Oncologie

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées puis nécropsiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent douze semaines de régime enrichi en lipides, subissent deux gavages, trois à onze injections et quatre séries de huit à neuf prélèvements de sang à la queue, certaines une chirurgie sous anesthésie générale. Le projet teste si la surexpression d'une adipokine dans le tissu adipeux retarde la résistance à l'insuline liée à l'obésité. Le porteur écrit que le modèle in vivo est "indispensable" pour étudier ces dialogues entre cellules, après avoir précisé que son équipe cultive couramment des adipocytes humains et murins.

Objectifs

L’obésité est caractérisée par un excès de tissu adipeux et s’accompagne de complications métaboliques. L’excès de tissu adipeux est corrélé au degré d’insulino-résistance qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit au développement d’un diabète de type 2. Le tissu adipeux est un organe central du métabolisme par sa fonction de stockage des lipides. Il produit également de nombreux facteurs, dont des adipokines bénéfiques ou délétères vis-à-vis de l’action de l’insuline ; ces adipokines peuvent agir au sein même du tissu ou à distance dans l’organisme. Une meilleure connaissance des adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l’obésité. Nous avons mis en évidence chez l’Homme une nouvelle adipokine dont le niveau d’expression dans le tissu adipeux est faible chez des personnes atteintes de syndrome métabolique ou de diabète de type 2. Son taux sanguin est un déterminant négatif de la résistance à l’action de l’insuline. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de cette adipokine par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une insulino-résistance. Nous voulons tester si sa surexpression dans le tissu adipeux peut permettre de retarder, voire d’empêcher, le développement d’une résistance à l’action de l’insuline induite par l’obésité. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’apport de nouvelles connaissances sur les acteurs de la sensibilité à l’insuline, dans un contexte de prise de poids et de dégradation de la signalisation insulinique. La compréhension du rôle de certaines adipokines dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline au cours de l’obésité, permettra de cibler de nouveaux mécanismes cellulaires. L’apport de l’expérimentation animale est majeur dans l’étude de la dérégulation de ces voies, en offrant un point de vue à corps entier de la physiopathologie de l’obésité et du diabète.

Procédures

Dans l’EU1, les animaux auront une alimentation enrichie en lipides durant 12 semaines et un hébergement à thermoneutralité. Tous les animaux seront soumis à 2 gavages, 3 à 11 injections et 4 séries de 8 à 9 prélèvements de sang à la queue au cours de leur vie ; chaque acte sur animaux vigiles n’excédant pas 15 secondes consécutives. Tous les animaux pourront subir une intervention chirurgicale (de 10 à 15 minutes maximum) sous anesthésie générale avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire. Dans l’EU2, les animaux seront soumis à 1 gavage, 1 série de 5 prélèvements de sang à la queue n’excédant pas 15 secondes consécutives, puis nécropsiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourraient survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min), lors des 12 semaines de régime enrichi en lipides, lors des gavages (environ 15 sec) ou encore lors des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 5 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors de prises de sang ou encore lors d’injections. Dans l’éventualité où l’option chirurgicale serait retenue pour induire la surexpression de l'adipokine étudiée, les souris pourraient ressentir une douleur légère pendant 1 à 2 jours malgré l’utilisation d’antalgique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et nécropsiés en vue de l'analyse de leur sang et de plusieurs organes.

Remplacement

Les modèles in vitro d’adipocytes humains et murins existent et l’équipe en cultive couramment. Cependant, en raison de la capacité de prolifération quasi-inexistante des adipocytes, ces lignées sont cultivées sous forme de préadipocytes puis différenciées en adipocytes matures grâce à un milieu de culture spécifique. Ces conditions de culture rendent les cellules artificiellement résistantes à l’action de l’insuline et il est impossible d’étudier l’effet de certaines molécules sur la sensibilité à l’insuline. De plus, les tissus adipeux sont constitués d’une grande diversité de cellules, outre les adipocytes, qui participent à la dysrégulation de la sensibilité à l’insuline. C’est le cas des cellules immunitaires qui, selon leurs sécrétions de cytokines et chimiokines, influencent le signal insulinique à l’échelle du tissu. Ainsi, le modèle in vivo sur l’animal, utilisé à des fins expérimentales, est indispensable à l’étude de ces dialogues intercellulaires au niveau du tissu, puis à l’étude des dialogues inter-organes au niveau systémique.

Réduction

Grâce à nos études préliminaires, nous savons qu’un minimum de 10 animaux nourris avec un régime enrichi en graisses par condition testée est nécessaire pour observer un effet sur la sensibilité à l’insuline. Ces travaux n’avaient cependant été réalisés que sur des mâles de fond génétique sauvage. A cause d’une hétérogénéité interindividuelle significative dans les paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront dans ce projet d’utiliser 15 animaux contrôles par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard) et 15 animaux génétiquement déficient pour une adipokine par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard), pour chaque condition expérimentale et température d’hébergement. Ce nombre minimal permettra d’obtenir des résultats robustes et basés sur une puissance statistique suffisante, en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Nous estimons que pour établir une différence éventuelle entre les groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus par groupe : soit 15 mâles non déficients, 15 mâles déficients, 15 femelles non déficientes et 15 femelles déficientes par condition expérimentale et température d’hébergement. L'utilisation de 3 cohortes au maximum, manipulées à des temps « indépendants », est justifiée par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Pour le bien-être animal, les souris seront en groupes sociaux de 4 à 5 individus constitués dès le sevrage de fratries, dans la majorité des cas. Les souris ne seront jamais isolées lors des protocoles. Un contrôle quotidien de l'alimentation, la boisson et l'état physique des animaux sera effectué. Des enrichissements (feuille d’essuie-tout, bâtonnet de bois, papier kraft « sizzle-nest ») seront placés dans les cages et remplacés lors du change hebdomadaire ou en cas de souillure excessive. Si les animaux montrent des signes d’agitation/nervosité lors des manipulations, des abris seront ajoutés aux cages (igloos, tubes…) afin de satisfaire leur besoin naturel de se cacher. Selon le développement technique et la disponibilité commerciale de certains produits à administrer, ces options moins invasives seront privilégiées à la chirurgie. Dans le cas contraire, les injections ou chirurgies se feront sous anesthésie avec antalgique et tapis chauffants. Dès l’apparition d’un comportement normal de réveil (étirements, ébrouement, toilettage…), il sera replacé avec ses congénères. Dans les jours suivants, la litière de copeaux de bois standard sera remplacée par une litière de cellulose ne produisant pas de poussière, évitant l’irritation des plaies chirurgicales. La cicatrisation de l’abdomen et l’absence de signes de douleurs (évaluée par la grille de scoring) sera un point essentiel de la surveillance quotidienne. Après mise sous régime riche en graisses, un suivi du poids hebdomadaire sera réalisé. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris) est le modèle animal expérimental le plus étudié notamment pour les études physiologiques et métaboliques. La lignée animale déficitaire pour le gène d’une adipokine a été développée chez la Souris et est utilisée par plusieurs équipes de recherche, ce qui permet une comparaison avec les données de la littérature. La transposition du modèle à l’Homme est améliorée par l’humanisation du modèle murin, par l’utilisation de vecteurs viraux permettant l’expression du gène humain de notre adipokine dans le tissu adipeux des animaux. Les animaux utilisés seront adultes et âgés de 8 semaines au début du protocole, 22 semaines à la fin du protocole.

Tuées à l'issue pour prélever leur sang et leur foie, 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent l'injection d'une molécule choisie pour sa toxicité hépatique, qui peut provoquer des douleurs abdominales. Quatre cents d'entre elles subissent en plus l'ablation des ovaires, dont la moitié avec la pose d'une capsule hormonale sous la peau, pour modéliser la ménopause et les traitements hormonaux. Le porteur reconnaît que le type de douleur induite par ces molécules n'a jamais été formellement caractérisé, et affirme dans le même temps qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement".

Objectifs

De nombreuses études ont montré que la toxicité de nombreux médicaments dépends des rythmes circadiens c'est-à-dire que leur toxicité est dépendante de l'heure de la journée. Cette approche de la pharmocologie, appellée chronothérapie, permet de diminuer la toxicité et/ou augmenter l'efficacité des médicaments. Cependant, l'effet du sexe sur différentes chronothérapies n'a été étudié que très brièvement dans la littérature alors qu'on sait que de nombreux paramètres pharmacologiques (absorption, métabolisation, excrétion) sont régulés de manière sexe-dépendante et circadienne. L'objectif de ce projet est donc de tester la chronotoxicité de 5 molécules utilisées en clinique et connues pour présenter une pharmacocinétique circadienne et dont nous avons identifié que les voies de métabolisation hépatique dépendent du sexe et du statut oestrogénique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer et comparer la chronotoxicité de ces 5 molécules entre les femelles et les mâles ainsi qu'entre des femelles intactes modélisant des femmes en période reproductive et des femelles ovariectomisées modélisant des femmes ménopausées. Ces résultats seront déterminants pour optimiser la chronothérapie de ces 5 molécules chez les femmes en période reproductive, les femmes ménopausées et les hommes sachant que ces molécules sont fréquement utilisées en clinique.

Procédures

Certains animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales dont une de classe légère (pose de capsule à libération prolongée sous la peau mimant les traitements hormonaux de la femme) et une de classe modérée (ablation des ovaires mimant la ménopause). Ces deux procédures durent entre 10-20min sous anesthésie générale. Au total, 200 animaux seront soumis à une chirurgie de classe modérée (ovariectomie) et 200 animaux seront soumis aux deux chirurgie de classe légère (pose de pellet sous-cutanné) et modérée (ovariectomie). Tous les animaux de ce projet (800 animaux au total) seront soumis à l'injection de molécule induisant une toxicité hépatique pouvant induire des douleurs abdominales et est donc considérée comme une procédure de classe modérée.

Impact sur les animaux

L'étude de la toxicité hépatique nécessite par définition d'utiliser des doses toxiques des différents composés testés pouvant induire des douleurs (douleurs abdominales). Si le type de douleur induite par ces molécules n'a jamais été formellement caractérisée, la toxicité hépatique aigue est généralement considérée comme une procédure de classe légère ou modérée. Ce protocole peut donc engendrer chez les animaux des douleurs abdominales et un stress lié à la manipulation.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélevements (sang, foie) et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Les effets de sexe et circadiens font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du sexe et des rythmes circadiens sur la métabolisation et la toxicité hépatique. De même, l'étude de la toxicité hépatique ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet. Cependant, une veille bibliographique régulière sera réalisée afin d’identifier de nouvelles méthodes alternatives pertinentes pour remplacer ce protocole.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages. L'étude de l’horloge biologique nécessite également de raffiner les conditions d'hébergement des animaux afin de respecter leur propre horloge car les souris sont des animaux nocturnes. Ainsi, les animaux utilisés dans ce projet seront manipulés dans la phase de nuit. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie et d’analgésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce s'est orienté vers la souris car c'est le modèle utilisé dans les études précedentes qui ont généré les résultats préliminaires aboutissant à ce projet. De plus, afin de pouvoir appliquer les conclusions de ce projet à l'humain, le modèle murin est le modèle expérimental qui permet de modéliser au mieux la pharmacocinétique des molécules testées. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.

Une partie des souris est génétiquement prédisposée à développer des tumeurs du côlon, l'autre privée du gène de la tétraspanine 8. 1 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont marquées par section d'une phalange, gavées avec des bactéries choisies pour leur rôle pro-cancéreux, puis saignées par ponction derrière l'œil sous anesthésie, la progression tumorale étant suivie deux fois par semaine par l'aspect du pelage, celui de l'anus et la présence de sang dans les selles. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure pour prélèvements, sauf celles retenues pour entretenir la lignée.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle de la tétraspanine 8 (Tspan8) dans le côlon en termes physiologique et physiopathologique. Cette protéine est majoritairement localisée dans la membrane des épithéliums notamment dans le tube digestif et est connue pour être associée à des processus métastatiques dans le cancer colorectal. Pour ce projet, nous utiliserons des souris invalidées pour Tspan8 et des souris prédisposées à dévolopper un cancer colorectal. L’objectif principal sera de générer un modèle d'étude prédisposé à développer un cancer colorectal et invalidé pour la Tspan8 afin d’établir l’implication éventuelle de cette protéine sur la carcinogénèse colique. Le second objectif consistera à définir l’importance de cette dernière dans la perméabilité intestinale et son rôle sur le microbiote intestinal dans les deux contextes. En effet, ce dernier est un acteur majeur des (dis-) fonctions intestinales et il a été montré que les tétraspanines peuvent interagir avec des souches bactériennes. De ce fait, nous évaluerons également si TSPAN8 peut être partenaire pour des bactéries commensales ayant acquis des facteurs de virulence et connues pour jouer un rôle procarcinogène dans le cancer du côlon (Escherichia coli productrice de colibactine). Enfin, nous testerons la même hypothèse avec une entérobactérie murine Citrobacter Rodentium mimant une infection par entérobactérie chez homme.

Bénéfices attendus

Cette étude est partie intégrante d’un projet plus large visant à caractériser l’effet du microbiote intestinal sur la survenue de cancers colorectaux. En effet, l’étude des modifications de la structure de la barrière intestinale et de la colonisation bactérienne, en contexte sain ou pathologique sur des souris invalidées pour le gène de la TSPAN8, nous permettra de définir le rôle pro tumoral de cette protéine et de débuter les études mécanistiques visant à établir le lien entre cette protéine et les bactéries intestinales. A terme, ces études permettraient de définir une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer colorectal.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage intragastrique (douleur légère, faible durée quelques secondes) et des prélèvements de sang par technique rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse en pré-mortem (douleur légère, faible durée quelques secondes).

Impact sur les animaux

Pour les souris ne produisant pas la protéine d'intérêt TSPAN8, il n’est pas attendu de phénotype dommageable au vu des précédentes observations. Pour les souris prédisposées à développer un cancer colorectal, la croissance tumorale sera appréhendée par une observation bi-hebdomadaire des souris. Une fiche de score sera réalisée pour chaque souris et permettra de déterminer si l’animal est en souffrance. Les animaux seront génotypés/marqués par phallangectomie. Cette technique entraîne une douleur légère et de faible durée. Plusieurs paramètres généraux, comportementaux et d’autres liés au modèle seront observés : suivi du poids, aspect du pelage et de l’orifice anal, consistance et présence de sang dans les selles, locomotion, comportement innée et induit. Un suivi renforcé (quotidien) sera également mis en place dès l’apparition des premiers signes de douleur (noté sur la fiche de score) afin d’intervenir la plus rapidement. Les animaux pourront également subir un gavage intragastrique (douleur légère, très courte durée) ou un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital en prémortum sous anesthésie gazeuse (douleur légère, très courte durée).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour des prélèvements post-mortem sauf ceux nécessaires à l'entretient de la lignée.

Remplacement

La caractérisation des propriétés de la Tspan8 sur l’architecture de l’épithélium intestinal en contexte sain sera complétée par des études in vitro sur cellules coliques polarisées. Cependant, l’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il est impossible d’étudier le rôle de la Tspan8 lors d’une infection chronique en modèle in vitro. De même, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'étudier la perméabilité intestinale à l'échelle systémique en présence de microbiote intestinal sain ou pathologique. Enfin, l'étude du rôle de la TSPAN8 sur la modulation du microbiote intestinal en contexte sain ou pathologique doit obligatoirement être réalisé sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire sur modèle sain (Tspan-/-) ou pathologique (APCmin/+) ont mis en évidence une forte variabilité des modèles (variabilité inter individuel), de la colonisation bactérienne post gavage, de son maintien au cours du temps, de la progression tumorale en fonction du temps et de l'étude de le perméabilité intestinale. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance des modèles et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Lors de la création de la lignée le nombre d'animaux est également réduit à son minimum afin d'obtenir à terme un minimum de 7 souris femelles et mâles présentant le génotype d'intérêt pour l'étude du bien être animal.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un suivi qui permettra de détecter toute apparition de souffrance ou de mal-être quel que soit le modèle (sain ou pathologique). Le cas échéant, l’animal sera isolé et traité à l’aide d’antidouleurs de manière graduelle à la souffrance observée. Les animaux seront hébergés avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre). L’eau et l’alimentation seront fournis à volonté et disposé dans le fond de cage pour faciliter son accès. La litière sera changée en fonction des besoins de chaque cage. Durant la phase de création de la lignée, les animaux bénéficieront du même raffinement.

Choix des espèces

L’étude des processus de progression tumorale ne peut s’effectuer que dans un organisme vivant proche de l’homme, en l’occurrence, le modèle souris. Celui-ci est aussi particulièrement adapté aux expériences d’infection bactérienne et d’étude de la perméabilité intestinale. Dans le modèle prédisposé à développer un cancer colorectal et invalidé pour la Tspan8, nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois correspondant respectivement à la période d’apparition des premières lésions et d’un stade avancé de développement tumoral. Pour le modèle uniquement invalidé pour la synthèse de la Tspan8, nous regarderons aux temps 2,3 et 4 mois les modifications de perméabilité de l’épithélium intestinal. La colonisation bactérienne sera suivi en temps réel 1fois/semaine.

Une phalange est coupée sur chaque souriceau entre son septième et son dixième jour de vie, pour l'identifier. Les mêmes souris développent à partir de quatre mois un cancer de la glande surrénale avec métastases pulmonaires, et reçoivent alors deux à trois injections par semaine pendant deux mois, seules ou combinées à une chimiothérapie. 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à six mois, au stade où la dissémination métastatique est jugée évidente. Le porteur ne mentionne comme nuisances que le stress de la contention et une douleur de faible intensité liée aux piqûres, sans un mot sur ce que représente pour l'animal un cancer métastatique laissé évoluer deux mois.

Objectifs

Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif avec un pronostic très défavorable, en grande partie à cause de l’absence de thérapies efficaces pour les patients atteints de carcinome cortico-surrénalien métastatique ou récurrent. En effet, le traitement standard actuel pour ces patients – la combinaison du mitotane avec la tri-chimiothérapie EDP (Etoposide, Doxorubicine et Platine) ne donne qu’une survie globale de 15 mois, soulignant la nécessité de développer de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer le potentiel thérapeutique de l’élimination des cellules sénescentes avec des sénolytiques seuls ou en co-thérapie avec l’étoposide dans un modèle métastatique de carcinome cortico-surrénalien cliniquement pertinent. Ceci devrait permettre d’améliorer le pronostic du corticosurrénalome, qui reste aujourd’hui défavorable.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Identification par phalangectomie : une phalange distale des souris nouveaux-nées sera coupée entre les premiers 7 et 10 jours de vie afin de permettre l’identification et le génotypage des individus. Le geste sera realisé une seule fois au cours de la vie de l’animal et ne durera que quelques secondes. - Injections intrapéritoneales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 128 souris (mâles et femelles confondus, âgées de 4 mois), seront injectées deux ou trois jours par semaine pendant 2 mois avec des sénolytiques seuls on en combinaison avec la chimiothérapie étoposide. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Échographie : realisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, 128 souris de 4 mois d’âge, mâles et femelles confondus, seront rasées sur les flancs et la taille de la tumeur sera mesurée à l’aide d’un échographe. Ce geste sera réalisé 3 fois par souris : une fois au début du traitement, une fois après un mois de traitement, et puis entre 72 et 48h avant la mise à mort de la souris, et ne durera que 30 minutes à chaque fois.

Impact sur les animaux

Bien que de courte durée (quelques secondes), la contention et les injections intrapéritoneales peuvent induire un stress et une douleur de faible intensité.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses ciblant le rôle des sénolytiques comme nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés ayant un potentiel comme agent antitumoral. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour faire des analyses moléculaires et l’autre pour des analyses histologiques.. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux injectés avec le sénolytique seul ou en combinaison avec l’étoposide seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, jusqu’à leur euthanasie. Les points limites de nos expériences sont déterminés en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Ainsi, les expériences seront arrêtées suite à la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Pour tous les signes indicateurs de douleurs (activité réduite, perte de poids, automutilation…) nous suivrons une échelle de points limites stricte et des analgésiques seront administrés si besoin.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La lignée utilisée permet l’inactivation de ces deux gènes dans le cortex de la glande surrénale. À partir de 4 mois, ces souris développent des corticosurrénalomes agressifs qui se manifestent par l’apparition de métastases pulmonaires. Afin d’évaluer le rôle antitumoral des sénolytiques sur des corticosurrénalomes à des stades avancés associés à une dissémination métastatique, les souris seront traitées avec le sénolytique seul ou en combinaison avec l’étoposide au moment où les premiers signes de malignité ont été détectés (4 mois) et jusqu’au moment où la dissémination métastatique est évidente (6 mois).

Opérées d'une splénectomie partielle sous anesthésie générale pour recevoir une injection de cellules tumorales, les souris de ce projet développent des métastases hépatiques. 787 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude pour analyse des cellules du foie. Certaines subissent en plus trois injections d'un inducteur sous anesthésie locale, deux gavages par sonde œsophagienne et un prélèvement de sang, le porteur reconnaissant que les métastases peuvent provoquer douleurs et perte de poids modérées. Le bénéfice annoncé reste une meilleure compréhension de la biologie des macrophages et l'espoir d'identifier des cibles thérapeutiques, quand les atteintes infligées aux souris sont immédiates et certaines.

Objectifs

Chaque année 1,4 million de nouveaux cas de cancer colorectal sont diagnostiqués dans le monde et 700 000 en meurs chaque année faisant de celui-ci la 2e cause de mort cancer. Environ 25% des patients présentent des métastases hépatiques, la résection des tumeurs est la meilleure option pour traiter ses métastases cependant seul 10 à 20% des patients y sont éligibles. Pour les patients atteints de métastases non-résécables, la survie ne dépasse pas les 2% à 5 ans. Par conséquent, il existe un besoin urgent pour de meilleures options thérapeutiques pour ces patients. Les tumeurs sont formées d’un ensemble de cellules cancéreuses et non-cancéreuses composant le microenvironnement tumoral (TME) telles que des cellules immunitaires. Parmi celles-ci, les macrophages associés aux tumeurs sont présents en abondance et sont associés à un mauvais pronostic. Notre laboratoire a démontré que les macrophages émergent lors de plusieurs vagues consécutives au cours du développement. En plus de ses particularités, l’effet du temps passé dans le tissu contribue à l’acquisition d’une signature unique. A Dans ce projet, nous avons pour objectif d’étudier avec précision les interactions locales et les fonctions de ce mélange hétérogène de macrophages d’ontogénie différentes dans le microenvironnement métastatique afin d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a le potentiel d'améliorer de manière significative notre compréhension de la biologie des macrophages dans le contexte des métastases hépatiques. Nous espérons que ce projet offre de nouvelles perspectives et stratégies concernant l'exploitation des macrophages à des fins thérapeutiques dans le cancer. Les découvertes liées à ce projet pourraient également avoir des portées plus larges applicables à d'autres maladies. Ce projet pourra apporter alors des avances majeures en termes de recherche fondamentale et translationnelle.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales après splénectomie partielle chirurgicale (n=1, durée 15 minutes sous analgésie et anesthésie générale). Certains animaux subiront également un prélèvement de sang (n=1, anesthésie locale, durée 1 minute maximum). Certains animaux auront 3 injections d'un inducteur (durée 15 secondes, anesthésie locale). Des animaux auront deux gavages (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

L'opération chirurgicale permettant l'injection de cellules cancéreuses dans la rate sous anesthésie et analgésie occasiionnera en elle-même une contrainte légère et temporaire. Le développement des métastases hépatiques représente une nuisance pour l'animal qui peut se manifester par des douleurs ou une perte de poids modérés. Les injections sous anesthésie locale représentent des contraintes légères liée à la contention. Le gavage représente une contrainte moyenne de courte durée liée à la contention et à l'introduction de la sonde dans l'œsophage: risque de douleur locale légère.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'étude pour analyses sur les cellules hépatiques.

Remplacement

Ce projet nécessite l'établissement des métastases dans des conditions réelles pour pouvoir étudier l'hétérogénéité des macrophages au cours du temps et en fonction de leur origine. Nous développons en parallèle des modèles types organoïdes pour récréer les tumeurs in vitro cependant cette approche ne permet pas actuellement de récapituler la complexité du microenvironnement tumoral qui est un paramètre fondamental de notre étude. De plus, notre stratégie est entre autres basée sur le suivi temporel de la différentiation des macrophages ayant colonisé le tissu métastatique à différents moments avant et durant le developpement de métastases. Si les organoïdes nous permettent d'étudier l'évolution tumorale sur quelques semaines, ils ne nous offrent pas la possibilité de l'étudier sur un lapse de temps comparable à nos modèles murins. Ainsi, l'utilisation de modèles animaux est indispensable à notre étude.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit a son minimum en suivant la littérature ou en utilisant des outils statistiques pour le calcul des effectifs. De nombreuses cellules dont certaines rares seront collectées après mise à mort pour pouvoir étudier l'implication de nos cellules d'interêt dans les métastases hépatiques au niveau cellulaire, moléculaire et transcriptomique. Chaque individu permettra de générer de très nombreuses informations.

Raffinement

Les souris sont sous surveillance clinique quotidienne pour une évaluation précise et stricte de leur état de santé. Des points limites précoces adaptés ont été définis et seront strictement appliqués. Nous avons adapté nos procédures pour limiter les nuisances et effets indésirables. Pour la chirurgie, les souris reçoivent une analgésie et sont sous anesthésie générale. Pour les injections, les souris recoivent une anesthésie locale ou générale en fonction du site d'injection et nous utilisons des aiguilles très fines . Pour les gavages nous utiliserons des sondes souples.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude car il nous permet d'utiliser des modèles de tumeurs issus de lignées cellulaires murines qui se rapprochent des pathologies humaines. Ses ressemblances en terme de physiologie nous permettent d'étudier le rôle du système immunitaire dans la tumorogénèse dans sa globalité. Animaux à maturité sexuelle entre 8 et 12 semaines, âge minimum de la maladie chez les patients.