Oncologie

138 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à six séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie gazeuse et quinze tests comportementaux. 75 d'entre elles reçoivent un composé qui déclenche une épilepsie, les 63 autres formant le groupe témoin. Les crises attendues sont focales et non convulsives, les souris cessant leur activité en cours, et les tests mesurent l'activité motrice, la dépression et l'anxiété. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et corréler l'imagerie aux analyses immunohistochimiques.

Objectifs

L'épilepsie, une maladie neurologique fréquente touchant environ 1% de la population et générant 100 nouveaux cas annuels pour 100 000 habitants, demeure une condition potentiellement sérieuse dont les mécanismes moléculaires et cellulaires restent encore mal compris. De fait, les traitements médicamenteux actuels se limitent principalement à des approches symptomatiques. Notre démarche vise à approfondir notre compréhension de l'épilepsie tout en identifiant de nouvelles voies thérapeutiques potentielles, en mettant particulièrement l'accent sur l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires cérébraux. L’imagerie fonctionnelle se présente comme un outil puissant pour explorer in vivo divers mécanismes cérébraux. Ainsi, la tomographie par émission de positons (TEP), largement utilisée en médecine nucléaire, permet de suivre au cours du temps différents paramètres dans les différentes régions du cerveau. Dans le cas de l’épilepsie, la TEP est particulièrement intéressante pour observer : • Le métabolisme des cellules du cerveau, un indicateur de leur activité ; • La concentration en synapses, ces zones de transmission d’information entre neurones ; • L’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, la barrière naturelle qui protège le cerveau. Le choix du radiotraceur varie en fonction du paramètre que l’on souhaite suivre. L'objectif de ce travail consiste à appliquer cette méthode d'imagerie, déjà développée et appliquée dans notre laboratoire, y compris chez l'Homme, à un modèle rongeur d'épilepsie bien caractérisé. Cette approche permettra d'identifier les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie neurologique, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques. De plus, nous réaliserons des tests de comportement afin de corréler les données de l’imagerie à des symptômes cliniques. Les tests de comportement, tels que l'évaluation de l'anxiété, de la dépression et de l’activité motrice, sont essentiels pour comprendre les comorbidités neurocomportementales de l’épilepsie. Ils permettent de mesurer l'impact des crises sur le comportement et de développer des interventions thérapeutiques adaptées.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à élucider les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans l'épilepsie, en établissant une corrélation entre ces dysfonctionnements et les comportements manifestés par les animaux. De plus, cette approche permettra d'identifier la méthode d'imagerie la plus pertinente pour une poursuite du développement chez l'homme. À terme, cette étude ouvrira la voie à l'exploration in vivo de ces mécanismes chez des patients atteints d'épilepsie, avec l'objectif de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette approche pourrait ainsi contribuer à l'avancement des traitements et à l'amélioration de la qualité de vie des personnes touchées par ces pathologies.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : - Administration (75 animaux, durée 25 minutes) d’un composé induisant une épilepsie pour le groupe épilepsie tandis que le groupe témoin (63 animaux, durée 25 minutes) ne recevra pas de composé induit une épilepsie. - Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, 6 imageries maximales par animal) - Injection d’un radiotraceur (1 minute) - Les rongeurs seront soumis à plusieurs tests comportementaux afin de mesurer 1) l'activité motrice (durée du test = 10 minutes, 15 tests comportementaux maximales par animal), 2) la dépression (test de 6 minutes) et 3) l’anxiété (test de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : - des crises épileptiques principalement focales et non convulsives (les souris cessent leur activité en cours) ; - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des analyses immunohistochimique permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans l’épilepsie et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Les études in vivo sont essentielles pour comprendre pleinement les mécanismes d’un dysfonctionnement cérébral. Les modèles animaux permettent d'observer les effets des interventions dans un organisme entier, incluant la distribution, le métabolisme, et l'élimination des composés, ainsi que les interactions avec divers systèmes biologiques. Il n’existe pour l’instant pas de méthode alternative capable de faire ces observations.

Réduction

Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum), ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé pour qu’il soit le plus petit possible tout en ne compromettant pas une analyse statistique fiable des résultats.

Raffinement

Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergées par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, des bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Deux semaines d’acclimatation sont prévues après la livraison et avant de débuter le protocole. Un suivi régulier permettra de repérer une éventuelle souffrance animale et de prendre en charge l’animal concerné dans les plus brefs délais. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Des analgésiques seront également administrés avant et après la chirurgie. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections neurologique. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP ainsi qu’à l’étude comportementale. Plus particulièrement : - les rongeurs sont particulièrement appropriés pour ce type d'étude en raison de leur taille, de leur facilité d'hébergement et de manipulation ; - il existe de nombreux tests comportementaux standardisés chez les rongeurs pour mesurer les comportements dépressifs et anxieux. Ces tests permettent de corréler efficacement les données d'imagerie avec les symptômes cliniques observés dans l'épilepsie, offrant ainsi une compréhension plus complète des mécanismes physiopathologiques et des comorbidités comportementales associées à cette maladie. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).

Injection de cellules tumorales au premier jour, puis deux fois par semaine une injection de marqueur et une imagerie du corps entier sous anesthésie, pendant quatre semaines au plus : 894 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs pulmonaires qui se développent peuvent occasionner une gêne respiratoire. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem, l'objet étant de comprendre comment des macrophages vieillissants favorisent le cancer du poumon chez les personnes âgées. Le calcul annoncé, vingt-quatre souris par condition et cinq génotypes comparés, laisse de côté les trente souris consacrées au seul choix de la lignée de cellules tumorales.

Objectifs

Le cancer du poumon est la première cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Il est particulièrement fréquent chez les personnes âgées : 50 % des cas sont diagnostiqués chez des patients de plus de 70 ans. Nous souhaitons donc étudier le développement du cancer du poumon dans le contexte du vieillissement. Les macrophages sont un type de cellules du système immunitaire inné, ce qui signifie qu'ils peuvent réagir rapidement et immédiatement à des menaces telles que l'invasion d'agents pathogènes. Il est également connu que les macrophages se trouvent souvent à proximité de tumeurs en développement. Récemment, des chercheurs ont découvert que dans le cancer du poumon, les macrophages sénescents s'accumulent et favorisent la croissance de la tumeur et la progression de la maladie. La sénescence est un état souvent observé dans les cellules des personnes et animaux âgées. Les cellules sénescentes cessent de se diviser, accumulent des dommages et changent de morphologie et de fonctionnalité. On ne sait toutefois pas comment ces macrophages "âgés" contribuent au développement des tumeurs pulmonaires. Pour répondre à cette question, nous utiliserons différents modèles génétiques de souris qui provoquent un vieillissement accéléré spécifiquement dans les macrophages pulmonaires, mais pas dans les autres cellules du tissu. Nous étudierons le développement de tumeurs chez ces souris et les caractéristiques différentielles des macrophages jeunes et vieux dans ce contexte. Globalement, ce projet vise à découvrir comment les changements liés à l'âge dans le système immunitaire inné contribuent au développement de tumeurs pulmonaires, ce qui ouvrira la voie à de futurs traitements anticancéreux potentiels adaptés aux personnes âgées.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est responsable de la plupart des décès liés aux tumeurs dans le monde. L'âge élevé est l'un des principaux facteurs de risque de son développement et de sa progression, 50 % des cas étant diagnostiqués chez des patients âgés de plus de 70 ans. On sait que les macrophages pulmonaires sénescents, qui s'accumulent au cours du vieillissement de l'organisme, jouent un rôle pro-tumorigène dans le carcinome pulmonaire non à petites cellules, le type de cancer du poumon le plus courant. Mais jusqu'à présent, on ne comprend pas comment ils contribuent au développement de la tumeur. Dans ce projet, nous visons à identifier les caractéristiques des macrophages sénescents qui favorisent la croissance des tumeurs pulmonaires. Cela nous aidera à comprendre pourquoi les organismes âgés sont plus enclins à développer des tumeurs pulmonaires et quel rôle le système immunitaire inné joue dans ce processus. À long terme, ce projet permettra d'accroître nos connaissances sur la manière de prévenir la progression du cancer dans des conditions de vieillissement du système immunitaire et de développer des options de traitement immunothérapeutique spécifiquement adaptées aux personnes âgées. Étant donné que les macrophages sont des cellules résidentes dans tous les tissus et que le vieillissement est un facteur de risque pour de nombreuses maladies, nous nous attendons à ce que ce travail ait un large impact et soit pertinent au-delà du cancer du poumon.

Procédures

Chaque animal recevra une injection de cellules tumorales au début de l'expérience (durée du geste : environ 10 secondes). À partir du troisième jour après l'injection, la taille de la tumeur sera contrôlée deux fois par semaine, ce qui nécessite l'injection d'un produit de marquage (durée du geste : inf à 10 sec) et la réalisation d'une imagerie non invasive du corps entier sous anesthésie (durée de l’anesthésie :10 minutes). La durée maximale de l'expérience est de 4 semaines.

Impact sur les animaux

L'injection intraveineuse de cellules tumorales et l'injection de produits de marquage pour l’imagerie peuvent provoquer une douleur légère et transitoire au point d'injection. Les animaux auxquels on a injecté des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires qui pourront occasionner une gêne respiratoire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nous nous intéressons à la réponse systémique du système immunitaire au développement de tumeurs pulmonaires. Cette réaction ne peut être étudiée que dans un organisme entier, avec une circulation lymphatique et sanguine intacte, une hématopoïèse active (formation de nouvelles cellules immunitaires par la moelle osseuse) et des poumons fonctionnels. l De nombreuses méthodes requises pour le projet proposé ainsi que des modèles génétiquement modifiés pour nos protéines d'intérêts ne sont disponibles et établis que chez la souris.. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis dans la littérature, ce qui fait de la souris un organisme modèle approprié. Dans la mesure du possible, nous utiliserons des alternatives in vitro à l'expérimentation animale, telles que la co-culture de macrophages et de cellules tumorales. Nous disposons déjà de premiers résultats utilisant ce système in vitro (sphéroïdes, formés à partir de la co-culture de cellules tumorales et de macrophages), qui renforcent nos hypothèses. Cependant, ce système est trop simplifié pour comprendre pleinement les adaptations que les macrophages du poumon et d'autres composants du système immunitaire subissent in vivo en réponse au développement de tumeurs. En outre, nous prévoyons de remplacer la microscopie in vivo par des approches d'imagerie ex vivo, qui réduisent le nombre de procédures sur les animaux vivants, mais qui nécessitent toujours l'induction et la surveillance de tumeurs in vivo.L'expérimentation animale ne peut donc pas être entièrement remplacée par des alternatives in vitro.

Réduction

Nous avons déterminé, sur la base d'expériences déjà réalisées avec des tests statistiques, que nous avons besoin de 24 souris par condition expérimentale. Nous les répartirons en 3 groupes d'expériences indépendantes de 8 animaux chacune afin d'obtenir des résultats aussi robustes que possible. Nous étudierons 5 génotypes différents ainsi que des souris non modifiées génétiquement, y compris des contrôles correspondants pour chacune de ces conditions. Nous aurons besoin de 3 séries d'expériences pour l'analyse des tissus post-mortem. De plus, nous devons tester trois lignées différentes de cellules tumorales pour trouver celle qui donne le meilleur résultat expérimental. Cela nécessite 30 souris. Pour réduire le nombre d'animaux à utiliser, nous employons un plan d'étude longitudinal basé sur l'imagerie par bioluminescence pour mesurer la croissance tumorale, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Pour l'analyse post-mortem, le tissu pulmonaire sera réparti entre plusieurs méthodes d'analyse afin de permettre une utilisation optimale de chaque animal impliqué dans l'expérimentation animale.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. La lignée cellulaire tumorale qu’on utilisera permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence (mesure non invasive, faite deux fois par semaine, pendant maximum 4 semaines). Nous pèserons également les souris deux fois par semaine pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction d’une grille de score adaptée à notre projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

Les souris sont le modèle de choix pour les expériences dans le domaine de l'immunologie des tumeurs. Cette recherche nécessite un contexte génétique bien défini et des modèles génétiquement modifiés, qui ne sont disponibles que chez cette espèce. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis. Tous ces éléments font de la souris le seul organisme modèle approprié pour notre projet. Des souris adultes seront utilisées pour toutes les expériences, ce qui est nécessaire pour étudier un système immunitaire mature. Comme nous étudions les effets du vieillissement sur le développement des tumeurs, nous utiliserons des souris dont l'âge se situe entre 8 semaines (jeunes adultes) et 24 mois (adultes âgés).

Capturées au filet maillant dérivant, démaillées en sectionnant les mailles autour de leur corps, endormies à la benzocaïne puis équipées d'un émetteur acoustique poussé dans l'estomac par la bouche à l'aide d'un tube. 300 grandes aloses vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une trentaine de minutes de captivité par individu. L'espèce est classée en danger critique d'extinction sur la liste rouge de l'UICN, et le projet cherche à mesurer combien de géniteurs meurent en remontant la Loire, entre les barrages et les silures. Toutes sont remises à l'eau à l'endroit exact de leur capture, quelques minutes après le marquage, malgré un risque d'écaillage et de cisaillement que le porteur dit réduit au minimum.

Objectifs

Ce projet a pour but d’estimer la population entrante des grandes aloses Alosa alosa - espèce de poisson migrateur - et de quantifier la répartition de la population et les principales pressions majeures rencontrées lors de leur migration (taux de perte sur la migration (mortalité)), depuis l’estuaire jusqu'aux frayères du bassin versant pendant 2 ans (2025-2026).

Bénéfices attendus

Au niveau local, la mise en place de mesures de conservation pour les grandes aloses (Alosa alosa) doit se faire sur la base d’une identification scientifique, avérée et robuste des pressions affectant la survie des reproducteurs de l’espèce. A ce titre, il est attendu de cette étude de délivrer des informations fiables sur : 1. L’estimation du recrutement de géniteurs de grandes aloses dans l’estuaire d’un grand fleuve (hors procédure). 2. Le taux de pertes sur la migration (mortalité) en pourcentage d’individus marqués par kilomètre du cours d’eau. Il permettra aussi de visualiser spatialement où sont situés les pertes et la part des différentes pressions ciblées qui sont établies par : - Le taux de prélèvement des grandes aloses par la pêcherie professionnelle de l’estuaire (hors procédure) ; - L’évaluation du taux de franchissement par les grandes aloses de 4 seuils sur le fleuve et ses affluents (objet de la présente demande) ; - La contribution relative des grandes aloses dans le régime alimentaire du silure glane à fine échelle temporelle (mensuelle) et large échelle spatiale (2 sites). Cette contribution sera estimée pour la période de migration (février à juin) et durant la reproduction (mai à juillet). 3. Des indications sur le comportement des grandes aloses sur les frayères à fine échelle temporelle (mensuelle) et large échelle spatiale. Ces données seront utilisées dans les plans de gestion des poissons migrateurs et devront in fine permettre d’obtenir des mesures de gestion efficaces pour sauvegarder cette espèce sensible, classée CR (danger critique) sur la liste rouge des espèces menacées en France (Union Internationale de la Conservation de la Nature).

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures de marquages gastriques (sans chirurgie) sous anesthésie pour l'implantation des émetteurs. Il n'y aura qu'une procédure par individu qui durera moins de 30 minutes. Les poissons seront capturés au filet maillant dérivant et démaillés immédiatement après la capture en sectionnant les mailles autour de l’individu. Le démaillage sera donc très bref et effectué dans l’anesthésiant pour la majorité des individus. Un risque de blessure (écaillage, cisaillement) par l’engin de pêche est présent mais réduit à son minimum car les temps de pêche seront réduits au minimum : dès que le filet est posé entièrement, celui-ci est relevé à partir du début de la pose, soit environ 10 minutes. Le temps de captivité temporaire est estimé en moyenne à 30 minutes, incluant la capture, le marquage, la surveillance jusqu’à la relâche.

Impact sur les animaux

Afin d’estimer le taux de mortalité pendant la migration due à la prédation par le silure glane, mais aussi lors du franchissement d’obstacles formés par les constructions humaines, les grandes aloses sont marquées d’émetteur acoustique. Les poissons sont capturés au filet maillant dérivant. Le stress lors de la capture doit être pris en compte et un risque de blessure (écaillage, cisaillement) est présent, mais fortement diminué par le protocole utilisé. En effet, le temps de présence dans le filet par individu est réduit à son minimum car une relève du filet pour démaillage est déclenchée dès qu’un poisson est observé dans le filet. Après avoir libéré des mailles le poisson, celui-ci est transféré dans le bac d’anesthésie (benzocaïne) ou dans un bac d’attente, en restant constamment immergé. Le transfert de l’individu dans les différents bacs (bac d’anesthésie, bac d’attente, etc.) peut induire un stress chez le poisson. La mesure de la longueur de l’individu est faite sous anesthésie (poisson toujours immergé) et le marquage gastrique est fait de la manière suivante : l’émetteur acoustique est inséré dans l'estomac par la bouche à l’aide d’un tube flexible transparent. Une fois l’émetteur placé dans l’estomac, il est relâché via un poussoir. Malgré les précautions prises, lors du marquage par l’insertion gastrique cela peut générer une inflammation de la paroi intestinale dû aux frottements. Mais l’expérience de l’équipe et la robustesse du protocole déjà mis en pratique lors d’une étude précédente en 2022-2023 nous pousse à être confiant sur les faibles effets nuisibles du marquage sur leur migration. Lors de cette étude, la reprise de migration vers l’amont d’individus marqués a été élevée (95%). Pour ce marquage, malgré l’anesthésiant qui agit aussi comme analgésique, le ressenti d’une douleur par l’individu marqué n’est pas à exclure. Le temps de captivité temporaire est estimé en moyenne à 30 minutes, incluant la capture, le marquage, la surveillance jusqu’à la relâche. Aucun effet indésirable est attendu sur l’alimentation du poisson durant cette captivité, car celui-ci ne s’alimente plus lors de sa migration vers les frayères.

Devenir

Tous les animaux marqués seront replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leurs capture, quelques minutes seulement après.

Remplacement

La mortalité sur l’ensemble du trajet de la migration de la grande alose, depuis l’estuaire jusqu’aux lieux de reproduction en amont d’un fleuve, reste trop peu connue en France. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle écologique par des modèles numériques et/ou physique et/ou de l’analyse de données existantes.

Réduction

Sont compris dans la procédure de la demande d'autorisation de projets de cette étude l’évaluation de la mortalité durant la migration des grandes aloses (Alosa alosa) jusqu’à l’atteinte des zones de reproduction par l’évaluation du franchissement des barrages et de la prédation par le silure glane. Ce taux de perte sur la migration, s’il existe, pourrait être variable en fonction des années, car l’espèce est soumise aux variations des conditions hydrologiques et aux variations de facteurs de mortalité du début (estuaire) à la fin (lieu de reproduction) du trajet de migration : les prélèvements par la pêcherie professionnelle (hors procédure), la prédation par les silures et la rupture de connectivité par les barrages. Ainsi, l’étude doit porter sur une longue durée (deux périodes de migration), avec un effectif suffisant. En 2024, plus de 9 tonnes d’aloses ont été prélevés sur l’estuaire du fleuve. Nous avons choisi de marquer 6 lots de 50 individus sur deux ans, soit 150 individus par an, ce qui équivaut à environ 120 kg. Compte tenu du taux de perte sur la migration (mortalité) estimé en se basant sur celui précédemment estimé sur d’autres espèces migratrices, cet effectif est le minimum pour avoir un effectif final suffisant pour qualifier et quantifier par télémétrie acoustique les différentes pressions présentes (prédation lors de la migration et barrages). Le protocole utilisé permet aussi cette réduction du nombre d’individus à marquer car il y a peu perte immédiate, dues à la pêche et au marquage. Sur une étude récente (2022-2023), 110 grandes aloses ont été pêchées, marquées suivant le même protocole. Cette étude a montré aucun rejet de marque, et un bon taux de reprise de migration, à hauteur de 95%, confirmant la fiabilité et un faible impact de la méthode. Donc 300 grandes aloses (Alosa alosa) seront marquées sur l’ensemble de la période in situ du projet (2025-2026).

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place afin de limiter les nuisances décrites en amont : stress de la captivité et de la manipulation (capture, transfert du filet vers les bacs de stabulation et d'anesthésie), stress et douleur lors de l'implantation d'une petite balise acoustique dans l'estomac. La capture se fera avec des filets dérivants, afin de limiter les blessures lorsque l’individu se bloque dans les mailles avec un fort courant. De plus, afin de réduire le stress pendant la capture, les temps de pêche seront réduits au minimum : dès que le filet est posé entièrement, celui-ci est relevé à partir du début de la pose, soit environ 10 minutes. Le démaillage sera très rapide. Il se fera par section du filet autour de l’animal pour ainsi limiter les manipulations, diminuer le temps de démaillage et ainsi limiter le stress du poisson. Les marquages gastriques se feront sous anesthésie générale dans une civière de chirurgie remplie d'un bain de benzocaïne et oxygéné par bulleur afin de limiter le stress et la douleur du poisson. Pendant l'endormissement, un opérateur est dédié au maintien et à la surveillance de l’individu immergé, orienté sur le dos contre la paroi de la civière lors du marquage. Le poisson est gardé sous l’action de l’anesthésiant par ventilation mécanique des branchies avec l’eau dans la civière. Un second opérateur sera dédié à l'insertion de l'émetteur acoustique dans l'estomac. De la vaseline est utilisée pour réduire les frottements lors de l’insertion de l’émetteur. En cas de mouvement de l’individu, l’opération est arrêtée et la dose d’anesthésiant est immédiatement augmentée par l’ajout de 25 mg.l-1. L’opération est reprise dès lors que l’animal ne répond plus aux stimulations réflexes (plus précisément dès l’atteinte du stade 4 de l’anesthésie). Si un second ajout de benzocaïne est nécessaire, alors on estimera que le bain n’est plus assez efficace et il sera obligatoirement changé pour les poissons suivants. Après marquage, chaque individu est gardé en surveillance dans un bac de réveil jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant (en moyenne 10 min). Sur l’ensemble des manipulations sur le poisson, de la récupération dans le filet jusqu'à la relâche, celui-ci reste immergé en continue afin de limiter le stress lors des manipulations.

Choix des espèces

La grande alose (Alosa alosa) est une espèce amphihaline classée en danger critique d'extinction (Liste rouge UICN) au niveau national français depuis 2019 ("Critically Endangered" - CR) et depuis 2008 sur le bassin de la Loire. Le stade géniteur est ciblé car il correspond au stade de migration des océans vers les frayères en rivières, période la plus vulnérable du cycle de vie de l'espèce. Toutes les mesures visant à alléger les pressions subies par cette espèce doivent donc être mises en place de manière rapide.

4 524 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau du flanc, puis viennent des injections dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant trois semaines, et pour un groupe une irradiation de sept minutes trente sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse. Le porteur écrit que les traitements ne provoquent pas d'effets indésirables, et indique par ailleurs que l'irradiation entraîne diarrhée et perte de poids pendant plusieurs semaines et qu'une nécrose peut apparaître sur la tumeur en fin d'expérience. Aucun antalgique n'est prévu pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur s'appuyant sur des recommandations internationales en cancérologie expérimentale pour leur substituer un suivi rapproché et des points limites précoces.

Objectifs

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.