Recherche fondamentale

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis huit semaines à un régime riche en graisses, à des prélèvements sanguins hebdomadaires à la queue et à une injection d'amphétamine, avant une perfusion terminale sous anesthésie profonde. Le porteur indique que les rats mutants sont aveugles et anosmiques et que l'amphétamine peut provoquer une hyperagitation ou des troubles moteurs transitoires. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'effet d'une mutation sur les fonctions cognitives.

Objectifs

Le but du projet est de mettre en évidence l'impact bénéfique d'un régime cétogène sur les troubles cognitifs sur un modèle animal intelligent : le Rat. Le régime cétogène existe depuis une centaine d'année et a été longtemps utilisé dans plusieurs indications médicales. Au-delà de la perte de poids, le régime cétogène est utilisé dans le traitement de diverses pathologies : épilepsie, cancers, maladies inflammatoires, etc. Nous disposons d'un modèle animal d'une pathologie mentale et souhaitons analyser l'impact de ce régime sur les troubles de la mémoire observés. Dans ce projet, nous voulons comprendre si les troubles de mémorisation et les altérations des voies de signalisation neuronales (dopaminergiques principalement) présents chez les animaux génétiquement modifiés constatés chez ces animaux, sont impactés ou non par l'état de cétose.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une première approche fondamentale pour déterminer le rôle d'un gène identifié chez l'Homme, dans une population de malades. Nous pourrons accumuler des données permettant de mieux comprendre le rôle du gène et ses interactions avec le métabolisme, dans le cadre d'une cétose. Ce projet nous permettra de comprendre les voies d'action de cette cétose, mise en place par une régime lipidique, et de définir si les mécanismes impliquant gène modifié dans la lignée de Rat étudiée sont sensibles à cet état. Ce projet constitue une première étape dans la compréhension des maladies génétiques humaines impliquant ce gène et dans la mise en place de traitements permettant de réduire les symptômes.

Procédures

Chaque semaine entre 7 et 14 semaines d'âge, les animaux subiront un prélèvement de deux gouttes de sang à la queue sur animaux vigiles. Cela se réalise en quelques minutes. Durant l'une des expériences, les animaux recevront une injection d'une faible dose d'amphétamine, afin de mettre en évidence le fonctionnement des voies dopaminergiques. Ce protocole s'étale sur 2 heures environ En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés de manière profonde pour une procédure de perfusion qui entraînera leur décès.

Impact sur les animaux

Les animaux mutants présentent une cécité et une anosmie complète. Néanmoins, ils présentent un état général tout à fait normal, aussi bien au niveau du poids, du toilettage, de l'activité. Durant ce protocole, ils recevront une diète spécifique dont la source principale de calorie est le gras. Le passage dans ce régime entraine rapidement un état cétogène qui est lié à une perte d'appétit et une baisse de poids. Néanmoins, sur la durée de l'étude (8 semaines sous ce régime), aucun risque pour la santé des animaux n'est attendu. La procédure d'amphétamine peut induire un état d'hyperagitation ou au contraire des troubles moteurs compulsifs. Ces effets sont transitoires et un retour à la normale se fait naturellement dans les 2 heures qui suivent l'injection. Par ailleurs, les animaux sont monitorés durant cette période.

Devenir

En fin de protocole, nous effectuerons des prélevements post-mortem pour étudier l'impact du régime et de la mutation au niveau hépatique et central.

Remplacement

Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique sur les fonctions cognitives. Seul le modèle animal est suffisamment informatif pour pouvoir poursuivre la recherche dans ce domaine.

Réduction

Les effectifs utilisés dans ce protocole ont été établis par étude de puissance sur les tests concernés. Par ailleurs, nous avons constaté qu'ils convenaient dans les études antérieures. L'ensemble du protocole expérimental a été mis en place pour réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés pour conclure. Nous étudierons plusieurs paramètres dans ce projet : le poids de l'animal, sa glycémie, son niveau de cétogène circulant. Les mêmes groupes d'animaux effectueront plusieurs protocoles expérimentaux afin de limiter le nombre d'animaux employés.

Raffinement

Dans ce projet, nous nous assurerons que le bien-être des animaux sera respecté durant l'ensemble de sa réalisation. En respectant les conditions recommandées d'hébergement, en nous assurant de l'absence de signes de souffrance, de lésions liées à des combats entre animaux. Les rats seront suffisamment jeunes pour être maintenus à deux par cages afin d'éviter un stress d'isolement. Les cages seront changées régulièrement afin d'éviter que le gras du régime cétogène ne favorise des lésions cutanées. Si le cas se présentait ; un traitement local serait administré pour éviter une infection locale. Dans ce cas, nous pourrions êtes amenés à isoler les animaux concernés pour permettre une bonne cicatrisation des plaies. L'ensemble de ce protocole est encadré par un suivi hebdomadaire du bien-être des animaux : suivi du poids, de l'état général, toilettage, posture, vocalisation. Tous ces paramètres permettront de nous assurer de l'absence de souffrance des animaux. Néanmoins, en présence d'une souffrance estimée à l'aide de nos tableaux de scorage

Choix des espèces

Le Rat est une espèce intéressante pour modéliser des pathologies humaines. En effet, il s'élève facilement, présente des comportements élaborés et nous pouvons accéder à des animaux génétiquement modifiés. Nous travaillons avec des animaux jeunes adultes qui présentent déjà les troubles cognitifs observés et sont disponibles auprès de notre partenaire.

72 poissons, daurades royales et loups sauvages, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une marque électronique est implantée dans leur cavité péritonéale sous anesthésie, puis chaque individu est placé en tunnel de nage et exposé à un réchauffement, un refroidissement ou une hypoxie pour mesurer sa perte de performance. Le porteur indique que la mise à mort finale sert à récupérer la marque et les données enregistrées. Il présente ces seuils de tolérance comme utiles à de futurs plans de gestion des stocks de pêche.

Objectifs

Le Golfe du Lion est une des zones les plus productives de la Méditerranée. La zone côtière est constellée de lagunes qui sont de véritables nourriceries et zones d’alimentation pour la faune marine. Les lagunes sont aussi des écosystèmes vulnérables, particulièrement sensibles aux effets des changements globaux. Notamment, des vagues de chaleur et des épisodes d’hypoxie estivaux sont susceptibles de stresser les organismes résidents, entraînant une baisse de leur performance physiologique, voire même menaçant leur survie. De nombreuses espèces de poisson à haute valeur économique occupent les lagunes du Golfe de Lion au cours de leur cycle de vie, et l'altération anthropique de ces habitats pourrait largement affecter les dynamiques de ces populations. Dans ce contexte, la daurade royale et le loup représentent des cas d’étude par excellence. Ces espèces exploitent tous les ans les lagunes en tant que nourriceries estivales, permettant aux individus de constituer des réserves pour la saison hivernale en mer ouverte. Il est essentiel comprendre l’importance des lagunes pour le maintien des stocks de poissons à haute valeur économique dans le Golfe du Lion, afin de développer des plans de gestion. En particulier, pour mieux comprendre comment les effets du changement climatique affecteront le cycle biologique des espèces exploitant les lagunes. L'objectif général de ce projet est de mieux comprendre l’écophysiologie des daurades et loups sauvages, issus des lagunes en période estivale. En particulier, leurs performances physiologiques en termes de capacité de nage, et comment des changements de température et des épisodes d'hypoxie peuvent influencer cette capacité. Nous cherchons à établir des seuils de tolérance sous-létaux, en utilisant une perte de la performance de nage comme indicateur.

Bénéfices attendus

Les données du présent projet, sur les seuils sous-létaux au-delà desquels la température et l’hypoxie nuisent à la performance de nage, permettront de mieux interpréter des migrations saisonnières entre lagune et mer, mais aussi les migrations ponctuelles vers la mer en été, pour échapper à des conditions extrêmes dans les lagunes. Ces informations seront utiles pour informer le développement de plans de gestion, des stocks de daurade royale et loup, et des habitats clé pour leurs cycles de vie.

Procédures

Les poissons seront équipés avec une marque électronique dans leur cavité péritonéale, sous anesthésie générale. La durée de l'opération est moins de 30 minutes. Cette chirurgie sera suivie par 96 heures de récupération dans un bassin isolé des perturbations humaines. Puis, chaque individu sera placé dans un tunnel de nage pour 48 heures et subira deux procédures en séquence. Premièrement, un test de performance de nage, puis un test de tolérance à un stress (réchauffement, refroidissement, hypoxie). Chaque test dure entre 4 et 6 heures, avec 20 heures de récupération entre les deux tests.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables devraient être limités, les procédures sont d'une sévérité modérée. Les 96 heures de récupération de la chirurgie permettent aux poissons de regagner une fréquence cardiaque baisse et stable, situation qui se met en place à partir de 72 heures. Les procédures en tunnel de nage ne sont pas douloureuses, et la performance de nage dans le tunnel n’est pas différente entre les poissons qui portent une marque et des poissons qui n’ont pas subi une intervention chirurgicale.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux (72) seront euthanasiés pour récuperer la marque éléctronique et les données de fréquence cardiaque et d'accélération corporelle.

Remplacement

Il est impossible de remplacer les daurades et les loups sauvages par des autres modèles, l'intérêt du projet étant justement de regarder l'impact sur ces espèces.

Réduction

Le nombre total d'individus testés sera limitée à n = 36 de chaque espèce, parmi lesquels n = 12 seront exposés à chaque facteur environnementale (n = 72 animaux en total). Le nombre de 12 individus exposés à chaque facteur environnemental (réchauffement, refroidissement, hypoxie) permettra d'établir des réponses moyennes de chaque population d’étude, en tenant compte de la possibilité d'une variation interindividuelle. Les réponses seront évaluées statistiquement en utilisant des modèles linéaires mixtes et des analyses de variance.

Raffinement

Tout a été mis en place pour limiter la souffrance et le stress des animaux liés au placement des capteurs. Le capteur sera placé dans la cavité péritonéale sous anesthésie, en proximité du coeur afin de capter les signaux bioélectriques (électrocardiogramme) qui permettent de calculer la fréquence cardiaque. Le placement du capteur sera suivi par un minimum de 96h de récupération dans des bassins externes isolés des perturbations humaines, avec une alimentation journalière « ad-libitum ». Les procédures en tunnel de nage sont bien établies chez les poissons et sont des techniques largement maîtrisées et utilisées par l’ensemble de la communauté scientifique, ainsi que par notre équipe. L’objectif de nos protocoles est de limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux pendant les manipulations, avec capture des poissons sous l’eau et placement dans les tunnels sans exposition à l’air, suivi par une durée minimale d’acclimatation de 4h. Les poissons sont à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Cela permet d'obtenir des mesures valides et fiables de leurs réponses aux facteurs environnementaux, qui ne sont pas influencées par un état préalable de souffrance, stress ou agitation.

Choix des espèces

La daurade royale et le loup sont des espèces côtières de premier plan en Méditerranée française, tant pour l'importance de leur exploitation, leur valeur commerciale et leur aquaculture, que pour leurs aspects emblématiques. Aujourd'hui concernées par les plans de gestion des petits métiers en Méditerranée, de nombreux aspects de leurs cycles de vie restent pourtant inconnus. L’acquisition des connaissances sur leur capacité de nage et leur tolérance à la température et à l'hypoxie est primordiale pour une compréhension des migrations de ces espèces et leur utilisation des lagunes côtières. Ces informations seront un appui aux mesures de gestion de ces espèces en Occitanie. Les animaux seront tous adultes reproducteurs et auront une masse comprise entre 300 et 700g, une taille qui permet le placement des capteurs électroniques dans la cavité péritonéale.

1 610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeurs bronchiques humaines, des gavages quotidiens jusqu'à deux fois par jour cinq jours sur sept et des scanners, pour étudier la résistance aux thérapies ciblées du cancer du poumon. Le porteur indique des difficultés respiratoires liées à la tumeur et des inconforts liés aux gavages répétés. Il affirme que la croissance tumorale ne peut s'étudier que sur un modèle vivant et que les données précliniques chez la souris sont une étape "nécessaire".

Objectifs

L’objectif du projet est de comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des résistances aux thérapies ciblées dans les cancers bronchiques, principalement les inhibiteurs tyrosine kinase de l’EGFR (ou EGFR-TKi) dans le but d’identifier des combinaisons thérapeutiques permettant de limiter ou de prévenir la rechute chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet servira d'une part à apporter des connaissances scientifiques sur l'origine des mécanismes de résistance aux thérapies ciblées in vivo afin d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques, et d'autre part de tester les cibles qui auront préalablement été validées in vitro en réalisant des combinaisons de traitement dans le but de prévenir l'émergence de résistances. Les bénéfices seront à moyen terme de développer des essais cliniques chez les patients.

Procédures

1) Implantation de tumeurs sous-cutanées (PDX et xénogreffes) ; 5 à 10 minutes/manipulation, 1565 souris; 2) Gavages ; une à deux fois/jour, 5 jours/semaine,

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables potentiels ainsi que les mesures prises pour réduire, éviter ou atténuer ces nuisances sont décrits dans les procédures expérimentales. Les principaux effets indésirables peuvent être : 1) Des difficultés respiratoires liées à la tumorigénèse bronchique du modèle CCSP-rTA-EGFRL858R 2) Des inconforts liés aux gavages quotidiens 3) Des effets potentiellement indésirables liés aux traitements, dont les potentiels signes de toxicité feront l’objet d’un suivi rapproché

Devenir

Procédure 1 (implantation de PDX) : une fois les tumeurs établies, les souris seront traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 2 (Implantation de cellules tumorales bronchiques humaines) : une fois les tumeurs établies, les souris seront traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 3 (Traitement des souris par gavage) : une fois les tumeurs établies, les animaux seront traités par gavage et mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 4 (Tumorigenèse pulmonaire du modèle CCSP-rtTA-EGFRL858R) : la croissance tumorale sera déterminée par CT-scan (procédure 5) et les souris seront traitées par gavage (procédure 3) puis mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 5 (CT-scan) : la croissance tumorale sera monitorée, les souris seront ensuite traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2.

Remplacement

L'étude des mécanismes à l'origine des résistances aux thérapies ciblées est en majeure partie réalisée in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, pour étudier la croissance tumorale, la dissémination métastatique et la réponse aux traitements qui sont des processus complexes, il faut prendre en compte plusieurs paramètres comme la présence du microenvironnement tumoral, le métabolisme in vivo, la circulation sanguine ou encore la présence du système immunitaire le cas échéant, ce qui n'est possible que via l'utilisation de modèles vivants. De plus, l’obtention de données précliniques chez la souris est une étape nécessaire pour l’établissement d’un protocole clinique chez les patients.

Réduction

Le nombre de souris utilisées fera l'objet d'une étude statistique préalable a fin de limiter au mieux le nombre d'animaux à utiliser tout en garantissant la fiabilité statistique des résultats

Raffinement

Les souris sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur. Afin de réduire au maximum le stress des animaux, ils seront manipulés avec précautions et calme durant toute la durée de l’expérience. Pour éviter le stress des animaux, le milieu environnemental et les conditions d’hébergement des souris seront optimisés (enrichissement, igloos, ajout de gels nutritifs, manipulation par personnel formé). Si besoin, nous utiliserons un agent analgésique (Buprecare, Buprénorphine) pour réduire la douleur liée notamment à l'implantation de tumeurs sous-cutanées. Quand nécessaire, les souris seront anesthésiées à l'isoflurane 3%. Les souris seront quotidiennement observées pour détecter d’éventuels signes de souffrance (difficultés à respirer, prostration, dos voûté, agitation, activité sociale anormale).

Choix des espèces

Les souris NSG sont classiquement utilisées en oncologie car elles favorisent l’implantation et le suivi des tumeurs d’origine humaines (PDX), et les souris nudes sont classiquement utilisées dans le cadre de l’implantation et le suivi de lignées cellulaires telle que les lignées PC9, HCC4006 ou H3122. Il existe de plus de nombreuses données bibliographiques sur ces modèles, ce qui permet d’une part d’optimiser les séquences techniques (protocoles d’implantation) et d’autre part d’ajuster les traitements en fonction des données publiées. Le modèle CCSP-rtTA-EGFRL858R a déjà été utilisé dans de nombreuses études et notamment au laboratoire, car il présente le double avantage d’avoir des caractéristiques histopathologies très similaires aux adénomes et adénocarcinomes humains (Politi et al. Genes Dev. 2006) et de reproduire l’évolution clinique observée chez les patients sous traitement aux EGFR-TKi (Politi et al, Dis Model Mech. 2010 ; Starrett et al., Cancer Res. 2020). Implantation PDX et xénogreffes réalisés sur des souris jeunes âgées de 6 et 8 semaines, ce qui permet d’une part de favoriser la prise des greffes et d’autre part de pouvoir réaliser des traitements pouvant aller jusqu’à 6 à 8 mois selon les modèles.

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent plusieurs chirurgies sous anesthésie générale pour l'implantation puis le contrôle de stents utilisés chez l'humain contre les anévrismes intracrâniens, la dernière intervention n'étant pas suivie d'un réveil. Le porteur indique une anxiété, un stress et des douleurs postopératoires possibles, ainsi qu'un rare risque de paralysie de la patte. Il affirme que l'utilisation d'animaux est "indispensable" car aucune méthode in vitro ne reconstitue ces conditions.

Objectifs

Le projet consiste en l’étude chez le lapin de dispositifs implantables de neuroradiologie interventionnelle utilisés chez l’humain dans le traitement des anévrismes intracrâniens. L'objectif est de comparer quatre types de stents à diversion de flux (des dispositifs médicaux implantables utilisés dans le traitement des anévrismes intracrâniens par voie endovasculaire) sous des régimes différents d’anti-agrégation plaquettaire, et d’analyser l’endothélialisation et le risque thromboembolique de chacun des dispositifs. Une étude clinique rétrospective a suggéré que des stents à diversion de flux « actifs » pouvaient être mis en place sous simple anti-agrégation plaquettaire en phase de rupture d’un anévrisme, avec une occlusion satisfaisante de ces derniers, sans complication ischémique surajoutée. Le but de ce projet sera d'étudier l’endothélialisation des stents par des analyses radiologiques et histologiques, et nécessitera donc l'utilisation de l'animal pour être mené à bien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’effectuer des analyses qui ne sont pas réalisables chez l’être humain afin évaluer la réponse biologique à l’implantation de stents à diversion de flux, ce qui n’a encore jamais été fait de façon indépendante in vivo. L’analyse de la prolifération tissulaire sur le dispositif et sa thrombogénicité, apportera des connaissances supplémentaires et une meilleure compréhension sur les principes du traitement des anévrysmes cérébraux par stents à diversion de flux, permettant d’opter pour les dispositifs les plus fiables pour l’Homme et de les développer.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement de sang 5 jours avant l’implantation du stent, sous anesthésie locale (15 min environ). Un second prélèvement sera fait pendant la première chirurgie, sous anesthésie générale (1 h environ). Une deuxième chirurgie sous anesthésie générale sera effectuée 15 jours plus tard pour le contrôle (45 min environ). Le dernier contrôle à 1 mois demandera également une chirurgie sous anesthésie générale, pour laquelle l’animal ne sera pas réveillé à son terme (1 h environ).

Impact sur les animaux

L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque procédure/prélèvement. Des douleurs peuvent également survenir en contexte post-opératoire, de même qu’une paralysie de la jambe du lapin en cas d’atteinte du nerf (très rare).

Devenir

Les animaux mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les pièces anatomiques à des fins d’analyse en histologie.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la prolifération cellulaire et la thrombogénicité sur des stents à diversion de flux dans des conditions proches de ce qui est trouvé chez l'Homme. Aucune méthode alternative in vitro ou ex vivo ne permet de reconstruire un modèle proche de ces conditions. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est indispensable.

Réduction

Une analyse intermédiaire effectuée en OCT (tomographie par cohérence optique, technique d’imagerie permettant d’obtenir des images en coupe du vaisseau) et angiographie à 15 jours après l’implantation des stents permettra d’étudier partiellement le processus d’endothélialisation du stent, et évite d’avoir recours à une analyse histologique intermédiaire qui nécessiterait un sacrifice. Par ailleurs, l’implantation de différents stents chez le même lapin permet de diminuer le nombre de lapins utilisés).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale, et leur première entrée en procédure. Leur environnement comportera un enrichissement (bûchettes à ronger...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque procédure opératoire. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés . Si une infection se présente, un traitement antibiotique adapté au lapin pourra être mis en place. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort.

Choix des espèces

Le lapin est un animal dont l’élevage est aisé, et un modèle animal reconnu pour l’étude des anévrismes intracrâniens. La biologie de la néo-endothélialisation des stents est ainsi bien étudiée chez le lapin et similaire aux mécanismes humains. Par ailleurs, la taille des vaisseaux du lapin est similaire à celle des vaisseaux humains, où sont implantés les stents flow-diverter étudiés. Les animaux utilisés seront des adultes de plus de 3 kg pour la taille des artères et la taille des dispositifs du commerce utilisés.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent 23 injections intrapéritonéales quotidiennes d'un inhibiteur enzymatique, puis des tests comportementaux de mémoire, pour comparer trois composés candidats sur un modèle génétique de trisomie 21. Le porteur décrit la douleur des injections répétées comme la principale nuisance. Il affirme que l'étude de ces déficits d'apprentissage "nécessite un modèle vivant et suffisamment proche de l'homme".

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent 3 nouveaux composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer le composé parmi ces 3 candidats (composés 1,2 et 3) qui se révélera le plus efficace en termes de restauration des fonctions intellectuelles. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous esperons obtenir une amelioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoires, memoire de travail et mémoire sementique)

Procédures

Les animaux seront injectés quotidienement par voie intraperitonéale avec des molécules inhibitrices de l'enzyme kinase Dyrk1A.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une aiguille pour l'injection en intraperitoneale. Cette douleur sera accentuée à cause de la repetition des injections, 23 au total, soit 1 par jour.

Devenir

Tous les animaux seront Euthanasiés à l'issue de l'unique procédure décrite dans ce projet.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposées à l’espèce humaine.

Réduction

Pour ces tests, des rongeurs mâles et femelles seront utilisés à partir de 12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons les 3 composés sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. Le test statistique utilisé sera le test de Student pour des groupes non appariés avec comparaison de moyennes des différents groupes à une constante spécifiée, ici 50% correspondant à une performance au hasard. 16 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Nous utiliseront également un test ANOVA « génotype » x « traitement ». L'étude de se déroulera en 3 groupes d’expérience (1 groupe par composé) comme détaillées ci-dessous : Pour chacun des différents composés nous aurons besoin de 3 lots d’animaux : - 16 Souris contrôles sauvages non traitées - 16 Souris contrôles trisomiques non traitées - 16 Souris trisomiques traitées. Ici, nous aurons donc un maximum de 48 x 3 =144 souris.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris et egalement une espèces physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries pendant six mois avec des croquettes contenant des pesticides, subissent des prélèvements et des mesures de fonction rénale, puis une chirurgie qui provoque une agression rénale aiguë et une détérioration de leur fonction rénale. Le porteur indique une perte de poids, une prostration ou une léthargie possibles, déclenchant la mise à mort au-delà de 24 heures. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet aujourd'hui de tenir compte de la physiologie d'un "organisme entier".

Objectifs

Les maladies rénales chroniques et aigues sont en augmentation constante dans le monde et représentent un problème important de santé publique. Les reins sont des organes sensibles à certaines molécules toxiques. Parmis celles-là, les pesticides sont largement utilisés en agriculture et peuvent parfois ne pas être totalement spécifiques des organismes nuisibles mais pourraient affecter aussi la faune et l’Homme. Nous voulons donc savoir si une exposition chronique à de faibles doses de pesticides modifie la fonction rénale et rend ces organes plus fragiles.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projets sont de mieux caractériser les effets rénaux des pesticides, afin de savoir s'ils fragilisent les reins et peuvent les faire évoluer vers une insuffisance rénale.

Procédures

Les animaux seront nourris pendant 6 mois avec des croquettes contenant des pesticides. Pendant ces 6 mois de régime, des prélèvement d’urine, de selles et de sang pourront être effectués à 2 reprises, chez les animaux vigiles. Des mesures de la fonction rénale seront réalisées 3 fois . Cette intervention nécessite une courte anesthésie d'environ 5 minutes suivie d'une mesure de 45 minute sur animal vigile grâce à un dispositif fixé sur le dos de l'animal qui est ensuite retiré. Enfin, à l'issue des 6 mois de régime, les animaux subiront une intervention chirurgicale d'environ 30 minutes (sous anesthésie générale et analgésie) pour induire une agression rénale.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une agression rénale aigue, résultant en une détérioration de leur fonction rénale.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin du projet.

Remplacement

Étant donné la complexité des mécanismes pathologiques mis en jeu, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants qui ne tiennent pas compte de la physiologie d’un organisme entier. Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives pour obtenir des résultats exploitables et pertinents par rapport à la pathologie humaine.

Réduction

les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 216 souris

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis: 1) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’ARA ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est déjà l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.