Oncologie

Une perte de poids supérieure à 15 %, un dos voûté, des poils hérissés ou une déshydratation déclenchent la mise à mort. 123 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer l'inflammation de leur colon et de leur intestin. Gavées une fois avec un microbiote humain, sain ou prélevé chez des personnes atteintes de rectocolite hémorragique, elles reçoivent ensuite pendant quatre semaines une alimentation additionnée de microplastiques, une partie recevant en fin d'étude une molécule pro-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant cinq jours. Le porteur attend des signes d'inflammation digestive, une perte de poids et des saignements, et compte extrapoler des données fécales de souris une estimation de l'exposition alimentaire humaine aux microplastiques.

Objectifs

Les humains sont exposés aux Microplastiques (MP) tous les jours. Ces particules (1-5000 μm) sont omniprésentes dans nos aliments, y compris l'eau et les boissons, et l'air. Les MP sont détectés dans les selles humaines de la naissance à l'âge adulte : des études pilotes ont en effet détecté des MP dans le méconium et dans les matières fécales d'adultes sains. Des résultats préliminaires et plusieurs études ont montré que l'ingestion de MP favorise l'inflammation intestinale et le déséquilibre de la flore intestinale chez la souris. La rectocolite hémorragique (RCH) est une maladie intestinale inflammatoire persistante causée par des facteurs génétiques et environnementaux. Notre hypothèse est que les microplastiques (MP) sont des éléments responsables de la RCH. Les principaux objectifs du projet lié à cette saisine sont : - Évaluer les effets des MP sur l'apparition de l'inflammation (effets sur la réponse immunitaire, la perméabilité intestinale, le microbiote fécal) en tant que déclencheur favorisant la colite sur un modèle de souris colonisées par un microbiote humain sain ou un microbiote issu de patient avec RCH, et qui seront exposées à un régime contenant des MP via l’alimentation. - Etant donné que la fragmentation des MP entraîne la génération de nanoplastiques (NP, d'une taille inférieure à 1 μm), caractériser les MP et des NP dans les matières fécales de souris grâce à des méthodes analytiques. Le modèle de souris à microbiote humanisé à l’avantage d’être plus proche du microbiote humain que les rongeurs conventionnels et donc faciliter l’extrapolation future des résultats de cette étude à l’Homme.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet serviront au profit de la santé humaine, afin de mieux comprendre le rôle et l’impact de contaminants environnementaux comme les MP sur l’intestin et le microbiote intestinal. Plus précisément, ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de leur impact sur l'équilibre intestinal notamment dans la rectocolite hémorragique. La caractérisation des MP dans les fèces de souris à microbiote humanisé permettra de comparer les caractéristiques des MP ingérées avec les caractéristiques des MP fécales, et de calculer la proportion de MP ingérées par rapport à celle des MP fécales. En appliquant ce facteur aux données quantifiées dans des échantillons de selles humaines, nous serons en mesure d'estimer les quantités d'exposition alimentaire aux MP dans la population adulte. Ceci est essentiel pour une évaluation précise des risques pour la santé. De plus, les différences que nous identifierons entre les patients atteints de colite ulcéreuse et les sujets sains permettront de mettre en évidence les MP les plus problématiques et donc ceux à bannir en priorité de notre alimentation.

Procédures

Les animaux ne subiront qu’un seul gavage qui ne durera qu’1 min maximum. Des échantillons de matières fécales (1 à 2 crottes) seront prélevés chez les souris environ 1 fois par semaine depuis leur arrivée jusqu'à la fin de l’étude. En fin d'étude, une anesthésie générale (10 minutes) sera réalisée pour prélever du sang (1 prise de sang). Une partie des animaux sera traités en fin d'étude (5 jours) avec une molécule pro-inflammatoire mélangée à l'eau de boisson (pas de gavage) pour s'assurer de l'apparition d'une colite.

Impact sur les animaux

Le gavage qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté, afin de s’assurer de la sécurité des animaux et de réduire l’inconfort lors de la contention. En outre une phase d’entrainement sur 3 souris conventionnelles est prévue en amont afin de s’assurer du geste dans les conditions d’un isolateur. Le gavage sera réalisé sur animaux vigiles (durée quelques secondes) et ne sera réalisé qu’une seule fois pour l’inoculation du microbiote d’origine humaine. L’administration des microparticules de plastique sera faite via l’alimentation pendant toute la durée du protocole (soit 4 semaines) après inoculation du microbiote (sauf pour les animaux contrôles). Elle ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. Les animaux avec un microbiote issus de patients atteints de recto-colite et les animaux traités avec la molécule pro-inflammatoire pourront présenter des signes d’inflammation du système digestif, avec potentiellement une perte de poids pendant la durée du traitement et également avoir des saignements. Cependant, la dose administrée et la durée de cette administration sont tout à fait conforme avec ce qui est fait dans la littérature scientifique. C’est un modèle maîtrisé depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement est aussi très dépendante de l’environnement de l’animal mais que les opérateurs sauront rapidement repérer les symptômes afin de limiter la souffrance des animaux.

Devenir

En fin de procédure, les animaux sont mis à mort afin de mesurer de nombreux paramètres d'intensité de l'inflammation colique ou intestinale, afin de démontrer l'intensité de la capacité des micro et nanoplastiques à aggraver l'inflammation. Les organes des animaux conventionnels renforceront l'étude comparative.

Remplacement

A ce jour, les maladies intestinales ne peuvent pas être entièrement reproduites par des modèles cellulaires. En effet, la physiologie intestinale est complexe car elle implique plusieurs systèmes distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et la flore intestinale. Concernant les polluants environnementaux, malgré le développement de méthodes in vitro de plus en plus intégratives, il reste nécessaire d'évaluer leurs effets in vivo, afin d'intégrer l'ensemble des processus intervenant dans l'effet d'un polluant ingéré et dans la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, à savoir la digestion, le microbiote, le système immunitaire muqueux et systémique.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre de souris par groupe, à savoir 20 souris (10 mâles et 10 femelles) réparties dans 2 groupes, eux-mêmes subdivisés en 3 sous-groupes soit un total de 20 x 2 x 3 = 120 souris nécessaires à cette étude pour obtenir la puissance statistique suffisante en tenant compte de la variabilité des données liés à l’analyse du microbiote, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux. L’impact du sexe souvent négligé dans les études sera là bien pris en compte avec une répartition égale entre mâles et femelles. Pour le nombre de souris conventionnelles, il a été réduit au minimum afin de permettre un entrainement sur le geste technique pour l'ensemble des applicateurs impliqués au projet en condition d’isolateur.

Raffinement

Le transport des animaux axéniques se fera grâce à un transporteur agréé assurant la bonne condition des animaux. A l’arrivée dans nos locaux, les animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux (mâles/femelles séparés) et trois pour les souris conventionnelles, dans des cages à l’intérieur d’un isolateur avec une ventilation adéquate. Les animaux auront à disposition litière de bois, de hamac pour se cacher et grimper, des tunnels suspendus et autres matériaux d’enrichissement tout au long du protocole. Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée. Le point limite est fixé selon un score défini au préalable et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids de plus de 15%, déshydratation, yeux et abdomen creux) suffisamment prédictifs et spécifiques à ce projet. Les symptômes sévères sont repérés rapidement afin de limiter la souffrance des animaux et intervenir sans délai. En fin de protocole, les animaux recevrons une anesthésie générale gazeuse afin de prélever le sang et suite à la mise à mort, les organes seront prélevés pour permettre des analyses biologiques. Cette mise à mort se fera en dehors de l’isolateur, dans une pièce isolée loin des autres souris.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix dans l’étude des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Le modèle choisi est très largement publié, en raison de sa simplicité d’administration (dans l’alimentation) de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée (pour étudier le processus inflammatoire et de « récupération »). Concernant l’axénie, il s’agit d’un modèle reconnu pour l’étude du microbiote humain. Enfin la 1ere partie de ce projet (qui ne fait pas l’objet de cette saisine) a porté sur des souris conventionnelles (même race), il s’agit donc d’une continuité dans le modèle animal utilisé. Les souris utilisées auront 5 semaines à l’arrivée puis 8 à 9 semaines lors du début du protocole. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte », ce qui correspond aux besoins du projet, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin touchant majoritairement de jeunes adultes.

Tuées à la fin des procédures pour l'analyse de marqueurs biologiques et des vérifications anatomiques, 2 314 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une ou deux interventions chirurgicales de quarante minutes à deux heures sous anesthésie, toutes passent des tests attentionnels et cognitifs, certains quotidiens pendant un mois à raison de trente minutes par jour, et certaines apprennent à porter une fibre d'imagerie fixée sur la tête. Le porteur reconnaît qu'une tâche comportementale est désagréable et stressante, qu'une autre suppose un rationnement alimentaire, et que la fibre contraint les mouvements. Il justifie l'ensemble en indiquant que les études cliniques sont difficilement réalisables sur des personnes autistes, en raison de leur fragilité et de leur incapacité à supporter les contraintes de l'imagerie cérébrale.

Objectifs

Les déficits attentionnels affectent une large proportion des autistes (jusqu’à 80%) entraînant des problèmes importants dans la vie quotidienne, tels que des difficultés à sélectionner les informations sensorielles appropriées. Cela peut conduire à une surcharge cognitive et ou des problèmes de comportement. La coexistence des problèmes attentionnels et de l'autisme est mal comprise. Une meilleure connaissance des mécanismes neurobiologiques sous-jacents à ces difficultés pourrait améliorer la prise en charge des personnes concernées en affinant les approches thérapeutiques visant à atténuer ces symptômes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention ainsi qu’une meilleure compréhension de l’implication des déficits attentionnels dans un modèle murin d’autisme. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.

Procédures

Tous les animaux effectuent les tests comportementaux ayant pour objectif de tester leurs capacités attentionnelles et cognitives. Certaines tests seront réalisés quotidiennement (~30min par jour) pendant 1 mois. D'autres tests seront plus courts (2 séances de 30 min et 15 min sur deux jours). Certains animaux subissent une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie (durée 40 min à 2h). Certaines animaux reçoivent un traitement pharmacologique (non-toxique) sur 1 jour.

Impact sur les animaux

Les interventions chirurgicales entrainent un risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids. Une des tâche comportementales est légèrement désagréable et stressante pour l'animal; l'autre necessiterait un rationnement au niveau de la nourriture, qui peut est légèrement stressant pour les animaux. Les animaux seront entraînés à porter une fibre d'imagerie sur leur tête, ce qui peut représenter une contrainte pour le mouvement de l'animal. Le produit injecté pourrait avoir un effet léger sur le comportement de l’animal, sa perception ou son niveau de vigilance ou acrtivité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.

Remplacement

Le projet se concentre sur l’exploration des changements comportementaux et biologiques chez un modèle de maladies neurodéveloppementales. Les expériences proposées nécessitent l’utilisation d’un modèle animal vivant et ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro ou in silico. Les études cliniques sont difficilement réalisables en raison de la fragilité de la population concernée et de leur incapacité à supporter les contraintes requises pour l’imagerie cérébrale. De plus, des approches invasives sont nécessaires pour répondre à nos questions scientifiques et ne peuvent pas être réalisées chez une population clinique. Les structures cérébrales ciblées par notre étude sont généralement bien conservées chez différentes espèces de mammifères, ce qui suggère une similitude fonctionnelle entre les rongeurs et les humains. L’utilisation de modèles animaux présentant une sensibilité neuronale plus faible (tels que les invertébrés ou les poissons) ne convient pas à notre projet, car ces organismes ne possèdent ni la structure cérébrale ni les capacités comportementales ciblées par les objectifs de notre étude.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de manière à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale rigoureuse de notre projet permettra de mettre en place une stratégie de réduction optimale du nombre d’animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Notre étude intègre également plusieurs expériences pilotes, permettant d’évaluer la faisabilité technique de certains aspects du projet ainsi que son raffinement. Les données recueillies seront analysées à l’aide de tests statistiques appropriés, permettant une extraction maximale d’informations et assurant des analyses solides. Notre stratégie expérimentale permet également une analyse précoce des données, étape par étape, dans le but de réduire le nombre d’expériences ou de réévaluer notre approche si cela s’avère pertinent ou possible.

Raffinement

Le bien-être animal est essentiel pour garantir la réussite de notre projet. Nous avons réfléchi à notre projet afin d’intégrer plusieurs mesures de raffinement, notamment : i) Vérification de l’état de l’animal avant et après chaque expérience ou manipulation. ii) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d’une crème ophtalmique et d’un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle de l’animal ; utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. iii) Application de soins post-opératoires préventifs. iv) Manipulation quotidienne des animaux avant les séances comportementales afin de réduire le niveau de stress. v) Utilisation de techniques de manipulation adaptées pour minimiser le stress lié aux manipulations. vi) Habituation progressive à la salle de comportement. vii) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. viii) Mise en place de mécanismes d’intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de ressources éducatives en bien-être animal et sollicitation d’experts du domaine.

Choix des espèces

Choix de l'espèce : Les expériences proposées pour cette étude nécessitent des mesures comportementales et neurophysiologiques (impliquent des interventions invasives). Nous avons donc besoin d’un modèle animale complexe et intacte, adapté à la réalisation des tests cognitifs, possèdant la structure cérébrale ciblée par notre étude, pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique. De plus, il est essentiel que l'espèce soit susceptible d'accepter des modifications génétiques pour reproduire les conditions génétiques humaines. Idéalement, le modèle devrait être bien validé par des études antérieures en tant que représentation fiable et éprouvée pour l'étude de l'autisme. La souris répond à tous ces critères et offre la cohérence avec les recherches précédemment menées au sein de notre équipe. Les modèles animaux avec une sensibilité neurophysiologique moindre, tels que les invertébrés ou les poissons, ne sont pas appropriés pour notre projet, car les approches techniques que nous envisageons ne peuvent pas être appliquées à ces organismes. De plus, les tests comportementaux chez ces animaux sont souvent trop limités pour modéliser de manière adéquate des maladies complexes comme l'autisme. Stade de développement : 6 à 8 semaines au début des procédures (c.a.d. l'acte chirurgical) et 10 à 12 semaines (jeunes adultes) au moment du test comportemental. Justification : Ce stade de développement a été choisi pour être en cohérence avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe, utilisant le même modèle transgénique. En effet, cette étude s'inscrit dans la continuité de notre programme de recherche, et il est très important de maintenir les mêmes conditions expérimentales afin de garantir la reproductibilité et la fiabilité de nos expériences, tout en facilitant la comparabilité de nos données avec celles obtenues précédemment. L'âge de 10 à 12 semaines a été choisi car il correspond au moment de maturité des circuits neuronaux ciblés. Bien que la condition étudiée se manifeste à tous les stades de la vie, une intervention thérapeutique sera plus efficace si elle est effectuée de manière la plus précoce possible. C'est pour ces raisons que nous utilisons des jeunes adultes.

Pour produire de nouveaux mélanomes chez la souris et y tester des molécules candidates, 4 833 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Des nouveau-nés reçoivent trois jours de suite une injection intra-gastrique d'un agent chimique déclenchant des mutations, d'autres souris reçoivent des cellules tumorales par voie sous-cutanée ou intraveineuse, d'autres encore se font implanter un fragment de tumeur sous la peau entre les omoplates, la plaie étant refermée par sutures ou agrafes. Le porteur décrit les tumeurs cutanées primaires comme n'engendrant "aucune douleur estimable" sauf ulcération, et réserve la douleur aux mélanomes métastatiques. Les expérimentations s'arrêtent à l'atteinte d'un point limite évalué par grille de score, la croissance tumorale étant suivie au pied à coulisse, par photographie ou par imagerie.

Objectifs

Les mélanocytes, cellules pigmentées de l’épiderme, synthétisent de la mélanine afin de protéger notre organisme des rayonnements ultra-violet (UV) du soleil. Mais quand ces mélanocytes sont endommagés, ils peuvent se transformer en mélanome. Le mélanome est le cancer de la peau le plus rare mais aussi le plus grave car plus susceptible d'envahir les tissus voisins et de se propager à d'autres parties du corps. La plupart des décès dus au cancer de la peau sont causés par le mélanome. Il existe actuellement deux types de thérapies principales (thérapie ciblée et immunothérapie) dans le traitement contre le mélanome, malheureusement les patients rechutent dans 30-50% des cas en raison du développement de résistance à leur traitement. Des connaissances générées à partir de biopsies de mélanomes humains, de lignées de mélanomes humains et de mélanocytes humains, nous permettent de réaliser des tests in silico, in vitro et in cellulo. Notre équipe a identifié des mécanismes qui seraient impliqués dans l’initiation et la progression des mélanomes, ainsi que des molécules ciblant ces mécanismes Néanmoins, malgré des résultats intéressants, il est possible que les modèles cellulaires, même très sophistiqués, ne reproduisent pas entièrement les évènements qui se produisent lors de la transformation des mélanocytes en mélanome ainsi que lors du processus de résistance aux traitements. L'expérimentation dans des modèles de cancer chez la souris est maintenant nécessire pour tester le potentiel thérapeutique de ces molécules. L’objectif général de ce projet est de produire de nouveaux mélanomes murins afin de mieux comprendre ces mécanismes dans l’initiation et la progression tumorale et de tester ces molécules nouvellement identfiiées à potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Il y a encore 20 ans, les patients atteints de mélanome cutanés métastatiques mouraient rapidement après le diagnostic. Grâce à des approches combinées impliquant notamment la génétique, la signalisation cellulaire, ainsi que l’utilisation de modèles murins et de lignées de cellules de mélanomes, il est aujourd’hui possible de traiter un grand nombre de patients atteints de ce cancer. Bien que des progrès considérables aient été réalisés, notamment avec des traitements augmentant la survie à 5 ans, seule une faible proportion des patients bénéficie d’une guérison définitive. Ce succès limité s’explique par l’apparition des résistances d’origine génétique, épigénétique (processus modulant l’expression des gènes sans altérer la séquence d’ADN) et cellulaire. Il est donc indispensable de poursuivre ces recherches pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, identifier de nouvelles cibles thérapeutique et développer des approches innovantes permettant d’améliorer durablement le pronostic des patients. La première partie de cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de certaines gènes/protéines dans l’initiation des mélanomes à partir de mélanocytes, mais aussi leur rôle potentiel dans la progression des mélanomes et l’apparition de métastases. La seconde partie de l’étude se concentrera sur l’émergence de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les protéines étudiées dans la première partie de l’étude lors des différents processus, de l’initiation à la progression des mélanomes.

Procédures

Un lot d’animaux sera traité à la naissance par injection intra-gastrique 3 jours consécutifs (J1-J2-J3) par un agent chimique permettant l’expression de mutations spécifiques. Un autre lot d’animaux sera injecté avec de nouvelles molécules (la voie et la fréquence d’injection seront déterminées en fonction de la molécule) afin de déterminer la dose à utiliser en traitement Dans un autre lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées en sous-cutanées ou en intra-veineuse aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience). Les animaux seront ensuite traités par les nouvelles molécules (voie et fréquence d’administration déterminées lors de l’expérience précédente). Pour certains de ces animaux, un suivi par imagerie sera réalisé afin de suivre la croissance tumorale interne. Pour cela, un marqueur sera injecté aux souris puis elles seront endormies par anesthésie gazeuse et placé dans l’imageur. Cela est réalisé une à deux fois par semaine. Dans un autre lot d’animaux, des fragments de tumeurs seront implantés aux souris. Le plan cutané des animaux sera ouvert sous anesthésie gazeuse et analgésie, puis le fragment sera positionné entre les omoplates et le plan cutané sera refermé soit par sutures soit à l’aide d’agrafes. Les animaux seront ensuite traités par les nouvelles molécules (voie et fréquence d’administration déterminées lors de l’expérience précédente).

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement modifiés développeront des mélanomes cutanés pouvant provoquer des irritations. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (douleur légère de courte durée). Suite à l’injection du de traitement, un retard de croissance peut être observé le premier mois de vie qui est compensé très rapidement sans séquelle. Les animaux greffés avec des cellules tumorales/ou des fragments de tumeurs par chirurgie développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de la chirurgie sont celles liées à l’ouverture du plan cutané (douleur de faible intensité). Aucune douleur de l’animal n’est observée lorsque le renouvellement des mélanocytes n’a pas lieu ; les souris deviennent blanches et ne subissent aucun ostracisme de la part de leurs congènères. Les seules douleurs qui sont possibles peuvent avoir lieu lorsque les souris développent des mélanomes métastatiques. Les tumeurs cutanées primaires n’engendrent pas de douleur estimable sauf éventuellement en cas d’ulcérations.

Devenir

A la fin de chaque expérience, les souris sont mises à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les connaissances générées à partir des biopsies de mélanomes humains, à partir des lignées de mélanomes humains et de mélanocytes humains, nous permettent de tester in silico (modèles informatiques), in vitro et in cellulo (modèles cellulaires) les modifications au niveau des protéines et du fonctionnement des cellules ainsi que le métabolisme de ces cellules. L’utilisation de systèmes plus complexes mimant des stuctures en 3D constituées de cellules (systèmes 3D, sphéroïdes (cellules cultivées en suspension sous forme de sphère) ou peaux reconstituées) nous permet de mieux appréhender l’importance de certaines protéines ou de certaines mutations dans les processus sus-cités. Bien que les modèles cellulaires soient utilisés majoritairement comme paradigme pour étudier ces processus, il est possible que les modèles cellulaires, même sophistiqués, ne reproduisent pas entièrement les événements qui se produisent lors du développement embryonnaire, lors du renouvellement des mélanocytes, lors de la transformation des mélanocytes en mélanome. De plus, la recherche systématique de traitement contre le mélanome a révélé que l’hétérogénéité cellulaire au sein d’un mélanome engendre des résistances génétiques et épigénétiques qui ne sont pas reproductibles in vitro. En conséquence, l’utilisation de modèle physiologique sophistiqué proposé uniquement aujourd’hui le modèle mammifère est obligatoire dans un but cognitif et thérapeutique.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des souris qui présentent un bagage génétique identique et l’ensemble de nos souris mutés le sont pour un gène donné sur un fonds génétique connu. La conséquence est que la variabilité d’individu est réduite, et en conséquence nous avons besoin de moins d’animaux. Nous optimiserons les accouplements en utilisant dès que cela est possible des croisements avec des souris présentant des mutations à l’état homozygote afin de réduire le nombre de souris produites. L’étude ne se fera qu’avec des molécules qui auront été validées in vitro avant tout test sur animaux. Nous utiliserons un suivi d’imagerie longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

En cas de retard de croissance pour les nouveaux-nés génétiquement modifiés, injectés avec des traitements, nous introduirons dans la cage des aliments gélifiés et hyper calorique afin d’augmenter les apports caloriques pour ces petits. Nous raffinerons les mutations en ciblant uniquement les cellules d’intérêt sans affecter les autres cellules de l’organisme. Les souris sont suivies régulièrement afin d’assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées dès l’atteinte d’un point-limite(mise en place d’une grille de score) Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec utilisation d’analgésiques. Nous ajouterons dans la cage post-chirurgie des aliments gélifiés et de petites croquettes dans le fond de la cage afin que la souris n’ait pas à se redresser pour se nourrir et s’hydrater. Les animaux seront suivis trois fois par semaine à quotidiennement. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas d’atteinte d’un point-limite. Nous suivrons le devenir de la tumeur primaire ou des métastases en utilisant régulièrement (en fonction) un pied à coulisse, un appareil photo ou l'imagerie.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris car il s’agit de l’espèce de choix pour les expériences menées en cancérogénèse et de recherche en thérapeutique du cancer. De plus, la souris est un modèle reconnu pour étudier la robe chez les mammifères. Ce modèle animal nous permet (i) de générer des mutations spécifiques, conditionnelles ou non, dans le lignage mélanocytaire, (ii) de contrôler au mieux le la présence de mutation génétique ce qui permet de réduire le nombre d’animaux car la variablité entre individus est plus faible. Nouveau-né et adulte, développement de tumeurs chez l’animal adulte @ Nous prendrons des nouveaux-nés lorsque nous les induirons à l’aide d’un agent chimique. L’induction est réalisée à la naissance avant la formation des poils, et les mélanocytes sont sensibles à cet agent chimique. @ Nous suivrons l’apparition des tumeurs au cours du temps chez l’adulte.

3 266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, des injections intrapéritonéales et intraveineuses de traitements, puis deux mesures de tumeur par semaine au pied à coulisse. Le porteur annonce une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, l'objectif restant de comprendre comment un type de macrophage récemment décrit participe aux défenses contre le cancer du sein. Sur le remplacement, il affirme que la complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires rend l'expérimentation animale "indispensable", après des modélisations informatiques et des cultures cellulaires menées en amont.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à se défendre. On en trouve en grande quantité dans les tumeurs. Notre équipe a découvert un nouveau type de macrophages dans les cancers du sein. Au début du cancer du sein, ces macrophages aident d'autres cellules de notre système de défense (les lymphocytes) à détruire les cellules cancéreuses. Mais si la tumeur continue de se développer, les macrophages peuvent arrêter de fonctionner correctement, ce qui rend nos défenses moins capable de combattre la tumeur. Nos buts sont : 1. Comprendre comment ces macrophages aident à combattre le cancer. 2. Étudier ce qui les empêche de bien fonctionner.

Bénéfices attendus

Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à combattre le cancer. Les scientifiques les voient comme des cibles importantes pour les traitements contre le cancer. Notre projet vise à comprendre comment ces cellules aident à lutter contre le cancer pour trouver de meilleurs traitements.

Procédures

1- biopsie de la queue (5 secondes/souris). 2- Injection sous-cutanée de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (5 secondes/souris). 3- Injection intrapéritoneale de différents traitements (5 secondes/souris). 4- Injection intraveineuse de différents traitements (5 secondes/souris). 5- Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse 2 fois par semaines (20 secondes/souris)

Impact sur les animaux

- biopsie au niveau de la queue induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - injection intrapéritonéale de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Injection intraveineuse de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Anesthésie générale lors de la greffe de tumeur entraînerant un léger stress de courte durée. - Injection sous-cutanée de tumeurs entraînerant une douleur légère de courte durée. - La croissance des tumeurs entraînerant une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque expériences pour analyser les tissus cancéreux et pour analyser les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Les mâles reproducteurs seront mis à mort à l'issue de leur période reproductive.

Remplacement

La complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires ne peut être modélisée de manière complète in vitro, rendant l’expérimentation animale indispensable. Toutefois, des modélisations informatiques et des cultures cellulaires ont été réalisées en amont afin de limiter autant que possible l’usage d’animaux.

Réduction

Nous utilisons des tests statistiques adaptés pour réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour mener à bien ce projet tout en assurant des résultats interprétables. Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques sur chaque animal permettant de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences.

Raffinement

Afin de minimiser l'impact des procédures sur le bien-être animal, nous anesthésions les souris dans tous les protocoles incluant des injections susceptibles de causer des douleurs. Nous réalisons une surveillance rapprochée des animaux et nous avons établis des points limites adaptés pour réduire leur souffrance. Des points limites intermédiaires sont aussi mis en place lorsque les animaux présentent des premiers signes de douleur ou de détresse: nous placerons si nécessaire de la nourriture gélifiée dans les cages. Enfin si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour la recherche en immunologie et en thérapeutique du cancer. Sa grande homologie avec l’humain permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes pour étudier un système immunitaire mature et une croissance tumorale adaptée.