Oncologie

Pour mesurer l'effet de l'obésité sur l'apparition de lésions précancéreuses du pancréas, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 172 sont tuées, dont les femelles allaitantes mises à mort au sevrage parce qu'elles ne peuvent pas porter une seconde portée, et 128 femelles sont transférées vers un autre projet d'imagerie. Les souriceaux subissent une coupe du bout de la queue pour génotypage, et un groupe est rendu obèse par un régime gras de l'âge de quatre à six semaines jusqu'à seize semaines, puis reçoit du sucre par gavage et six piqûres de la queue en deux heures pour mesurer sa glycémie. Le porteur explique avoir choisi des femelles allaitantes pour faire passer le produit par le lait maternel, ce qui évite de manipuler les souriceaux et déplace l'administration sur les mères.

Objectifs

L’adénocarcinome du pancréas est un cancer de plus en plus fréquent et serait la deuxième cause de mortalité par cancer en 2030. Il est souvent diagnostiqué à un stade tardif et sa mortalité est importante avec une survie à 5 ans tous stades confondus estimée à 11 % en 2024. De plus, la prévalence de l’obésité est en augmentation, particulièrement dans les pays développés. La corrélation entre obésité et cancer du pancréas est établie chez l’homme sur des données épidémiologiques, mais il existe à ce jour peu de données sur les mécanismes biologiques, cellulaires et moléculaires impliqués. Le but de cette étude est donc d’étudier l’impact de l’obésité sur l’apparition de lésions précancéreuses pancréatiques (donc avant la formation d’un cancer) à l’aide de 2 modèles de souris mimant 2 types de lésions précancéreuses.

Bénéfices attendus

L’étude des processus de développement et d’évolutivité de ces lésions précancéreuses du pancréas dans un contexte d’obésité est une des clés pour développer un meilleur dépistage et des traitements précoces, plus personnalisés et plus efficaces pour les patients.

Procédures

On génère les souris d’intérêt par croisement afin d’obtenir les modifications génétiques nécessaires à la formation des lésions pré-cancéreuses. Un produit est administré une fois par jour pendant 4 jours aux souris femelles allaitantes, soit par gavage, soit par injection dans le ventre. Cette manipulation dure moins de 15 secondes et permet au produit de passer dans le lait maternel afin que les souriceaux allaités le reçoivent indirectement. Ce produit permet ainsi d’induire l’activation de la modification génétique des souriceaux et de favoriser le développement des lésions pré-cancéreuses une fois l’âge adulte atteint pour étudier les causes du développement et de la progression de ces lésions. On effectue un prélèvement d’un petit bout de queue chez les souriceaux pour le génotypage, c'est à dire l'identification des modifications génétiques induites chez chaque animal. La manipulation est très rapide (moins de 30 secondes) et n’induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise très rapidement à ce stade. Un groupe de souris se nourrira d’un régime spécial riche en gras à base de croquettes de l’âge de 4-6 semaines jusqu’à 16 semaines afin d’induire une obésité. On donne ensuite du sucre par gavage à la souris afin de déterminer si elle est diabétique ou non (taux élevé de sucre dans le sang) en mesurant ensuite le taux de sucre via une goutte de sang prélevée au bout de la queue en moins de 5 secondes (au total, 6 gouttes de sang sur une période de 2 heures). Enfin, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie générale avant l’euthanasie de l’animal, la durée du prélèvement étant de moins de 30 secondes. On euthanasie les animaux à l’âge de 16 semaines afin qu’ils aient le temps de développer les anomalies du pancréas et de prendre du poids avec le régime riche en gras.

Impact sur les animaux

Le traitement des souris allaitantes peut entrainer une légère perte de poids transitoire. Le prélèvement d'un petit bout de la queue chez les souriceaux peut entrainer une légère douleur transitoire et un léger saignement. Un groupe de souris se nourrira d’un régime spécial riche en gras afin d’induire une obésité qui provoque une légère baisse de la capacité de mouvement des souris. Le prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue de la souris nécessite une contention qui est une légère source de stress et provoque une légère douleur transitoire.

Devenir

Les souris allaitantes seront euthanasiées au sevrage des souriceaux car elles ne peuvent pas être réutilisées une seconde fois pour une nouvelle portée. Les souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôles) seront euthanasiées à 4 mois afin d’étudier le développement et la progression des lésions précancéreuses pancréatiques en rapport avec l’obésité. Les 128 femelles restantes seront réutilisées dans un autre projet concernant la détection en imagerie des lésions prénéoplasiques pancréatiques (Apafis en cours d’écriture).

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement des lésions précancéreuses pancréatiques, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme. Des études sur organoïdes de souris (mini-version d’un organe cultivée en laboratoire à partir de cellules, qui imite certaines de ses structures et fonctions), ou issus de prélèvements de lésions humaines sont également possibles en complément mais ne peuvent pas remplacer cette étude avec ce modèle physiologique. Les retombées de ce travail sont utiles du point de vue des implications diagnostiques et thérapeutiques à terme chez l'homme, mais aussi d’un éventuel dépistage précoce.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal de souris, déterminé par des résultats obtenus précédemment et dans les publications scientifiques pour ce type d’analyse, et qui permet d'obtenir des résultats avec une puissance statistique permettant la validation de l'étude.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des conditions optimales d'élevage, en portoirs ventilés. Les souris sont 5 individus par cage au maximum pour avoir assez de place dans la cage sans pour autant être isolés car ce sont des animaux qui vivent en groupe. La température, le taux d’humidité, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec des cotons et des petits abris. Une surveillance quotidienne du personnel de l'animalerie et un suivi régulier de l'expérimentateur (au moins 1 fois par semaine) avec la prise en compte de différents éléments bien définis tels que l'aspect du pelage et des yeux, le poids et le comportement des souris permet d'éviter toute souffrance des animaux (suivi de ce qu’on appelle les points limites). Enfin l’euthanasie des animaux est réalisée sous anesthésie avec administration d’un traitement antidouleur.

Choix des espèces

Les souris modifiées génétiquement sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes biologiques et cellulaires de pathologie humaine. L’objectif du projet est d’étudier l’impact de l’obésité sur le développement et l’évolutivité de lésions pré-cancéreuses pancréatiques grâce au modèle de souris et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, ainsi que de proposer des stratégies diagnostiques et de dépistage. Nous utilisons des femelles allaitantes car cela permet d’induire la modification génétique chez les souriceaux sans avoir à les manipuler directement. Les femelles « allaitantes » auront au moins 60 jours lors de leur mise en accouplement. Le temps de gestation moyen est de 21 jours. Le temps d’allaitement moyen est de 30 jours. Au sacrifice, les femelles souris allaitantes seront euthanasiées à environ 17 semaines de vie. On laisse les lésions pré-cancéreuses se développer dans ce modèle de souris jusqu’à l’âge de 4 mois. Cela permet d’étudier l’impact de l’obésité dans le développement de ces lésions précancéreuses.

2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à trente injections espacées de huit heures et subir dix micro-prélèvements de sang après section de la pointe de la queue. Toutes sont tuées en fin de procédure pour le recueil des échantillons. L'objet est de vérifier l'innocuité de composés en développement, le porteur estimant que 200 composés seront testés en cinq ans sur ces 2 500 souris. Il indique que ces candidats-médicaments peuvent induire une mort cellulaire, la défaillance d'un ou plusieurs organes et des douleurs locales ou systémiques, tout en présentant l'opération comme un moyen de définir une posologie ne portant pas atteinte au bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments ou de nouveaux outils pharmacologiques, il est nécessaire d’étudier l’activité pharmacologique de la substance active chez l’animal. Avant ces études pharmacologiques, il est indispensable d’évaluer l’innocuité des produits pharmacologiques (sondes…) et candidats-médicaments en cours de développement dans le but d’identifier les effets indésirables liés à l’administration de ces composés. Cette étape clé doit permettre de mettre en évidence toutes atteintes au bien-être animal et de définir les conditions d’utilisation optimale des composés avant leur utilisation future dans des modèles complexes chez la souris. Cette étape permet aussi d’éliminer les composés présentant une toxicité incompatible avec l’utilisation souhaitée.

Bénéfices attendus

La mesure de l’innocuité des composés permettra d’éliminer les plus toxiques et de définir les conditions d’utilisation les plus adaptées et notamment une posologie (voie, dose et fréquence d’administration) ne portant pas atteint au bien-être des animaux. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament ou un outil pharmacologique efficace et sûr.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des injections (quelques secondes) pour l'administrer les composés étudiés. Les composés étudiés seront administrés 1 à 30 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et certaines administrations. Afin de suivre la concentration sanguine du composé et/ou contrôler les constantes biologiques et les biomarqueurs au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une période minimale de 72h. Un prelèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée et peuvent être répétée durant 30 jours consécutifs. La section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre des prélèvements sanguins de qualité, rapidement et sans contention entraine également une douleur légère de courte durée. Les candidats médicaments testés sont susceptibles d’exprimer leur activité biologique et tout autre effets indésirables. Ils sont susceptibles de perturber les fonctions biologiques, d’induire une mort cellulaire, d’entrainer la défaillance d’un ou plusieurs organes, de provoquer des douleurs locales ou systémiques se traduisant par une modification du comportement des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments et les produits pharmacologiques auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire l’innocuité d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire les fonctions mécaniques vitales et l’ensemble des phénomènes biologiques nécessaire à la vie et impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les composés les plus prometteurs et éliminer les plus dangereux avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure permet la mise en évidence des effets indésirables dès 2 animaux par condition testée en l’absence d’analyses biologiques. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de suivre l’évolution des constantes biologiques. Pour ces analyses, 5 à 8 animaux par groupe permettent une analyse statistique efficace des résultats . D’après notre expérience antérieure et l’évolution des pratiques, nous estimons que l’innocuité de 200 composés sera mesurée sur une période de 5 ans pour un maximum de 2500 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification », d’un igloo, d’une roue, d’une balançoire et de bâtonnets à ronger. Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations et seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Un renforcement positif est mis en place après chaque administration par l’ajout de récompenses alimentaires dans la cage (« Mini-gâteries »). Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des composés. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort et/ou une perte ou absence de prise de poids significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La mesure de l’innocuité est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments et des produits pharmacologiques. De plus, certains composés sont très difficiles à synthétiser et la petite taille de la souris requiert beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’innocuité d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.

Parce que ce modèle "garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie", 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les premiers jours de vie, chaque souriceau est séparé de sa mère et reçoit une injection d'antibiotique sous la peau, puis, à partir de la quatrième semaine, un régime riche en graisses plus ou moins chargé en vitamine B9. Toutes sont tuées après six ou quatorze semaines pour prélever leur foie. Le porteur écrit que ce régime, qui fait passer les souris d'un foie gras à un cancer du foie, se déroule "sans douleur".

Objectifs

La maladie dite du « foie gras » peut évoluer en cancer du foie, une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Un manque en vitamine B9 pourrait favoriser le développement de cette maladie et le cancer du foie. Cependant, son rôle exact n’est pas encore clair et les mécanismes impliqués ne sont pas bien compris. Le but du projet est donc de voir si la vitamine B9 peut influencer cette maladie et le cancer, et par quels mécanismes. Pour répondre à ces questions et étudier l’évolution de la maladie du « foie gras » en cancer, il n’est pas possible d’utiliser de cellules en culture. Par contre, des souris nourries avec un régime gras et traitées avec un antibiotique spécifique développent la maladie comme chez l’humain : d’abord une accumulation de graisse, puis une inflammation et des cicatrices, et enfin un cancer du foie. Pour déterminer si la vitamine B9 joue un rôle dans cette évolution, ces souris recevront soit une quantité insuffisante, soit une quantité excessive de cette vitamine. On pourra ainsi étudier quels sont les mécanismes mis en jeu et qui sont influencés par la présence ou l’absence de vitamine B9.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment le cancer du foie se développe lorsque l’alimentation est riche en gras, et comment un manque ou trop de vitamine B9 peut y contribuer. Nous espérons pouvoir identifier de nouveaux mécanismes de régulation de l’expression des gènes liés au cancer et donc mieux comprendre comment l’expression de certains gènes est mal régulée lors du développement du cancer du foie. Nous pourrons aussi savoir si cette vitamine peut protéger ou aggraver la maladie, ce qui aidera à proposer des conseils alimentaires pour les personnes à risque (comme celles atteintes de la maladie du « foie gras »). A plus long terme, les résultats pourraient contribuer à la découverte de nouveaux outils pour diagnostiquer ou traiter ce cancer.

Procédures

Les interventions seront effectuées sur les 90 souris : • Injection d'un antibiotique rapidement après la naissance, durant quelques minutes • Isolement de la mère pendant quelques minutes • Alimentation avec un régime riche en graisses avec une quantité normale, faible ou forte en vitamine B9 à partir de la 4 ème semaine jusqu'à la mise à mort de l'animal (après 6 semaines ou 14 semaines selon le groupe).

Impact sur les animaux

- Douleur liée à l’injection sous-cutanée de l'antibiotique. - Stress lié à la séparation du souriceau de la mère. - Une alimentation enrichie en graisses favorise la progression de la maladie du foie gras vers un cancer du foie dès la semaine 16, un processus potentiellement influencé par un manque de vitamine B9 ou par son enrichissement dans le régime alimentaire.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude. Le foie sera récupéré, afin d’étudier les mécanismes qui régulent l’expression des gènes.

Remplacement

Nous avons mené des études préliminaires sur des cellules de cancer du foie, cultivées avec ou sans vitamine B9. Nous avons trouvé que l’expression de certains gènes était modifiée quand il n’y avait pas de vitamine B9. Par contre, nous ne pouvons pas étudier avec ces cellules le développement de la maladie, tel qu’il se produit chez l’humain, avec la progression d'un foie gras vers le cancer. Seul le modèle animal permet de l'étudier.

Réduction

Pour cette étude, nous allons travailler avec 9 groupes de souris, en testant 3 types d’apport en vitamine B9 (normal, avec peu de B9, avec beaucoup de B9) à différents moments (3). Pour garantir des résultats fiables, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques qu’il nous faut 10 souris par groupe, soit 90 au total.

Raffinement

À leur arrivée, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les accouplements. Elles seront hébergées dans une animalerie répondant à tous leurs besoins (température, humidité, air filtré) et installées dans des cages ventilées avec des matériaux pour construire des nids. Les nouveau-nés recevront une injection unique d’antibiotique, réalisée par un expert, sans anesthésie car elle est rapide et peu invasive. Pour tout signe d'abandon ou d'isolement de plus d'une journée, l'animal sera placé avec une autre mère pour adoption. Si l'isolement persiste avec la nouvelle mère, l'animal sera mis à mort. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur bien-être, avec un suivi précis de leur état de santé et des pesées régulières. Après le sevrage, les souris seront nourries avec un régime riche en graisses qui provoque une progression de la maladie vers le cancer du foie, sans douleur. Elles seront regroupées par cinq dans des cages enrichies avec des objets pour jouer, se cacher, ronger et explorer, comme des tunnels, des dômes, et des bûchettes non toxiques. Tout est pensé pour leur assurer le meilleur confort possible. Si des signes de souffrance sont détectés et persistants, ou qu'une perte de poids trop importante est notée, les animaux souffrants seront mis à mort.

Choix des espèces

Les principaux modèles de maladie du foie gras ont été validés à l’échelle internationale sur des souris ou des rats. Nous avons choisi de travailler avec des souris car ce modèle, utilisé par nos collègues, garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie. Les souris utilisées proviendront de femelles gestantes, et les souriceaux débuteront le protocole avec l’injection d’un antibiotique rapidement après la naissance, qui permet d’instaurer un pré-diabète, une condition typique de la maladie du « foie gras ». Selon leur groupe, les souris seront suivies jusqu’à 4, 10 ou 18 semaines, correspondant respectivement aux étapes d’un foie normal, d’un « foie gras », et d’un cancer du foie. Ce protocole nous permet d’étudier les différentes étapes de l’évolution de la maladie du « foie gras » vers le cancer.

3 648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections abdominales sur animal vigile pour déclencher la modification génétique, puis des glucocorticoïdes ou des régimes obésogènes pendant quatre jours à vingt semaines, avec des jeûnes de cinq à quinze heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures. Elles passent aussi deux minutes immobilisées dans un tube pour la mesure de leur masse grasse et dix minutes dans un test d'anxiété dont le protocole n'est pas nommé. L'objet est de décrire les effets d'un excès de glucocorticoïdes sur la graisse, le foie et le comportement, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit "la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

Les glucocorticoïdes sont des outils thérapeutiques amplement utilisés dans un large panel de maladies chroniques inflammatoires. Néanmoins chez certains patients, l’utilisation à long terme et à fortes doses peut entrainer des maladies telles que le diabète, des maladies du foie et des anomalies de répartition des dépôts adipeux, présentant des altérations fonctionnelles. Ces altérations peuvent également impacter le comportement des animaux et favoriser des troubles de l’anxiété à différents âges. Ce projet de recherche vise à décrire l’impact d’un excès de glucocorticoïdes sur la physiologie des tissus adipeux et les conséquences métaboliques sur d’autres tissus sensibles à l’action de l’insuline tels que le foie et le muscle squelettique ainsi que les conséquences sur l’activité cognitive. De plus, les expériences décrites dans ce projet permettront d’étudier le rôle des glucocorticoïdes dans un contexte d’obésité induite par des régimes obésogènes, sur les maladies hépatiques, la fonctionnalité des organes sensibles à l’insuline et dans l’équilibre glycémique.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre comment les glucocorticoïdes impactent et modifient le comportement des animaux ainsi que le fonctionnement et la morphologie des tissus graisseux, notamment lors de traitements de longue durée. Plus largement, nous examinerons aussi les conséquences de leur action des glucocorticoïdes sur les maladies du foie (par exemple, l'accumulation de graisse dans le foie, l'inflammation, la fibrose ou la cirrhose), induites par des régimes riches en graisses. À terme, ces recherches pourraient montrer que bloquer l'action de ces hormones au niveau des tissus graisseux pourrait devenir une solution pour réduire les effets négatifs de ces traitements ou de ces régimes sur le métabolisme.

Procédures

Une partie des animaux seront soumis à un traitement par injections intrapéritonéales afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours soit un total de 5 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite soumis à différents traitements via des régimes alimentaires spécifiques et/ou l’eau de boisson durant 4 jours à 20 semaines selon les groupes. Les animaux seront impliqués dans une mesure de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 2 minutes. Les souris seront soumises à des tests pour évaluer soit la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun (entre 5h et 15h selon les actes), les souris seront injectées au niveau de l’abdomen ou par voie orale et 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Des souris adultes et âgées seront également soumises à des tests de comportement pour mesurer l’anxiété des souris traitées ou non (1 fois, 10 minutes par animal). Enfin, une partie des animaux subiront une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses. Une seconde partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés pour réaliser un prélèvement sanguin (2-3 minutes) ou une chirurgie (8-10 minutes) immédiatement suivie de l’euthanasie en vue des prélèvements, sans réveil des animaux.

Impact sur les animaux

Les modèles transgéniques inductibles subiront des injections pour induire l’invalidation du gène d’intérêt. Les administrations entrainent une contrainte/stress liée à la contention, à la piqure qui sont légers et de courte durée. Une partie des animaux subiront des traitements aux glucocorticoïdes ou seront exposés pendant plusieurs semaines à des régimes obésogènes pouvant induire une obésité associée à une insulino-résistance et le développement des pathologies hépatiques qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Les animaux soumis à une mesure de la composition corporelle subiront un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention durant la mesure (1 fois, environ 2 minutes). Les souris seront inclues dans plusieurs tests de phénotypages métaboliques. Ces phénotypages seront réalisés sur des souris à jeun, pour lesquels l’alimentation aura été supprimée auparavant (entre 5h et 15h en fonction des tests mis en œuvre). Cela pourrait induire une sensation de faim au cours de ces périodes. Elles seront également amenées à suivre des challenges métaboliques. Ces manipulations pourront entrainer un stress et une douleur de courte durée (contention, administration par orale et/ou injection, prélèvement sanguin de faible volume) ou des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Les tests de comportement seront potentiellement générateurs de stress et ou d’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, avant l’euthanasie en vue des différentes analyses, une partie des animaux subira une unique injection au niveau de l’abdomen pouvant induire un léger stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d’introduction de l’aiguille. Les animaux seront ensuite euthanasiés après quelques minutes par une méthode réglementaire. Une autre partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés afin d’effectuer un prélèvement sanguin terminal qui sera suivi d’une euthanasie sans réveil des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour l’étude histologique ou biochimique des tissus sensibles à l’insuline des animaux.

Remplacement

Cette étude vise à mieux comprendre comment les glucocorticoïdes impactent et modifient le comportement des animaux ainsi que le fonctionnement des tissus graisseux, ainsi que d’autres organes sensibles à l’insuline tels que le foie. D’un point de vue évolutif le GR apparait chez les vertébrés terrestres et plus particulièrement chez les mammifères, justifiant l’utilisation d’un modèle mammifère dans ce projet. Ce travail de physiologie intégrée permettra de comprendre d’une part, l’activité sensori-motrice et le degré d’anxiété des animaux et d’autre part, les communications inter-organes et les régulations métaboliques entre les différents tissus. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire le comportement des animaux et les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. L’utilisation d’un modèle petit rongeur, comme la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).

Réduction

Le projet impliquera un total de 3648 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet, les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). La principale contrainte concerne les injections intrapéritonéales pour induire le modèle génétiquement modifié. Les administrations de traitement via l’eau de boisson seront surveillées et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Les régimes seront placés en faible quantité afin de garantir une qualité optimale de l’aliment et son appétence. Les différentes explorations métaboliques et comportementales mises en œuvre seront effectuées par du personnel formé au geste et selon des protocoles maitrisés et les mises à jeun seront réduites au maximum pour réduire la contrainte sans compromettre l’obtention des résultats scientifiques De plus, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le récepteur aux glucocorticoïdes, tel que présent chez l’homme, est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes modèles plus simples. Plusieurs modèles murins transgéniques seront utilisés au cours de notre projet afin de répondre aux différentes questions scientifiques. Justification des stades de développement : Les souris transgéniques seront utilisées à l’âge adulte et/ou âgées car nous étudions l’impact des glucocorticoïdes sur des tissus et organes matures, totalement différenciés.

Tuées à l'issue parce que leur obésité, selon le porteur, leur interdit d'être maintenues en vie, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue obèse par un régime à 60 % de lipides, les autres le sont par une mutation du gène de la leptine qui les rend morbidement obèses dès la cinquième semaine de vie. Elles reçoivent une ou deux injections d'un nanocatalyseur dans les coussinets graisseux de l'abdomen, dix minutes d'exposition à une lampe infrarouge, des prélèvements sanguins, un passage en cage à métabolisme et deux heures à 4 °C. Le porteur qualifie ce composé de "traitement révolutionnaire" qui "ouvre sans conteste des perspectives thérapeutiques prometteuses", alors que l'étude décrite est son premier test sur un animal vivant.

Objectifs

L'obésité est une pandémie mondiale. En 2019, un indice de masse corporelle supérieur à la norme a causé 5 millions de décès. Ceci suggère un besoin urgent de nouveaux traitements. Le brunissement du tissu adipeux blanc est une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour lutter contre l’obésité. En effet, pour mieux combattre le froid, les cellules adipeuses brunes produisent des protéines transformant l’énergie graisseuse en chaleur et brûle ainsi les calories stockées. Chez l’homme, le tissu adipeux est constitué à 95% de graisse blanche et 5 % de graisse brune. Il a été montré que l’activation spécifique de certaines protéines du tissu adipeux blanc permet sa transformation en tissu adipeux brun et ainsi l’élimination des calories excédentaires sous forme de chaleur. Plusieurs molécules agissant sur la voie de signalisation intracellulaire des récepteurs régulant la fonction des adipocytes pour augmenter le métabolisme oxydatif, ont déjà été développées mais elles ont toutes montré des effets secondaires délétères Dans ce projet, nous avons développé un nanocatalyseur induisant la transformation des cellules adipeuses blanches en tissu adipeux brun. Les études préalables que nous avons faites in vitro ont montré qu’il induit un renouvellement important des adipocytes, et reste non toxique pour ces cellules. Pour tester son effet in vivo, nous voulons cibler le tissu adipeux blanc de souris obèses par injection du nanocatalyseur dans les coussinets adipeux abdominaux. La présence d’acides gras sera contrôlée dans le sang, l’urine et les féces avant l’injection puis 15 et 30 jours après l’injection. La pesée des souris sera réalisée quotidiennement ainsi que le contrôle de la prise de nourriture et d’eau. L’étude sera réalisée sur 2 modèles de souris obèses : des souris nourries avec un régime riche en lipides et des souris génétiquement obèses. La 1ère étape est un test unique fait sur un petit nombre d’animaux afin de vérifier l’innocuité du catalyseur et de déterminer la dose optimale à utiliser. La 2ème étape permettra de tester 4 structures de nanocatalyseur différant de quelques acides aminés et de déterminer celle qui est la plus efficace et la plus fonctionnelle. Un replicat unique du protocole utilisant la structure du nanocatalyseur la plus efficace sera ensuite réalisé pour asseoir la robustesse statistique des résultats en vue de les publier.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Ce nanocatalyseur multifonctionnel qui comprend de l'hème et des acides aminés, ouvre sans conteste des perspectives thérapeutiques prometteuses pour le traitement de l’obésité et plus largement pour traiter les maladies cardiovasculaires. C’est un traitement révolutionnaire ayant une application à visée humaine personnalisée là où les traitements médicaux traditionnels ont leurs limites. L’étude décrite dans ce projet constitue la première étape testant la fonctionnalité in vivo chez la souris de ce nanocatalyseur transformant les cellules adipeuses blanches en tissu adipeux brun après tout un travail de mise au point préalable in silico et sur culture cellulaire in vitro. C’est une étape clé dans la réalisation de ce nouveau traitement contre l’obésité. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude est minimisé, l’étude exploratoire déterminera la concentration de nanocatalyseur optimale et l’étude confirmatoire, la structure la plus fonctionnelle et efficace.

Procédures

Au cours du projet, les animaux recevront une injection unique de biocatalyseur lors de l’étape 1 et deux injections à un mois d’intervalle lors de l’étape 2. Liste des interventions faites sous anesthésie gazeuse : -l’injection du nanocatalyseur dans les coussinets graisseux de la souris d’une durée de 20 secondes. -l’exposition de l’abdomen des animaux à une source de lumière infrarouge commerciale (à usage médical) pendant un maximum de 10 minutes juste après l’injection du nanocatalyseur. -les prélèvements sanguins d’une durée de 1 min chacun. Liste des interventions faites sur animal vigile : -La récupération de selles et d’urine après avoir mis les animaux en cage à métabolisme pendant 30 min. En cage à métabolisme, les souris ont un accès libre à la nourriture et à la boisson. - Le test de tolérance au froid (4°C) d’une durée de 2h, nous utiliserons une caméra infrarouge avancée pour surveiller sans contact et en permanence la température cutanée des souris. Les souris dont la température cutanée aura baissé de plus de 1°C par rapport au début de l’expérimentation seront remises à température ambiante et réchauffée sous une lampe infra rouge médicale.

Impact sur les animaux

L’injection du nanocatalyseur dans les coussinets adipeux de la souris peut engendrer une légère douleur, ainsi que l’exposition consécutive de l’abdomen des animaux à une source de lumière IR (à usage médical) pendant 10 minutes. Le prélèvement sanguin peut également être douloureux. Bien que peu probable, la toxicité potentielle du nanocatalyseur est aussi à envisager dans les effets indésirables attendus sur les animaux particulièrement lors de la 1ère étape du projet. L’état d’obésité obtenu chez les groupes de souris ayant une alimentation enrichie en lipides ainsi que l’état d’obésité avéré des groupes de souris obèses génétiquement est à prendre en compte dans les nuisances potentielles attendues sur les animaux même si des mesures de suivi, de soins et de conditions d’hébergement seront prises en conséquence. Avec l’âge et la prise de poids, ces animaux seront en perte de mobilité. Ils seront susceptibles de développer des maladies métaboliques chroniques. L’exposition au froid est également à considérer.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car leur autopsie et les prélèvements de coeur, de foie et de rein de tissu adipeux blanc et brun sont nécessaires pour compléter notre étude. De plus, ce sont des animaux obèses qui ont des facteurs de comorbidité importants et ne peuvent être maintenus en vie.

Remplacement

Le recours à la pratique sur animal pour valider la fonctionnalité thérapeutique de ce nanocatalyseur est essentiel. Cette validation arrive au terme de plusieurs longues étapes de mise au point in silico et d’études de sa fonctionnalité in vitro. Il a d’abord été élaboré in silico en utilisant des logiciels de conception. Son efficacité et sa toxicité ont également été évaluées in silico au moyen de logiciels puis il a été testé in vitro sur culture de cellule. Toutes les expériences in vitro possibles ont été réalisées au préalable. Tous les critères étant validés, il doit être testé in vivo car les expériences sur la souris constituent l'étape ultime dans le développement de cette nouvelle thérapie et ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives. Nous avons fait tout notre possible pour remplacer l’expérimentation sur l’animal qui arrive en bout de chaine d’étude et seulement après la validation des tests in vitro et de l'étape 1 in vivo.

Réduction

Lors de la 1ère étape du projet déterminant la dose optimale de nanocatalyseur à utiliser, un total de 16 souris nourries avec un régime riche en lipides et 16 souris génétiquement obèses seront utilisées. La 2ème étape du projet permettra de tester 4 structures différentes de nanocatalyseur et de préciser celle qui est la plus efficace et la plus fonctionnelle. Un replicat unique du protocole utilisant la structure du nanocatalyseur la plus efficace sera ensuite réalisé pour valider statistiquement les résultats en vue de les publier. Pour la 2ème étape du projet, avec l’aide d’un biostatisticien, nous avons établi : -qu’un protocole type utilisera 16 souris nourries avec un régime riche en graisses et 16 souris génétiquement obèses -que 4 protocoles types seront réalisés pour tester les 4 structures de nanocatalyseur (1 structure de nanocatalyseur par protocole type). - que la structure du nanocatalyseur déterminée comme étant la plus fonctionnelle et la plus efficace pour le brunissement des adipocytes donnera lieu à un replicat unique du protocole type en vue d’asseoir la robustesse statistique des résultats et de les valider statistiquement. Sur 2 ans, nous utiliserons un total de 160 souris maximum et moins si les résultats escomptés sont obtenus avant. Pour le test au froid, nous n’utiliserons pas de groupes d’animaux supplémentaires. Le nombre de souris utilisées par lot est calculé au plus juste pour interpréter et valider statistiquement les résultats. Les groupes de souris témoins négatifs de la 1ère étape du projet seront réutilisés dans l’étape 2 et non pas en surnuméraire. La taille de l'échantillon a été estimée selon des hypothèses appropriées et les résultats seront analysés avec un test statistique approprié. Selon ces hypothèses, nous avons obtenu une taille de groupe de huit animaux. Les animaux seront assignés au hasard aux groupes expérimentaux. Les données seront traitées en aveugle. Tous les animaux en bonne santé avant et pendant l'expérience seront inclus dans l'étude. Si des signes de détresse, de douleur et de perte d'état corporel sont observés, les souris seront exclues du protocole et prise en charge par des antalgiques.

Raffinement

Dès leur entrée à l’animalerie et pour toutes les souris, la surveillance sera quotidienne, des croquettes seront mises dans une mangeoire dans la cage pour faciliter l’accès à l’alimentation des animaux obèses ainsi que l’utilisation de biberons à pipettes longues. La fréquence de change sera de 2 fois par semaine (les souris obèses sont diabétiques et urinent plus) et les souris seront hébergées par 4 dans une cage. Avant le début du protocole, les animaux seront pesés à l’occasion des changes pour éviter de les perturber avec mesure de la prise de nourriture et de boisson. Une grille d’évaluation clinique du bien-être (BEA) spécifique au protocole sera mise en place pour chaque animal dès son arrivée avec un scoring du comportement (attitude dans la cage), de l’aspect physique (aspect du poil), de la physiologie (hyperventilation, déshydratation) et de l’évolution du poids. Ce qui permettra d’adapter un traitement antalgique selon le score obtenu. Une surveillance renforcée des souris sera effectuée après l’injection du nanocatalyseur : toutes les 2h pendant 12h puis toutes les 12h pendant 72h et enfin quotidienne avec contrôle de la consommation de nourriture, de la boisson, pesée des souris et observation de leur état général. Des points limites adaptés seront mis en place pour les souris obèses de ce projet. Durant l’exposition au froid, nous utiliserons une caméra IR avancée pour surveiller sans contact et en permanence la température cutanée des souris mais si la température corporelle d’un animal baisse de 1°C, il sera immédiatement retiré et réchauffé sous une lampe infrarouge. Durant l’expérience, pour éviter toute douleur, la plupart des actes seront faits sur souris anesthésiées : l’injection du nanocatalyseur, l’exposition de l’abdomen à une source de lumière IR, ainsi que le prélèvement sanguin.

Choix des espèces

Chez l’homme, l’obésité résulte de facteurs alimentaires, génétiques/épigénétiques et environnementaux. Elle est due à : 1) une alimentation trop riche, une activité physique faible 2)une prédisposition génétique : 8 gènes responsables d’obésité monogénique et 22 gènes de prédisposition à l’obésité ont été identifiés. Par conséquent, nous utiliserons, ici, les 2 modèles de souris développés spécifiquement pour les études sur l’obésité : -l’un reproduit les conditions humaines d’obésité alimentaire avec insulino-résistance : souris nourries avec un régime enrichi en lipides 60% pendant 30 jours. -le modèle génétiquement obèse est proche de l’obésité génétique humaine (mutation du gène codant pour la leptine également identifiée chez l’homme). Elles présentent une obésité morbide apparaissant 4 à 5 semaines après la naissance, s'accompagnant de troubles métaboliques. La prise en charge des animaux obèses est décrite dans les procédures. Ces animaux sont de jeunes adultes mâles de 25 grammes soit 35 à 42 jours environ. C'est à ce stade de développement que la courbe de croissance des souris s'infléchit et que les fonctions physiologiques de l'animal ont atteint leur maturité. Notre étude à visée humaine doit être réalisée sur souris adultes comme le sont la plupart des études précliniques de ce type en recherche fondamentale.