Oncologie

Tuées à la fin du protocole pour des analyses post-mortem, ou réutilisées dans un autre projet pour 65 d'entre elles, 390 souris sont soumises à un régime gras dès l'âge de quatre semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent 28 jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen, des gavages, sept prélèvements de sang en deux heures par une incision de la queue, et trois minutes de contention dans un tube d'imagerie. Le porteur indique que le régime gras prolongé peut altérer leur mobilité et créer un état dépressif et de l'anxiété, et prévoit que les souris écartées du protocole après le régime soient utilisées pour l'enseignement ou des mises au point techniques.

Objectifs

Afin d’améliorer la quantité trop importante de sucre dans le sang, chez le diabétique de type 2, plusieurs approches médicamenteuses sont possibles. Parmi elles, il existe une famille de molécules proches d’hormones naturellement produites par l’intestin. A l’heure actuelle, les médicaments de cette famille sont nombreux sur le marché, mais ne cible généralement qu’un seul site d’action. La molécule de cette étude est la première capable de cibler deux sites à la fois, lui conférant ainsi un potentiel thérapeutique plus important que les médicaments actuellement le marché. L’avantage d’avoir deux cibles réside dans le fait que des mécanismes d’action différents et complémentaires pourraient exister et donc permettre une efficacité supérieure. L’étude de l’action de ce type de médicament a mis en lumière le fait qu’en plus d’améliorer le diabète, elles étaient capables d’améliorer le métabolisme des graisses, souvent perturbé chez le diabétique. En effet, l’accumulation de graisses dans le foie, est un phénomène courant chez le diabétique et a des effets délétères sur l’organe mais aussi sur le diabète en général. Le but de ce projet est d’identifier comment la molécule étudiée dans ce projet ciblant deux sites améliore le métabolisme à la fois du sucre et des graisses chez un modèle de souris obèse/diabétique et en particulier d’identifier quels sont les mécanismes d’action permettant ces améliorations au niveau du foie en essayant de discriminer l’implication de l’un ou l’autre site d’action. Pour permettre la mesure des paramètres pertinents pour cette étude, ce projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type 2 et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un site d’action et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi les effets. Les études préliminaires sur les effets de la molécule de cette étude semblent montrer une efficacité accrue en raison de sa capacité à cibler simultanément les deux sites d’action. L’intérêt d’un tel ciblage est que l’activation des deux sites entraîne des effets différents et complémentaires. Là où deux molécules étaient nécessaires, avec la molécule de notre étude une seule serait suffisante. De plus, d’un point de vue « pratique », les études montrent qu’une prise hebdomadaire chez l’Homme est suffisante pour permettre d’avoir les effets escomptés. Néanmoins, certains effets bénéfiques en relation avec le métabolisme lipidique et notamment avec un site d’action particulier restent à déterminer En résumé, le développement et la compréhension du mécanisme de la molécule de cette étude devrait permettre de contrôler plus efficacement le diabète de type 2 et d’apporter un confort au patient par l’administration d’une prise hebdomadaire unique de la molécule.

Procédures

Pour les tests nécessitant un gavage, les animaux vigils recevront un bolus unique par gavage. Cette manipulation prendra une dizaine de secondes. Pour chaque test nécessitant des mesures sur le sang, un prélèvement de sang se fera sur animaux vigiles et consistera : - en un prélèvement unique de 100 µl sur 2 minutes à J-4. - ou de 7 prélèvements de 30 secondes sur 2h à J+25 ou J+27 selon le test utilisée Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par injection dans la partie abdominale sur les animaux vigils, qui auront été habitués à leur manipulateur. Cette intervention prend moins de 10 secondes par animal. En ce qui concerne l’imagerie, les souris, vigiles, seront insérés dans un tube permettant la contention et la mesure indolore durera 3 minutes. Toutes les interventions citées ici exceptée la dernière se tiendront dans l’EU1, La technique d’imagerie se tiendra dans l’EU2.

Impact sur les animaux

En plus d’une perturbation du métabolisme, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer la capacité des animaux à se Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Les gavages nécessitent la contention de la souris, celui-ci peut provoquer un stress. De plus le gavage peut provoquer une fausse route. Les prélèvements de sang au cours des différents test de tolérance (glucose, insuline et lipides) nécessitent une petite incision à la queue qui peut provoquer une douleur légère et passagère. L’imagerie se fera par insertion de la souris dans un tunnel sombre qui permet la mesure. Cet environnement étroit et nouveau, peut entraîner un stress durant la mesure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux. Les animaux qui ne seront pas entrés dans le protocole de traitement, suite au régime serviront pour l’enseignement ou des mises au point techniques.

Remplacement

L’obésité et le diabète de type 2 sont des maladies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du sucre dans le sang, ce qui a des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences de cette pathologie, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. Par ailleurs l’utilisation de modèles cellulaires in vitro, issus des animaux obèses diabétiques nous permettra de mieux comprendre l’impact direct des traitements sur les différents organes et évitera l’utilisation d’un certain nombre d’animaux supplémentaires pour les études in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de tester beaucoup de doses, ni de multiplier les temps de traitements pour ce type de molécule. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante. En ce qui concerne le travail in vitro nous avons essayé d’optimiser le nombre pour permettre de travailler sur l’ensemble des tissus d’intérêts aux différentes doses et temps escomptés. Grâce à notre expérience de ce type de traitement et au nombre important d’animaux issu de la partie préliminaire (suite au régime et avant la division en groupe pour le traitement), nous pourrons limiter les tests à une partie seulement des souris : petit nombre d’animaux pour avoir des résultats significatifs. Notre expérience dans ces techniques in vitro nous permet de rationaliser ce nombre pour ne pas multiplier les conditions expérimentales.

Raffinement

Par expérience, nous appliquerons des conditions optimales à l’obtention du modèle en permettant de maintenir le bien-être nécessaire. Afin d’éviter le stress de l’isolement, les animaux seront plusieurs par cage (5 à 10). De plus, les animaux auront à disposition dans les cages des objets permettant l’enrichissement nécessaire : des tunnels en plastique permettront de diminuer le stress et de réduire l’ennui en stimulant l’activité et permettant un sentiment de sécurité. De plus de la « frisette »de carton, permettra aux animaux de créer un nid et de s’y réfugier, renforçant le bien-être et ce sentiment de sécurité. Les animaux auront libre accès à un biberon d’eau et des objets d’enrichissement de milieu seront placés dans les cages. Une partie de la nourriture pourra directement être placée dans la cage pour permettre aux souris obèses ayant des problèmes de mobilité d’avoir accès à la nourriture plus facilement. Les tunnels d’enrichissement seront aussi placés à proximité de la nourriture et l’eau pour permettre aux souris de monter sur ces objets et de leur donner un accès plus facile. Pour ce qui est de l’anesthésie, nous utiliserons un anesthésique chimique lors des procédures 2, 3 et 4 qui se tiendront dans l’EU 1 et un gaz anesthésiant lors de la procédure 1 qui se tiendra dans l’EU 2. Pour le transport des animaux entre les deux EU (fin de procédure 1), les souris seront mises dans une cage contenant du coton avec un couvercle filtrant et transportées dans l’EU2 qui se trouve en face du lieu où les souris sont hébergées (EU1). Le temps de trajet estimé est de moins de 5 minutes. Au cours de ce transport, les cages seront mises dans un sac noir afin de préserver les souris de l’environnement extérieur en termes de température et de stress. Nous veillerons aussi au points limites du projet engendré par le diabète de type 2 qui consiste principalement en une déshydratation, en veillant à réhydrater ces derniers en cas de besoin. Enfin, en ce qui concerne les traitements et prélèvements, le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaires au bon déroulement du prélèvement de sang servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des injections intrapéritonéales. Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie est le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Les animaux utilisés seront des jeunes males de 4 semaines. L’utilisation d’animaux jeunes se justifient par le fait qu’à cet âge, l’efficacité du régime est optimale car ils sont en pleine croissance. Ceci permet donc de limiter le temps de régime et donc le stress et les nuisances engendrées. Par conséquent, les traitements qui auront lieu par la suite seront réalisés sur ces mêmes souris devenus adultes (20 semaines)

Des cellules tumorales sont injectées directement dans le rein gauche de chaque souris après incision du dos, puis la tumeur est suivie deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie pendant un mois. 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever reins et poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie cette chirurgie de "mineure et quasi non-invasive", et décrit par ailleurs une incision douloureuse et inflammatoire, une perte de poids liée à la croissance de la tumeur et des difficultés respiratoires en cas de métastases pulmonaires. Cette dérive métastatique vers les poumons fait partie de ce qu'il attend du modèle.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) représente 80 pourcents des cas de cancer du rein. Malgré les avancées des dernières années en matière d’analyse transcriptomiques, la compréhension des mécanismes mis en jeu reste nécessaire pour raffiner les approches thérapeutiques mises en place. La récente découverte de l’expression intrinsèque augmentées des proteines du complément chez les cellules tumorales suggèrent des fonctions non-canoniques essentielles à la formation et l’agressivité des cellules tumorales rénales, et corrèlent notamment avec un pronostique défavorable chez les patients. Cependant, les mécanismes connectant les protéines du complément à la physiologie des cellules tumorales restent encore incompris. L’objectif de ce projet est de comprendre l’implication des proteines du complément intracellulaire exprimées par les cellules tumorales. Pour répondre à cet objectif, nous proposons de créer un modèle murin d’injection de cellules tumorales rénales contrôles ou invalidées pour des gènes du complément candidats, implantées directement au niveau du rein gauche de la souris. Cette méthode nécessitant une chirurgie cutanée mineure et quasi non-invasive à l’avantage de recréer l’environnement primaire des tumeurs, et dans lequel nous pouvons observer une progression tumorale similaire à celle observée chez l’homme. Ainsi, la mise en place de ce modèle orthotopique est pertinent pour l’analyse et l’étude de la fonction des proteines du complément intrinsèque aux tumeurs. De plus, il permettra d’étudier la tumeur dans son ensemble, à savoir la mise en place et les interactions existantes entre les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral. Ce projet permettra la compréhension des mécanismes qui sont mis en jeu et sera utile pour l’étude de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

La prévalence du cancer du rein atteint 3 pourcents parmi tous les types de cancer, avec la plus forte incidence observée dans les pays occidentaux. Parmi eux, le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) représente plus de 80 pourcents des cancers du rein. Malgré les récentes avancées dans la compréhension du système du complément, ses fonctions au niveau intracellulaire restent encore méconnues. De part son impact observé sur la progression tumorale des patients atteints de ccRCC, et de part la disponibilité modèle tumorale murin reproduisant la progression observée chez l’homme, les benefices attendus sont d’avoir une meilleure compréhension de l’impact des gènes du complément sur la progression tumorale. Les tumeurs récuperées serviront de matériel de départ pour différentes analyses qui permettront de déterminer les mécanismes cellullaires impliqués mis en jeu. Notamment, certaines données préliminaires suggèrent que le complément intracelllulaire agit différemment dans les cellules cancéreuses comparé aux cellules saines. Avec l’essor de récentes thérapeutiques ciblant l’action des protéines du complément, nous pourrons à terme tester des inhibiteurs validés chez l’homme dans d’autres pathologies, pour une redirection thérapeutique.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention est nécessaire afin d’injecter les cellules tumorales dans le rein gauche (moins de 10 minutes). Apres injection, la progression tumorale sera mesurée 2 fois par semaine par imagerie non invasive via la bioluminescence effectuée sous anesthésie générale (environ 5 minutes pendant 1 mois maximum). Le suivi de la progression tumorale jusqu’à la fin de l’experience durera 1 mois maximum.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales directement délivrées au niveau du rein requiert une chirurgie cutanée faiblement invasive nécessitant le recours à un traitment anesthésique et analgésique. L’incision réalisée au niveau du dos pourrait être source de douleur et d’inflammation. Les souris peuvent avoir faim ou soif après la chirurgie et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée en raison d’une réduction de la mobilité conduisant à une perte de poids. L’animal pourra présenter des signes de douleurs, de difficulté respiratoire en cas de métastases pulmonaires. Le suivi des animaux par imagerie impliquera des anesthésies fréquentes de courte durée pouvant générer un stress des animaux en raison des manipulations et un stress thermique du fait de l’anesthésie. L’ensemble de la procédure peut conduire à une perte de poids au cours du protocole, qui sera contrôlé par une pesée quotidienne des souris.

Devenir

Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les reins et le poumon dans le but d’analyser par des techniques de laboratoire les cellules tumorales et le profil des cellules immunitaires infiltrants la tumeur.

Remplacement

Nos expériences préliminaires de co-cultures in vitro suggèrent que l’abaltion des génes du complément intracellulaire chez la tumeur influence également la réponse immunitaire, améliorant la réponse anti tumorale. Cependant, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu (l’ensemble des cellules immunitaires, la vascularisation…). En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et les cellules immunitaires infiltrant la tumeur dans sa globalité. Les tumeurs seront ensuite collectées et analysées pour comprendre le comportement des cellules tumorales in vivo ainsi que les cellules du système immunitaire infiltrantes. Des experiences supplémentaires in vitro seront utilisées pour corroborer les observations faites in vivo.

Réduction

Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 16 souris par groupe. Nous utiliserons des techniques d'imagerie non invasive pour mesurer le volume tumoral et pour l’apparition des métastases aux cours du temps. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 288. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.

Raffinement

Le raffinement implique l’optimisation de l’expérimentation afin de réduire et ou supprimer la détresse et la douleur des animaux. Afin de supprimer le stress des souris liés à un changement d’hébergement, nous respecterons le délai réglementaire de 8 jours minimum entre l’arrivée des animaux et la première manipulation de ces derniers dans le cadre de l’expérimentation. De plus, les souris seront hébergées dans des cages avec un milieu enrichi et limitées à 5 pour s’assurer d’un espace vital suffisant pour diminuer le stress. Au démarrage de la procédure, les dispositions nécessaires seront prises pour supprimer la douleur pendant l’instillation de la tumeur et soulager l’animal en phase de récupération. Ainsi, les souris seront sous anesthésie complète, combiné à un analgésique lors de l’acte chirurgical. La potentielle hypothermie induite par un endormissement prolongé sera prévenue par le maintien de la température de la souris à 37 degrés Celcius à l’aide d’un tapis chauffant. La micro-incision réalisée pendant l’opération nécessitera l’application de colle tissulaire pour permettre une cicatrisation complète. Au réveil, de la nourriture liquide sera placé au sol de la cage pour faciliter leur alimentation et leur ré-hydratation post-opératoire. Le temps estimé de l’opération est de moins de 10 minutes. La surveillance s’effectuera par le manipulateur à chaque mesure de suivi par imagerie non invasive des cellules tumorals par bioluminescence, 2 fois par semaine, en complément des surveillances quotidiennes opérées par le personnel de l’animalerie. Lors des mesures de la progression tumorale par imagerie, les souris seront endormies par anesthésie gazeuse permettant un réveil rapide dès l’arrêt de la procédure. Afin de prévenir la baisse de température corporelle due à un endormissement prolongé pendant les acquisitions d’images, les souris seront placées sur un tapis chauffant à 37 degrés Celcius. Le temps de cette procédure est estimé à 5 minutes

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences dans un systeme in vivo complexe et s’intègre dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Le modèle utilisé ici, récemment décrit dans la litterature, combine une approche rapide et peu invasive tout en récapitulant au mieux le tableau clinique observé chez l’homme avec l’implantation d’une tumeur primaire rénale et l’observation d’une dérive métastatique pulmonaire. Nous utilisons des souris couramment utilisées pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever foie et rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral porteur du génome de l'hépatite B leur est injecté dans une veine, puis, selon les groupes, elles reçoivent deux fois par semaine pendant quatre semaines un produit provoquant une fibrose du foie, une injection unique déclenchant un cancer du foie, ou des anticorps détruisant une partie de leurs cellules immunitaires. Certaines subissent ces injections dès quinze jours de vie. Le porteur écrit que ces atteintes hépatiques entraînent des nuisances "inexistantes ou minimes", et affirme que le modèle murin est "indispensable" puisque aucun modèle in vitro, même un organoïde multicellulaire, ne reproduit les échanges entre le foie et le système immunitaire.

Objectifs

L'infection par le Virus de l'hépatite B (VHB) a touché plus d'un milliard de personnes dans le monde et est responsable d'infection chronique pour 250 millions de personnes, aujourd'hui. Ces infections chroniques peuvent conduire à la cirrhose et au cancer du foie. Environ un million de personnes décèdent tous les ans de cette infection virale. Il est donc essentiel de comprendre cette maladie virale afin de développer de nouvelles approches théraputiques. Notre projet de recherche basé sur nos précédents travaux, porte sur l'impact de l'expression d'un des gènes du VHB sur la pathogenèse hépatique et notamment en modulant la réponse immunitaire. Nous souhaitons évaluer le rôle de ce gène viral et les mécansimes associés en utilisant des virus complets ou délétés sur ce gène. Le modèle murin est indispensable pour évaluer les nombreuses interactions existantes entre les cellules du foie infectées et les cellules de l'environnement hépatique dont les cellules immunologiques. Cependant, le modèle murin n'étant pas infectable par le VHB. C'est pourquoi, nous avons généré des vecteurs viraux modifiés génétiquement qui sont d'une part, capables d'infecter le foie des souris et d'autre part, d'exprimer soit le génome complet soit un génome partiel du VHB. Ces vecteurs viraux et les modèles murins nous permettront ainsi d'évaluer l'impact d'une des protéines virales sur la pathogenèse hépatique et de déterminer le rôle de la réponse immunitaire dans cette progression.

Bénéfices attendus

Nos données acquises nous éclairerons sur la pathogenèse hépatique et le risque de développement du cancer du foie associé à une infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Elles pourraient conduire à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant l'infection par le VHB et des complications hépatiques associées chez les patients infectés par le VHB.

Procédures

Le transfert du génome du virus de l'hépatite B (VHB) sera réalisé après anesthésie (par injection pendant 5-10 secondes par voie intra-péritonéale) sur l'ensemble des souris incluses. Ce transfert sera réalisé par une unique injection par voie intra-veineuse (injection de 5-10 secondes). Parmi ces animaux, un groupe de souris vigiles sera soumis à une injection intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 4 semaines d'un réactif générant une fibrose hépatique. Un autre groupe également vigile sera soumis à une injection unique intra-péritonéale (5 à 10 secondes) d'un réactif générant un cancer du foie. Un troisième groupe de souris vigile aura été pré-immunisé par une injection intra-veineuse unique (de 5 à 10 secondes). Un dernier groupe de souris vigiles subira une déplétion de sous-population de cellules immunitaires par injections d'anticorps par voie intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 1 à 2 semaines. Au cours de cette étude, nous serons également amenés à prélever du sang (1 à 5 minutes). Le nombre de prélèvement de sang varie de 1 à 2 selon le temps d'expérimentation (de 7 semaines à 6 mois) de chaque procédure. Les animaux seront anesthésiés avant ce prélèvement de sang. A la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L'anesthésie des animaux pourrait engendrer un stress thermique. L’induction des pathologies hépatiques sont bien connues et ont montré des nuisances légères ou modérées de l'atteinte hépatique. La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et pourraient conduire à une douleur légère de courte durée au site d'injection au moment du geste. L'administration de différentes drogues pourrait induire une inflammation, une fibrose et un cancer hépatique. Néanmoins, compte tenu des court temps expérimentaux effectués et/ou du faible impact de certaines des drogues utilisées, les nuisances cliniques seront inexistantes ou minimes. Ils pourraient éventuellement générer quelques troubles digestifs transitoires et rapidement réversibles. Les prélèvements sanguins pourraient être source de stress au moment de l’anesthésie et conduire à des saignements/hématomes.

Devenir

Pour l’ensemble des animaux inclus dans ce projet, l'euthanasie est requise afin de prélever des échantillons biologiques (foie, rate,...) pour permettre de réaliser de nombreuses analyses expérimentales post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) et, ainsi, répondre à la question scientifique posée. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

De précédents résultats effectués sur des hépatocytes primaires humains (PHH) in vitro suggèrent un rôle du VHB dans le recrutement et l'activation des différents intervenants du système immunitaire intra-hépatique. La mise en place d'un modèle in vitro récapitulant la réponse immunitaire innée et acquise, le recrutement des cellules de la moelle osseuse, ainsi que les interactions entre le foie et le système digestif (interactions essentielles à la pathogenèse hépatique) n'est pas réalisable à ce jour in vitro, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces travaux dans un modèle in vivo afin étudier l'impact du VHB sur le recrutement et l'activation des différents acteurs du système immunitaire, par interaction directe et/ou indirecte avec les hépatocytes infectés.

Réduction

La réduction de l'échantillonnage d'animaux est liée à l'approche statistique qui nécessite 30 souris par condition afin d'évaluer une différence significative entre les groupes par des tests statistiques. Le nombre total d'animaux sera de 1050 souris. Ce nombre a été évalué selon un calcul de puissance adapté en prenant la somme de toutes les expérimentations prévues dans ce projet de recherche. A l'issue de ces expérimentations, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate...) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris et ainsi de répondre aux questions scientifiques soulevées.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin syngénique (de génome identique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons étudier ici. Les animaux nés dans notre établissement seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie pour l'initiation du cancer du foie, soit au moment ou quelques semaines après le sevrage pour les autres types d'expérimentation. Les souris adultes provenant de notre fournisseur seront de même fond génétique que les souris provenant de notre établissement. Ces souris seront acclimatées à notre environnement expérimental au moins une semaine avant inclusion dans une de nos procédures. Ces souris seront identifiées à l'inclusion dans une de nos procédures.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié soumise à un régime gras pendant dix-huit mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe 48 heures seul en cage de mesure de la dépense énergétique, subit sept pesées, une injection, un gavage et trois prélèvements, puis jusqu'à six tests évaluant l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire et les capacités sensorimotrices. La faim liée à la mise à jeun, la peur pendant les manipulations et l'isolement figurent parmi les nuisances déclarées. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'animal entier" et retient la souris pour la facilité d'y invalider des gènes, les corps servant ensuite aux analyses histologiques.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d'évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal. La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux.La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, à l'occasion des prélèvements ou de leur isolement dans certaines procédures. La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement. D'autres nuisances sont la douleur à l'injection, lors des prélèvements, ou à l'occasion de certains tests comportementaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire, - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.

Sept minutes au maximum entre l'anesthésie, l'ouverture de l'abdomen pour y glisser un émetteur, le prélèvement d'un fragment de nageoire et la remise à l'eau : 490 poissons, dont 30 loups de mer, sont capturés à l'hameçon puis opérés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous relâchés là où ils ont été pris. Le suivi de leurs déplacements doit servir à harmoniser la gestion des aires marines protégées entre la France et l'Espagne. Les espèces retenues le sont pour le volume et la valeur commerciale de leur exploitation, et aucune n'est ciblée précisément, la liste couvrant jusqu'à 28 espèces possibles. Le chiffre de 490 marques ne repose sur aucun calcul, le porteur indiquant qu'aucune approche statistique n'a été réalisée et retenant 20 individus par espèce d'après la littérature.

Objectifs

Le littoral pyrénéen abrite une grande diversité d’espèces et d’habitats à forte valeur économique et patrimoniale. Pour préserver cette biodiversité et ses services écosystémiques (pêche, tourisme, loisirs), des réserves marines et des réglementations ont été mises en place. Cependant, ces mesures restent insuffisantes, car elles ne considèrent pas la région comme une unité écologique, ce qui entraîne la surexploitation de certaines espèces. Grâce à la télémétrie acoustique (technologie composée d’émetteurs acoustiques implantés dans le ventre des poissons après un acte chirurgical sous anesthésie, et d’un réseau de récepteurs acoustiques permettant de suivre le déplacement de ces poissons), le projet vise à améliorer la conservation en intégrant les habitats essentiels et en suivant les déplacements des poissons. L’étude inclura de nouveaux habitats (canyons sous-marins, estuaires, récifs artificiels) et le suivi d’espèces emblématiques comme les requins et les raies. Un diagnostic de l’état de conservation des espèces commerciales sera établi, avec une attention particulière aux stades critiques de leur cycle de vie (reproduction, juvéniles). Les poissons marqués et relâchés au plus vite après l’implantation de l’émetteur acoustique permettront d’identifier leurs déplacements et les corridors écologiques qu’ils empruntent. Ces données seront essentielles pour adapter les réglementations et les mesures de gestion à l’échelle régionale et transfrontalière.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’améliorer les connaissances sur le déplacement, la biologie et le comportement des populations de poissons. A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie du mouvement des espèces suivies et de mettre en place une conservation et une gestion harmonisée entre les Aires Marines Protégées de deux pays frontaliers.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : 1) une capture par des pêcheurs professionnels affrétés pour cette opération (capture à la palangre dérivante de surface, capture à la canne et au leurre artificiel) avec utilisation d'hameçons sans ardillon pour limiter au maximum tout stress et/ou traumatisme (durée de capture et blessure), 2) un acte chirurgical sous anesthésie pour insérer un émetteur dans la cavité abdominale ou sur le dos du poisson, et 3) un prélèvement d'un petit fragment de nageoire caudale ou pectorale. L'implantation de la marque et le prélèvement du petit fragment de nageoire ne se fait qu'une seule fois par animal ; le temps maximum pour l'anesthésie, l'acte chirurgical, le prélèvement de nageoire, le réveil et le relâcher est estimé à 7 mn maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus concernent : 1) un stress dû à la capture, minimisé au maximum par l'utilisation d'hameçon sans ardillon, 2) une douleur modérée due à l’implantation d'une marque (acte chirurgical sous anesthésie) dans la cavité abdominale du poisson (à son réveil) ainsi que le prélèvement d'un petit fragment de nageoire caudale qui peut générer une très légère nuisance supplémentaire pour le poisson mais n’impacte en rien ses capacités natatoires.

Devenir

Les individus prélevés sont relâchés à l’endroit où ils ont été capturés afin de limiter les perturbations comportementales. Tous les individus seront relâchés directement après l’acte chirurgical une fois correctement réveillés.

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser les mouvements individuels en milieu naturel, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. L’apport de la télémétrie acoustique (détection de la présence de poissons marqués à proximité d’un récepteur) devrait permettre l’amélioration des connaissances sur les habitats occupés par les espèces et leurs mouvements, ce qui permettra à terme d’adapter leur gestion de manière cohérente entre la France et l’Espagne.

Réduction

Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En l’absence de connaissance sur le niveau de fréquentation spécifique du site ciblé par cette étude, le nombre de 20 individus par espèce a été choisi afin de capturer la majorité des comportements spatiaux à l’échelle d’une zone spécifique. Aucune approche statistique n’a été réalisée afin de définir le nombre d’individus marqués en raison de l’étendue de la zone d’étude (réseau régional à l’échelle de la façade Méditerranéenne France-Espagne) et de la forte mobilité spatiale des espèces concernées en zone hauturière. Mais, en se basant sur la biomasse de ces espèces pêchées en Méditerranée (plusieurs dizaines à centaines de tonnes débarquées par an), l’impact de ce projet sur les populations paraît extrêmement limité. Enfin, en prenant en compte les contraintes de la télémétrie acoustique (ex : probabilité de détection) et la littérature existante, un nombre minimum de 20 individus par espèce est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques associées aux populations concernées.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors du marquage, incluant la capture (utilisation d’un engin sélectif en direct, l’hameçon sans ardillon, pour limiter au maximum toute blessure et le temps où l’animal est en phase « capture »), ainsi que des procédures d’anesthésie optimales quand c’est possible (sinon utilisation de l’immobilité tonique et anesthésiant local – voir plus bas) durant les phases pré-opératoire, opératoire et post opératoire. Les individus seront surveillés en permanence de manière régulière avec une attention particulière à la respiration branchiale afin de s’assurer de la bonne oxygénation des animaux. Les individus seront retirés de la procédure dès que les points limites seront atteints. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies).

Choix des espèces

Le nombre d’espèces capturables sur la zone d’étude étant extrêmement varié, il est proposé dans cette étude de ne pas cibler d’espèces particulières, mais de (1) fournir une liste d’espèces potentielles, (2) limiter le nombre d’individus rentrant dans une procédure à N= 20 et (3) de limiter le nombre de marques déployées à N= 490, soit un équivalent de 28 espèces à N=20 ou N=10 individus par espèce si celle-ci est étudiée dans d’autres projets de télémétrie acoustique dans le Golfe du Lion. Les espèces de cette liste sont des espèces de premier plan en Méditerranée française, tant pour l'importance de leur exploitation (volume) que pour leur valeur commerciale (€). De nombreux aspects du cycle de vie de ces espèces restent inconnus, limitant la capacité des scientifiques à fournir un appui aux gestionnaires pour leur gestion. Pour la majorité de ces espèces, l’acquisition de connaissances sur leur dynamique spatiale est une première étape primordiale pour améliorer leur gestion. La maturité des poissons et des Élasmobranches marins (requins et raies) est très variable d’une espèce à l’autre et est déterminée généralement à partir de la taille. Afin de limiter l’impact sur la population et le choix du stade de développement (mature ou immature) de l’individu susceptible d’être choisi (nécessitant donc la capture, la mesure puis soit le relâcher, soit l’inclusion dans une procédure), des individus matures et immatures seront utilisés dans cette expérimentation. La taille de l’hameçon utilisé permettra juste de limiter la capture d’individus trop petits ou trop gros.