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Ciblage spécifique de cellules de la rétine à l’aide du système CRISPR Cas9 et évaluation d’une immunité dirigée contre la protéine Cas9 pour la maladie de Stargardt.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
142 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 132 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections sous la rétine ou dans le vitré des deux yeux sous anesthésie, une imagerie rétinienne répétée et des prélèvements sanguins, avant une ponction intracardiaque terminale, pour tester une édition génique CRISPR-Cas9 contre la maladie de Stargardt. Le porteur indique aussi que le projet sert à mettre au point des gestes techniques et à valider les compétences des personnels. Il affirme qu'il est impossible de reconstituer la rétine in vitro.
Objectifs
Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les plates-formes les plus performantes pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. Parmi les différents sérotypes d’AAV connu, le sérotype AAV2/8 avec les ITRs d’AAV2 encapsidés dans la capside d’AAV8 montre une grande efficacité en termes de tropisme et de niveau d’expression dans les photorécepteurs de la rétine. Par ailleurs, les vecteurs AAV pouvant donner lieu à une réponse immunitaire suite à une pré-exposition au virus, nous souhaitons également tester les nanoparticules lipidiques (LNP) afin de délivrer la nucléase Cas9. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel d’une stratégie d’édition génique en ciblant l’intégration d’un minigène correctif dans un site de coupure d’ADN double-brin induit par la nucléase Cas9. Ce minigène permet la correction des mutations du gène ABCA4 qui impactent le fonctionnement de la protéine ABCA4, transporteur essentiel pour le métabolisme des rétinoïdes dans les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. Avec une preuve de concept déjà établie in vitro et avec des résultats préliminaires in vivo, la valeur thérapeutique de cette approche est réalisable. L’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. Pour cela, les praticiens et concepteurs en recherche sur la cécité doivent acquérir les compétences nécessaires à la réalisation de leurs projets de recherche impliquant des animaux selon la Directive Européenne (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques). C’est dans ce cadre que nous souhaitons mettre au point les techniques d’injections sous rétinienne et intravitréenne sur le modèle rat. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce.
Bénéfices attendus
L’immunogénicité de la protéine Cas9 a été décrite dans quelques études. Il est cependant à noter qu’en transfert de gène, plusieurs facteurs peuvent influencer l’initiation d’une réponse immune ; parmi eux, la dose de vecteur, la nature du transgène ou encore la voie d’administration. Dans cette étude, le but est d’étudier la présence d’une réponse immune après transfert de gène dans l’œil qui est un site décrit comme immunoprivilégié et ce, à une dose cliniquement pertinente. Concernant la détection d’une réponse immune dirigée contre la protéine Cas9, les techniques d’analyse décrites dans la littérature ne sont pas standardisées et aucun kit n’est, à ce jour, commercialisé. Notre étude permettra d’établir un protocole adéquat pour la détection de la réponse immune anti-Cas9. De plus, l’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. L’évaluation in vivo de notre stratégie d’édition génique nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. En effet, l’utilisation d’un minigène codant plusieurs exons à la fois, si efficace, permettra de corriger une large partie du gène, ce qui sera utile pour de nombreux patients, même avec des mutations différentes. Enfin si notre approche se révèle efficace, elle pourrait être utilisée pour soigner les pathologies liées à d’autres gènes de la famille ABCA.
Procédures
Phases 1 et 2 : (i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 à 3 µL injectés dans les 2 yeux des animaux, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis une fois par mois, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’examen 20 minutes maximum. (iii) Imagerie rétinienne (ERG) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis avant l’euthanasie de l’animal, soit 2 fois au total. Durée de l’examen 30 minutes maximum. (iv) Prélèvements sanguins (Phase 2) : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection puis toutes les deux semaines post-injection, soit au maximum 7 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Phase 3 (v) Injection sous cutanée de 50μg de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund : Geste réalisé sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vi) Injections en intramusculaire : 1 semaine après l’injection SC. Geste réalisé sous anesthésie générale, 200μL de vecteur en 4 sites d’injection, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vii) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection SC, soit une fois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. (viii) Ponction intracardiaque terminale : Geste réalisé sous anesthésie générale avec renforcement analgésique. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
(i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs AAV chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Une pommade ophtalmique composée de dexaméthasone et d’oxytétracycline est appliquée à la suite de l’intervention pour minimiser l’irritation de la cornée. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT et ERG) : Aucune douleur n’est attendue lors des examens d’imagerie (non invasifs). En effet, afin que l’animal soit immobilisé, cet examen est fait sous anesthésie générale n’entrainant pas de stress ou de douleur que pourrait entrainer une contention physique de l’animal et permettant ainsi d'assurer une qualité optimale d'acquisition des images. (iii) Prélèvements sanguins : un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. (iv) Injection sous cutanée de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund et injections en intramusculaire : afin de limiter le stress de ces injections et que l’asepsie soit optimale, ces gestes seront réalisés sous anesthésie général de l’animal. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections. (v) Ponction intracardiaque terminale : Une ponction intracardiaque terminale sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux. De plus, les anesthésies répétées seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Remplacement
La rétine est une structure complexe composée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières. Il n’est pas possible de reconstituer parfaitement cet organe complexe in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire, nous utiliserons au maximum des animaux de réforme pour la phase 1. Nous avons calculé nos estimations sur les séances précédentes d’injections sous rétiniennes. D'après une revue des publications d'études similaires ainsi que l’expérience du laboratoire notamment sur la reproductibilité des ERG, 8 animaux par groupe seront suffisants pour réaliser des analyses statistiques pertinentes (comparaison des groupes à l’aide d’un test non paramétrique ‘one-way ANOVA’). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques de type Mann-Whitney U pour analyser les données générées par l’expérience. Pour réduire le nombre d’animaux au minimum nous avons mis en place des mesures pour limiter la variabilité des données, y compris l’effet de la lumière. La luminosité est normalisée entre toutes les cages (mesurée par luxmètre chaque semaine). La détermination du nombre d’animaux pour l’évaluation de l’immunogénicité de Cas9 a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique des maladies de la vision. Une analyse de puissance été effectuée avec le logiciel R et le package pwr en utilisant l'écart-type que nous observons dans les mesures d’ERG chez nos rats WT. De là, nous avons sélectionné une taille d’échantillon n=8 animaux/lot comme maximum.
Raffinement
Les études antérieures de notre équipe ont été faites sur d’autres modèles pour des études précliniques. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce. Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie
Choix des espèces
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt : la lignée, issue de rats Sprague Dawley, que nous utilisons ici, a été créée par la technologie de CRISPR/Cas9. Cette technologie nous a permis de produire, lors du même projet de transgénèse, des rats « knock-out » pour ABCR4 (ABCR-/-). Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. L'augmentation du niveau de bis-rétinoïdes est mis en évidence dès l'âge de 3 mois et augmente avec l'âge comme le montrent nos résultats préliminaires par HPLC et spectrométrie de masse. Il semble donc pertinent de commencer le traitement entre l'âge de 2 et 3 mois : à cet âge le risque de décollement de la rétine est faible et on se situe dans la fenêtre thérapeutique. Pour l’évaluation de la réponse immunitaire, nous souhaitons évaluer celle-ci sur des animaux ayant un système immunitaire mature, donc sur des rats adultes de 3 mois.
Evaluation de l’impact de la dépletion de la microglie durant le développement sur les fonctions cognitives à l’age adulte
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après déplétion de la microglie par gavage des mères gestantes, elles subissent à l'âge adulte des sons intenses provoquant des sursauts, des chocs électriques plantaires pour un conditionnement pavlovien et un test de sensibilité à l'épilepsie pouvant déclencher des convulsions. Le porteur qualifie ces périodes de stress de courtes et indique faire enchaîner toute la batterie de tests aux mêmes animaux pour en réduire le nombre. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico n'existe pour étudier ce rôle développemental.
Objectifs
Le développement des cellules de la microglie (une population spécifique du cerveau) durant le développement embryonnaire constitue une étape clé dans la mise en place des réseaux neuronaux mais aussi dans l'équilibre entre les différents types cellulaires qui semble prépondérant dans de nombreuses pathologies neurodégénératives chez l'Homme. Nous souhaitons dans le cadre de cette étude mettre en évidence les troubles comportementaux qui seraient susceptibles d'apparaitre chez des animaux ayant subi une déplétion de cette microglie durant leur développement. On constate en effet que la microglie se régénère lors du développement post-natal, mais que son absence durant le stade embryonnaire entraîne un impact durable au niveau cognitif. Pour cela, des Souris seront exposées durant leur développement (par gavage des souris gestantes), à un agent pharmacologique entrainant une disparition de la microglie durant une période définie du développement. Par la suite, ces Souris poursuivront leur développement et nous analyserons leurs réponses comportementales dans de multiples tests visant à déterminer les capacités cognitives.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mettre en évidence le rôle critique joué par la microglie durant le développement embryonnaire, sur les fonctions cognitives à l'âge adulte. De plus, nous obtiendrons des informations imporantes sur la chronologie des évenénements ayant lieu au cours de la mise en place de cette population durant le développement de l'embryon.
Procédures
Les animaux effectueront plusieurs procédures impliquant des sons d'intensité élevée mais d'une durée inférieure à 40 ms, afin de déterminer leurs réaction face à des stimulus acoustiques, un choc électrique plantaire d'intensité modérée et d'une durée inférieure à 50ms (afin de mettre en place un conditionnement de type pavlovien) ainsi qu'une évaluation de leur sensibilité à l'épilepsie pouvant mener à des convulsions musculaires. Aucun prélevement sanguin ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront durant ce projet de courtes périodes de stress (30 minutes environ) liées à l'exposition à des bruits entrainant des sursauts, ainsi qu'à un choc électrique plantaire visant à mettre en place un apprentissage de type pavlovien. En fin de protocole, lors de l'évaluation de la susceptibilité à l'épilepsie, il pourraient subir des contractions musculaires d'intensité modérée à forte durant une période de deux heures, sous surveillance d'un expérimentateur entrainé.
Devenir
Les animaux ayant suvi l'ensemble du protocole ne pourront pas être réutilisés pour d'autres projets.
Remplacement
Etant donné que ce protocole vise à déterminer le rôle d'une population de cellules durant le développement d'une organisme complexe sur le comportement adulte, aucune alternative (in vitro ou in silico) n'est actuellement possible
Réduction
Nos effectifs expérimentaux sont réduits à 10 animaux par groupe, ce nombre est suffisant pour obtenir une puissance statistique acceptable dans les procédures que nous allons utiliser, au regard des données précédemment générées. Par ailleurs, le même lot d'animaux effectuera l'ensemble de la batterie de tests afin de minimiser le nombre d'animaux employés tout en disposant de temps de récupération pour éviter un effet cumulatif du stress et une interaction des procédures entre elles.
Raffinement
Toutes les mesures possibles ont été mises en place pour améliorer les conditions de vie ainsi que réduire le stress occasionné par les procédures expérimentales. Ainsi, les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à disposition, lors des protocoles expérimentaux, les animaux sont placés 30 minutes avant le test dans la pièce expérimentale pour réduire le stress occasionné par le changement d'environnement de leur cage. Durant les procédures impliquant une anésthésie, un gel oculaire sera utilisé pour éviter le déssechement de la cornée. Les animaux seront maintenus en groupe sociaux durant l'ensemble du projet.
Choix des espèces
Nous disposons de bons modèles de déplétion de la microglie durant le développement embryonnaire dans ce modèle . Les animaux seront agés de 8 semaines lors de l'implantation de la puce et de 10 semaines au premier tests comportemental, cela constitue l'âge idéal pour étudire le comportement des animaux déjà suffisamment développés.
Apport de la thérapie génique pour traiter les déficits visuels, auditifs et d’équilibre dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
5 694 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 954 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 620 un niveau léger et 120 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections dans la cochlée ou sous la rétine sous anesthésie, puis des tests auditifs, des tests d'équilibre (rotarod, suspension par la queue, nage) et des électrorétinogrammes, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Usher. Le porteur indique que les souris déficientes présentent surdité et troubles de l'équilibre et n'attend aucune aggravation. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit le fonctionnement de la rétine et de l'oreille interne.
Objectifs
Le syndrome de Usher de type 1B (USH1B), causé par une mutation dans le gène MYO7A, représente plus de la moitié des formes héréditaires de surdicécité. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour prévenir et/ou corriger les déficits sensoriels responsables de ces atteintes auditives et visuelles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B (USH1B). Nous testerons deux stratégies de transfert de gènes (via des vecteurs viraux ou via des liposomes) dans des souris génétiquement modifiées (déjà créées ou à créer, mâles et femelles, nouveau-nés et adultes).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables des pertes visuelles et auditives décrites dans le syndrome de Usher de type 1B et de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder la maladie. A court terme : - L’utilisation de souris humanisées nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la maladie dans les cellules sensorielles de la rétine et de l’oreille interne. - L’injection des formes courtes de la Myosine 7A (mini-MYO7A) nous permettra de mieux comprendre le rôle des différents domaines constituant la Myosine 7A et leur implication dans le syndrome de Usher de type 1B. - Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de la thérapie génique dans la correction des troubles auditifs, vestibulaires et visuels chez des souris porteuses de mutations dans le gène Myo7A. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques et qui permettront de prévenir ou retarder la cécité et la surdité chez les patients atteints du syndrome de Usher de type 1B. Ceci inclut : - la découverte d’un mini gène fonctionnel et prêt pour de potentiels essais cliniques, - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène non viral, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques, Les méthodes que nous allons développer pourraient permettre de traiter d’autres maladies affectant des gènes de grande taille.
Procédures
Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections intracochléaires ou à des injections sous-rétiniennes. Ces injections se feront sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes. Tests auditifs : Les souris injectés au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées par voie intrapéritonéale puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Les potentiels auditifs évoqués seront enregistrés à l’aide d’électrodes sous-cutanées placées à proximité du nerf facial. Les produits de distorsion des oto-émissions acoustiques seront enregistrés à l’aide d’une sonde placées à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux destinés à évaluer leur fonctions vestibulaires. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système de vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifié à l’aide d’un système rotarod (31 minutes) et d’un test de maintien sur une plateforme surélevée (2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à un test de suspension par la queue (15 secondes) et par un test de retournement (15 secondes). Un test de nage sera finalement réalisé (30 secondes) avant le retour en cage d’hébergement. Tests Visuels : Les souris injectées au niveau de la rétine seront soumises à des électrorétinogrammes (ERG) entre 2 et 11 mois post-injection. Elles seront placées à l’obscurité 3 heures avant leur anesthésie par voie intrapéritonéale, puis exposées à de brefs flashes lumineux d’intensité croissante. Les réponses électriques générées par les photorécepteurs et neurones rétiniens seront enregistrés à l’aide d’électrodes placées sous les paupières. Des ERG seront également réalisés entre 0 et 60 minutes après désensibilisation à la lumière (exposition de 3 minutes à une intensité lumineuse déterminée). Prélèvement d’organes : Les tissus seront récupérés post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en myosine VIIa (souris shaker-1) sont atteintes de surdités et présentent des troubles de l’équilibre. Les déficits visuels sont peu marqués et ne provoquent aucun changement comportemental. Les nouvelles lignées de souris que nous souhaitons créer pourraient présenter des phénotypes similaires. Aucune aggravation de phénotype n’est attendue pour ces nouvelles lignées de souris déficientes en Myosine-7a. Les injections intracochléaires et sous-rétiniennes seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue, hormis un risque limité de cataracte. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté Myo7a contribuera à rétablir les fonctions d’équilibre voire l’audition des souris injectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car ne pouvant être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de la rétine ou de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus visuel ou mécanique par les photorécepteurs ou les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux cellules ganglionnaires de la rétine ou aux neurones spiraux de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la cécité ou la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de déterminer le nombre minimum d’individus par groupe expérimental, nous avons retraité les données issues de souris normales et mutantes avec un outil statistique. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel. Selon la taille et la distribution des échantillons, nous utiliserons différents tests paramétriques ou non paramétriques. Pour certaines procédures, les mêmes animaux seront utilisés pour nos tests comportementaux et auditifs, puis mis à mort pour collecte des tissus.
Raffinement
Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes en carton et de bâtonnets en bois. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’œil et de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Ces modèles, complétés de ceux que nous souhaitons créer, vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections sous-rétiennes se feront sur des animaux âgés de 30 jours, soit à un stade où l’espace sous-rétinien est bien formé. Les injections intracochléaires se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 6 jours et 11 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.
Immunogénicité et innocuité de candidats vaccins chez le primate non humain (PNH).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Macaques rhésus : 50
Singes vervets : 50
400 primates non-humains (300 macaques crabiers, 50 rhésus, 50 vervets) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés après une période de repos. Ils reçoivent des candidats vaccins par voie intramusculaire ou sous-cutanée, avec des prélèvements sanguins pouvant être quotidiens et aller jusqu'à 20 % du volume sanguin, la contention étant obtenue par entraînement plutôt que par anesthésie. Le porteur indique que les animaux pourront être mis à mort pour prélever leurs organes si le commanditaire ne demande pas leur réutilisation. Il qualifie le "modèle primate" d'"incontournable" en immunothérapie du fait de sa proximité avec l'humain.
Objectifs
Ce projet porte sur l’évaluation de l’immunogénicité et de l’innocuité de candidats vaccins chez le PNH. Une étude d’immunogénicité consiste en: 1) l'administration d'un/plusieurs antigène(s) ou un candidat vaccin, 2) l'hébergement des animaux pendant la période nécessaire à l’obtention d’une réponse immunitaire et 3) au recueil du sang, des fluides corporels et/ou des organes afin d’analyser, par des méthodes in-vitro, la réponse immunitaire. L’objectif est d’analyser la réponse immune primaire (première en réponse à une infection) ou la réponse mémoire (secondaire à l'infection) ainsi que certains paramètres d’innocuité (réaction locale et systémique, suivi du poids et éventuellement de la température corporelle, etc).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet pourront être multiples : 1) sélection des antigènes et des adjuvants constituant le candidat vaccin, 2) définition de la dose humaine, 3) évaluation du mécanisme d’action du candidat vaccin, 4) évaluation de la performance du candidat vaccin au niveau préclinique avant les essais cliniques chez l’homme, 5) support au développement des procédés de production des antigènes et des adjuvants, 6) support au développement d'un test d’activité biologique. Ces différentes données précliniques ont pour but de sélectionner et d’optimiser les candidats vaccins en amont de leur évaluation clinique et en support à leur enregistrement réglementaire.
Procédures
Le projet consiste en l’administration d’un/plusieurs antigène(s) sous différentes voies d'administration et si nécessaire d’un adjuvant entre 1 et 4 fois. De façon générale, les voies d'administration de vaccin utilisées sont l'intramusculaire ou la sous-cutanée ; ces administrations peu invasives sont rapides (
Impact sur les animaux
Des réactions locales au niveau des sites d'administration et une réaction systémique de type fièvre peuvent apparaître les jours suivants les administrations du candidat vaccin. Les sites d'administration et la température corporelle seront donc suivis les jours suivants les administrations.
Devenir
Les animaux seront réutilisés après une période de repos et avis vétérinaire (revu du protocole de prélèvement sanguin: fréquences et volumes prélevés en fonction des recommandations). Si la réutilisation n'est pas envisagée (demande du sponsor) , les animaux pourront être mis à mort pour récolte d'organes.
Remplacement
L’évaluation de l’immunogénicité spécifique d’un antigène nécessite un enchaînement d’étapes impliquant de multiples organes et tissus évoluant sur plusieurs semaines. Cette succession d’évènements est difficile à reproduire in-vitro et pour cette raison, le recours à l'animal est requis dans la plupart des cas. Des essais in-vitro sur cellules animales ou humaines peuvent apporter des données complémentaires mais ne peuvent pas encore substituer les essais in-vivo à ce jour.
Réduction
Pour chaque procédure réalisée, il sera veillé à utiliser un nombre minimal et suffisant d'animaux pour que les résultats soient interprétables et transposables.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d'enrichissement dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Une attention particulière sera accordée à l’enrichissement du milieu de vie des animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. L'inclusion de paramètre hématologiques et biochimiques pour le suivi clinique, l'inclusion de prélèvement de fluides biologiques permettent un suivi précis du statut de l'animal. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélèvements ainsi qu’entre les administrations de la ou des molécule(s) étudiée(s). Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable. Avant tout acte techniques, les animaux bénéficieront d'entrainements avec récompenses, ce qui permettra de réduire leur stress durant les manipulations.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé chez le primate (macaque cynomolgus, rhésus ou vervet) du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du système immunitaire et de la qualité des réponses immunes entre ces deux espèces. Le modèle primate est incontournable en immunothérapie où beaucoup de molécules montrent des résultats décevants dus à un manque de similitude avec d'autres modèles tels que les rongeurs. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le PNH seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. Pour le choix de l’espèce de macaque, les données de la littérature seront considérées lorsque disponibles, ainsi que des aspects techniques : taille, état sanitaire et disponibilité des animaux d'élevage. De jeunes adultes seront utilisés pour des raisons de poids et de maturité du système immunitaire.
Le rôle du recepteur CB1 dans le processus de de/regeneration de la junction neuromusculaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un écrasement chirurgical du nerf sciatique pour dénerver une patte, puis reçoivent un dérivé de cannabinoïde ou un placebo, avant mise à mort à 2 ou 21 jours pour prélever muscles et nerfs. Le porteur indique un risque faible d'automutilation des extrémités dénervées, entraînant la mise à mort en cas d'atteinte. Il affirme que les connaissances actuelles ne permettent aucune simulation in vitro ou in silico de ces processus.
Objectifs
Avec ce projet, nous voulons comprendre le mécanisme par lequel les cannabinoïdes (molécules dérivées du cannabis) régulent la (ré)génération nerveuse, et leurs implications potentielles dans les maladies neurodégénératives. Pour ce faire, nous procéderons à un écrasement chirurgical du nerf sciatique chez des souris, afin de supprimer transitoirement l’innervation d’une patte, ce qui que nous permetra d’étudier par la suite les effets des cannabinoïdes sur la dé/ré-generation nerveuse.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra amener au développment d’outils thérapeutiques visant les processus de dégénération des nerfs périphériques, qui manquent cruellement pour traiter un certain nombre de maladies neuro-dégénratives (telles que la sclérose latérale amyotrophique).
Procédures
Nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées, dont le récepteur aux cannabinoïdes de type 1, « CB1 », est absent chez la moitié des individus. Ces souris subiront une dénervation complète et transitoire d’un membre inférieur par écrasement du nerf sciatique. Cette procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale, avec un traitement morphinique pour prévenir la douleur. L'intervention aura une durée de 30 minutes. Dans la période postopératoire (intevention de 3 jours), une injection sous-cutanée de Buprénorphine (0,1 mg/kg) sera administrée 6 heures apres la premiere injection et répétée une fois par jour pedant 3 jours. Par la suite, un groupe de souris sera traité avec un analogue des cannabinoïdes tandis que l’autre recevra un traitement placebo, par injection quotidienne dans l’abdomen. Cette intervention aura une durée de 2 jours ou 21 jours comme expliqué apres. En fait la moitié des souris sera mise à mort après seulement 2 jours de traitement, pour l’analyse post-mortem de la dégénération nerveuse. L’autre moitié sera mise à mort après 21 jours de traitement, pour analyser cette fois-ci la régénération nerveuse.
Impact sur les animaux
La procédure de dénervation complète transitoire d’un membre inférieur par écrasement contrôlé du nerf sciatique offre un modèle fiable de dégénération/régénération nerveuse et sourtout sans impacts dramatiques sur l’état générale de l’animal, son comportement moteur et alimentaire ou presence de douleur chronique, car la procédure sera effectué de façon aigüe et unilaterale. Il n’y a pas de risque majeur de saignement lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traité par une anesthésie majeure et des analgesiques (voir procédure). La douleur est normalment associée à l’acte opératoire mais il n’y a pas de signe perceptible des douleur après l'opération et durant la régénération. Neanmoins, il peut y avoir des points limites bien décrit dans la procédure. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie et autotraumatisme des extremités suite à la dénervation est très faible et la mortalité lié à la procedure de dénervation est reportée aux alentours de 1% dans les publications sur le sujet. Ainsi, un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique e.g. cicajet et anti-inflammatoire systemique e.g. Metacam 5mg/kg I.P.) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal (automutilation), l’animal sera mis a mort.
Devenir
Les souris sont mises à mort par dislocation cervicale 2 jours ou 21 jours apres la procedure chirurgical/injections pour prelevement post-mortem des muscles et nerf sciatiques. Ce type de mise a mort est l’unique compatible avec les analyse hystologique at d’expression des proteines que seront effectué sur les echantillons.
Remplacement
À ce jour, l'étendue des connaissances concernant le système nerveux est encore trop limitée pour permettre la conception de simulations numériques ou de modèles in vitro pour modéliser fidèlement les processus de dégénération et régénération nerveuse. De plus, l’usage d’invertébrés, qui ont un système nerveux complètement différent du nôtre, serait ici inapproprié. Dans ce contexte il demeure donc nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale sur des vertébrés.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 12 animaux par groupe expérimental, c'est-à-dire le nombre minimal d’animaux permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine. Cela représente au total 288 souris, sur les 2 années que dure ce projet. Les nombres prévus permettront de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, avec un milieu enrichi (matériel de nidification), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des soins soient immédiatement prodigués si nécessaire (désinfection, anti-douleurs, etc.). La mise en place de points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux et peut conduire à la mise à mort d’un animal afin d’éviter toute souffrance prolongée qui ne saurait être soulagée.
Choix des espèces
La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur aux cannabinoïdes de type 1, « CB1 »), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont parfaitement adaptées à l’étude des rongeurs. Les souris seront âgées de 8-12 semaines (âge adulte). En effet, les protocoles que nous avons établis nécessitent des souris adultes, pour éviter la variabilité associée aux différences de développement. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain. Les protocoles que nous avons établis seront utilisés sur des souris mâles pour éviter la variabilité associée au cycle menstruel des femelles, qui a un impact sur les niveaux d’expression du récepteur CB1. Cela nous permettra également de comparer les résultats obtenus avec ceux d'autres études déjà effectuées dans notre équipe.
Détermination du nombre de cellules tumorales à injecter pour induire des métastases hépatiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules tumorales sont injectées dans la rate par chirurgie pour induire des métastases du foie, suivies de jusqu'à cinq séances d'IRM sous anesthésie, afin d'étudier la résistance aux traitements du cancer colorectal. Le porteur indique que la douleur peut venir de l'implantation tumorale et prévoit la mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids ou en cas de troubles du comportement. Il affirme que la complexité de ce cancer interdit actuellement tout remplacement in vitro.
Objectifs
Le cancer colorectal est l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde, aussi bien chez les femmes que les hommes. Le risque de métastases dans des organes distants est fréquent, le foie représentant généralement le premier organe touché et donc représentatif pour le pronostic du patient. Chez ces derniers patients, le traitement de référence reste est un traitement médicamenteux composé d’une chimiothérapie associée à un agent anti-vasculaire (suivi d’une ablation de la partie cancéreuse du foie). Cette stratégie thérapeutique permet l’augmentation de la survie des patients. Malheureusement, environ 40 à 50% des patients présentent des résistances aux traitements médicamenteux, ne laissant pas la possibilité de les opérer. Le but de cette étude est de déterminer les mécanismes (cellulaire et moléculaire) de cette résistance aux traitements. Le projet vise à étudier la tumeur (les cellules cancéreuses) et son microenvironnement (cellules des vaisseaux sanguins) par IRM (imagerie par résonance magnétique).
Bénéfices attendus
Développer des nouveaux biomarqueurs pour évaluer l'effet du traitement sur le microenvironnement tumoral et le réseau vasculaire. Valider l'efficacité de ces marqueurs sur une cohorte de patients. Prédiction de la réponse aux traitements pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à : 1) Chirurgie : injection des cellules tumorales dans la rate, la durée de la procédure est estimée à 30 minutes. Cette procédure est réalisée sous anesthésie. 2) Imagerie par résonance magnétique :12 jours après l’injection des cellules tumorales, le nombre de séance d’IRM peut aller jusqu’à 5 séances au total, le délai minimal entre les séances d'IRM (Après la première IRM) est d’une semaine à 10 jours (selon la vitesse de croissance de la tumeur). La durée des IRM est 1h par souris (réalisé sous anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
(1) Risque de douleurs suite à la chirurgie. (2) Développement d'un cancer
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin du protocole.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude in vivo ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes, compte-tenu de la complexité́ de ce cancer . Ce modèle permettrait d'étudier les métastases du foie dans leur environnement (développement de tumeur dans l’organe), notamment les cellules des vaisseaux sanguins qui jouent un rôle important dans le développement tumoral. Des études in vitro ont été réalisées en amont, qui complèteront ce volet d'expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation de 30 souris pour une durée maximale de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisé est le minimum requis pour atteindre l’objectif fixé en prenant en compte que le taux tumoral peut varier.
Raffinement
Acclimatation de 10 jours pour les souris après leur arrivée à l'animalerie avant de débuter le protocole. Les animaux sont surveillés quotidiennement et ont accès à la nourriture et à l’eau. Ils sont hébergés dans un environnement enrichi permettant la formation de groupes sociaux. La procédure chirurgicale sera d'environ 30 minutes (maximum), les souris seront endormies et allongée sur un lit chauffant. A la fin de la procédure chirurgicale, le réveil des animaux sera surveillé de près. Après leur réveil les animaux seront réintégrés dans leur cage. Des croquettes humidifiées et de l'hydrogel seront mis en place pour favoriser le bien-être des animaux. Toutes les manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées. Un analgésique qui sera administré avant, pendant et après la chirurgie. L’utilisation de ce dernier sera renouvelée si besoin afin d’éviter toute souffrance à l’animal. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé́, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.) puis l'anorexie, perte de poids > 20%. Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité́ de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris adultes de 8 semaines. Ce modèle est le plus utilisé et validé par la littérature scientifique. Les cellules tumorales qui seront utilisées dans ce protocole sont des cellules murines, qui sont compatible avec l'espèce choisie.
Bivalimage: traceurs peptidiques bivalents pour le ciblage tumoral en imagerie nucléaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections intraveineuses de traceurs radioactifs sous anesthésie, suivies d'imagerie et d'un prélèvement sanguin terminal, pour tester des peptides de ciblage du cancer de la prostate. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grâce à l'imagerie non invasive. Il indique recourir à des cultures cellulaires tant que possible et réserver la souris aux expériences in vivo.
Objectifs
Les tumeurs peuvent co-exprimer différents récepteurs, cibles de nouvelles stratégies de détection et traitements tumoral. Des peptides à deux parties distinctes peuvent se lier à ces différents récepteurs et présenter des avantages (meilleure affinité, rester plus longtemps sur la tumeur, augmenter les chances de visualiser le tissu malade indépendamment du stade de la maladie) par rapport à des peptides simples. Ainsi ce projet vise à étudier les propriétés de ciblage tumoral de ces nouveaux peptides, marqués par de la radioactivité, pour leur utilisation en imagerie et thérapie nucléaires.
Bénéfices attendus
Un peptide à deux parties, ciblant à la fois le récepteur de la gastrine (GRPR) et le récepteur membranaire spécifique de la prostate (PSMA) pourrait permettre de détecter puis de traiter une très large gamme de profils d'expression du cancer de la prostate (y compris les tumeurs PSMA négatives ou GRPR négatives) quel que soit le stade de développement de la maladie.
Procédures
Les animaux du projet seront soumis à différents actes, en premier lieu acte 1 des greffes de cellules tumorales au niveau sous cutanée réalisées sous anesthésie qui vont permettre une croissance tumorale pendant 7 à 8 semaines au cours desquelles tous les animaux recevront sous anesthésie des injections intraveineuses de radiotraceurs qui permettront un suivi des tumeurs par imagerie non invasive TEP/TDM et enfin suite à la dernière imagerie un prélèvement sanguin sous anesthésie sera réalisé suivi d'une euthanasie par une méthode réglementaire. L'acte 2 s'étalera au maximum sur 3 semaines. L'acte 3 aura lieu environ entre 7 et 8 semaines après l'acte 1 de greffe tumorale soit lorsque les souris auront entre 12 et 14 semaines.
Impact sur les animaux
D’après les connaissances sur ces modèles de xénogreffe tumorale et l'utilisation de l'imagerie non invasive, il ne devrait pas y avoir d'effets indésirables attendus sur les animaux. Si un animal montre des signes de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs, celle-ci sera immédiatement stoppée et l’animal sera placé dans sa cage sous surveillance.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour des prélèvements post mortem.
Remplacement
Des cellules de cancer de la prostate en culture seront utilisées tant que les expériences le permettent et le modèle de souris de xénogreffe tumorale pour les expériences nécessaires in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux, 160 au total, sera limité au maximum par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Le nombre d'animaux a également été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive pour suivre des modèles in vivo uniques parfaitement décris dans la littérature (modèle de greffe sous-cutanée de cancer de la prostate).
Raffinement
Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maison de type igloo en plastique) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Pour chaque procédure, des points limites ont été fixés et des méthodes prévues (anesthésie) pour éviter toute souffrance ou douleur aux animaux, qui resteront sous surveillance tout au long du projet.
Choix des espèces
Des souris immunodéprimées sont utilisées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et la validation de la biodistribution de nouveaux radiopharmaceutiques. Stade adulte, l’étude est portée sur l’imagerie d’un organisme déjà totalement développé.
Facteurs génétiques de régulation de la fonction testiculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le testicule sous anesthésie pour inactiver un gène, suivie d'un prélèvement sanguin puis de tests comportementaux (exploration, prise alimentaire, interaction avec des objets et des partenaires sexuels), avant mise à mort pour prélever les testicules. Le porteur décrit une opération simple et peu invasive, avec analgésie sur 48 heures. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro le fonctionnement testiculaire et juge la souris "indispensable".
Objectifs
Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de la synthèse de testostérone et la reproduction chez les mammifères est indispensable tant du point de vue de la recherche fondamentale que pour les avancées évolutives et médicales qu’elle pourrait permettre. L’un de ces aspects est la régulation génétique de la synthèse de testostérone. Ce projet repose sur l’inhibition expérimentale de l’expression d’un gène régulateur de l’expression génique dans le testicule adulte, chez la souris, pour en comprendre la fonction. Les effets de ce gène sur la synthèse de testostérone embryonnaire étant connus, il est vraisemblable qu'il régule également la synthèse de la testostérone chez l’adulte. Cette régulation de l’expression génique repose sur une lignée de souris transgénique chez laquelle l’injection d’un vecteur permet l’invalidation locale du gène ciblé. Ce vecteur sera administré sous anesthésie générale couplée à des antalgiques dans les testicules adultes. Les conséquences de la réduction de l’expression du gène cible seront mesurées sur la synthèse de testostérone, le comportement reproducteur et l’anatomie des cellules testiculaires.
Bénéfices attendus
Ces connaissances permettront une meilleure compréhension des régulations du fonctionnement testiculaire, y compris ses dysfonctionnements. Les connaissances nouvelles que nous produirons, outre des avancées dans la compréhension du fonctionnement testiculaire physiologique, pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour agir sur des déficits de synthèse de testostérone et améliorer la fertilité humaine et animale.
Procédures
Ce projet comporte deux procédures de classe modérée qui reposent sur l'invalidation de notre gène d'intérêt dans le testicule. Cette invalidation nécessite l'injection d'un vecteur dans le testicule de souris adulte. Nous étudierons l’impact de cette absence génique sur la production d’hormone et le comportement reproducteur. Ainsi, une injection de 5 minutes sera effectuée au cours d'une anesthésie de 20 minutes, . Après une période de récupération de 2 semaines, un bilan hormonal sera réalisé sur un prélèvement sanguin. Lors de la procédure 2, 3 semaines après injection, les mâles seront inclus dans des analyses comportementales mettant en jeu des comportements naturels : exploration, prise alimentaire, interaction avec des objets et mise en contact avec des partenaires sexuels pour corréler les expériences réalisées avec le phénotype des animaux.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur l'injection intratesticulaire d'un vecteur. L’injection nécessaire pour contrôler l’expression de notre gène d’intérêt sera réalisée sous anesthésie avec un contrôle analgésique multimodal pendant 48H assurant une absence de douleur. Cette opération est simple, rapide et peu invasive, ce qui permettra un rétablissement très rapide. Pendant cette période, pour permettre un Raffinement expérimental optimal, les animaux auront accès à une alimentation hydratée à leur hauteur, leur permettant de se nourrir sans effort. Ils seront surveillés quotidiennement pendant leur rétablissement et leur bien être évalué selon une grille de scoring multicritères (posture, alimentation, masse, état du pelage, déplacements). Si les animaux présentaient des signes de douleur persistante, l’expérience serait interrompue et le protocole révisé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse à postériori de leurs testicules prélevés post-mortem. Cela permettra de corréler l'efficacité du vecteur aux conséquences anatomiques et/ou comportementales induites par l'invalidation génique.
Remplacement
La maturation et le fonctionnement testiculaires (stéroïdogenèse et spermatogenèse) sont des processus intégrés et complexes. Il est impossible de les modéliser ou de les simuler intégralement in vitro. L’utilisation d’animaux est indispensable pour aborder ces questions.
Réduction
Les procédures sont conçues pour réduire le nombre d'animaux inclus dans le projet. La première procédure utilise des contrôles internes, ce qui évite de faire deux groupes distincts. La seconde procédure s'appuiera sur les résultats de la première pour permettre une efficacité optimale des conditions expérimentales pour réduire le nombre d'animaux à inclure. Enfin chaque prélèvement sera scindé en plusieurs séries, ce qui permettra de réaliser de nombreuses expériences sur chacun des prélèvements, sans avoir besoin de traiter de nouveaux animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement de nos souris sont prévues pour minimiser le stress pendant la croissance et la période expérimentale : hébergement par fratries de même sexe, présence d'ouate et d’igloos dans les cages pour faciliter la construction de nids. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera évalué selon une grille de scoring multicritères dont les critères seront adaptés à chaque procédure.
Choix des espèces
Ce projet propose d'étudier le rôle de l'expression génique dans les fonctions endocrines et exocrines du testicule. -Cette approche génétique nécessite de travailler sur des animaux chez lesquels les outils génétiques sont disponibles et fiables. -L'organisation du testicule est différente d'un clade à l'autre. Cette étude doit donc être réalisée sur une espèce mammifère, pour que les observations soient transposables à l'ensemble des mammifères, y compris l'homme. -Notre projet repose en partie sur des analyses hormonales, comportementale et d’observation de la fertilité ce qui nécessite une espèce avec des tests validés. Seule la souris remplit l’ensemble de ces critères. En particulier, les tests que nous proposons sont validés par de nombreuses publications. Les souris seront étudiées à l’âge adulte, entre 2 et 4 mois, l’âge requis pour avoir pleinement développé un comportement adulte.
Développement d’un pancréas bioartificiel : validation de matrices d’encapsulation d’îlots pancréatiques de rats et humains.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 791 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 008 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 783 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est induit par injection de streptozotocine, suivi de chirurgies abdominales pour prélever le pancréas ou implanter des modules d'encapsulation d'îlots, avec un suivi de 91 jours et des tests répétés de tolérance au glucose. Le porteur indique qu'une dégradation rapide de l'état des rats diabétiques peut survenir malgré l'insuline, ceux perdant plus de 20 % de leur poids étant mis à mort. Il affirme le recours aux animaux "indispensable" pour évaluer le biomatériau.
Objectifs
La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline.
Bénéfices attendus
La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus, au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans l’omentum permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.
Procédures
- Procédure 1 : L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par une seule injection et l’intervention (et la contention) durera quelques secondes. Chez les rats devenus diabétiques, mise d’implants à insuline afin de permettre un maintien à l’équilibre de la quantité de sucre dans le sang (glycémie) et de prendre du poids (nécessaire à la transplantation des îlots). Procédure réalisée sous anesthésie générale d’environ 10 minute. Une mesure de glycémie quotidienne avec un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier l’efficacité de notre insulino-thérapie. - Procédure 2 : Isolement d’îlots de rat qui seront inclus dans nos hydrogels. Pour le prélèvement du pancréas, une laparotomie abdominale et une cathétérisation du canal cholédoque seront réalisé sous anesthésie générale. Après quoi l’animal est euthanasié puis le pancréas prélevé (procédure sans réveil). - Procédure 3 : L’implantation des modules d’encapsulation dans l’omentum des rats se fera après incision de l’abdomen (2 cm). Chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée d’environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, quotidiennement la prise de poids et la glycémie capillaire (lecteur de glycémie) seront mesurées. Hebdomadairement, une prise de sang sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (marqueurs de fonction de la greffe, marqueurs de l'inflammation...). Une fois par mois un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capilaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 6h (accès à l'eau ad libitum). Une prise de sang de 200 μL(incision de l'extrémité de la queue) et une mesure de la glycémie seront effectuées à jeun juste avant l'injection intraéritonéale du glucose.
Impact sur les animaux
Suite à la procédure d’induction du diabète et/ou la perte progressive de la fonction du greffon, une dégradation rapide de l’état sanitaire des animaux diabétiques pourrait survenir malgré l’administration d’insuline et la transplantation des îlots. Cela pourrait se manifester par une diminution marquée de l’activité ou à l’inverse une hyperactivité, une diminution du toilettage, une perte de poids rapide supérieure à 20%, une polyurie, des hyper et hypoglycémies. Néanmoins, l’insulino-thérapie et la greffe d’îlots devraient empécher cela. Si aucune
Devenir
- Procédure 1 : « Induction du diabète par injection intra-péritonéale de Streptozotocine et mise de pompe à insuline en sous-cutanée. » Les rats devenus diabétiques poursuivent l’étude et seront utilisés dans la procédure 3. Les rats non devenus diabétiques seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« euthanasie sans préservation de sérothèque et tissuthèque (atteinte du point limite) »). - Procédure 2 : « Isolement d’îlots pancréatiques de Rat. » L’ensemble des animaux de la procédure seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« Prélèvement pancréas »). - Procédure 3 : « Implantation intra-omental des hydrogels + îlots et suivi métabolique des rats par mesure glycémique, par évaluation de la prise de poids, par tests de tolérance au glucose (IPGTT) et dosage plasmatique de biomarqueurs. » A la fin de cette procédure tous les rats seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« euthanasie sans préservation de sérothèque et tissuthèque (atteinte du point limite) ») car il s’agira de la fin de l’étude. Nous pourrons ainsi prélever le sang total pour réaliser des dosages plasmiques de marqueurs de survie et de fonction du greffon, de paramètre statuant sur la régulation de la glycémie, sur l’état inflammatoire etc… Nous prélèverons les modules d’encapsulation pour analyse (histologique ...). Enfin, nous prélèverons également les organes impliqués dans la régulation de la glycémie et impactés par le diabète afin de faire des analyses histologiqsues, de protéomique et de génomique.
Remplacement
L'étude consiste à déterminer l’efficacité de biomatériaux sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique, ainsi, le recours à des animaux est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Cette étude nécessitera 1791 rats.
Raffinement
Le respect du principe de raffinement intervient en premier lieu au niveau des conditions d’hébergement : les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions de température et d’hygrométrie régulées et conformes aux règles en vigueur, ainsi que de cages enrichies à l’aide de cylindres en PVC rouges. Les rats sont placés dans des cages de 1500cm², en fonction de leur poids (jusqu’à 200 g ils sont 6 par cage), entre 200 et 300 g ils sont 5 et ensuite un rat est enlevé par tranche de 100g). Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de préanesthésie, d’anesthésie et de prise en charge post-opératoire. Enfin, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses d’études sur le diabète. En effet, lors de l’induction ou l’apparition du diabète, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme, notamment une glycémie à jeun supérieur à 1,26 g/L et des taux d’HbA1c (reflet de l’équilibre glycémique sur les semaines antérieures) comparables. Les rats employés pour ces études sont de souche Lewis, souche consanguine provenant d'un élevage agréé. Ils ont été préférés aux souris à cause de leur taille qui permet une aisance de manipulations, facilite les interventions chirurgicales, et permet une étude à plus long terme (environ deux mois dans de bonnes conditions par rapport à leur état diabétique). Les rats pour cette étude seront uniquement utilisés à un stade jeune adulte (Age : 8 semaines) possédant un système immunitaire. De plus, à ce stade de développement, les animaux présentent un poids idéal pour réaliser les isolements. En effet, c’est à partir de cet âge que le canal cholédoque possède une taille suffisamment grande pour réaliser facilement la cathéterisation permettant l’injection de l’enzyme utilisée pour la digestion du pancréas. Cela permettra d’obtenir un rendement d’isolement optimal.
Modélisation des ribosomopathies chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
- Système urogénital
1 140 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ 855 conservés comme reproducteurs et les autres tués faute de porter la modification génétique recherchée. Les adultes subissent une coupure de nageoire pour vérifier leur génotype, leurs embryons servant à modéliser des maladies génétiques humaines rares. Le porteur décrit l'imagerie sur embryon comme non invasive. Il affirme que la souris ou le xénope ne permettent pas de modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet.
Objectifs
Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et physiologiques gouvernant le développement de ribosomopathies (pathologies génétiques humaines) en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours de l'établissement de ces pathologies, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt et la synthèse des ribosomes dans des tissus cibles. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent les événements précoces de ces ribosomopathies qui interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 11 Lignées pour ce projet : (A) 5 lignées transgéniques : 4 lignées transgéniques ciblant spécifiquement 4 tissus : Tg(crêtes neurales::CRE) ,Tg(sang::CRE), Tg(lignée germinale::CRE) et Tg(système neural::CRE) pour visualiser les étapes précoces de la mise en place des pathologies dans ces tissus, 1 lignée transgénique permettant de quantifier la synthèse des ribosomes in vivo : Tg(ribo:Tag) et (B) 6 lignées mutantes des génes humains et candidats impliqués dans les ribosomopathies: tsr2, rpsa, rpn1, hspa, et deux nouveaux génes (ribo1, ribo2) pour modéliser et analyser le rôle possible de ces gènes candidats dans le développement des ribosomopathies.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour modéliser les ribosomopathies qui ne sont pas modélisables chez d'autres modèles vertébrés comme la souris ou le xénope. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle de ces gènes dans différents processus physiologiques.
Procédures
Afin de valider leur génotype les animaux subiront un coupure de la nageoire au stade adulte. Les animaux générés par la suite seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.
Impact sur les animaux
A ce jour, nos expériences n'indiquent pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques à l'état hétérozygote et homozygote. Enfin, le génotypage des adultes pourrait induire un stress qui sera surveillé attentivement.
Devenir
Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs (1140 X3)/4 = 855 animaux. Les autres qui ne portent pas l'événement génétique requis seront mis à mort.
Remplacement
Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et à l'observation ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation et observation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRISPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour modéliser les ribosomopathies.
Choix des espèces
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes modélisant les ribosomopathies humaines affectant le développement cranio-facial et l’hématopoïèse. Une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques. Cependant, les modèles murins ne sont pas adaptés pour modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet. Il présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse et la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ses embryons facilement pour observer le développement précoce de ces pathologies (impossible chez un mammifère) et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.
Urbanisation et réponse inflammatoire chez les oiseaux
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
480 poussins de mésange charbonnière vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis laissés au nid jusqu'à l'envol. Ils reçoivent une injection de LPS dans l'abdomen et deux prélèvements sanguins par ponction de la veine brachiale sur deux jours, pour comparer la réponse inflammatoire entre sites urbains et forestiers. Le porteur indique que la nichée n'est dérangée que quinze minutes au plus et que la dose de LPS reste sous le seuil d'une souffrance visible. Il précise avoir déjà appliqué ce protocole sur la même espèce sans compromettre l'envol.
Objectifs
Les villes sont le lieu d’implantation souvent spontanée d’un nombre croissant d’espèces animales et végétales. L’habitat urbain impose portant aux organismes des contraintes environnementales très contrastées par rapport à leur habitat naturel d’origine, dans lequel elles ont évolué. La quasi disparition des milieux naturels, les pollutions sonores et lumineuses sont parmi les marqueurs les plus évidents de l’environnement urbain qui exerce donc des pressions écologiques a priori singulières sur les populations naturelles. Ces pressions impactent un grand nombre de facettes du phénotype des individus et de nombreux travaux montrent que le comportement, la morphologie ou certaines fonctions physiologiques des organismes sont affectés, de même que leur reproduction qui apparait moins dynamique par comparaison avec ce qui est observé en milieu naturel. L’immunité est une fonction majeure pour maintenir l’intégrité des organismes. Son rôle est prioritaire dans les interactions hôtes-pathogènes, et une modification de son expression sous l’effet de l’anthropisation des écosystèmes (dont l’urbanisation est un extrême) peut impacter les espèces, et également influencer la circulation d’agent infectieux. Lors d’un travail précédent sur la Mésange charbonnière (un oiseau forestier devenu très commun en ville), nous avons montré que la réponse inflammatoire était négativement affectée par l’habitat urbain par rapport à l’habitat forestier. L’objectif de ce projet est de retravailler une comparaison de la réponse inflammatoire chez cette espèce, mais à partir de 4 paires de sites villes/forêt situés dans 4 zones géographiques et des contextes biogéographiques différents (Strasbourg, Dijon, Toulouse, Montpellier). Nous comparerons donc la réponse inflammatoire des poussins au nid de mésanges charbonnières, entre un site urbain et un site forestier de référence, pour chacune des 4 zones géographiques mentionnées plus haut.
Bénéfices attendus
Nous proposons de tester l’influence de l’habitat urbain sur une composante de l’immunité chez une espèce d’oiseaux d’origine forestière et bien implantée en ville. L’ambition est de voir si les premiers résultats obtenus sont généralisables. Si nous détectons une réponse immunitaire plus faible en milieu urbain, cela ne permettra pas d’inférer sur le processus impliqué (« simple » impact d’un environnement difficile, réponse plastique ou/et adaptive des organismes à une modification des bénéfices et des coûts associés à l’immunité relativement à d’autres fonctions biologiques et à un risque environnemental propre à la ville ?). Mais cela permettra d’appréhender la sensibilité des populations urbaines au risque infectieux qui peut rapidement changer, avec des conséquences possible sur le statut des populations urbaines et leur rôle potentiel de réservoir à pathogènes dans des zones par définition densément peuplées par les humains.
Procédures
Les oiseaux seront l’objet d’une injection intrapéritonéale de 0.01 mg de LPS (soit en moyenne 0.06g/Kg) dilués dans 50 µl de PBS et de deux prélèvements sanguins sur deux jours, par effraction de la veine brachiale à l’aide d’un aiguille stérile 27G.
Impact sur les animaux
Deux effets indésirables sont en principe envisageables. La première est le dérangement de la nichée. Avant l’âge de 15 jours, les poussins qui sont déjà emplumés ne risquent pas de quitter prématurément le nid avec une faible aptitude au vol et une très faible probabilité de survie à très court terme. Par contre, l’activité de nourrissage des parents est interrompue. Les opérations réalisées sont organisées de manière à minimiser cela à quelques minutes (15 au plus) ce qui est sans conséquence dans la mesure où les parents reprennent leurs activités dès que l’observateur s’éloigne un peu du nichoir. La deuxième est l’inconfort lié à l’injection de LPS, mais la dose injectée est minimisée de manière à déclencher une réponse inflammatoire sans générer de syndrome comportemental signalant une souffrance. De nombreux travaux réalisés (et notre propre expérience) montrent cela. De plus, à dose équivalente, les oiseaux apparaissent moins affectés par une injection de LPS que les mammifères. Enfin, les poussins ne sachant pas voler et n’étant pas très habiles dans leurs mouvements, leur manipulation ne nécessite pas de contention particulière ce qui évite ou en tout cas réduit fortement les nuisances potentiellement associées à la manipulation. Notons que nous avons déjà appliqué un tel protocole il y a plusieurs années sur la même espèce sans que cela ne compromette la fin du séjour au nid et l’envol des poussins traités.
Devenir
Après la procédure expérimentale, les poussins sont laissés libres au sein de leur nichée (qu’ils n’ont pas quitté) pour poursuivre leur séjour au nid jusqu’à l’envol.
Remplacement
L'objectif étant de tester un phénomène en population naturelle, sous action de ensemble de facteurs environnementaux, les modèles de laboratoire et les modèles in vitro n’offrent pas les conditions favorables à la poursuite de cet objectif.
Réduction
Pour chaque site, nos nichoirs hébergent près d’une centaine de nichées de Mésange charbonnière, ce qui au total conduit à 800 nichées potentiellement utilisables. Chaque nichée comptant en moyenne 6 à 7 poussins, cela donne un effectif total d’au moins 4800 poussins. Avec au total 480 poussins (240 contrôles et 240 traités LPS) inclus dans l’expérience, nous appliquons une démarche de réduction à partir des deux leviers suivants : Quatre poussins (2 LPS et 2 PBS) sélectionné au hasard sont inclus dans l’expérience. Deux poussins par traitement par nichée représentent le minimum pour apprécier la variabilité intra-nichée qui a du sens d’un point de vie biologique et statistique. Quinze nichées dont la phénologie sera décalée dans le temps afin de manipuler au plus 2 nichées par site/jour représentent l’effectif calculé pour en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour la fiabilité des résultats.
Raffinement
Plusieurs choix de protocole relèvent d’une démarche de raffinement en plus du fait bien sûr que les poussins resteront au sein de leur nichée durant l’expérience. Au-delà du processus aléatoire de sélection des nichées expérimentales, les nichées contenant des poussins visiblement affaiblis ou/et chétifs pour leur âge (chose parfois observée) ne seront pas retenues pour l’expérience. Seuls des poussins ne présentant pas de signes d’affaiblissement seront donc inclus. L’âge (13/14 jours) auquel les poussins seront manipulés est suffisamment avancé pour qu’ils soient bien développés (thermorégulation effective, corps totalement couvert de plumes, masse très proche de la masse adulte, croissance osseuse quasi achevée) et supportent donc aisément les traitements, mais pas trop pour que la contention soit sans effort ni dispositif particulier. Les injections (LPS/PBS) et premiers prélèvements sanguins auront lieu en fin de journée, entre 18h et 20h, et les seconds prélèvements sanguins auront lieu 14h plus tard, donc entre 6h00 et 8h00. Ainsi, l’exposition au traitement dont l’action est courte aura lieu essentiellement pendant la phase nocturne, période naturellement sans activité (nourrissage ou autre). Les poussins inclus dans l’expérience seront traités les premiers au sein de leur fratrie. Les quelques minutes nécessaires à la manipulation du reste de la fratrie (pour baguage et mesures morphométriques) permettront de vérifier leur comportement (tonicité, « activité » avant de refermer le nichoir et de laisser les activités de la famille reprendre leur cours. Pour minimiser la durée de dérangement par poussin (maximum 15 minutes), la moitié de la nichée est retirée du nichoir (qui est refermé ensuite) et emmenée dans un véhicule climatisé situé à quelques dizaines de mètres. Cela permet (i) aux adultes de poursuivre très vite leur activité de nourrissage auprès de l’autre moitié de la nichée restée dans le nichoir, et (ii) de manipuler les poussins dans de bonnes conditions protégées des aléas extérieurs. Une fois manipulée, la première moitié des poussins et replacée dans le nichoir alors que la seconde moitié est retirée pour être à son tour manipulée (baguage, mesures) dans les mêmes conditions puis remise en place. Ainsi, l’interruption des activités des adultes au nichoir est réduite à quelques minutes et chaque poussin ne se trouve pas dans des conditions perturbées au-delà de 15 minutes.
Choix des espèces
La Mésange charbonnière représente une espèce d’oiseau modèle assez classique pour les études en populations naturelles car c’est une espèce très commune qui accepte volontiers les nichoirs artificiels. Comme la plupart des espèces d’oiseaux elle n’affiche supporte très bien les interventions des observateurs sur les nichées, sans risque de désertion pour peu que certaines règles de base soient respectées (en particulier, pas de capture des adultes au nid lorsque les poussins ont moins de 7 jours). Enfin, cette espèce d’origine forestière a colonisé les villes où elle est très abondante également ce qui offre la possibilité d’une comparaison entre populations urbaines te populations forestières. Les individus utilisés seront des poussins de 13/14 jours. A ce stade, les poussins seront suffisamment âgés pour être bien développés (thermorégulation effective, corps totalement couvert de plumes, masse très proche de la masse adulte, croissance osseuse quasi achevée, …), mais pas trop pour que la contention soit sans effort ni dispositif particulier et pour qu’ils risquent de quitter prématurément le nid suite à l’intervention.
Etude de l’effet de biothérapies ciblant l’interleukine-4 (IL-4), l’IL-13, les IgE ou les mastocytes sur les défenses antiparasitaires
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 416
416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.
Objectifs
Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.
Bénéfices attendus
L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).
Impact sur les animaux
D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.
Remplacement
Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).