Oncologie

Jusqu'à vingt et une injections, dix-huit séances de radiothérapie sous anesthésie et douze gavages pour un seul animal : 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un des modèles de cancer du sein employés provoque des métastases pulmonaires à partir de trente jours, avec une détresse respiratoire et la mort de l'animal. Le porteur affirme que les séances de radiothérapie n'entraînent aucune douleur et se dispense donc d'antidouleur, et qu'aucune toxicité n'est attendue aux doses employées. Le recours à des souris génétiquement homogènes est présenté comme permettant de travailler avec un nombre d'animaux "relativement réduit", ici 2 500.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer des combinaisons de Radiothérapie (RT) avec des médicaments anticancéreux. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association et les fractionnements (dose et nombre de séances de RT) afin de pouvoir développer des essais cliniques avec les schémas d’associations les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de RT guidée par l’image et dédié au petit animal, permettant de délivrer des traitements par RT similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce projet a été évalué et validé par le comité scientifique de notre établissement.

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer l’efficacité des traitements en optimisant des combinaisons innovantes, à la fois par l’évaluation de nouvelles combinaisons à bases de RT mais aussi l’optimisation des schémas de combinaisons (médicaments administrés avant, durant ou après la RT, et optimiser les doses et fractionnement de la RT…). Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les combinaisons les plus prometteuses en termes d’efficacité (évaluée par la croissance des tumeurs) sans induire de toxicités. Celles-ci pourront être sélectionnées pour le développement d’essais cliniques.

Procédures

- Injections: Une seule injection de cellules tumorales durant 5 secondes avec anesthésie des animaux sera nécessaire. Les médicaments anticancéreux seront aussi administrés par injection (3 injections/semaine pendant 1 mois soit 12 injections maximum) durant 5 secondes sur des animaux non anesthésiés ou vigiles suivant le site d'injection. Il y aura également 4 séances d'imagerie maximum par IRM et bioluminescence pour une durée entre 5 et 45 minutes qui nécessitera l'anesthésie des animaux et une injection (durant 5 secondes) par séance soit 8 injections maximum. Chaque animal pourra donc recevoir jusqu'à 21 injections maximum durant une procédure. - Gavage: admnistration durant 30 secondes de médicaments anti-cancéreux par voie orale sur des animaux non anesthésiés (3 gavages/semaine pendant 1 mois soit 12 gavages maximum) - Radiothérapie: Les animaux seront traités sous anesthésie gazeuse. Les séances de radiothérapie (jusqu’à 18 au maximum) pourront durer entre 1 minute et 5 minutes selon la technique utilisée et la dose délivrée. - Des prélèvements de sang durant 30 secondes et au nombre de 4 maximum réparties sur 3 semaines pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La pousse de la tumeur peut engendrer une douleur de faible intensité, des faibles pertes de poids et une légère gêne à la locomotion due à l’encombrement que la tumeur peut créer. Les séances de RT et les molécules thérapeutiques évaluées n’engendrent pas de nuisances aux animaux aux doses testées et à la durée des traitements réalisés. Les injections des médicaments seront réalisées à l’aide d’aiguille induisant une douleur légère de très courte durée. Un des modèles de cancer du sein testé peut entraîner le développement de métastases pulmonaires à partir de 30 jours après l’injection dans la glande mammaire des cellules tumorales pouvant provoquer une détresse respiratoire et donc entraîner une perte de poids et la mort de l’animal.

Devenir

Etant donné que les animaux auront reçu un traitement et une injection de cellules cancéreuses, ils ne pourront être utilisés pour une autre étude. Ainsi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des médicaments ou des nanoparticules, combinés à la RT, ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques (distribution, métabolisme, système immunitaire…) et donc d’étude sur animaux. De plus, l’étude de combinaisons avec des immunothérapies, nécessite de travailler sur des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la RT dépend du niveau d’oxygénation (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral (composé de différents types de cellules). Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études.

Réduction

Pour l’évaluation de l’efficacité d’une combinaison, il sera nécessaire de traiter 4 groupes d’animaux : 1) Contrôle ; 2) Molécule évaluée seule (chimiothérapie, thérapie ciblée, immunothérapie, nanoparticule…); 3) RT seule; 4) Combinaison molécule + RT. Nous prévoyons d’évaluer ces efficacités avec 10 souris par groupe. Ces effectifs tiennent compte de notre expérience sur la variabilité observée et permettent de pouvoir conclure à une potentielle supériorité des combinaisons en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, l’état des souris sera observé quotidiennement. Les injections des cellules cancéreuses sont réalisées sous anesthésie gazeuse, afin de réduire le stress et la souffrance de l’animal. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur évolution. Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie afin de maintenir les animaux immobiles et de réduire leur niveau de stress. Les animaux seront réveillés sous lampe chauffante pour éviter toute hypothermie puis replacés dans leur cage après chaque séance de RT d’une durée maximale de 5 minutes. La température moyenne dans la cabine d’irradiation est d’environ 25°c. Les séances de RT n’entrainent pas de douleur chez l’animal, elles ne nécessiteront donc pas l’emploi d’anti douleur. Aucune toxicité n’est attendue suite à la RT délivrée et les doses utilisées des médicaments associés seront celles utilisées usuellement en préclinique, commue pour ne pas induire de toxicité. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. Le groupe s’occupant du bien-être animal de notre établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Si besoin, les animaux recevront de l’alimentation gélifiée (pour limiter la déshydrations et/ou perte de poids. Un placement sous lampe chauffante sera mis en place en cas de diminution de la température corporelle des animaux.

Choix des espèces

Le modèle de souris est parfaitement approprié car les expérimentations sur cellules ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme complet, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeurs dans des souris de même type permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Les animaux seront utilisés à un âge minimum de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire fonctionnel et un poids corporel d’au moins 18-20 g afin d’avoir une efficacité homogène des médicaments.

Anesthésiées au gaz, injectées de cellules tumorales dans la patte arrière droite, puis gavées cinq fois et traitées par chimiothérapie, 924 souris sont mises à mort un, trois, cinq, huit et dix jours après les traitements. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. La tumeur dans la patte peut réduire leur mobilité et donc leur accès à la nourriture, une nécrose peut apparaître au point d'injection, et les chimiothérapies provoquent une perte de poids. Le porteur ajoute des croquettes au sol des cages pour compenser, et affirme qu'aucune douleur n'est attendue des injections puisqu'elles se font sous anesthésie gazeuse. Poumons, tumeurs, rates et ganglions sont prélevés après la mort.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Le régorafénib est un traitement utilisé dans le traitement de multiples cancers solides. En dépit des conséquences bénéfiques connues contre la tumeur après ce traitement, nous avons observé l’augmentation d’une population de cellules immunosuppressives. Le but de ce projet est d’évaluer si la combinaison du Régorafénib avec un autre traitement couramment utilisé contre, le cancer, la chimiothérapie 5-Fluorouracile (5-Fu), connue pour éliminer ce type de cellules immunosuppressives, permettrait d’obtenir une meilleure efficacité antitumorale et de comprendre pourquoi. Nous regarderons les conséquences de cette combothérapie sur la croissance tumorale et sur l’infiltrat immunitaire au cours du temps avec l’espoir de pouvoir prochainement proposer une nouvelle combinaison thérapeutique à tester en étude clinique.

Bénéfices attendus

Le cancer représente un enjeu majeur de santé publique, nécessitant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces et mieux tolérées par les patients. Ce projet s'inscrit dans une démarche appliquée visant à évaluer l'intérêt de la combothérapie associant le Régorafénib et le 5-Fu dans le modèle murin de cancer colorectal CT26. L'objectif est de déterminer si cette approche combinée permet d'améliorer l'efficacité du traitement en modulant favorablement l'environnement tumoral et en renforçant la réponse immunitaire antitumorale. En validant cette stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique, ce projet pourrait contribuer à l'optimisation des traitements actuels et ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques plus performantes et mieux tolérées en clinique.

Procédures

Les animaux sont injectés en sous-cutané dans la patte inférieure droite sous anesthésie gazeuse avec les cellules tumorales (5 minutes pour l’anesthésie et 30 secondes pour l’injection). Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes), une seule fois. Le gavage aura lieu 5 fois avec des sondes souples pour limiter le risque de blessures à l’œsophage. 1,3,5,8 et 10 jours après les traitements par chimiothérapie et Régorafénib, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort). Par la suite, les tumeurs, les ganglions drainants et rates sont récupérés (2 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales au niveau patte inférieur droite pourrait entrainer une diminution de la mobilité des souris. Cette diminution de mobilité pourrait diminuer la capacité des souris à se nourrir. L’injection des cellules tumorales se fait en sous-cutanée. De ce fait, nous pourrions observer des nécroses au niveau de la tumeur conduisant à une douleur chez l’animal. Les chimiothérapies utilisées peuvent entrainer une perte de poids chez les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons, tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 3 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections sous-cutanées (cellules tumorales), intra-péritonéales (traitements) et intra-veineuse (cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

La douleur est évaluée une fois par semaine, des points limites devant entraîner la mise à mort des souris qui se dégradent. 1 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Une chirurgie sous anesthésie générale implante des cellules tumorales dans le pancréas, puis viennent des échographies hebdomadaires sous anesthésie, une à deux séances de champs électriques pulsés par semaine et des injections dans la tumeur ou dans l'abdomen, chaque animal portant une électrode et son connecteur. L'objectif déclaré est de rendre l'environnement dense de la tumeur perméable à la chimiothérapie, les essais chez des personnes atteintes d'un cancer du pancréas étant renvoyés à plus tard.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic à cause d’un environnement tumoral dense empêchant la chimiothérapie d’atteindre sa cible, et d’une résistance à l’action du système immunitaire. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie et aux autres traitements d’être plus efficace. L’objectif de l’étude est d’observer si l’utilisation d’une thérapie par champ électrique pulsé permet de modifier l'environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains, en rendant les cellules tumorales plus perméables à la chimiothérapie et plus sensible à l’action du système immunitaire et ainsi améliorer l’efficacité des traitements existants. Ce projet est multi-site, l'implantation de tumeurs dans le pancréas se faisant dans l'animalerie 1, les examens et la suite du projet sont réalisés dans l'animalerie 2.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le traitement par champ électrique pulsé et réversible ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais thérapeutiques ultérieurs chez des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Intervention chirurgicale sous anesthésie générale (15 min maximum/souris) pour l’implantation des cellules tumorales. Alternativement, injection sous-cutanée de cellules tumorales (15 sec/souris). Suivi hebdomadaire de croissance tumorale par échographie sous anesthésie (8 min/souris). 1 à 2 traitements par champs électrique pulsé et réversible une fois par semaine (3 min/souris). Pour certains animaux, injection intrapéritonéale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine) ou injection intratumorale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine). Mesures de certains paramètres par injection intra-abdominale ou injection intraveineuse (20 min/souris, sous anesthésie générale), suite à une injection sous-cutanée d’antalgique 30 min avant (10 sec/souris).

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer une perte de poids et des signes de souffrance. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales cause une douleur modérée et un stress. Le suivi de la croissance tumorale hebdomadaire sous anesthésie peut causer du stress chez la souris. Les traitements par champs électrique peuvent causer un stress chez les animaux et des douleurs modérées. Les injections sous-cutanées pour soulager la douleur ou intrapéritonéales et intratumorales pour le traitement peuvent causer une douleur légère chez la souris. Les injections intrapéritonéales pour la réalisation de mesures invasives peuvent causer des douleurs et un stress pour les animaux. Le transport entre les animaleries 1 et 2 peut provoquer un stress léger. La présence de l'électrode et connecteur peuvent causer un inconfort léger chez la spuris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, pour analyses ex vivo des organes.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer les réglages à utiliser pour les champs électriques pulsés et réversibles et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral permise par un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentielles et limitant le degré de souffrance des souris, les tumeurs étant détectées très tôt.

Raffinement

Le suivi de la douleur sera réalisé une fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort de l’animal si nécessaire. Un suivi est prévu toutes les semaines en post opératoire et après injection des traitements. L’échographie sera réalisée sous anesthésie générale, à celle-ci on ajoutera une analgésie adaptée lors de la chirurgie et des traitements et mesures. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages disposant d’enrichissement. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle permettant de mimer les tumeurs du pancréas humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge adulte (8 à 10 semaines) afin de documenter l’impact des traitements sur un organisme mature.

Injectées d'un produit conditionnant leur organisme, puis greffées de cellules leucémiques dans la circulation sanguine, 120 souris subissent des prises de sang toutes les deux semaines pendant trois mois. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et la leucémie qui se développe provoque une anémie, un amaigrissement et une augmentation de la rate. Le porteur décrit des cultures en trois dimensions et des organoïdes de moelle osseuse capables selon lui de recréer un environnement proche du corps humain et de donner des résultats plus réalistes sans utiliser d'animaux, et retient malgré tout la greffe chez la souris. Le prélèvement de moelle osseuse et de sang après la mort est qualifié d'"indispensable".

Objectifs

Il s’agit d’étudier l’impact de l’absence d’une enzyme sur le développement des leucémies aiguës myélobastqiues.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM), un type de cancer du sang. 1 - Avancées scientifiques • Mieux comprendre comment l'absence d’une enzyme influence le développement des leucémies. • Étudier l’impact de cette enzyme sur la survie des cellules cancéreuses. • Tester ces découvertes dans un modèle de souris pour confirmer les résultats obtenus en laboratoire. 2 - Développement de nouveaux traitements • Identifier de nouvelles cibles pour des traitements contre la leucémie. • Concevoir des médicaments capables de ralentir la progression de la maladie. 3 - Amélioration du diagnostic et du suivi des patients • Trouver de nouveaux indicateurs permettant de mieux prédire la résistance aux traitements. • Adapter les soins en fonction du profil biologique de chaque patient. 4 - Impact pour les patients • Développer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. • Réduire les effets secondaires des chimiothérapies en combinant différents types de traitements. • Mettre en place une meilleure surveillance après le traitement pour éviter les rechutes. • Proposer des soins plus personnalisés et adaptés à chaque patient. 5 - Retombées sociétales et économiques • Faire avancer la recherche sur les leucémies et d'autres cancers. • Réduire les coûts des traitements en diminuant les hospitalisations et en évitant l'utilisation de médicaments inefficaces. Conclusion En résumé, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre la leucémie, d'améliorer les traitements actuels et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques plus ciblées.

Procédures

1 – Contention • Les souris seront manipulées avec précaution pour minimiser le stress lors des différentes interventions, en utilisant des techniques adaptées de contention douce. • Une attention particulière sera portée à la durée de la contention afin de limiter son impact sur les animaux. 2 - Injections et conditionnement préalable • Les souris recevront un traitement par injection d’un médicament avant l’injection des cellules leucémiques. Ce traitement vise à préparer leur organisme à recevoir les cellules. • Nombre d’animaux concernés : 120 souris • Durée : une seule injection 24 heures avant la greffe des cellules. 3 - Greffe de cellules leucémiques • Les souris recevront une injection de cellules leucémiques dans la circulation sanguine pour reproduire un modèle de la maladie. • Nombre d’animaux concernés : 120 souris • Durée : une seule injection, environ 1 minute. 4 - Suivi de la maladie • Des prises de sang seront réalisées toutes les deux semaines (jusqu’à 3 mois après l’injection des cellules leucémiques) afin de surveiller l’évolution de la leucémie et d’analyser la réponse immunitaire. • Nombre d’animaux concernés : 120 souris • Durée : environ 1 minute par prise de sang

Impact sur les animaux

Malgré toutes les précautions prises pour assurer leur bien-être, certains effets secondaires sont attendus en raison de la nature de l’étude. Effets liés aux interventions expérimentales • Les traitements administrés avant l’injection des cellules leucémiques peuvent provoquer une fatigue passagère et une légère perte de poids. • Les prises de sang régulières, nécessaires au suivi de la maladie, peuvent entraîner un certain stress. Pour limiter cet inconfort, des techniques adaptées seront utilisées. Effets liés au développement de la maladie • La progression de la leucémie peut causer une anémie (diminution des globules rouges), une perte d’énergie, un amaigrissement et une augmentation de la taille de certains organes comme la rate.

Devenir

Mise à mort des animaux pour analyses scientifiques Toutes les souris seront mises à mort pour des analyses approfondies qui concernent principalement la moelle osseuse et le sang, éléments essentiels pour comprendre l’évolution de la maladie. • Justification : ces examens sont indispensables pour valider les hypothèses scientifiques du projet et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie. • Méthode : la mise à mort sera réalisée selon des protocoles stricts garantissant une mort rapide et sans douleur, conformément aux réglementations en vigueur sur le bien-être animal.

Remplacement

Stratégies de remplacement de l’expérimentation animale Afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, plusieurs méthodes alternatives seront utilisées pour mener cette étude sur la leucémie. 1. Expériences en laboratoire sur des cellules humaines • Des cultures de cellules leucémiques humaines seront utilisées pour observer comment une enzyme influence leur croissance et leur évolution. • Des modèles plus avancés, appelés cultures 3D et organoïdes de moelle osseuse, seront développés pour recréer un environnement proche de celui du corps humain. Cela permettra d’obtenir des résultats plus réalistes sans utiliser d’animaux. 2. Analyses informatiques et exploitation des données existantes • Des bases de données contenant des informations sur des patients atteints de leucémie seront analysées afin de repérer d’éventuels liens entre l’expression d’une enzyme et la progression de la maladie. • Ces approches bioinformatiques permettront de générer des hypothèses solides avant de tester de nouveaux traitements, réduisant ainsi le besoin d’expériences sur des animaux. 3. Études sur des cellules humaines en dehors du corps (ex vivo) • Des cellules souches du sang seront cultivées dans des conditions spécifiques pour étudier le rôle d’une enzyme sans passer par des tests sur des souris. • Des échantillons de moelle osseuse prélevés chez des patients atteints de leucémie permettront de valider les résultats obtenus en laboratoire. Conclusion L’objectif est d’utiliser autant que possible ces alternatives avant d’envisager l’expérimentation animale. Cependant, certaines questions scientifiques nécessitent encore un modèle biologique complet pour être étudiées, ce qui justifie l’utilisation de souris lorsque les autres méthodes ne suffisent pas.

Réduction

Ce projet met en place plusieurs approches pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant des résultats fiables et exploitables. 1. Optimisation des protocoles expérimentaux • Une planification minutieuse des expériences permettra de réduire le nombre de souris nécessaires tout en obtenant des données statistiquement significatives. • Chaque animal sera utilisé pour plusieurs types d’analyses afin de maximiser les informations obtenues, évitant ainsi d’avoir recours à un plus grand nombre de sujets. 2. Expériences préliminaires avant les tests sur animaux • Des tests seront d’abord réalisés sur des cultures cellulaires (in vitro) et des échantillons biologiques (ex vivo), afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes avant de passer à des essais sur animaux. • Cela permettra d’éviter des expériences inutiles et de limiter le nombre de souris impliquées. 3. Utilisation de méthodes statistiques avancées • Des outils statistiques performants seront employés pour garantir des résultats fiables avec le plus petit nombre d’animaux possible. • Ces méthodes permettent d’optimiser les groupes expérimentaux en veillant à ce que chaque test apporte un maximum d’informations. 4. Partage des ressources et des résultats avec d’autres laboratoires • Une collaboration avec d’autres équipes de recherche permettra d’éviter de répéter des expériences déjà réalisées ailleurs. • L’exploitation de bases de données existantes sur la leucémie permettra d’affiner les hypothèses sans multiplier les tests sur animaux. Conclusion Grâce à ces stratégies, le recours aux animaux sera limité au strict nécessaire. Ces mesures s’inscrivent dans une démarche responsable et éthique, visant à réduire l’impact de l’expérimentation animale tout en poursuivant des avancées scientifiques essentielles pour la lutte contre la leucémie.

Raffinement

Afin de limiter le stress et la souffrance des animaux tout en garantissant des résultats scientifiques fiables, plusieurs mesures seront mises en place. 1. Techniques expérimentales adaptées pour minimiser l’inconfort • Les injections et prélèvements sanguins seront réalisés avec des techniques optimisées pour réduire la douleur et le stress des animaux. • Les expérimentateurs seront spécialement formés pour effectuer ces manipulations rapidement et avec le plus grand soin. 2. Surveillance attentive pour prévenir la souffrance • Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de détresse ou de douleur. • Des critères stricts seront appliqués : si un animal montre des signes avancés de souffrance ou de détérioration de son état de santé, il sera mis à mort de manière éthique et sans douleur pour éviter toute souffrance prolongée. 3. Amélioration des conditions de vie • Les souris seront élevées dans un environnement enrichi, comprenant des tunnels, des cachettes et une litière adaptée, afin de favoriser leur bien-être et de réduire leur stress. • Elles seront logées en petits groupes compatibles pour éviter l’isolement et favoriser un comportement naturel. 4. Formation et encadrement des chercheurs • Tous les chercheurs impliqués recevront une formation continue aux meilleures pratiques en expérimentation animale, pour garantir des manipulations respectueuses et éthiques. • Un dialogue constant sera maintenu avec le comité d’éthique et les spécialistes du bien-être animal, afin d’améliorer en permanence les protocoles et de s’assurer qu’ils respectent les dernières recommandations en matière de protection animale. Conclusion Grâce à ces mesures, l’impact des expériences sur les animaux sera réduit au minimum, tout en garantissant des conditions de vie optimales et un suivi rigoureux de leur bien-être.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette étude car elle représente un modèle particulièrement adapté à la recherche sur la leucémie humaine. Pourquoi utiliser la souris ? • Une grande similarité avec l’humain : le système de production des cellules sanguines (hématopoïèse) chez la souris fonctionne de manière très proche de celui de l’être humain. Cela permet de reproduire fidèlement les mécanismes impliqués dans le développement de la leucémie. • La possibilité de modifier son patrimoine génétique : grâce à des modèles génétiquement modifiés, les chercheurs peuvent étudier avec précision l’effet de l’absence d’une enzyme sur la maladie. • Une expérimentation contrôlée : la souris permet de tester l’évolution de la leucémie dans un organisme vivant, en réalisant des injections de cellules leucémiques, des traitements et des analyses de sang dans des conditions proches de celles utilisées en milieu clinique. • Un modèle rapide et efficace : les souris ont une durée de vie courte et se reproduisent rapidement, ce qui permet d’obtenir des résultats en un temps relativement réduit et d’évaluer l’évolution de la maladie sur plusieurs générations de cellules. Pourquoi utiliser des souris adultes ? Les études seront débutées sur des souris à un âge compris entre 8 et 12 semaines, car : • À cet âge, leur système sanguin est totalement formé et stable, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. • Leur taille et leur maturité physiologique facilitent les procédures expérimentales, comme les prélèvements et injections.

Une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis jusqu'à quatre injections d'immunothérapie : 1 008 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. La croissance des tumeurs est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et le porteur indique qu'une crevasse ou une nécrose de la peau peut apparaître en fin de croissance tumorale. L'objectif déclaré est de savoir si une masse musculaire augmentée ralentit des tumeurs colorectales, hépatiques ou des mélanomes en modifiant la réponse immunitaire, avec un potentiel de transfert vers la clinique annoncé comme fort. Une partie des animaux est déficiente pour le gène de la myostatine, ce qui décuple leur masse musculaire, et le porteur décrit la souris comme la seule espèce où de telles mutations s'introduisent facilement.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de déterminer si l’augmentation de la masse musculaire permet de réduire la résistance des tumeurs colorectales, hépatiques et du mélanome à l’action antitumorale des cellules immunitaires en réponse à un traitement par immunothérapie dans des modèles murins de cancer colorectal, de carcinome hépatocellulaire ou de mélanome sous-cutanés chez les mâles et les femelles. Il a été mis en évidence qu’une masse musculaire décuplée chez des animaux déficients pour le gène de la myostatine est associée à une croissance tumorale ralentie et à une formation de polypes intestinaux moindre. Cependant, l’implication potentielle du système immunitaire dans ce processus n’a pas été évaluée et l'impact d'une masse musculaire supérieure sur la réponse à l'immunothérapie n'a jamais été étudiée chez ces souris transgéniques. Nous effectuerons des suivis de croissance tumorale et des isolements de cellules immunitaires infiltrant les tumeurs chez des animaux contôles ou déficients en myostatine traités ou pas par immunothérapie. Diverses équipes nationales et internationales étudient l’impact du cancer sur la perte de masse musculaire et la cachexie mais aucune n’a à ce jour exploré l’effet d’une masse musculaire préservée sur la réponse immunitaire antitumorale en utilisant notamment le modèle de souris déficient pour la myostatine. D'autre part les investigations menées à la fois chez les mâles et les femelles permettront d'évaluer l'effet immunorégulateur du sexe dans l'interaction entre le muscle et le système immunitaire dans un contexte de cancer.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle immunomodulateur du muscle dans un modèle préclinique afin de fournir un rationnel scientifique pour proposer des stratégies adaptées de maintien de la masse musculaire chez la patiente ou le patient atteint d'un cancer digestif ou d'un mélanome dans le but d'améliorer sa réponse à l'immunothérapie et de favoriser des rémissions à long terme. Le potentiel de transfert des résultats de ce projet vers une application clinique faisable est fort.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection d'une solution saline contenant les cellules tumorales d'une durée d'environ 10 secondes et entre 0 à 4 injections d'immunothérapie d'une durée d'environ 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux concernent: - le stress et la légère douleur lors de l'injection des cellules tumorales et des traitements - la douleur modérée possible en fin de croissance tumorale. En effet, l'apparition d'une crevasse ou d'une nécrose de la peau au niveau de la tumeur peut survenir, ce qui est vérifié au cours du suivi des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses cellulaires, biochimiques et moléculaires ultérieures.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, les évaluations de nouveaux agents thérapeutiques en oncologie doivent être réalisées sur les organismes vivants.

Réduction

Si le génotype n'a aucun effet sur l'efficacité de l'immunothérapie lors de l'expérience 2, les expériences suivantes visant à évaluer les modulations précoces de la réponse immunitaire et les réponses immunitaires mémoires ne seront pas réalisées. Aussi, si le sexe n'impacte pas les expériences 1 et 2, un seul sexe sera choisi pour les expériences 3 et 4. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.

Raffinement

L'expérimentateur est formé et expert des modèles tumoraux garantissant des gestes techniques maîtrisés et une manipulation adéquate des animaux. La taille des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse. Cela permettra de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Ce suivi individuel permettra la surveillance du bien-être des animaux qui seront hébergés par groupe de cinq à six dans un établissement agréé. Dans le cas où certaines souris seraient proches d’un point limite, la surveillance deviendra quotidienne. Si un animal présente des signes de souffrance, les mesures nécessaires seront prises pour limiter la souffrance animale et un traitement pourra être administré selon les recommandations d'un vétérinaire.

Choix des espèces

La souris, outre l’avantage lié à ses caractéristiques physiologiques, est la seule espèce animale pour laquelle des mutations génétiques peuvent être relativement facilement introduites et générer ainsi des souris déficientes pour une cible particulière donnée. Ces modèles murins très standardisés permettent une meilleure reproductibilité de nos expériences. Enfin les outils d'évaluation du système immunitaire, notamment les anticorps pour la cytométrie de flux, sont très développés et nombreux chez la souris ce qui permet une investigation approfondie des diverses populations cellulaires d'intérêt. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 12 et 20 semaines d’âge) pour la mise en oeuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et une croissance musculaire stabilisée.

L'expérience s'arrête quand une souris perd 20 % de son poids ou quand sa tumeur cutanée dépasse 17 millimètres de diamètre, s'ulcère ou s'infecte. 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des organes lymphoïdes. Elles reçoivent une à deux injections dans le sinus derrière l'œil, des cellules tumorales sous la peau après rasage, ou une infection par Listeria monocytogenes qui peut provoquer diarrhées et léthargie. Le porteur qualifie ces injections d'actes "ne générant aucun stress", et retient la souris au motif que 99 % de ses gènes sont orthologues à ceux de l'être humain.

Objectifs

Les réponses immunitaires efficaces contre les cellules cancéreuses et les pathogènes sont le résultat de processus cellulaires complexes et hautement coordonnés. Au cours des dernières décennies, d'importants efforts de recherche ont montré que les lymphocytes T jouent un rôle central dans le développement de ces processus. Le développement d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaire est apparu comme un mode d'action efficace pour renforcer l'activation des lymphocytes T contre les cellules cancéreuses et à l’inverse pouvant contrôler les réponses auto-immunitaires. Les thérapies basées sur les récepteurs antigéniques chimériques constituent une deuxième approche fructueuse et offrent un moyen unique d'armer les lymphocytes T pour éliminer les tumeurs exprimant des antigènes spécifiques. Cependant, malgré le succès remarquable de l'immunothérapie, tous les patients ne répondent pas aux nouveaux traitements et certains développent des signes cliniques liés à des effets secondaires nocifs. La régulation de l’activation des lymphocytes T implique de nombreux acteurs moléculaires. À cet égard, le ciblage des composants moléculaires impliqués dans la signalisation des cellules T est très prometteur pour contrôler leurs fonctions effectrices. Dernièrement, il a été identifié une molécule appelée Intersectine 2 (ITSN2) qui semble contrôler les niveaux d’expression de récepteurs activateurs présents à la surface des lymphocytes T. L’analyse de la souris déficiente pour l’ITSN2, démontre un phénotype activé des lymphocytes T (mais pas de phénotype dommageable pour la souris). Le but de notre étude est donc d’évaluer dans quelle mesure l’inactivation de l’ITSN2 dans des modèles murins permettent de mieux contrôler le développement de tumeurs, d’infections ou l’apparition de maladies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôle l’activation des lymphocytes T. Les expériences réalisées avec les modèles murins que nous possédons permettra d’identifier dans quelle mesure l’ITSN2 pourrait être une cible pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses mais aussi dans l’auto-immunité.

Procédures

Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress. Une à deux injections seront effectuées par souris, la procédure ne durera que quelques minutes. Les injections de cellules tumorales en sous-cutané seront également réalisées sous anesthésie gazeuse ne générant aucun stress et ne prendront que quelques minutes également. La contention pour raser les souris le jour précédant l’injection sous cutanée de cellules tumorales pourra générer un stress de courte durée qui sera minimiser la réalisation du geste par du personnel expérimenté.

Impact sur les animaux

Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress. Une à deux injections seront effectuée par souris (selon la procédure), la procédure ne durera que quelques minutes. La croissance tumorale pourra conduire à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères. L’infection avec Listeria monocytogenes à des doses sub-léthales, est normalement contrôlé par le système immunitaire des souris de la souche C57BL/6. Les souris pourraient avoir une perte d’appétit, développer des diarrhées et être dans un état léthargique dans les premiers jours suivant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, l'analyse des réponses immunitaires nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.

Remplacement

L’étude de processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte tumoral ou auto-immunitaire ne peut être réalisée à ce jour qu’à l’aide de modèles in vivo. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est indispensable.

Réduction

Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale. Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature, nous savons que des groupes de 6 animaux, analysés avec un test statistique nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en triplicat pour être publiables.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subi par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation de cellules tumorales, injection intraveineuse, immunisation). Suite à l’injection de cellules tumorales, de L. Monocytogenes ou à une immunisation, nous porterons une attention particulière à la taille de la tumeur (cas des tumeurs), au poids de l’animal mais aussi à leur posture et leur comportement en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement post injection par les zootechniciens et un score prenant en compte des paramètres tels que l’apparence physique, la capacité à s’alimenter et à s’abreuver, le comportement et la réponse aux stimuli. Pour une souffrance avérée, un traitement analgésique sera mis en place en plus des mesures précédentes qui seront poursuivis. Dans le cas d'une croissance tumorale, en plus des paramètres suivis, l’aspect de la tumeur sera monitoré et les mesures de raffinement seront adaptés. Une perte de poids supérieure ou égale 20% par rapport au début de l’expérience, une tumeur cutanée de diamètre supérieur à 17mm ou une ulcération et/ou infection de celle-ci sera un critère d’arrêt de l’expérimentation. Pour toute expérience nécessitant une manipulation de l’animal, ceux-ci seront anesthésiés avec les méthodes autorisées. Les animaux sont hébergés dans des cages dont la surface est de 500 cm2.

Choix des espèces

Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de lymphocytes B et T en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge des souris adultes de 7 à 12 semaines seront utilisées.

Pêchés à l'épuisette sans anesthésie, transportés dans un seau opaque, isolés vingt-quatre heures dans un bassin où la température de l'eau descend à 7 °C puis monte jusqu'à 32 °C, 100 bars juvéniles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération se répète jusqu'à cinq fois par poisson, et chaque individu est pesé sous anesthésie toutes les six semaines, jusqu'à douze fois. Le porteur qualifie de "légère" la nuisance aux températures intermédiaires et de "modérée" celle des températures extrêmes chaudes, maintenues moins de deux heures. Après sept jours de retour dans leur bac d'origine, tous les bars sont tués pour prélever leur cœur, leur foie, leur cerveau et leur muscle rouge.

Objectifs

Dans ce projet, nous évaluerons l’impact d’un réchauffement de l’environnement sur la capacité du bar européen à tolérer ou fuir une augmentation de la température de l’eau de son milieu naturel. L’objectif du projet est de déterminer à quelle température il préfère résider ; ainsi qu’à partir de quelle température il fuit, et si ces températures préférées de l’animal sont corrélées aux températures optimales de la centrale énergétique de leur cellule. Le modèle bar est choisi car au stade juvénile, le bar réside dans les estuaires, qui sont extrêmement sujets aux variations thermiques spatiales et temporelles. L’efficacité de la centrale énergétique de la cellule à convertir l’énergie des nutriments en énergie utilisable par les cellules sera aussi mesurée à différentes températures. La corrélation entre la température optimale d’efficacité de la centrale énergétique de la cellule et la température préférée de l’animal sera évaluée. Nous prédisons que la préférence thermique des bars juvéniles s’explique par l’optimum thermique du fonctionnement de leur centrale énergétique cellulaire. Les individus qui passent plus de temps dans une eau relativement chaude ont des centrales énergétiques cellulaires qui ont une efficacité maximale à des températures plus élevées que les individus qui préfèrent les eaux moins chaudes. Les données de ce projet nous fourniront des prédictions quant au comportement et à la physiologie des bars juvéniles dans les nourriceries lors d’évènements de chaleur aigus.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’acquérir des connaissances fondamentales sur le comportement et la physiologie du bar sauvage face aux variations temporelles et spatiales de son environnement thermique. A court terme, ce projet nous permettra de mesurer la préférence thermique du poisson sans le contraindre à rester dans un environnement qu’il aurait naturellement fui. Ce projet permettra de savoir si la température préférée de l’animal est corrélée à la température optimale du fonctionnement des centrales énergétiques cellulaires. Ce projet permettra aussi d’évaluer l’effet du conditionnement thermique (15°C et 20°C) sur la température préférée de l’animal et l’optimum thermique des centrales énergétiques cellulaires. A long terme, la réalisation de ce projet nous aidera à mieux mettre en place la surveillance des poissons in situ dans le but d’évaluer leur utilisation de l’espace en fonction de leur environnement thermique. Des connaissances manquent sur les réponses des poissons face aux vagues de chaud. On ne sait pas où se déplacent les animaux dans la journée, en fonction des changements de température réguliers et extrêmes. L’étude de la préférence thermique des poissons nous aidera à prédire leur déplacement sur la côte. Les données de ce projet nous fourniront aussi des prédictions quant à la mise en place des récepteurs dans les nourriceries de bars afin d’évaluer les déplacements des poissons marqués.

Procédures

Chaque poisson aura au maximum 5 pêches et transferts sans anesthésie (4 aller-retours du bac d’élevage au dispositif de mesure de la préférence thermique et l’aller pour la mise à mort) de moins de 3 minutes par transfert. Chaque poisson sera isolé pendant 24h avec une variation de température (par rapport à la température de conditionnement : refroidissement de 8°C et réchauffement de 12°C) qu’il pourra fuir pour retourner à une température préférée. Cette étape sera répétée au maximum 2 fois. Une seule pesée sans anesthésie dans une bassine avec de l’eau sera réalisée suite à la mesure de la préférence thermique, avant le retour vers le bac d’origine. Au préalable de la mesure de la préférence thermique, les poissons seront pesés toutes les 6 semaines sous anesthésie, et au minimum 3 semaines avant la mise à mort pour mesurer le fonctionnement des centrales énergétiques. Cette procédure sera répétée au maximum 12 fois.

Impact sur les animaux

Pour transférer les poissons de leur bac d’origine aux bacs de test et inversement, chaque poisson sera pêché individuellement sans anesthésiant avec une épuisette pour être déposé dans un seau de transport à couvercle opaque. L’animal sera transporté dans le seau sur une courte durée du bac d’élevage au bassin expérimental (3 min, < 100m). L’animal sera ensuite maintenu individuellement dans le bassin expérimental pendant 24h. Après 12h d’habituation dans le bassin expérimental, la température de l’eau d’une des 2 piscines va être diminuée puis augmentée par tranche de 2h (1h de transition + 1h de pallier). Pour les poissons conditionnés à 15°C, la température sera diminuée à 7°C et 11°C, puis augmentée à 19°C, 23°C et 27°C. Pour les poissons conditionnés à 20°C, la température sera diminuée à 12°C et 16°C, puis augmentée à 24°C, 28°C et 32°C. La nuisance générée est estimée légère pour les températures intermédiaires (

Devenir

Les animaux retourneront dans leur bac d’origine pour 7 jours. Puis leur mise à mort sera nécessaire pour prélever les tissus (cœur, foie, cerveau et muscle rouge) pour mesurer les performances mitochondriales.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation animale permet de réaliser une étude qui englobe l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques. Cela permet notamment de caractériser le résultat d’interactions complexes entre différents tissus et fonctions cellulaires, offrant ainsi la possibilité d’avoir un suivi complet des réponses des centrales énergétiques cellulaires face à l’environnement de l’animal.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et basé sur nos études précédentes qui montrent une relation statistique significative entre les performances animales et le fonctionnement des centrales énergétiques cellulaires à partir de n = 40 par conditions expérimentales.

Raffinement

- Le transfert de chaque poisson entre les bacs d’origine et le bac de test (< 100 m) se fera dans un seau avec un couvercle opaque afin de limiter l’émersion du poisson et diminuer le stress généré par cette manipulation. - Une fois le poisson déposé dans le dispositif expérimental, il sera surveillé (via une caméra) par un expérimentateur pendant 10 minutes. Si le poisson est toujours extrêmement agité, au bout de 10 min, il retournera à son bac d’origine. - Le poisson s’acclimatera dans le dispositif expérimental pendant 14h (une nuit) sans subir de changement de température. - Lors de la mesure de la préférence thermique, l’animal choisira toujours sa température préférée, sans contrainte. - Il sera transféré du dispositif expérimental à son bac d’origine (et inversement) sans changement de température afin qu’il ne soit exposé à aucun choc thermique. Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état des poissons sera réalisée. Des points limites suffisamment stricts et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Le bar européen est une espèce largement distribuée en Europe et une ressource économique et nutritive pour de nombreux pays. Il est donc important de prédire les réponses du bar face au réchauffement climatique. Juvénile – entre 0 et 1 an, car au stade juvénile, le bar réside dans les estuaires, qui sont extrêmement sujets aux variations thermiques spatiales et temporelles. En novembre 2024, les animaux avaient un poids de 28 g et une longueur totale de leur corps de 13.4 cm.

L'abdomen de chaque souris est ouvert sous anesthésie pour implanter des cellules tumorales dans la paroi du cæcum ou dans le foie, en quinze minutes. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des traitements injectés trois fois par semaine pendant trois semaines et deux séances d'imagerie hebdomadaires. Toutes sont tuées à la fin, y compris celles dont la tumeur régresse totalement et qui sont alors gardées deux mois de plus sous surveillance par imagerie. Le porteur range ces injections répétées et les anesthésies parmi les nuisances "fugaces" et "passagères", tout en reconnaissant que la croissance des tumeurs et l'apparition des métastases sont elles-mêmes sources de souffrance.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des systèmes de blocage pour inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale (ex : anti-PD1). Des thérapies ciblant l’inactivation de PD1 ont été développées pour rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements. Notre projet a pour but de démontrer que la déplétion des cellules CD4 de la souris permet à cette thérapie anti-PD1 d’être efficace contre les tumeurs implantés dans leur organe d’origine. En effet, la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 a déjà été montrée efficace dans des tumeurs implantées en sous-cutanée dans la souris. Le microenvironnement jouant un rôle important dans la réponse anti-tumorale, nous nous proposons ici d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 dans un modèle de cancer du côlon et dans un modèle de métastase hépatique d’origine colique.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses anti-tumorales grâce au blocage des « immune checkpoints » a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré dû à la présence de résistances à ces thérapies. Ce projet permettra donc de montrer l’implication des lymphocytes T CD4 dans la résistance aux traitements anti-PD1 et ainsi de confirmer l’intérêt de trouver et de tester des molécules bloquant ces cellules chez l’Homme afin d’améliorer les thérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 pour réaliser les traitements en intrapéritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum et dans le foie sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes. Les injections intrapéritonéales de traitements, de luciférase et d’antibiotiques, ainsi que les injections sous-cutanées de buprénoprhines sont une source de nuisances fugaces La manipulation des souris lors des injections des traitements et lors des imageries est une nuisance. Les infections liées à la chirurgie sont un risque de fréquence rare vue les mesures mises en place (stérilité, antibiothérapie). Les anesthésies mises en place lors de la chirurgie et des imageries sont également une source de nuisance passagère.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictif, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant.

Réduction

Pour chaque traitement à tester Control, a-CD4, a-PD1 et a-CD4+ a-PD1 (4), 4 groupes de 5 souris seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité du traitement tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 4 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Toutes les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Les souris recevant une chirurgie nécessitant l’ouverture de la cavité abdominale, recevront une antibiothérapie préventive avant chaque chirurgie. Les procédures telles que l’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie à l’isoflurane suivie d’un réveil sous lampe chauffante (EU2) ou couveuse (EU1), réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être en permanence contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée : 0.1 mg/kg de buprénorphine en pré-opératoire, de la lidocaïne en application locale sous forme de gel lors de la chirurgie et 0.1 mg/kg de buprénorphine seront injectées en sous-cutanée 2X par jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Les animaux seront transférés de l’EU1 à l’E2 (bâtiments situés proches l’un de l’autre) dans un sac de transport et le plus rapidement possible pour ne pas engendrer de stress.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes C57Bl/6, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Toutes mises à mort sous anesthésie pour que leurs organes soient prélevés, 65 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est mise à jeun six heures, reçoit une injection d'analgésique puis d'anesthésique, subit une laparotomie, une ligature de l'œsophage, un cathétérisme du canal biliaire et un prélèvement sanguin intracardiaque. L'objet du projet est de mesurer les sécrétions digestives de souris privées du récepteur des lipides dans les papilles gustatives, pour préciser le rôle de la langue dans le goût du gras. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer à l'animal vivant, décrit sa lignée comme "indispensable", et annonce une étude pilote sur cinq mâles reproducteurs pour vérifier que la chirurgie est faisable à quatre mois.

Objectifs

Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. C’est plus précisément les récepteurs gustatifs, exprimés par les cellules des bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) qui permettent la détection des saveurs. Les récepteurs de lipides exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Le signal gustatif est transmis au cerveau par les nerfs gustatifs, conduisant à une augmentation des sécrétions digestives préparant le corps à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue – cerveau – intestin. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas le récepteur principal des lipides ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras, due à une altération de l’axe langue – cerveau – intestin, avec notamment une diminution des sécrétions digestives déclenchées lors d’une application linguale de lipides. Comme ce récepteur est exprimé dans plusieurs tissus et organes, il a été difficile de déterminer chez ces souris, le rôle oral dans les effets observés. Ainsi, des souris génétiquement modifiées qui n’expriment pas le récepteur principal des lipides uniquement dans les papilles gustatives ont été générées. Le but de ce projet est de continuer d’étudier le rôle du récepteur principal aux lipidessur la langue dans l’activation des sécrétions digestives chez les souris qui n’expriment pas ce récepteur dans les papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description d’une nouvelle souche de souris génétiquement modifiées qui n’exprime pas le récepteur principal des lipides dans les papilles gustatives et qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard et sera pesé de façon hebdomadaire. Six heures avant la manipulation, les souris seront mises à jeun (de nourriture seulement). Lors de la manipulation, une injection sous-cutanée d’analgésiant puis une injection intrapéritonéale d’anesthésiant seront effectuées. Un anesthésique local sera également appliqué. Les souris endormies seront tondues au niveau de l’abdomen. Une laparotomie, une ligature de l’œsophage et cathétérisation du canal biliaire seront réalisés sous anesthésie générale. Un prélèvement sanguin intracardiaque (sous anesthésie toujours) sera réalisé puis les souris seront mises à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale sous anesthésie, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Ils auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie d’où l’utilisation d’analgésiques (buprénorphine + carprofene) en amont de l’anesthésie. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaire pour les injections sous-cutanées (analgésiques) et intrapéritonéales (anesthésiques). Une douleur est également à prévoir lors de cette injection sous-cutanée et lors de cette injection intrapéritonéale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

La sécrétion pancréato-biliaire est une étude faisant intervenir une communication inter-organes ainsi qu’une sécrétion pancréatique in vivo. C’est un paramètre métabolique qui ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable . Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur, la désinfection des surfaces, l’utilisation d'un champ stérile, la stérilisation des outils de dissection, la tonte de la zone d’incision et la désinfection de la peau.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la phase post-ingestive et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 4 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie. Dans le DAP précédent, l’âge minimum était 2 mois. Cela concorde avec les expériences précédemment réalisées (avec l’utilisation de ces animaux et avec les différents articles qui mentionnent cette chirurgie) mais les souris étaient toujours trop petites. Pour maximiser les chances de succès des chirurgies, nous choisissons des souris de 4 mois minimum. Tout de même, une étude pilote sera réalisée en amont sur 5 males reproducteurs pour s’assurer de la faisabilité de la chirurgie sur des animaux de 4 mois.

Seize semaines d'un régime riche en sucres, en graisses et en cholestérol rendent des souris diabétiques, avant qu'un régime cétogène, un régime sans glucides ou un supplément de bêta-hydroxybutyrate ne leur soit imposé pendant trois à neuf jours. 1 010 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur répète qu'aucun effet dommageable majeur n'est attendu, tout en indiquant une perte de poids de 10 à 15 % dans les trois premiers jours du régime cétogène et une prise de poids allant jusqu'à 45 grammes sous régime riche en graisses. La mise à mort sert à prélever des cellules rares du foie pour trois techniques d'analyse qu'il juge "indispensables", dont le séquençage de l'ARN cellule par cellule.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par une sensibilité à l'insuline altérée, dont la prévalence augmente à l'échelle mondiale, constituant ainsi une nouvelle forme de pandémie. De nombreuses interventions alimentaires ont été proposées pour améliorer le contrôle glycémique, le régime cétogène émergeant comme l'une des approches les plus répandues. Cependant, malgré les preuves solides soutenant l'efficacité du régime cétogène dans l'atténuation du diabète, son impact sur l'immunité innée, en particulier sur les macrophages hépatiques, reste mal compris. Ce projet vise à étudier l'effet du régime cétogène chez les souris rendues diabétiques sur une période de 16 semaines de régime occidental riche en sucres et en graisses. Dans une première phase de l'étude, nous chercherons à comprendre l'effet de la cétogenèse précoce sur les populations de macrophages hépatiques. Nous utiliserons ensuite ces informations pour explorer comment cette vague de cétogenèse peut remodeler le profil des macrophages hépatiques afin de les rendre plus résilients face au diabète.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira de nouvelles perspectives sur les cellules et/ou les voies métaboliques que nous devons activer pour déclencher la cétogenèse et inverser le diabète. Les résultats auront donc potentiellement des conséquences pour le traitement du diabète de type II.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux pourront avoir 9 jours de régime alimentaire standard (groupe contrôle), 3 jours de régime cétogène, 6 jours de régime cétogène, 9 jours de régime cétogène, 6 jours de régime riche en matières grasses (66 % de graisses, 30 % de glucides), 6 jours de régime sans glucides (30 % de graisses, 0 % de glucides), 6 jours de régime alimentaire standard avec supplément de beta-hydroxybutyrate, 16 semaines de régime alimentaire standard, 16 semaines de régime alimentaire standard suivies de 6 jours de régime cétogène, 16 semaines de régime riche en glucides/lipides/cholestérol avec saccharose/fructose, 16 semaines de régime riche en glucides/lipides/cholestérol avec saccharose/fructose suivies de 6 jours de régime cétogène. Certains animaux auront un prélèvement de sang (sous anesthésie locale (ponction rapide (durée 5 secondes d'une veine de la queue).

Impact sur les animaux

Régime cétogène : Aucun effet dommageable majeur pour les animaux. Les souris peuvent perdre un peu de poids corporel (jusqu’à 10-15% de perte de poids au cours des 3 premiers jours du régime). Il est à noter que des effets modérés sur l'activité physique peuvent être observés en raison de la transition métabolique vers la cétose. Régime riche en graisses : Pas d’effet dommageable majeur pour les animaux. Les souris peuvent prendre du poids progressivement (jusqu'à 45 g) au fur et à mesure des semaines, mais restent globalement en bonne santé. Régime sans glucides : Aucun effet indésirable significatif. Aucune perte de poids. Régime standard avec supplément de BHB : Pas d’effet dommageable notable. Aucune différence significative par rapport aux souris du groupe contrôle. Prélèvement sanguin: Aucune conséquence grave, mais les souris peuvent ressentir un léger stress ou inconfort dû à la contrainte et au prélèvement. La perte de 50 μL de sang ne devrait pas entraîner d'effets indésirables graves, mais un suivi des signes de stress ou d’inconfort sera réalisé. Les souris seront surveillées de près tout au long de l’étude pour s’assurer qu’elles ne subissent pas de souffrances sévères ou prolongées.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques (cytométrie en flux, imagerie, transcriptomique) qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans le foie dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donx indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous utilisons le moins de souris possible pour cette étude. Après leur euthanasie, nous collecterons différents types de tissus et cellules, y compris des cellules rares comme les macrophages du foie, pour des analyses approfondies (par exemple, single-cell RNA-seq). Chaque souris nous permettra d'obtenir une grande quantité d'informations. Le nombre de souris nécessaires a été soigneusement déterminé pour chaque groupe, soit à partir des données disponibles dans la littérature, soit à l’aide d’outils statistiques (calcul de puissance) pour garantir un effectif juste et nécessaire.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour évaluation clinique adaptée. Des point limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, de nombreuses publications mettent en avant le rôle essentiel des modèles murins dans les études précliniques de la cétogenèse, du diabète de type 2 et de la résistance à l'insuline. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales seront adultes / sexuellement matures (âgées de 8 à 10 semaines) au début de la procédure.