sociales, économiques et sanitaires. L'un des principaux facteurs affectant la santé des personnes âgées est le déclin des réponses immunitaires lié à l'âge, qui contribue à une incidence plus élevée du cancer. L'involution du thymus est un facteur important contribuant au déclin immunitaire associé à l'âge. La lenteur de la récupération des lymphocytes T après une greffe de moelle osseuse ou d'autres immunodéficiences acquises revêt une importance majeure. Ceci est également important chez les patients ayant subi une greffe de moelle osseuse, où la lente récupération des cellules T est principalement attribuée à l'involution des cellules épithéliales thymiques après le conditionnement et la chimiothérapie. Dans ce projet, nous allons étudier les premières interactions entre les thymocytes et les cellules épithéliales qui pourraient avoir un impact sur la dynamique des compartiments épithéliaux thymiques tout au long de la vie.
Procédures
Il y a deux types de procédures prévues qui peuvent générer une souffrance modérée. Le premier est une greffe de lobes thymiques sur la capsule du rein qui implique une chirurgie (20-30 minutes) et l’autre ces les effets de l’irradiation létale (10 minutes) en vue de reconstitution du système hématopoïétique (intervention durant 1 heure et 2 heures). Les souris nouveau-nées seront injectées avec des précurseurs hématopoïétiques à jour 0 ou 1 et gardées pendant 8 semaines (l’injection de nouveau nés prends 3-5 secondes et les nouveau-nés sont rendus à la mère en une heure maximum). Les animaux adultes reconstitués avec des cellules hématopoïétiques, puis traités avec FTY720 et 80 avec PBS contrôle, ou traités avec des anticorps (5-10 secondes par intervention).
Impact sur les animaux
Les souris qui sont transplantées avec des lobes thymiques sous la capsule du rein sont soumises à une chirurgie et des douleurs et du stress sont attendues dans les deux ou trois jours qui suivent la chirurgie. L’irradiation létale pour une reconstitution du système hématopoïétique engendre une anémie post-transplantation.. L’irradiation affecte aussi l’épithélium du système digestif et un passage de bactéries dans la circulation est possible. Malgré ces traitements il y a une période de deux semaines post-irradiation où on peut s’attendre à voir des effets sur le comportement et perte de poids chez les souris.
Devenir
Tous les animaux ayant subi des greffes, des reconstitutions ou des traitements seront mis à mort à la fin de l’expérience car ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives de remplacement non-animales dans ce domaine. Le système immunitaire est hautement complexe et constitué de différents types cellulaires qui ensemble conditionnent l’état de santé ou de déficit immunitaire ou auto-immunité. Il n’y a donc aucun système in vitro qui puisse remplacer les expériences in vivo. Dans la même logique il faut donc effectuer des expériences dans des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour le projet est basé sur un minimum de 4 expériences par groupe avec 6 souris par expérience en chaque groupe. Dès que possible les organes prélevés chez les souris seront partagés entre différents chercheurs pour limiter le nombre d’animaux utilisés. Les données seront analysées utilisant des tests T et ANOVA. Les mâles servant à générer les embryons et les souris nouveau-nées sont mutualisés entre les différentes procédures de ce projet voire d’autres projets quand cela est possible.
Raffinement
Les animaux soumis à des interventions chirurgicales seront surveillées trois fois par semaine, au minimum, des mesures d’analgésie seront aussi mises en place. Les souris seront hébergées dans des cages avec de l’enrichissement (igllos) et nous serons attentifs à toute amélioration possible des conditions d’hébergement. Les souris qui sont transplantées avec des lobes thymiques sous la capsule du rein sont soumises à une chirurgie et des douleurs et du stress sont attendues dans les deux ou trois jours qui suivent la chirurgie. Un traitement d’analgésie est prévu dans ces expériences. L’irradiation affecte aussi l’épithélium du système digestif et un passage de bactéries dans la circulation est possible. Un traitement antibiotique prévient l’effet néfaste de cette éventualité. Malgré ces traitements il y a une période de deux semaines post-irradiation où on peut s’attendre à voir des effets sur le comportement et perte de poids chez les souris. Elles seront donc surveillées de près pendant toute cette période et les souris atteignant les points limites définis seront mises à mort.
Choix des espèces
La souris comporte tous les composants-clés du système immunitaire inné et acquis, et de ce fait est un bon modèle pour l'étude des réponses immunitaires chez les mammifères. Le fonctionnement et les molécules du système immunitaire des souris sont bien caractérisés et largement comparables au système immunitaire humain. En conséquence, les résultats expérimentaux sont très probablement transférables aux humains. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes, knockout et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. En outre, les pathologies intestinales et la régulation homéostatique du nombre de cellules présentes chez les souris sont bien décrites. Les résultats des expériences que nous programmons fourniront des pistes importantes quant à la fonction des lymphocytes dans l’établissement du système immunitaire. Les souris seront des souris adultes de 6 à 8 semaines ; nous utiliserons des embryons de souris entre les jours 13 et les jours 18, seconde moitié de la gestation ; nous utiliserons aussi des nouveau-nés. L’étude des embryons et nouveau-nés est nécessaire pour comprendre les mécanismes qui gèrent l’établissement du système immunitaire.
Approches thérapeutiques des tumeurs osseuses primitives chez la souris immunodéficiente
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, le plus lourd bilan du lot. Des souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules d'ostéosarcome ou de sarcome d'Ewing, avec des tumeurs pouvant atteindre 1 500 à 2 000 mm³, pour tester des molécules candidates. Les rubriques du résumé restent très succinctes, les bénéfices tenant en une ligne ("application thérapeutique chez l'homme de nouvelles molécules") et les procédures en une phrase. Le porteur affirme que les expériences in vitro ne miment pas le microenvironnement tumoral osseux et limite chaque groupe à huit animaux.
Objectifs
Le projet porte sur l’étude de molécules capables d’inhiber le développement et la progression des tumeurs osseuses primitives et/ou le développement des lésions osseuses associées. Des études préliminaires ont été réalisées in vitro sur différents types de cellules d’ostéosarcome (humaines et murines) et de sarcome d’Ewing. Suite aux résultats les plus significatifs, des modèles animaux seront utilisés pour tester l’efficacité de ces molécules thérapeutiques dans un environnement in vivo complexe (os, tumeur…) pour une application thérapeutique potentielle chez l’homme.
Bénéfices attendus
Application thérapeutique chez l'homme de nouvelles molécules
Procédures
Procédure chirurgiclae modérée (une seul par animal), prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Développement de tumeur pouvant atteindre un maximum de 1500-2000mm3
Devenir
Mise a mort pour prélèvement des tumeurs et réalisation d'une autopsie complète.
Remplacement
Les expériences in vitro ne permettent pas de mimer un micro environnement tumoral complexe (os et tumeur). Le nombre d’animaux utilisés pour répondre à ces questions est limité au strict minimum afin d’avoir des résultats statistiques significatifs (soit 8 animaux par condition).
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au struct minimum de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Les souris recevront une période d’acclimatation de 5 jours, avant l’entrée en projet. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle jour –nuit de 12h-12h. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de mal-être.
Choix des espèces
Comme indiqué au point 3.3.2, l’utilisation de souris immunodéprimées est choisie afin d’étudier le développement de nouvelles thérapies sur des tumeurs humaines dans un environnement in vivo complexe (os et tumeur). La souris est choisie par rapport au rat afin d’injecter une quantité minimale de molécule à tester. Nous utilisons de jeunes souris afin de mimer au mieux les tumeurs osseuses qui se développent chez l’enfant, l’adolescent ou le jeune adulte chez les patients. Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines).
Apprentissage olfactif prénatal : une stratégie pour améliorer le bien-être et la santé en élevage porcin conventionnel ?
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
504 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis maintenus en vie et réintégrés au cycle de production de l'élevage. Truies et porcelets subissent des prélèvements sanguins sur animaux vigiles, et une partie des porcelets est isolée en loge individuelle pendant 72 heures pour des tests de choix alimentaire, ce que le porteur reconnaît source de stress. Le projet vise à évaluer si une odeur associée à un enrichissement pendant la gestation améliore le "bien-être" des truies et de leur descendance en élevage conventionnel. Le porteur affirme que l'espèce porcine, cible du projet, ne peut être remplacée, et met en avant un partenaire privé spécialisé dans les arômes pour "animaux de rente".
Objectifs
Le projet vise à évaluer des stratégies d'enrichissement du milieu à base d'odeurs. Les objectifs du projet sont : 1/ d'évaluer l’impact d’une exposition gestationnelle à une odeur couplée à un contexte positif (accès à une salle enrichie) pour les truies sur la santé et le bien-être des truies ainsi que de leurs porcelets lorsqu’ils sont réexposés à cette odeur au sevrage, 2/ de rechercher des marqueurs épigénétiques à long terme de l’expérience prénatale dans les cellules sanguines immunitaires.
Bénéfices attendus
L'élevage conventionnel porcin est caractérisé par des environnements pauvres et monotones, et offrant peu de stimulations sensorielles aux animaux, ce qui peut engendrer un sentiment d'ennui et de frustation et avoir des effets délétères sur le bien-être. Ce projet, qui fédère des unités autour de compétences multidisciplinaires (éthologie, épigénétique, immunité), apportera une preuve de concept et des connaissances scientifiques sur l’efficacité d’une stratégie à base d’odeurs associées à un enrichissement du milieu pour l’amélioration de la santé mentale et physique de porcelets en agissant sur l’environnement maternel. Sur le plus long terme, cette preuve de concept pourrait permettre d'envisager le développement de stratégies d'enrichissement peu onéreuses et faciles à implémenter via l'odorsiation de l'aliment ou de l'air dans des systèmes qui offrent parfois peu d'opportunité d'aménagement. Cela sera rendu possible notamment par l’implication d’un partenaire privé spécialisé dans la formulation d'actifs aromatiques à destination des animaux de rente.
Procédures
Une partie des animaux (truies et porcelets) sera soumis à des prélèvements sanguins sur animaux vigiles, à raison de 2 prélèvements par animal sur la durée totale du projet, d'une durée inférieure à 2 minute chacun. Une partie des porcelets seront soumis individuellement à un test de choix alimentaire pendant 72h, à partir de 10 jours après le sevrage (i.e. jour de changement d'aliment). Lors de ces tests, les porcelets seront logés dans des loges individuelles ce qui est susceptible d'engendrer un état de stress lié à l'isolement.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux (truies et porcelets) sera soumis à des prises de sang qui peuvent être source de stress. Néanmoins, les prélèvements de sang dureront toujours moins de 2 minutes, et induiront donc une réponse de stress de courte durée. Sur le plus long terme, les faibles volumes de sang prélevés n'induiront pas de risque d'anémie. Pour les truies allaitantes, des prises de sang à la veine mammaire seront privilégiés dès que possible car elles sont plus faciles à réaliser et ne nécessitent pas de contention. Les porcelets sevrés seront soumis à des tests alimentaires de 72h réalisés en loge individuelle et qui seront donc susceptibles de générer une légère angoisse liée à l'isolement social. Néanmoins, pendant ces tests, les porcelets auront possiblité d'avoir des contacts visuels et olfactifs avec leurs voisins de loge, ce qui devrait minimiser le stress. Des matériaux (sac de jute ou corde suspendue) seront également ajoutés dans les loges afin de complexifier l'environnement et de stimuler l'animal. Enfin, un suivi régulier des animaux permettra de repérer les animaux stressés ou mauvais état de santé.
Devenir
Les animaux seront maintenus en vie et seront inclus dans le cycle classique de production de l'élevage, conformément aux pratiques habituelles de l'élevage expérimental.
Remplacement
Le projet concerne spécifiquement l'espèce porcine. Son utilisation ne peut donc pas être remplacée.
Réduction
Nous avons réduit les effectifs de truies soumises aux prélèvements sanguins au minimum de manière à s'assurer de pouvoir traiter les données avec des statistiques paramétriques (9 truies par répétition et par lot expérimental, soit 18 truies par lot expérimental au total). Pour décrire les effets des traitements prénataux sur les paramètres sanguins liés à la santé et à l'immunité de la descendance, nous avons choisi de ne prélever que 1 mâle et 1 femelle par portée.
Raffinement
L'objectif de ce projet est de comparer des traitements (accès à un milieu multisensoriel enrichi et stimulant vs maintien dans un milieu standard sans stimulation) susceptibles de générer des états émotionnels contrastés chez les truies gestantes, et d'étudier les effets de ces traitements maternels sur les réponses comportementales et immunitaires de leur descendance, ainsi que les mécanismes épigénétiques associés. Le projet ne génère donc pas de souffrance animale, et propose au contraire à la moitié des animaux des améliorations au milieu de vie standard habituellement proposé aux truies en élevage conventionnel (groupe témoin), et donc une potentielle amélioration de l'état émotionnel de ces animaux. Le fait de limiter les mesures aux cellules immunitaires sanguines, et donc de réaliser les mesures immunitaires sans avoir à abattre les animaux pour collecter les cellules dans d'autres organes lymphoides est également une forme de rafinement du protocole, qui permet de maintenir en vie tous les animaux utilisés dans le projet. Enfin, nous avons choisi de limiter le nomnre de prises de sang à 2 sur les mères et lse porcelets, avant un intervalle de plusiurs jours entre 2 prélèvements et la définition de points limite (e.g. définition d'un temps maximal de contention) pour limiter le nombre d'évènements stressants pour les animaux expérimentaux.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le porc qui est l'espèce cible du projet, avec des perspectives d'application à la filière porcine. En effet, le projet pourrait possiblement conduire au développement de stratégies d'enrichissement du milieu à base d'odeurs dans les élevages conventionnels. De plus, le projet pourrait aboutir à l'identification de nouveaux indicateurs précoces de bien-être et de santé dans cette espèce. Il est impossible de remplacer l'approche sur les animaux vivants par une approche in vitro ou in silico puisque nous étudions ici les sorties comportementales, et leur lien avec des paramètres immunitaires ou des mécanismes épigénétiques. Nous réaliserons des mesures sur des truies gestantes puis sur leurs porcelets après la naissance car le protocole repose sur le développement d'apprentissages olfactifs in utero, en association avec un renforcement positif lié à l'état de bien-être procuré aux mères par l'enrichissement sensoriel de leur environnement.
SOLS VOLCANIQUES & SANTÉ : QUELS SONT LES RISQUES ? NOUVELLE APPROCHE CHIMIQUE ET ISOTOPIQUE
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère, par exposition chronique à des particules de sols volcaniques. Le porteur prévoit une mise à mort par décapitation sans anesthésie, expliquant que les anesthésiques et gaz d'euthanasie contiennent des métaux qui fausseraient ses analyses chimiques et isotopiques. Il reconnaît lui-même qu'une anesthésie serait "souhaitable" pour limiter la souffrance mais l'écarte pour préserver ses mesures. Il n'attend aucun effet indésirable notable en s'appuyant sur des études antérieures, et juge que seule une approche in vivo permet de quantifier la toxicité à l'échelle de l'organisme.
Objectifs
Majoritairement présents dans les pays en développement, les sols volcaniques représentent un réel danger pour la santé humaine. Une exposition prolongée pourrait favoriser le développement de certains cancers et autres dysfonctionnements physiologiques majeurs. Malgré ces dangers alarmants, les paramètres et les mécanismes de toxicité demeurent à ce jour mal connus, ne permettant pas de développer des actions durables pour préserver la santé humaine en domaine volcanique. En s’appuyant sur une recherche transdisciplinaire et co-construite avec des partenaires du LMV et du iGReD, mon objectif est d'étudier les risques liés à l’exposition chronique aux sols volcaniques. Ce projet est divisé en trois axes transversaux : -1. Caractériser les propriétés physico-chimiques des sols volcaniques afin d’évaluer leur degré de toxicité. -2. Comprendre les mécanismes d’actions induits à l’échelle de l’organisme. Cet axe sera basé sur un modèle expérimental murin couplé à des analyses chimiques, biochimiques et histologiques de pointe. Ces expériences sont fondamentales pour mieux cerner les fonctions biologiques les plus sujettes à la toxicité des particules volcaniques pouvant par la suite prédisposer à l’émergence de maladies en contexte volcanique comme les maladies repspiratoires, cardiovasculaires et hépatiques. -3. Quantifier les dérèglements du métallome (concentrations et isotopie des métaux) à l’échelle de l’organisme induits par l’exposition chronique aux sols volcaniques et développer de nouveaux biomarqueurs isotopiques. Ces nouveaux outils de diagnostic auront pour but de détecter et ainsi prévenir l’apparition des maladies associées au risque volcanique comme les pathologies hépatiques.
Bénéfices attendus
Toutes les données chimiques et isotopiques obtenues dans un premier temps sur les échantillons de sols volcaniques constitueront en premier lieu une base de données complète qui permettra d’identifier les sols les plus nocifs. A long-terme, cela permettra de concevoir une carte détaillée de l’aléa sanitaire d’origine volcanique. En parallèle, l'ensemble des données chimiques, biochimiques et histologiques obtenues sur les organes et fluides biologiques collectés uniquement aprés la mise à mort des souris, permettra d'identifier les fonctions biologiques et les mécanismes d'actions les plus sujets à cette toxicité volcanique et ce, à l'échelle de tout l'organisme. Les analyses isotopiques permettront quant à elles de développer de nouveaux biomarqueurs de diagnostic spécifiques à chaque réservoir dans le but de prévenir l'émergence de maladies associées à ce risque volcanique encore mal connu.
Procédures
Excepté la mise à mort par décapitation en fin de procédure expérimentale, les animaux ne subiront aucunes interventions comme des procédures chirurgicales invasives. Dans cette étude, nous préconisons une euthanisie par décapitation plutôt qu'une anesthésie par une surcharge d’agent chimique ou par asphyxie suivie d’une dislocation cervicale qui, nous sommes conscients, serait néanmoins souhaitable afin de limiter la souffrance animale. Néanmoins, comme énoncé précédemment (section 3.3.3), les anesthésiants chimiques (ex: le pentobarbital) et les gaz inhalés (ex: isoflurane, CO2), couramment utilisés pour euthanasier les souris peuvent contenir des quantités élevées de métaux qui peuvent biaiser de manière significative les résultats chimiques et isotopiques réalisés dans cette étude. La décapitation est donc la technique alternative la plus appropriée au regard de son effet minimal de contamination chimique.
Impact sur les animaux
Au vu des études précédentes ayant fait appel à des protocoles expérimentaux relativement similaires et n'ayant reportés aucun symptômes de souffrance ou de stress, aucune nuisance ou effets indésirables significatifs ne sont attendus sur les animaux. Pour chaque expèrience, un suivi journalier sera néanmoins mis en place pour surveiller l'état sanitaire des souris. En détail, cela se concretisera par l'établissement et le respect de points limites reposant sur le suivi quotidien du poids et du suivi alimentiare ainsi qu'une analyse de signes cliniques indicatifs d'un état de souffrance et/ou de stress tels que les yeux plissés, un pelage de mauvaise qualité (critére: apparence), des cris ou des comportements anormaux comme l'isolation, le looping ou le tournoiement (critères: Comportements et mouvements).
Devenir
A l'issu de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux pour lesquels des analyses chimiques, isotopiques et biochimiques sont envisagées, seront mis à mort par décapitation. Comme détaillé précédemment, les anesthésiants chimiques (ex: le pentobarbital) et les gaz inhalés (ex: isoflurane, CO2), couramment utilisés pour euthanasier les souris peuvent contenir des quantités élevées de métaux qui peuvent biaiser de manière significative les résultats chimiques et isotopiques réalisés dans cette étude. La décapitation est donc la technique alternative la plus appropriée au regard de son effet minimal de contamination chimique . L'euthanasie par décapitation sera également employée sur les souris ayant fait l'objet d'une exclusion de la procédure scientifique suite à l'atteinte d'un point limite. Cela nous permettra de collecter et d'analyser les organes de souris soumises à un stress physiologique anormal voir excessif (en cas d'atteinte de point limite) et de comparer les résultats obtenus avec des souris saines et/ou exposées aux particules volcaniques sans atteintes de points limites. A l'inverse, toutes les souris femelles et surplus de mâles néonatales issues des portées exposées et non exposées aux particules volcaniques, et par conséquent non inclus dans les procédures expérimentales, seront euthanasiées via une anesthésie par surcharge d’agent chimique ou par asphyxie suivie d’une dislocation cervicale pour limiter leur souffrance (cas où les organes ne sont pas analysés). Les souris femelles adultes utilisées pour les tests de reproduction, n’ayant à aucun moment été en contact avec les particules volcaniques, seront quant à elles recyclées dans l’animalerie pour une utilisation future (ex: lot contrôle lors d'une prochaine procédure) et/ou dans l’optique de maintenir une cohorte stable de souris isotonique C57BL/6 au sein de l’équipe.
Remplacement
Ce projet a été réfléchi et construit dans l'entier respect de la règle des 3Rs. Au vu de l'intéret scientifique de ce projet visant à mieux comprendre le risque induit par une exposition chronique aux particules volcaniques et ce, à l'échelle de l'orgnisme, seule une approche in-vivo sur modèle souris s'avère adéquate. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour quantifier les effets néfastes induits à l'ensemble de l'organisme par une exposition chronique aux particules volcaniques et seul le modèle vivant intégré permet une compréhension et une quantifiaction intégrale du problème.
Réduction
Bien que le remplacement ne soit pas possible, ce projet à néanmoins été pensé dans une logique de réduction du nombre d'animaux. Pour cela, le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été minimisé et calculé de façon à obtenir des données statistiquement fiables. Toutes les données obtenues dans ce projet feront l'objet d'analyses statistiques de types non-paramétriques (exemple: ANOVA ou MAnn-Whitney U test) visant à contraindre l'impact des particules volcaniques sur la santé
Raffinement
Le stress tout comme la souffrance pouvant affecter l'homéostasie et le métabolisme des métaux et ainsi biaiser nos résultats, il est primordial d'éviter toutes sortes de souffrance des animaux. Pour cela, nous adopterons un raffinement adapté reposant sur un hébergement et une surveillance quotidienne des animaux ainsi que sur l'élaboration de protocoles optimisant le bien-être animal. Cela reposera également sur un enrichissement (exemple: tunnel en carton, appareil de nidification) des cages et un maintien de plusieurs animaux par cage pour maintenir l'interaction sociale. La taille des cages sera également adaptées au nombre de souris (i.e., 3 souris par cage de 300cm2 maximum) afin de respecter la législation.
Choix des espèces
Les fonctions biologiques tout comme le métabolisme des métaux chez l'homme sont conservés chez la souris qui de fait, font de cette espèce un modèle animal entièrement adapté pour conduire notre étude. Par ailleurs, la souris reste un modèle simple d'utilisation avec des besoins d'hébergement et d'entretien faciles à subvenir. Le modèle murin est par ailleurs un modèle déjà utilisé dans ce cadre d'étude ce qui nous permettra de comparer les résulats obtenus dans ce projet avec les résultats bibliographiques antèrieurs. Afin de définir la population la plus vulnérable, l'exposition aux particules volcaniques sera faite sur des souris d'âges variables à différents stade de croissance allant de la phase néonatale à celle de l'age adulte. Pour cela nous envisageons de tester: 1/ Une exposition néonatale qui sera réalisée de la naissance jusqu'à différentes périodes de temps à savoir 20 jours (sevrage) (groupe 1), 5 semaines (groupe 2) et 10 semaines (groupe 3). Par groupe, nous travaillerons sur 1 portées exposée auquel sera ajouté 1 portée non exposée pour le groupe controle. Avec en moyenne 6 bébés par portée de femelle C57BL/6, cela fera 24 petits issus de mères non exposées par groupe soit au total 28 souris mobilisées (24 bébés + 4 femmelles adultes) pour les 5 ans. 2/ Une exposition sur des souris adultes âgées de 5mois sur des periodes de temps de un et deux mois. Pour chaque exposition, 12 souris mâles C57BL/6 seront répartis en 2 groupes (exposé et non exposé) soit 6 animaux par groupe répartis dans deux cages distinctes (3 souris par cage). Cela représentera donc 24 souris au total sur les 5ans. Pour chaque expérience, des tests de reproduction seront également réalisés. Pour les expositions néonatales, trois souris de sexe masculin par groupe seront mises en accouplement avec des souris femelles C57BL/6 matures sexuellement ce qui mobilisera 12 souris femelles supplémentaires. Pour les expositions réalisées à l'age adulte, toutes les souris seront mises en accouplement soit 24 souris femelles supplémentaires. A noter que l'accouplement se fera dans des cages individuelles dépourvues de particules volcanqiues. Les souris femelles C57BL/6 ne seront ainsi jamais exposés à quelconque risque volcanique. L'ensemble de ces expériences (adulte et néonatale) seront dupliquées deux fois pour assurer la fiabilité des résultats. Au total, ces expériences nécessiteront l'utilisation de 176 souris sur l'ensemble des 5 années ce de projet.
Evaluation de l’activité ostéogénique de vésicules extracellulaires extraites de tissus osseux dans deux modèles de repousse osseuse chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
143 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'un biomatériau, soit sous la peau, soit dans un défaut osseux du crâne créé au préalable, pour tester l'activité de vésicules extracellulaires sur la repousse osseuse. Le porteur annonce une analgésie péri et post-opératoire et n'attend que des douleurs légères, avant une mise à mort par élongation cervicale pour prélever les implants et les crânes. Il affirme qu'il n'existe pas de solution de remplacement pour une étude portant sur le tissu osseux et retient la souris, dont sont issues les vésicules étudiées.
Objectifs
En vieillissant, la communication intercellulaire entre les cellules osseuses est modifiée, et par conséquent l’équilibre entre la formation et la résorption osseuse est altéré conduisant à la perte osseuse. Récemment, des vésicules extracellulaires ont été identifiées comme un nouveau mode de communication entre les cellules osseuses, permettant la régulation du remodelage osseux. Notre hypothèse de travail est que ces vésicules extracellulaires sont impliquées dans la communication entre les cellules osseuses et qu’elles participent au processus de régénération tissulaire et au vieillissement osseux. Les vésicules extracellulaires osseuses sont obtenues par centrifugation différentielle à partir d’un broyat d’os long de souris (tibias et fémurs) prélevés sur des animaux morts (ces animaux ne sont donc pas pris en compte dans le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet). A l’issu des premières centrifugations permettant d’éliminer les débris d’os et les corps apoptotiques, la fraction obtenue est « l’extrait total ». L’ultracentrifugation de « l’extrait total » permet d’isoler la « fraction vésiculaire » et la « fraction soluble » (contenant l’ensemble des protéines solubles : cytokines et facteurs de croissance par exemple). Nous avons observé in vitro que l’extrait total permet de stimuler la différenciation des ostéoblastes, les cellules formant l’os. Nos résultats indiquent que c’est la fraction vésiculaire qui est à l’origine de cet effet in vitro. L’objectif de notre projet est de valider in vivo que l’activité ostéogéniques de l’extrait total est bien associée à la fraction vésiculaire, et non à la fraction soluble. Ainsi pour l’ensemble de cette étude, nous allons comparer l’effet de ces trois fractions entre elles. De plus, nous allons comparer l’effet de ces fractions avec celui du gold-standard, la Moelle Osseuse Totale (MOT) qui sera le contrôle positif de l’ensemble de notre étude. Afin de maintenir le matériel biologique dans les défauts osseux, les fractions seront associées à un biomatériau composé d’un mélange d’hydrogel et de granules de Phosphate de Calcium Biphasique (BCP) utilisé ici pour leurs propriétés ostéoconductrices. Ce biomatériau est déjà utilisé dans le laboratoire avec succès pour la régénération osseuse. Cette étude sera menée chez la souris dans deux contextes : en site ectopique (implantation en sous-cutané) et en site orthotopique (implantation dans des défauts osseux de calvaria).
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra pour la première fois de valider in vivo la capacité ostéogénique des vésicules extracellulaires extraites d’os dans le cadre de la régénération osseuse. Les perspectives de cette étude pourront nous apporter de nouvelles connaissances des phénomènes impliqués dans la régénération osseuse grâce aux vésicules extracellulaires dérivées d’os. A plus long terme, l’utilisation de vésicules extracellulaire pourra permettre de remplacer les thérapies cellulaires classiques et pourront être appliquées à l’Homme.
Procédures
Deux procédures chirurgicales seront réalisées. Les animaux seront soumis soit à l’implantation sous-cutanée d’un biomatériau chargé en fraction biologique (temps opératoire max : 10 minutes) soit à l’implantation d’un biomatériau chargé en fraction biologique au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de souris réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Ces procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
En se basant sur nos connaissances et nos études antérieures, nous n’attendons aucune gêne fonctionnelle, perte de poids, stress ou comportement anormal des animaux au cours de cette expérimentation. Les souris Swiss/CD1 sont décrites comme ayant une susceptibilité faible de développer les réactions inflammatoires sévères. Des douleurs post chirurgicales légères pourraient être observées. Pour cela, les animaux seront soumis à une analgésie péri-opératoire et post-opératoire par injection sous-cutanée de buprénorphine (0.05 mg/kg).
Devenir
En fin d’expérimentation, tous les animaux seront tués par élongation cervicale puis les implants sous-cutanés (procédure 1) ou les calvarias (procédure 2) seront prélevés et fixés pour les analyses radiologiques et histologiques mises en œuvre pour évaluer la repousse osseuse.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, d’ostéoinduction et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le biomatériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité et sa capacité d’ostéoconduction in vitro et in vivo. Pour la première procédure utilisant des implants sous-cutanés, plusieurs implantation (jusqu’à 4) seront réalisées sur le même animal pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour la deuxième procédure réalisée en site orthotopique, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de souris, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs une approche statistique (software GPower), nous a aidé à calculer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude. Les tests statistiques utilisés dépendront de la distribution des données. Pour chaque paramètre, la normalité et la distribution seront évaluées. En fonction de ces évaluations, un test de variance paramétrique (Anova) ou non paramétrique (Kruskall-Wallis) sera réalisé. Si P
Raffinement
Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée en prémédication et jusqu’à 48 heures après la chirurgie. La surveillance régulière des animaux permettra d’évaluer des points limites selon une grille d’évaluation détaillé (Annexe). Selon les points limites identifiés, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée ou seront retirés de l’étude. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux de 5 individus par cage avec enrichissement sous forme de frisottis et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum.
Choix des espèces
Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. De plus, les vésicules extracellulaires que nous étudions étant issues de souris, nous avons décidé de rester chez la même espèce pour la validation expérimentale in vivo de notre hypothèse d’étude. Les animaux inclus dans cette étude seront des souris mâles âgées de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.