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Alterations des circuits cortico-striataux de l’attention dans l’addiction à la nicotine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'un cathéter veineux puis une chirurgie stéréotaxique posant des électrodes ou des fibres optiques dans le cerveau, pour étudier l'addiction à la nicotine, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque d'un fixateur. Le porteur invoque explicitement l'éthique "spéciste" qui interdit ces approches invasives chez l'humain pour justifier le recours au rat. Il conclut que l'addiction, trouble du comportement, ne peut être reproduite ni sur cultures cellulaires ni par modèle in silico.
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les altérations des circuits neuronaux de l’attention dans le développement de l’addiction à la nicotine. Nous avons précédemment montré que des différences dans les capacités attentionnelles des rats prédisent leur prédisposition à développer une addiction à la nicotine. De plus, le développement de l'addiction à la nicotine entraine des modifications de l'activité neuronale du cortex préfrontal (PFC), une structure fortement impliquée dans l’attention. Dans ce projet, nous chercherons tout d’abord à d'identifier les altérations des circuits neuronaux cortico-striataux de l’attention lors du développement de l’addiction à la nicotine (Prodécures 1 et 2). Pour cela, nous mesurerons l’activité des circuits neuronaux lors du d’une tâche attentionnelle avant et après addiction à la nicotine en utilisant des techniques électrophysiologiques (Procédure 1) et photométriques in vivo (Procédure 2). Puis, nous chercherons à modifier l'activité de ces voies neuronales afin de restaurer les capacités attentionnelles et diminuer la consommation de nicotine (Procédure 3) en utilisant des techniques d’optogénétiques in vivo.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur la façon dont l'attention et les processus neuronaux associés aux PFC sont altérés à différents stades de la dépendance à la nicotine et ainsi d'étudier les variabilités individuelles de ces capacités attentionnelles dans la vulnérabilité à développer une addiction à la nicotine. De façon plus générale, ces expériences permettront également une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les capacités attentionnelles et leurs dysfonctionnement.
Procédures
Tous les animaux (n =264) seront tout d'abord soumis à une chirurgie intaveineuse pour l'implantation d'un catthéter intraveineux. Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 30 min. Les animaux seront ensuite soumis à une chirugie stéréotaxique soit pour l'implantation des électrodes pour les enregistrements électrophysiologiques (n = 48), soit pour l'implantation de fibres optiques (n= 168) ou photometriques pour les manipulation optiques ou les enregistrements de photométrie (n = 48). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 1h pour l'implantation des électrodes et 45 min pour l'implantation des fibres.
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...).
Devenir
A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier l'emplacement des électrodes (Procédure 1, Exp 1), des fibres photométriques (Procédure 1, Exp 2), et optiques (Procédure 2, Exp 3). Ceci nécessite une fixation du tissu cérébral par perfusion intracardiaque d’un agent fixant (formaldéhyde, 3,6%) des animaux des expériences 1, 2 et 3. Cette procédure est réalisée sous analgésie (carprofène, dose 5 mg/kg, s.c., 15 min avant) et anesthésie profonde (mélange de kétamine 110 mg/kg et de xylazine 15 mg/kg, i.v.) afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Un effectif de 14 rats par groupe est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 11-12 individus. Etant donné que le pourcentage d’attrition est estimé à 20% en fin d’expérience, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 14 rats. Enfin, les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques, principalement des analyses de variance, avec comparaisons inter-groupes et mesures répétées, suivies de tests a posteriori (HSD Tuckey). Le seuil de significativité statistique sera fixé à p < 0.05.
Raffinement
Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, dose 5mg/kg, sous-cutanée, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie chimique (Kétamine 110mg/kg +Xylazine 15mg/kg, intrapéritonéale) ou gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min-1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection intraveineuse d'antibiotique (0.2ml) ainsi qu’une injection sous-cutanée de NaCl, pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (i.e., remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant une période de récupération de 7-10 jours durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h/jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces critères incluent une perte excessive de poids, une diminution de la température corporelle, une dégradation de l’apparence physique (manque de soin, pelage sale) et une altération anormale du comportement (hyper ou hypoactivité, agressivité défensive, repli sur soi), ces performances comportementales. Ces manifestations éventuelles sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière [3 fois par semaine]). Si une perte de poids corporel supérieure à 20% est observée en 48 heures, l'animal sera alors mis à mort, sachant que dans tous les cas, il y a aussi d’autres points limites listés ci-dessus qui sont atteints (cf. méthodes de mise à mort). Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 MYA) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées (e.g., C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la nicotine mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro ou in silico. Chez l'Homme, les troubles de l'attention sont une pathologie qui se manifeste tôt dans la vie d'un individu et qui a des répercussions importantes tout au long de la vie adule de l'individu. Dans ce projet, les animaux utilisés seront de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité au développement de troubles attentionnels et à l'addiction aux drogues.
Analyse in vivo par microscopie à fluorescence de l’expression de la dystrophine dans le muscle et la restauration de son expression dans des lignées murines transgéniques rapportrices normales ou dystrophiques.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de molécules puis une chirurgie exposant le muscle tibial pour l'imagerie, la quasi-totalité étant tuée avant tout réveil et quelques-unes gardées une journée avant mise à mort. Le projet vise à visualiser la restauration de la dystrophine, protéine absente dans la myopathie de Duchenne. Le porteur affirme que la pharmacocinétique de la protéine restaurée ne peut être évaluée sans imagerie intravitale sur animal, "seul moyen" selon lui de visualiser cette dynamique in vivo.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), maladie musculaire héréditaire et fatale la plus fréquente chez l’enfant, est causée par des mutations dans le gène codant la dystrophine et menant à un manque d’expression de cette protéine indispensable au maintien de l’architecture de la fibre musculaire. La dystrophine est exprimée dans les fibres musculaires, tout au long du sarcolemme mais elle est exprimée dans d’autres compartiments que sont les jonctions myotendineuses et neuromusculaires de la fibre ainsi qu’au niveau de la niche des cellules souches musculaires. Nous développons au laboratoire trois types d’outils thérapeutiques pour restaurer l’expression de la dystrophine en interférant au niveau ADN ou ARN. Jusqu’alors la recherche sur la dynamique d’expression et de restauration d’expression de cette protéine était entravée par l’absence d’un modèle animal permettant l’imagerie directe in vivo de la dystrophine dans des conditions normales ou pathologiques dans ces différents compartiments d’expression. Nous avons créé au laboratoire plusieurs lignées murines transgéniques saines et pathologiques. Ces lignées vont nous permettre maintenant d’atteindre plusieurs objectifs : Objectif 1 : Etudier in vivo la stabilité et le turnover de la dystrophine sauvage ou restaurée Objectif 2 : Etudier in vivo la pharmacodynamique de la restauration de l’expression de la dystrophine dans les différents compartiments de son expression par le biais des approches thérapeutiques développées au laboratoire.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet doivent permettre i) de connaître la stabilité de la protéine dystrophine dans la situation contrôle/sain et la situation de protéine restaurée suite au traitement du modèle pathologique, ii) d’affirmer (ou infirmer) que les cellules souches musculaires sont un site cible pour la restauration de la dystrophine dans le contexte pathologique, iii) d’étudier la pharmacocinétique de la restauration de l’expression de la dystrophine dans ses différents sites d’expression en comparant différentes approches thérapeutiques (ciblant l’ADN ou l’ARN). A terme, ces résultats amélioreraient la compréhension de l’expression de la dystrophine manquante aux patients atteints de DMD et permettraient d’améliorer ou prédire les effets des thérapies pour cette maladie.
Procédures
Dans cette étude, les animaux des lots traités seront soumis à des injections intra-veineuses (une injection par semaine, entre une et quatre semaines, durée 1 minute avec la contention) ou une injection unique intra-musculaire (durée 30 secondes avec la contention), suivi d’une procédure chirurgicale pour l’imagerie intravitale sans réveil sauf pour un petit nombre d’animaux qui seront gardés au plus une journée après la chirurgie. La procédure chirurgicale décrite ici sera conduite sur animal anesthésié àl 'isoflurane. Un anesthésique local sera injectée en sous-cutanée avant incision des couches derme-épiderme pour exposition du muscle tibial antérieur nécessaire à l'imagerie. Cette procédure sera conduite pour tous les animaux du projet. Cette procédure ne sera conduite qu'une seule fois par animal. La quasi-totalité des animaux sera euthanasiée à la fin de la séance d'imagerie avant réveil et les muscles seront prélevés post-mortem. Un très faible nombre d'animaux sera réveillé pour être gardé une journée supplémentaire. Dans ce cas, un antidouleur sera injecté en sous-cutanée avant réveil. A J+1, les animaux seront euthanasiés avant prélèvement des muscles et isolement des fibres.
Impact sur les animaux
Notre recul sur les procédures in vivo nous a démontré qu’il n’y a aucun effet secondaire après administration des traitements envisagés dans ce projet. Par ailleurs, toutes les souris sont euthanasiées avant réveil immédiatement après la séance d’imagerie. Seuls certains animaux seront réveillés après l’imagerie. Des pertes de mobilité peuvent être attendues pour ces animaux après leur réveil dus aux points de suture au niveau du muscle tibial. Toutefois, un antidouleur sera administrée par injection sous-cutanée pour limiter la douleur. Du gel diet sera déposé dans la cage afin de faciliter leur récupération et nutrition tout en sachant que ces animaux ne seront maintenus en vie que pour une journée supplémentaire.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélévement et analyse des tissus musculaires.
Remplacement
L’efficacité des molécules thérapeutiques développées au laboratoire a été évaluée dans un 1er temps in vitro pour ne retenir que celles ayant démontré une efficacité moléculaire et tissulaire in vivo, avec un profil toxicologique satisfaisant. Toutefois, leur pharmacocinétique ne peut être correctement évaluée sans essai en imagerie intravitale sur modèles animaux, seul moyen de réellement visualiser la dynamique de l’expression et adressage de la protéine restaurée dans des conditions physiologiques.
Réduction
Les modèles murins utilisés ont des phénotypes peu ou pas dommageable. L’objectif de ce projet de recherche vise d’une part à étudier la pharmacocinétique des molécules thérapeutiques permettant de restaurer l’expression d’une protéine absente, et par conséquent d’améliorer le phénotype pathologique des animaux, et d’autre part d’avoir une meilleure compréhension de l’expression de cette protéine dans le muscle et au niveau des cellules souches musculaires in vivo. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini en fonction de notre expérience passée sur fibres isolées.
Raffinement
Les animaux seront traités avec des analgésiques pour limiter la douleur pendant la chirurgie et l’imagerie in vivo. Tous les animaux seront sacrifiés après l’imagerie avant leur réveil sauf si un prélèvement de fibres musculaires est jugé utile. Dans ce cas précis, les souris seront recousues au niveau du muscle exposé, réveillées puis gardées une journée supplémentaire avec nouvelle administration d’analgésique.
Choix des espèces
Les modèles murins mdx sont les modèles couramment utilisés pour l’évaluation préclinique de molécules thérapeutiques pour la DMD car eux seuls reproduisent le défaut génétique observé chez les patients, à savoir une mutation dans le gène DMD invalidant la production de protéine fonctionnelle en conditions physiopathologiques. Ainsi, nos lignées transgéniques nous permettront de suivre par fluorescence la protéine dystrophine couplée à l’EGFP, endogène dans le cas d’une souris normale (DmdEGFP) ou la protéine restaurée suite au traitement dans le cas de la souris portant la mutation mdx. D’autres lignées murines nous permettront aussi, grâce au système Cre/Lox, d’induire l’expression du fluorophore tdTomato uniquement dans les cellules souches musculaires.
Etude de la regeneration du tissu musculaire de souris genetiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent cinq injections de tamoxifène, et pour 108 d'entre elles une injection de cardiotoxine dans un muscle de la patte afin de provoquer une lésion, pour étudier la régénération musculaire par les cellules souches. Le porteur affirme que l'anesthésie et l'analgésie "garantissent l'absence de douleur" et que les souris reprennent leurs activités dès le réveil. Il conclut qu'aucune méthode ne peut se substituer à l'animal, ce processus reposant selon lui sur des interactions entre tissus lésés impossibles à reproduire in vitro.
Objectifs
Les muscles squelettiques composent près de la moitié de la masse totale d’un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires, de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu conjonctif. Suite à une blessure, les cellules souches résidentes du tissu musculaire s’activent, prolifèrent et réparent le tissu musculaire lésé. Ce processus implique une communication avec les cellules voisines afin de reconstruire les fibres musculaires de façon optimale. Le projet de recherche consiste à étudier la réparation musculaire en identifiant les signaux de communication importants, déployés spécifiquement par les cellules souches musculaires au cours de la régénération musculaire. Nous développerons deux approches, la première consistera à isoler des cellules souches d’animaux modèles et de former des muscles in vitro pour étudier des voies de régulation spécifiques au cours de la régénération musculaire. La deuxième approche nous permettra d’évaluer la régénération du tissu musculaire, mais cette fois-ci in vivo, à partir de ces mêmes modèles de souris transgéniques. Dans le contexte de régénération musculaire, ce projet de recherche nous permettra d’identifier les voies de communication entre cellules qui sont essentielles à la réparation musculaire. Ce projet utilisera au total 198 souris, ceci correspondant à la réduction optimale du nombre de souris nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables.
Bénéfices attendus
Cette approche permettra d’identifier les signaux extracellulaires reçus par les cellules souches musculaires au cours de la régénération du muscle. En plus d’augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules souches musculaires du muscle squelettique, ces résultats permettront de concevoir de nouvelles stratégies de médecine régénérative.
Procédures
5 injections intrapéritonéales d'huile contenant ou non du tamoxifène sur animaux vigiles (198 animaux). Chaque injection prend 5 minutes. Une injection intramusculaire de cardiotoxine dans le muscle releveur de la patte sur animaux anesthésiés (108 animaux). Cette intervention dure 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les trois modèles conditionnels et inductibles de souris transgéniques, qui seront utilisés dans le projet, ne présentent pas de phénotype dommageable à l’état basal. Les injections intrapéritonéales de tamoxifène (procédure n°1 et 2) n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal, aux doses et fréquences utilisées. L’utilisation d’analgésique et d'anesthésique au cours de la procédure n°2 de lésion musculaire garantit l’absence de douleur chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu’elles ne montrent pas de signes de douleur pendant les jours suivants.
Devenir
Les animaux sont mis à mort et les muscles sont prélevés.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour l’étude de la régénération du muscle via l’activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats n'auraient pas pu être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de notre projet utilisant des modèles transgéniques murins.
Réduction
L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlé à l'aide d’analyses statistiques adaptées (T-Test ou ANOVA). De plus, les résultats de la procédure n°1 conditionneront la mise en œuvre de la procédure n°2, ceci permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Avant le début de chaque procédure, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Au cours de la procédure n°1, les animaux seront pesés quotidiennement dès le premier jour de l’injection et ce jusqu’à la dernière injection, puis une fois par semaine jusqu’à leur mise à mort. Anesthésiques et analgésiques sont utilisés au cours de la procédure n°2 afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés au moins 1 fois par semaine afin de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d’interaction sociale, tout changement pourrait refléter souffrance, douleur ou stress, même minime, chez l’animal. Si ces changements sont relevés pendant plus de 48h, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d’améliorer les conditions de vie de l’animal et d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l’Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l’analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. De plus, la souris permet l'utilisation de modèles transgéniques conditionnels et inductibles, permettant la délétion d’un gène d’intérêt dans un type cellulaire et à un temps donné. Les expériences menées sur ces modèles ont permis d’obtenir des résultats fondamentaux et novateurs qui n'auraient clairement pas pu être établis à l'aide de lignées cellulaires. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 8 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.
Mécanismes et thérapeutiques de la thrombopénie autoimmune
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections répétées d'anticorps dirigés contre leurs plaquettes et subissent jusqu'à onze prélèvements sanguins, certaines avec implantation d'une pompe osmotique, pour reproduire une baisse des plaquettes d'origine auto-immune. Le porteur déclare n'attendre aucun effet indésirable ni nuisance remarquable, tout en fixant une mise à mort immédiate dès un score de 3 sur sa grille. Il qualifie ses procédures de "stricte nécessité" et affirme qu'elles ne peuvent être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.
Objectifs
Identifier les sous-classes d’immunoglobulines G (IgG) humaines et les récepteurs humains responsable de l’élimination des plaquettes dans un modèle murin de thrombopénie autoimmune (ce trouble de la coagulation se manifeste par une diminution du nombre de plaquettes dans le sang, elle-même causée par la production d’anticorps dirigés contre les plaquettes de la personne elle-même. Dans ce modèle, les souris sont injectées par des autoanticorps anti-plaquettes de différentes sous-classes d’IgG de manière répétée. Si une diminution des plaquettes est avérée, des souris sont injectées avec des anticorps antagonistes de certains récepteurs pour identifier s’ils interviennent dans la maladie.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à évaluer le rôle des sous-classes d’IgG et des récepteurs pour les IgG, dans la thrombopénie autoimmune afin de mieux en comprendre la physiopathologie et, à terme, pouvoir proposer des nouvelles approches thérapeutiques, ciblant les FcgRs par exemple.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : Procédure 1 : 6 prélèvements sanguins de 30uL Procédure 2 : 7 prélèvements sanguins de 30uL Procédure 3 : une implantation d’une pompe osmotique en sous-cutané et 11 prélèvements sanguins de 30uL.
Impact sur les animaux
Pas d’effets indésirables ni nuisances remarquables.
Devenir
Mise à mort en fin de procédure car les animaux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires de la thrombopénie autoimmune sont difficiles, voire impossible, à étudier chez l’homme, vu la rareté et la localisation des cellules impliquées (macrophages de la rate et du foie). Se déployant dans la rate en premier lieu (et le foie) dont les fonctions, la structure et la vascularisation sont uniques, les pathologies et les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.
Réduction
Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs (FcgR). Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimalisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances de type ANOVA sera réalisée entre les groupes.
Raffinement
Ce modèle de thrombopénie n’induit pas d’effets indésirables ni nuisances remarquables. Les manipulations d’animaux sont restreintes aux injections intraveineuses, et aux prélèvements sanguins, afin de minimiser le stress des animaux durant les 8-15 jours de la durée de l’expérience. L’état général des animaux sera suivi par observation selon une grille animaux témoins/procédure légère mise en place par la structure du bien-être animal en scorant Toilettage, Poil, Respiration, Posture, Mobilité ; chaque signe = 1 point, si score =3 le point limite est atteint et une mise à mort est effectuée immédiatement.
Choix des espèces
La thrombopénie autoimmune est une réaction qui se déploie la rate (et le foie), la pathologie et les thérapies étudiées ici, ne peuvent pas encore être modélisées pertinemment et donc remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (entre 8 et 15 semaines). Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.
Mise au point d’un nouveau modèle préclinique mimant la maladie d’Alzheimer chez le rat diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique implantant une pompe qui diffuse des oligomères amyloïdes dans le cerveau, puis des tests métaboliques répétés avec prélèvements sanguins, pour créer un modèle croisant maladie d'Alzheimer et diabète. Le porteur indique qu'une perte de poids de plus de 20 % entraîne le retrait de l'animal et son observation avant toute décision de mise à mort. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer ces rats par des systèmes in vitro ou in silico, la valeur du modèle tenant selon lui à un diabète spontané proche de l'humain.
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) et la maladie d’Alzheimer (MA) sont deux pathologies dégénératives, liées à l’âge, et dont la prévalence mondiale suit une progression alarmante à cause du vieillissement de la population. Leur fardeau socio-économique est destiné à s’alourdir surtout en l’absence d’un traitement curatif. De nombreuses études épidémiologiques ont montré que le DT2 est associé à un doublement du risque de développer une démence ou la MA. Réciproquement, l’intolérance au glucose et le DT2 sont fréquents chez les patients atteints de la MA. Néanmoins, malgré les progrès de la recherche dans ce domaine, la relation entre le DT2 et la MA reste encore mal comprise. De ce fait, comprendre les mécanismes moléculaires associant le DT2 et la MA est un enjeu majeur de la recherche, afin d’identifier des cibles thérapeutiques communes permettant de modifier le déclenchement et la progression de ces deux pathologies.Pour élucider le lien entre ces deux maladies, nous allons créer deux modèles précliniques de MA en injectant dans le cerveau du rat Goto-Kakizaki (GK), un modèle spontané du DT2, et du rat Wistar (WT) non diabétique des oligomères du peptide β-amyloïde (Aβ). Nous appellerons ces modèles « GK-Alz » et « WT-Alz ». Pour chacun de ces deux modèles un groupe contrôle, qui ne recevra pas les oligomères , sera rajouté. En effet dans la pathologie humaine, l'une des caractéristiques majeure est l'agréagation des oligomères Aβ pour former des plaques entre les neurones. Nous étudierons si un DT2 préexistant va éventuellement accélérer la formation de ces plaques et aggraver la neurotoxicité des oligomères Aβ grâce à des analyses histologiques et biochimiques sur le cerveau et le pancréas. Réciproquement, nous étudierons si l’induction de la MA va impacter négativement l' homéostasie glucidique de nos modèles animaux, en effectuant des tests métaboliques in vivo . Ce projet nécessitera l'utilisation de 80 rats et sera mené sur 3 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la mise en place de la MA, de mettre en évidence les impacts du diabète sur la MA et d'offrir de nouvelles perspectives dans la prévention de son développement . Ce projet nous aidera à étudier la réponse physiopathologique à l’administration des oligomères Aβ et son évolution à différents moments du cycle de vie (avec l’évolution du diabète et le vieillissement du rat) .
Procédures
Les animaux subiront une procédure chirurgicale ,par stéréotaxie, pour l'implantation de la canule équipant la minipompe osmotique. Les 80 rats de l'étude seront implantés. Cette chirurgie dure 60 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur les 48 animaux restants dans le cadre de tests métaboliques IPGTT et IPITT( à l'âge de 7.5 mois soit 1.5 mois aprés l'implantation des pompes Alzet.) et lors du suivi de la glycémie (entre 6 et 7.5 mois). Chacun de ces tests dure 2h. Pour l'IPGTT des prélèvements de sang de 30 microlitres aux temps 0, 15 30 et 90 minutes sont réalisés afin de mesurer la glycémie et l'insulinémie. Pour IPITT une goutte de sang (5 microlitres) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps T0 T15 T30 T60 T90 et T120. Entre le test IPITT et IPGTT se déroule une semaine pour la récupération.
Impact sur les animaux
Les animaux sont isolés en cage individuelle suite à l'implantation en sous curtanée d’une minipompe osmotique Alzet® reliée à une canule implantée en ICV. L'injection en intrapéritonéal dans le cadre des IPGTT et ITT est à l'origine d'une petite douleur liée à la piqure. Une éventuelle hypoglycémie peut arriver dans le cadre de l'ITT, mais cela est trés rare chez le rat. Les anomalies cérébrales entrainées par le peptide Aβ pourraient induire une intolérance au glucose chez les rats wistar et aggraver le diabète des GK.
Devenir
A la fin de la procédure 1 de chirurgie, réalisée à l'âge de 6 mois, les 80 rats sont maintenus en vie. A la fin des 2 semaines de perfusion 8 rats de chaque groupes seront mis à mort pour valider le modèle. A l'âge de 7.5 mois les autres animaux( 48 rats) subissent les tests métaboliques, à l'issue desquels ils sont mis à mort.
Remplacement
L’étude de la réponse physiopathologique à l’administration des oligomères Aβ et son évolution à différents moments du cycle de vie (avec l’évolution du diabète et le vieillissement du rat) ne peut être réalisée que sur animaux vivants, et l’avantage du rat GK réside dans le fait que c’est un modèle de DT2 sans manipulation génétique et mimant la chronologie d’évolution du diabète humain. Ainsi, sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant au mieux la différence entre les groupes.
Raffinement
Afin de raffiner toutes les procédures et réduire au mieux l’apparition, d'une éventuelle douleur, d’angoisse et de stress chez les animaux, nous prendrons toutes les précautions nécessaires (recours à l’analgésie, l’anesthésie, maintien de l’enrichissement (morceau de bois et sopalin), habituation, récupération). Des points limites d’évaluation de la douleur seront déterminés portant sur l'apparence physique( manque de toilettage, poils ebouriffés, dos arrondi) le comportement (modification de la prise alimentaire, prostatration) les modifications de poids. Une perte de poids de plus de 20% entrainera le retrait de l’animal de la procédure et son observation avant toute décision de mise à mort. Le choix du protocole expérimental impliquant les 4 groupes d'animaux, nous permet d'assurer une fiabilité à cette étude. Pour les rats diabétiques GK une litière adaptée sera mise dans les cages et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que du point de vue comportement, le rat est un apprenant rapide et intelligent, et les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète est le rat.
NEUROPEPTIDES : Etude des rôles des neuropeptides URP1 et URP2 au cours du développement larvaire du poisson zèbre (Danio rerio)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
1 480 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les traitements par balnéation, destinés à faire surproduire deux hormones ou à détruire les neurones qui les fabriquent, provoquent des déformations de la colonne vertébrale, cyphose puis scoliose, le porteur signalant aussi un risque de mortalité lié au metronidazole. Les animaux expérimentaux sont élevés jusqu'à six mois puis tués pour analyse des tissus, tandis que les lignées génétiquement modifiées sont gardées comme reproducteurs jusqu'à deux ans. Le bénéfice avancé, réduire les malformations de la colonne chez les poissons d'élevage, est renvoyé au long terme, et le porteur affirme que la morphogenèse d'un organe complexe "nécessite" un modèle animal.
Objectifs
Notre projet est d’étudier les fonctions de deux hormones peptidiques (nommées URP1 et URP2) dans la mise en place et le maintien de la colonne vertébrale chez les poissons. Ces hormones sont produites par des neurones de la moelle épinière et agissent sur les muscles dorsaux du tronc. Chez le poisson-zèbre, notre modèle d’étude, en l’absence de ces deux hormones ou de leur récepteur, chez des poisons porteurs de mutations des gènes qui les codent, les animaux présentent une malformation de la colonne vertébrale. Ce défaut apparait chez la jeune larve. A ce stade, l’animal présente alors une simple courbure de l’axe avec la queue vers le bas (cyphose). La déformation évolue sensiblement au cours de la vie larvaire. Chez le juvénile, la colonne présente une double courbure en forme de S évoquant une scoliose. Ce phénotype ne semble pas s’aggraver pendant la croissance du juvénile ni plus tard chez l’adulte. En dehors de cette malformation, les animaux grandissent et vivent normalement. L’objectif de notre projet est de déterminer si ces hormones sont nécessaires uniquement chez la larve pour la mise en place de la colonne vertébrale ou si elles sont requises tout au long de la vie pour le maintien de la colonne.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer les fonctions des neuropeptides URP1 et URP2 dans la formation de l’axe vertébrale des poissons. A long terme, ces travaux devraient apporter de nouvelles pistes d’études pour réduire la fréquence des malformations de la colonne chez les poissons d’élevage
Procédures
3 types d’interventions sont utilisées dans ce projet : - 1 : Transgénèse : production d’animaux génétiquement modifiés. - 2 : Traitement par balnéation au tamoxifen 3 nuits consécutives pour induire une surproduction des hormones URP1 ou URP2. - 3 : Traitement par balnéation au metronidazole 3 nuits consécutives au metronidazole (balnéation) pour éliminer spécifiquement une population de neurones produisant les peptides URP1 et URP2 et ainsi supprimer la source de ces hormones.
Impact sur les animaux
La transgénèse est généralement sans effet mais est susceptible d’entrainer des malformations non souhaitées. La surproduction des hormones URP1 ou URP2 (induite par traitement au tamoxifen) et l’ablation des cellules sources d’URP1 et URP2 (induite par traitement au metronidazole) devraient entrainer des déformations de la colonne vertébrale. Le traitement au tamoxifen en lui-même est sans effet. Le traitement au metronidazole pourrait être toxique pour les animaux à la dose utilisée avec un risque de mortalité. Dans ce cas, la dose utilisée serait revue à la baisse.
Devenir
Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs jusqu’à l’âge de 2 ans. Dans le cadre des expériences de surproduction des hormones URP1 ou URP2 ou d’ablation cellulaire, les animaux sont élevés jusqu'à 6 mois (âge adulte) puis sont utilisés pour réaliser des analyses des différents tissus pouvant être affectés.
Remplacement
L’étude dynamique des processus de morphogenèse (croissance et acquisition de la forme des tissus, organes et animaux) est essentielle pour comprendre de nombreuses étapes du développement embryonnaire et larvaire normal et pathologique. La morphogenèse de tissus et d’organes complexes, comme la colonne vertébrale, ne peut être reproduite totalement in vitro et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux.
Réduction
Dans le cadre des traitements au tamoxifen ou au metronidazole, les expériences seront conduites par lots successifs de façon à pouvoir être arrêtées dès que les résultats obtenus seront concluants. Les phénotypes obtenus seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés très régulièrement. Les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche pour assurer une croissance optimale ainsi que de la nourriture vivante (larves d’artémia, rotifères) pour permettre un enrichissement du milieu et sont maintenus à une densité adaptée afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Pour la création des lignées génétiquement modifiées, l'utilisation d'un marqueur de transgénèse permet de sélectionner les embryons porteurs des transgènes d'intérêt sans avoir recours à des biopsies.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire et larvaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités d’édition du génome (production de lignées génétiquement modifiées porteuses d’un transgène ou d’une mutation d’intérêt) en font un modèle de choix pour la recherche. Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Les animaux sont donc utilisés de la fécondation jusqu'à l'âge adulte. Dans le cadre des expériences de surproduction des hormones URP1 ou URP2 ou d’ablation cellulaire, les traitements sont réalisés entre 2 semaines (jeune larve) et 12 semaines (juvénile) afin d’en tester l’impact en fonction de l’âge des animaux. Les animaux sont ensuite élevés jusqu'à 6 mois (âge adulte) puis sont utilisés pour réaliser des analyses des différents tissus pouvant être affectés
Imagerie spécifique des propriétés de la myéline par IRM de transfert d’aimantation inhomogène quantitatif (qihMT)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 70
440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 250 en gravité sévère. Ils servent de modèles de démyélinisation, génétiques ou induits par la cuprizone, passent des examens d'IRM, puis leur système nerveux central est prélevé par perfusion intracardiaque de fixateur suivie de décapitation. Le porteur met au point une technique d'IRM censée être spécifique de la myéline, à valider par comparaison histologique. Les retombées cliniques annoncées restent conditionnées à la réussite du projet.
Objectifs
Introduction : La myélinisation des axones est une composante fondamentale du fonctionnement du système nerveux central (SNC), puisque qu’elle assure d’une part l’isolation axonale et permet d’autre part la propagation efficace du signal électrique le long des fibres nerveuses. Ainsi, pouvoir accéder in vivo à l’intégrité de la myéline permettrait une meilleure compréhension du développement du SNC chez le sujet sain, ainsi qu’une meilleure caractérisation des pathologies neurologiques de la substance blanche (e.g. Sclérose en Plaques). Aucune technique IRM actuelle n’est réellement spécifique de la myéline et plusieurs facteurs confondants limitent ou empêchent les diagnostics précis. Les techniques basées sur le transfert d’aimantation offrent pourtant des potentialités très intéressantes. Récemment, nous avons développé une nouvelle technique dérivée du transfert d’aimantation, le transfert d’aimantation inhomogène (ihMT), dont la sélectivité du signal pour la myéline s'avère remarquable. Les objectifs majeurs de ce projet sont de développer une technique ihMT quantitative (qihMT) et de valider ses métriques quantitatives comme marqueurs spécifiques des différentes propriétés de la myéline (organisation, composition, structure, dynamique) dans des modèles pathologiques (e.g. modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle de démyélinisation cuprizone, modèles de dysmyélinisation) et dans le suivi de la maturation cérébrale.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet aura pour vocation de fournir un outil non-invasif quantitatif dont les métriques seront spécifiques des différentes propriétés de la myéline (structure, composition, fonction). Cet outil permettra un diagnostic in vivo plus précis ainsi qu’une levée des limitations des techniques actuelles. De plus, grâce à la transversalité de l’IRM, le protocole validé sur petit animal pourra être appliqué à l’homme sur la base des résultats obtenus en préclinique.
Procédures
A la fin des analyses IRM, le système nerveux central des animaux controles/modèles (nombre total de 440) sera être prélevé pour analyses histologiques par des techniques de référence d'imagerie de la myéline afin de valider les données qihMT. Le système nerveux central des animaux sera prélevé selon le protocole de perfusion intracardiaque suivant (durée 30 minutes): Administration analgésique Buprénorphine (buprecare, 0.3mg/ml) à la dose de 0.1mg/kg. La buprénorphine aura été préalablement dilué (X20) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 160 microlitre. Injection d’euthasol en ip à la dose de 140mg/kg. L’euthasol aura été préalablement dilué (X40) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 350 microl (seringue de 0,3 ou 0,5 ml, aiguille de 29 G) L'animal aura sa cage thoracique ouverte en vue d'effectuer une perfusion intracardiaque de 20 ml de PBS - Héparine 100U/ml puis de 50 ml de PFA 4%. A la fin de la perfusion, l'animal sera décapité et son cerveau sera prélevé puis post-fixé dans du PFA 4% à 4°C pendant 24 h.
Impact sur les animaux
Des nuisances temporaires de stress, liées à l'environnement relativement bruyant des IRM est attendu pour tous les animaux lorsqu'ils seront sortis de l'armoire de stabulation pour l'examen IRM (2heures). Une perte de poids temporaire (-5% pendant 1 semaine) due au changement de régime alimentaire est attendu pour les souris du modèle cuprizone.
Devenir
L'issue de chacune des procédures 1-6 cloturera un point particulier du projet global sur l'imagerie quantitative de la myéline. Les 440 animaux nécessaires à l'ensemble des procédures seront donc euthanasiés par perfusion intracardiaque (mise à mort décrite en 3.3.3 et demande de dérogation en 3.3.4) permettant le prélèvement de leur système nerveux central.
Remplacement
La spécificité des métriques quantitatives de la technique qihMT pour la myéline doit être démontrée in vivo afin de valider l'IRM ihMT comme marqueur spécifique utilisable dans des protocoles cliniques. Cette démonstration ne pourra être effectuée que sur la base de mesures réalisées à différents points temporels sur des animaux contrôles et modèles caractérisés d’altération/développement de la myéline. Ces mesures seront ensuite corrélées à des analyses histologiques. Ces aspects ne peuvent être conduits chez le patient du fait de l’impossibilité de réaliser une étude histologique sur un même échantillon préalablement exploré in vivo par IRM. Néanmoins, une stratégie de remplacement sera effectuée. Ainsi, à chaque fois que cela sera possible, notamment lors des ajustements de premier niveau (debuggage des séquences IRM, optimisation, tests...), des fantômes (composés chimiques ayant des caractéristiques similaires à la myéline, e.g. systemes de lipides lamellaires synthétiques) seront utilisés en lieu et place des animaux.
Réduction
Les examens IRM seront réalisés de sorte que plusieurs paramètres IRM puissent être ajustés au cours d’une même session et sur des mêmes animaux. La durée des examens n’excèdera néanmoins pas 2h par animal (durée standard d’investigation multimodale IRM sur petit animal). Un suivi longitudinal par exploration IRM non invasive sera effectué sur tous les modèles investigués, réduisant ainsi de manière drastique le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux est assuré par les animaliers. La stabulation des animaux sera réalisée au sein de notre unité, dans des armoires dédiées à raison de 5 souris / cage et 2 rats / cage pour les animaux contrôles. Après un examen IRM, chaque animal sera placé dans une cage individuelle avec accès facilité à la nourriture/boisson puis replacé dans sa cage une heure après. Les cages de stabulation souris du CRMBM sont dotées d’un environnement enrichi (roues, tunnels... pour la stimulation des animaux). Les procédures expérimentales de chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile Isoflurane 3% dans l’oxygene pur et ventilation assistée ou mélange kétamine (100mg/kg de poids)/xylazine (10mg/kg de poids)) et des analgésiques sont administrés (injection intramusculaire de Buprenorphine, 0.1mg/kg).
Choix des espèces
Justification de l’utilisation de souris : Existence de différents modèles génétiques caractérisés de pathologies affectant la myéline chez la souris : modèles Shiverer et Twitcher (modèles génétiques des leucodystrophies, caractérisées par une dysmyélinisation du SNC résultant d’un déficit en galactocérébrosides pour Twitcher ou en Myelin Base Protein (MBP) pour Shiverer), modèle cuprizone et EAE (miment certains effets de la sclérose en plaques par une démyélinisation locale et par des lésions axonales entrainant un déficit cognitif et une incapacité progressive, et effets inflammatoires). Justification de l’utilisation des rats : L’interêt du rat est de disposer de structures de système nerveux central plus grosses que celles de la souris et donc d’un signal IRM plus conséquent. Investigation possible grace au diamètre plus grand du scanner 7T. L’IRM étant une technique très peu sensible, le critère de rapport signal sur bruit élevé est primordial afin de limiter le temps d’examen. Pour toutes les études (hors maturation cérébrale), les animaux seront âgés de >10 semaines correspondant au début de l’âge adulte afin de s’assurer d’un niveau de maturation du système nerveux central maximal. Pour l’étude de la maturation cérébrale, les animaux seront utilisés à différents stades du développement (de D6, jusqu’à >10 semaines).
Détermination de l’implication du système sympathique dans la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette demande ne couvre que la partie élevage d'un projet sur la sclérose latérale amyotrophique, les animaux ne subissant pas d'intervention active mais développant les altérations motrices de la maladie, suivies par une grille de score. Le porteur indique que le phénotype lui-même est dommageable et surveille de près la moitié des animaux. Le bénéfice avancé est une meilleure compréhension d'une maladie mortelle chez l'humain.
Objectifs
Cette DAP ne couvrira que la partie élevage du projet. La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homeostasie corporelle. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones cholinergiques qui sont moléculairement extremement proches des neurones qui commandent les muscles striés: les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caracterisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et au décès des patients par insuffissance respiratoire. Les causes précises de la degenerescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette degenerescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau de son partenaire synaptique: le muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du controle vasculaire et nerveux des muscles à la degenerescence des MNs. L' objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoses (avant l'apparition des symptomes moteurs) de la regulation sympathique sur un modele murin de la SLA, la souris SOD1 G93A.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la SLA. La maladie se déclare à l’âge adulte chez l'humain (40- 80 ans) et va évoluer, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient par paralysie des muscles respiratoires. Il est donc important pour les patients qu'on avance sur la connaissance de cette maladie (cause, détection de signes précoses, traitements, etc.)
Procédures
Les animaux ne subiront aucune procédure. Seul le phénotype sera dommageable et donc suivi dans le temps grâce à une feuille de scoring. L'ensemble des animaux du projet seront concernés (n=80)
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude)
Devenir
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immunohistologiques.
Remplacement
le nombre d'animaux choisit pour l'étude est le minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiques fiables. Il est important de ne faire ni trop, ni trop peu afin de ne pas avoir à refaire l'ensemble de l'expérimentation. Ce nombre a été choisit sur la base de d'expériences précedentes du laboratoire et de la bibliographie dans ce domaine. Les tests utilisés seront d'abord un test de normalité afin de savoir si les courbes des données recueillies suivent la loi normale. En fonction, des tests paramétriques ou non seront faits afin de comparer nos lots.
Réduction
Un grand nombre d'expérimentations dans notre laboratoire sont faites ex vivo, sur cellules vivantes. Cela a permis d'obtenir un certain nombre de données en évitant toute souffrance animale. Toutefois, dans certains cas, il est indispensable de travailler dans un système intégré comme un organisme complet. Ainsi, il n'est, dans notre cas, pas possible de reproduire les modifications de commande nerveuse sympathique dans une modèle de maladie, avec uniquement des systèmes ex-vivo. Pour le traitement des données, nous utiliserons des tests ANOVA one and two ways.
Raffinement
Les individus porteurs de la mutation seront suivis régulierement. Un scoring sera fait toutes les semaines à partir de P60 puis tous les 3 jours à partir de P90. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé inutilement afin de préserver le caractère grégaire de la souris.
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les mâles reproducteurs seront mis en accouplement dès 7 semaines à la descente des testicules. Les stades de prélèvements sont ceux habituellement utilisés dans la littérature pour l'évaluation de la SLA sur ce modele murin.
Analyse du rôle de GD3 dans la progression tumorale du glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 172 en gravité sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules de glioblastome sous la peau ou dans le cerveau, cette dernière suivie d'une étude de survie jusqu'au franchissement d'un score de souffrance. Le porteur euthanasie les animaux à une perte de poids de 20 % ou à un score de souffrance défini. L'objectif est d'analyser le rôle d'un ganglioside, le GD3, dans l'agressivité de cette tumeur cérébrale.
Objectifs
L'objectif est d’analyser le rôle de l'expression du ganglioside GD3 dans l'agressivité du GBM. Pour cela, nous étudierons l'impact de l'expression de GD3 dans la capacité des cellules de GBM à former des tumeurs (propriétés de tumorigénicité) ainsi que dans la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Le GBM est une tumeur cérébrale dont le pronostic est sombre. Il n’existe aucun traitement curatif et la survie médiane des patients est de un an avec un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. La récidive est inévvitable dans un délai de 7 à 10 mois. Il est donc urgent de rechercher de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces pour les patients. L’utilisation du ganglioside GD3 comme cible thérapeutique comme agent anti-cancéreux pour le traitement du GBM a fait l’objet de plusieurs publications.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Greffes sous-cutanées (108 animaux, une seule intervention de 1 minute environ); 2) Greffes intra-cérébrales (172 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ); 3) Injection i.p. pour l'anesthésie des animaux avant les greffes intra-cérbrales ou les perfusions intra-cardiaques (172 animaux, quelques secondes d'intervention); 4) Injections sous-cutanées d'analgésiques lors des greffes intra-cérébrales (172 animaux, quelques secondes d'intervention).
Impact sur les animaux
Hormis une perte de poids qui reflète la progression tumorale des tumeurs intracraniales, aucun autre effet indésirable n'est attendu dans ce projet. Les administrations intracérébrales (exécutées sous anesthésie) n’induisent en principe pas de souffrances à la suite de la chirurgie. L’injection sous-cutanée induit une douleur légère, dont la durée est limitée à l’intervention. Néanmoins, Le suivi de l’état général des animaux sera réalisé en mesurant quotidiennement le poids corporel et en surveillant l’apparition de signes définis comme points limites. Lorsque nous observerons une perte de poids supérieure ou égale à 20%, en référence au poids initial de l'animal ou un score de souffrance supérieur ou égal à 10, les animaux seront euthanasiés sans délai (grille de scores en annexe).
Devenir
Procédure 1: tous les animaux seront euthanasiés lorsque les tumeurs atteindront 1500 mm3, ou en cas d'absence de prise tumorale. Procédure 2: tous les animaux seront euthanasiés 60 jours après la greffe tumorale pour effectuer des analyses histologiques. Procédure 3: tous les animaux seront euthanasiés dès le franchissement d'un score limite défini par la grille de scores (étude de survie). Procédure 4: tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les cerveaux pour l'analyse des volumes tumoraux et des marqueurs histologiques.
Remplacement
l n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés, un maximum d'expériences sera réalisé in vitro. Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d’une grille de score. Les animaux seront euthanasiés dès l’apparition d’un signe de détresse (perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial, posture, prostration, difficultés à respirer, à se déplacer, ataxie). Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie comme animal modèle pour plusieurs raison : 1) La facilité, la praticité pour maintenir cette espèce dans notre structure et le fait que notre animalerie d’hébergement soit équipée pour accueillir des souris ; 2) Les personnes concernées par ce projet maîtrisent la manipulation de cet animal ; 3) le faible coût d’entretien des animaux ; 4) l’injection de cellules cancéreuses est communément pratiquée chez cette espèce et maîtrisée depuis de nombreuses années ; 5) La prise tumorale est rapide (entre 15 jours et 2 mois selon la lignée cellulaire concernée) quand des cellules de glioblastome sont injectées dans le cerveau. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique classique.
Modulation du niveau de DNM2 par croisement génétique dans le traitement des myopathies liées à MTM1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation reproduisant une myopathie myotubulaire, avec atrophie musculaire, paralysie progressive des membres postérieurs et déformation du dos, et subissent des tests moteurs puis une mesure terminale des propriétés musculaires sous anesthésie sans réveil. Le porteur cherche à valider une thérapie par croisement génétique modulant la protéine dynamine 2. Le bénéfice reste une "preuve de concept" pour de futures approches chez les patients.
Objectifs
Nous souhaitons valider chez la souris, une preuve de concept pour les myopathies myotubulaires lié à MTM1 en modulant le niveau de la protéine Dynamine 2 par croisement génétique. En effet, Les animaux mutant Mtm1-KO montrent une sur expression de la Dynamine 2 que nous souhaitons faire diminuer par croisement avec une souris mutante (atteinte de CMT) présentant une diminution du niveau de cette même protéine.
Bénéfices attendus
Le projet vise à fournir une preuve de concept que la modulation de la protéine dynamine 2 peut améliorer le phénotype MTM1. Ceci pourrait conduitre au développement d'approches thérapeutique pour les patients atteints de myopathie myotubulaire.
Procédures
Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à l'âge de 7 à 8 semaines. Ces expériences consistent à mesurer la force du musculaire, la position des pattes lors des déplacements, l’habilité à se déplacer sur une barre crantée (3 essais/jour/souris). Mesurer l’activité électrique musculaire par EMG (Electromyographie) et la mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA). Pour ces 2 expériences seulement un essai sera réalisé.
Impact sur les animaux
Pour cette étude deux modèles murins seront utilisés, un modèle atteint de Myopathie Centro-Nucléaire (CNM) et un deuxième atteint de la maladie de CMT. La souris atteintes de la maladie de CMT présente un phénotpe léger avec une légère perte de poids par comparaison avec la souris contrôle. Aucune douleur n'est observée chez ces animaux. En revanche, la souris atteinte de myopathie myotubulaire (MTM1-KO) présente un phénotype sévère avec une atrophie musculaire pouvant conduire à une paralysie progressive des membres postérieurs et l’apparition d’une cyphose (dos arrondie). Cependant, les premiers signes du phénotype dommageable n’apparaissent qu’à l’âge de 4-5 semaines pour atteindre un maximum à environ 8 semaines. A noter qu’il existe une certaine variabilité phénotypique entre les animaux mutant et que tous ne développeront pas l’ensemble des signes de la maladie. Les mesures d’électromyographies (EMG) nécessitent une immobilisation de l’animal réalisé sous anesthésie pour une durée maximum de 10 minutes. Pour réaliser la stimulation électrique, un courant de 0.9 mA à 4 mA est délivré grâce à des électrodes de stimulation (avec un diamètre équivalent aux aiguilles utilisé en acupuncture) implanté sous la peau de l’animal. De la même manière, une électrode de réception est également implantée sous la peau de la souris. Les expériences de mesure de la force musculaire (AURORA) sont réalisées sous anesthésie profonde. Une petite incision est réalisée au-dessus du nerf sciatique permettant de poser de part et d’autre de ce dernier les électrodes de stimulation électrique et un courant de 1 à 10 mA sera délivré pour induire la contraction du muscle. Un deuxième acte chirurgical consiste à dégager le muscle tibial antérieur afin de le fixer sur l’appareil de mesure.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante. Après les mesures électrophysiologique, l’animal est réchauffé sur une plaque maintenue à 37°C jusqu’à son réveil. La dernière expérimentation qui est "sans réveil" consiste à mesurer les propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA) sous anesthésie.
Remplacement
Pour caractériser cette maladie (CMT) et évaluer l’efficacité de ce croisement génétique nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part l’amélioration des symptômes apporté par la régulation de cette protéine par croisement génétique. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la force musculaire seraient impossibles à évaluer. D’autre part une étude sur culture de cellules mutante ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice de la force musculaire ne peut être mesuré (REMPLACEMENT).
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 15 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Cependant une première étude pilote sera réalisée avec 10 animaux, afin de vérifier le phénotype et le niveau de la protéine Dynamine 2. En tenant compte des géniteurs, des animaux d’expérience, nous prévoyons 100 animaux pour cette étude (REDUCTION).
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. De la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée (RAFFINEMENT).
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène DNM2 et les effets de la modulation de cette protéine, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est différente. De plus, la souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologie humaine. Lors d'une précédente étude nous avons constaté qu'à l’âge adulte c'est à dire à 7 et 8 semaines, le phénotype lié à la maladie était exprimé. Ainsi, nous souhaitons réaliser les test comportementaux à cet âge afin d'évaluer la maladie et le bénéfice de ce croisement sur la pathologie.
Etude des troubles de l’humeur associés à l’obésité : mécanismes neurochimiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique, une partie subit une chirurgie stéréotaxique implantant une sonde dans le cerveau, un isolement en cage individuelle de trois semaines et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur étudie les troubles de l'humeur associés à l'obésité et à l'inflammation, avec des retombées nutritionnelles ou pharmacologiques renvoyées au long terme. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale".
Objectifs
Le thème général du projet concerne l'étude des effets nocifs d'une alimentation déséquilibrée sur les troubles de l'humeur. Plus précisément, il s'agit ce caractériser et de comprendre le développement des troubles de l'humeur associés à la consommation chronique d'un régime hypercalorique hyperlipidique chez la souris. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de cette alimentation sur l'inflammation dite "de bas bruit" qu'elle va générer, et qui va médier un certain nombre de processus conduisant à la perturbation du fonctionnement des systèmes de neurotransmission monoaminergiques qui peuvent sous-tendre le développement des troubles de l'humeur, jusqu'à la dépression. Si certains effets de l'inflammation dans ces phénomènes sont aujourd'hui décrits, les mécanismes neurochimiques précis mis en jeu ne sont pas encore totalement élucidés. En particulier, leur implication dans le déficit de réponse aux antidépresseurs, dont la proportion est largement plus présente chez les patients dépressifs présentant une inflammation chronique, reste peu étudiée et reste à démontrer.
Bénéfices attendus
Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la dépression associée à l’inflammation. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte inflammatoire.
Procédures
Des chirurgies seront réalisées sur souris anesthésiées, afin d'insérer dans une région spécifique du cerveau une sonde de dialyse, permettant de receuillir le milieu extracellulaire et d'y doser un neurotransmetteur, la dopamine. Il est prévu un nombre de 120 souris pour cette procédure, qui sera réalisée une seule fois sur chaque animal. Les souris seront soumises à la contention nécessaire à une injection intra-péritonéale (470 souris), 120 souirs seront placées en isolement pendant 3 semaines. Les souris seront soumises à des tests comportementaux (420 souris).
Impact sur les animaux
La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris. Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modèlisé ici) est atendu chez les souris soumises au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. Les douleurs attendues concernent celles liées à la chirurgie stéréotaxique, la contention et l'injection intra-péritonéale et l'isolement en cage individuelle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever leur cerveau pour analyses ultérieures.
Remplacement
L'objectif général du projet est de mieux comprendre chez l'animal les ménanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur en condition inflammatoire induite par une exposition chronique à un régime obésogène. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l'étude des troubles de l'humeur reste une nécessité expérimentale afin d'appréhender la réalité physiologique de nos résultats. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.
Réduction
Les mêmes souris seront sucessivement soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale.Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Le nombre minimal de souris pour chaque groupe expérimental est fixé afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante, afin de ne pas répéter la procédure.
Raffinement
A leur arrivée, les souris bénéficient d'une période minimale d'une semaine d'habituation à leur nouvel environnement avant de débuter les expérimentations. En concertation avec la structure Bien-Etre du laboratoire, nous avons défini les meilleurs conditons d'hébergement possibles ainsi que les points limites et d'arret précoces et adaptés. Les souris seront ainsi hébergées par 5 (excepté pour le test comportemental de mesure de fatigue en cage individuelle avec roue d'activité sur une période maximale de 3 semaines), avec présence de différents enrichissements, surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalables soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation. Pour les procédures invasives et/ou susceptibles de générer une douleur, les soins pré- et pos-opératoires sont appliqués, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie sont mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes évitant la répétition des expériences.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permet un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. Les animaux arriveront au laboratoire à l’âge du sevrage (P21). Ils seront mis immédiatement sous régime contrôle ou hyperlipidique jusqu’à la fin de l’expérience. Toutes les expériences seront ensuite faites à l’âge adulte (après 15 semaines d'exposition au régime).
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une irradiation localisée à forte dose au colorectum, à l'abdomen ou au thorax, jusqu'à 27 Gy, puis est maintenu sept jours avant euthanasie. Le porteur indique que l'irradiation entraîne des douleurs et une perte de poids, la mise à mort survenant si l'animal perd plus de 20 % de son poids. Cette phase vise à mettre au point l'isolement des cellules endothéliales et le choix du modèle d'irradiation.
Objectifs
Le projet que nous présentons ici s’inscrit dans le cadre de ce projet de développement des outils de prédiction des lésions tissulaires radio-induites, basé sur la réponse moléculaire des cellules endothéliales à l’irradiation in vitro en raison de leur rôle dans l’initiation et le développement des toxicités liées aux fortes doses d’irradiation localisée (Annexe 2). Pour évaluer les effets des nouvelles modalités d’irradiation en radiothérapie, notre programme de recherche s’appuie sur les mesures d’un ensemble de paramètres biologiques dans les cellules endothéliales cultivées in vitro comme l’expression de gènes, la sénescence ou le cycle cellulaire, pour comparer des rayonnements ionisants de différentes qualités. Des premières séries expérimentales sur des souris ont permis de confirmer ces différences de réponse pour des débits de dose différents in vivo (12). Pour rendre notre modèle plus robuste, nous souhaitons maintenant collecter et utiliser des données provenant de cellules endothéliales irradiées in vivo. La phase 1 des expériences in vivo est proposée dans ce protocole : il s’agira de mettre au point l’isolement des cellules endothéliales d’organes de souris contrôles et irradiées, condition nécessaire à l’étude de l’expression des gènes et des protéines de ces cellules, afin de comparer les rendements et qualités (notamment la viabilité) des cellules obtenues à partir de trois organes d’intérêt : colorectum, intestin et poumon. En effet, il se peut que certains organes soient mieux adaptés à l’obtention de quantités et de viabilités des cellules suffisantes pour la suite des expériences (cytométrie en flux et séquençage de l’ARN sur cellules uniques). Ce protocole permettra de faire le choix de l’organe pour la suite du projet. Dans la phase 2 du projet, il s’agira d’irradier l’organe choisi lors de la première étape à différentes énergies et différents débits de doses. Cette phase du projet sera proposée dans une future DAP. L’objectif du projet présenté ici (cf. Annexe 3) sera de réaliser des expériences pour choisir, parmi les modèles d’irradiation localisée au niveau du, de l’abdomen (intestin) ou du thorax (poumon), le modèle qui permettra de collecter le plus grand nombre de cellules endothéliales et dans le meilleur état possible (proportion de cellules vivantes supérieur à 80%).
Bénéfices attendus
L’objectif global de notre projet est l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales issues d’organes irradiés in vivo chez la souris. Le projet a pour but de contribuer à une meilleure prédiction des risques de séquelles à long terme liées aux traitements par la radiothérapie. Le bénéfice scientifique attendu de ce projet est la validation et le renforcement de notre modèle d’évaluation des risques de séquelles utilisant des cellules en culture (in vitro) en établissant des liens entre les jeux de données obtenus in vitro et ceux obtenus chez la souris par des analyses mathématiques et bio-informatiques. Une fois établi, notre modèle pourra permettre d’évaluer in vitro les risques sans recourir à l’expérimentation animale. Pour ce qui concerne le projet présenté ici, le bénéfice scientifique attendu est de pouvoir choisir l’organe optimal pour ces études. A plus long terme, le bénéfice attendu de ce projet sera principalement pour l’être humain : par l’établissement d’un modèle de prédiction in vitro du risque de séquelles lié aux nouvelles pratiques de la radiothérapie, nous comptons contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des patients après traitement anti-cancéreux, un objectif inscrit dans la stratégie décennale de lutte contre les cancers 2021-2030.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie, maintenus 7 jours en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis euthanasiés avant le prélèvement des différents organes (colorectum, intestin ou poumon – les animaux étant irradiés à 2.5 Gy/min, les durées d’irradiation des doses 17, 18 et 27 Gy seront respectivement de 6.8 min, 7.2 min et 13.5 min). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus seront occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Les 3 modèles d’irradiation localisée que nous utiliserons sont bien caractérisés dans notre laboratoire : irradiation au niveau du colorectum, irradiation au niveau de l’abdomen, irradiation du thorax. Le recul acquis par le laboratoire sur ces modèles n’a pas montré de dommage clinique nécessitant l’euthanasie anticipée des animaux. Pour les 3 modèles, l’irradiation entraîne des douleurs et une perte de poids. En revanche, le temps final de l’étude étant assez court (7 jours après l’irradiation), ces protocoles n’entrainent pas la mort des animaux.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements sous anesthésie terminale
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude.
Réduction
Cette étude est une mise au point. Pour les souris contrôles (non irradiées), nous prélèverons 3 organes différents sur le même animal (colorectum, intestin et poumon), ce qui limitera le nombre d’animaux. Dans l’étape 1, il s’agira de comparer les rendements en cellules endothéliales sur ces 3 organes, en condition non irradiée. Dans l’étape 2, le protocole de purification des cellules irradiées sera appliqué à des souris irradiées, en comparaison à des souris non irradiées.
Raffinement
Tous les animaux du projet seront surveillés quotidiennement avec une mesure de poids afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, diarrhée/constipation, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation des signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera une euthanasie anticipée. La connaissance du laboratoire dans les 3 modèles nous indique que les premiers signes apparaissent à J8-J10 post-irradiation, or les animaux seront euthanasiés à J7. Il n’est donc pas attendu de signes cliniques majeurs dans ce projet.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 10 à 12 semaines. Ceci correspondant au stade adulte, ce qui permet d’éviter l’hétérogénéité éventuelle liée à l’âge (il s’agit également de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée). La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, c’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation colorectale, intestinale et thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions radio-induites. Nous possédons donc un recul important sur les conséquences de l’irradiation pour chacun de ces trois modèles.