Oncologie

Privées d'un récepteur plaquettaire, du fibrinogène ou de la fibrine, ou porteuses de récepteurs humains, les souris de ce projet appartiennent à des lignées génétiquement modifiées, dont certaines seront créées pour l'étude. 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le volet EU1 d'un projet partagé entre deux établissements. Anesthésiées, elles reçoivent des injections ou des perfusions de trente minutes et subissent une chirurgie de deux heures au plus qui provoque un AVC, puis sont transportées vers le laboratoire de l'IRM. Pendant 72 heures, elles peuvent présenter une activité réduite, voire une prostration. Toutes sont tuées après une laparotomie et une perfusion intracardiaque sous anesthésie, pour l'analyse histologique de l'AVC.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement en s’accumulant au niveau d’une lésion du vaisseau. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes s’accumulent et forment un caillot qui bloque la circulation du sang pouvant entraîner des accidents vasculaires cérébraux (AVC). A l’heure actuelle, il n’y a qu’un seul traitement de l’AVC qui permet de détruire le caillot, combiné ou non à une approche de retrait mécanique du caillot. Ces deux approches doivent être utilisées rapidement après l’apparition des 1er symptômes chez le patient (4h30 pour le traitement et 6h pour le retrait mécanique), ce qui limite fortement le nombre de patients traités. Les antiplaquettaires ne sont pas utilisés dans le traitement de l’AVC car ils augmentent fortement le risque de saignement. Ce projet comprend trois axes d’étude - Axe 1 : caractériser deux modèles d’AVC et confirmer que les plaquettes sont bien impliquées dans le mécanisme de l’AVC. - Axe 2 : étudier le rôle d’un 1er récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin après un AVC. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne présentent pas ce récepteur pour voir l’impact sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons également des souris qui présentent ce récepteur dans sa forme humaine pour étudier l’effet d’un traitement ciblant ce récepteur sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons des souris déficientes pour deux protéines se fixant au récepteur : la fibrine et le fibrinogène ; et nous allons générer des souris avec ce récepteur humain et déficientes pour la fibrine ou le fibrinogène afin d’évaluer s’il y a un impact de l’interaction protéine – récepteur sur la restauration du flux sanguin. - Axe 3 : étudier le rôle d’un 2e récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC. Nous utiliserons 2 agents ciblant la forme humaine de ce récepteur. Pour cela, nous utiliserons des souris présentant la forme humaine du récepteur car nous disposons d’anticorps anti-humaine. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur l’accident vasculaire cérébral (AVC). On pourrait mettre en évidence une réduction des séquelles lors de l’absence du récepteur ou lors d’un traitement ciblant l’un des 2 récepteurs étudiés, sans trop augmenter le saignement. Ce qui ouvrira des perspectives pour de nouvelles indications et de nouveaux essais cliniques. L’obtention de tels résultats pourrait déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant un AVC et, de ce fait, à une réduction des séquelles à long terme de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections en bolus ou en perfusion de 30 min (animal anesthésié) (EU1). Les modèles nécessitent des procédures chirurgicales (EU1), celles-ci seront de maximum 120 min et réalisées sous anesthésie générale. Des IRM (EU2) de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC. Une seule chirurgie et une seule IRM seront effectuées sur les animaux. Une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque (animal anesthésié) seront réalisées pour permettre une analyse histologie de l’AVC. Ces gestes seront réalisés sur une durée de 20 min (EU1).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision ou au site chirurgical. Des saignements ainsi qu’un œdème pourraient être observé suite à la craniotomie. De manière plus spécifique, les souris peuvent avoir des signes cliniques neurologiques pendant les 72h qui suivent l’intervention chirurgicale : modification du comportement (activité réduite, voire prostration), de l’apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), de la prise alimentaire et de la motricité (rotation), même si les premiers tests sur ces modèles semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale. Les traitements antiplaquettaires pourraient conduire à des saignements au niveau des plaies chirurgicales. Durant l’imagerie IRM, l’anesthésie pourrait avoir un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort car le développement d’un AVC n’est pas compatible avec un maintien en vie de la souris. Des tissus seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’AVC impliquant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro. Cependant, tous les traitements utilisés dans cette étude sont soit déjà utilisé en clinique, en essai clinique ou ont été préalablement testés dans des modèles in vitro afin de valider leur effet antithrombotique.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. • Par une habituation au gel nutritif avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure • Par application de gel protecteur sur les yeux lors de l’anesthésie et par injection de sérum physiologique avant la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. • L’animal est acheminé par nos soins dans une boîte de transport équipée de litière et d’aliment hydraté dans le laboratoire où se trouve l’IRM afin d’y effectuer un examen IRM. Du coton et de la frisure seront rajoutés dans la cage de transport.

Choix des espèces

Chez la souris, les modèles in vivo sont largement répandus et maitrisés, notamment les modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). De plus, les techniques de modifications génétiques ont permis d’obtenir des souris déficientes pour un récepteur plaquettaire, sans fibrinogène ou incapable de former de la fibrine, tout comme des souris exprimant 2 récepteurs humains distincts. Ces souris nous permettent donc d’évaluer le rôle de ces récepteurs/protéines dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC afin de mieux comprendre les mécanismes, mais aussi de tester de nouveaux traitements ciblant ces récepteurs humains. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Il n’y aura pas d’effet lié à l’âge.

Des souris subissent une chirurgie de deux heures au plus, avec craniotomie, pour provoquer un AVC ischémique, puis une IRM sous anesthésie à 24 ou 72 heures et une laparotomie avec perfusion intracardiaque. 456 souris, dont des lignées génétiquement modifiées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, le porteur jugeant l'AVC "pas compatible avec un maintien en vie de la souris". Pendant les 72 heures qui suivent l'opération, elles peuvent présenter une prostration, des paupières fermées et des mouvements de rotation, pour une étude du rôle de deux récepteurs plaquettaires dans la reperméabilisation des artères. Ce résumé porte la mention EU2/2, un résumé jumeau au même texte existe pour l'autre établissement (NTS-FR-411894), et chacun déclare 456 souris sans dire s'il s'agit des mêmes.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement en s’accumulant au niveau d’une lésion du vaisseau. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes s’accumulent et forment un caillot qui bloque la circulation du sang pouvant entraîner des accidents vasculaires cérébraux (AVC). A l’heure actuelle, il n’y a qu’un seul traitement de l’AVC qui permet de détruire le caillot, combiné ou non à une approche de retrait mécanique du caillot. Ces deux approches doivent être utilisées rapidement après l’apparition des 1er symptômes chez le patient (4h30 pour le traitement et 6h pour le retrait mécanique), ce qui limite fortement le nombre de patients traités. Les antiplaquettaires ne sont pas utilisés dans le traitement de l’AVC car ils augmentent fortement le risque de saignement. Ce projet comprend trois axes d’étude - Axe 1 : caractériser deux modèles d’AVC et confirmer que les plaquettes sont bien impliquées dans le mécanisme de l’AVC. - Axe 2 : étudier le rôle d’un 1er récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin après un AVC. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne présentent pas ce récepteur pour voir l’impact sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons également des souris qui présentent ce récepteur dans sa forme humaine pour étudier l’effet d’un traitement ciblant ce récepteur sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons des souris déficientes pour deux protéines se fixant au récepteur : la fibrine et le fibrinogène ; et nous allons générer des souris avec ce récepteur humain et déficientes pour la fibrine ou le fibrinogène afin d’évaluer s’il y a un impact de l’interaction protéine – récepteur sur la restauration du flux sanguin. - Axe 3 : étudier le rôle d’un 2e récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC. Nous utiliserons 2 agents ciblant la forme humaine de ce récepteur. Pour cela, nous utiliserons des souris présentant la forme humaine du récepteur car nous disposons d’anticorps anti-humaine. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur l’accident vasculaire cérébral (AVC). On pourrait mettre en évidence une réduction des séquelles lors de l’absence du récepteur ou lors d’un traitement ciblant l’un des 2 récepteurs étudiés, sans trop augmenter le saignement. Ce qui ouvrira des perspectives pour de nouvelles indications et de nouveaux essais cliniques. L’obtention de tels résultats pourrait déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant un AVC et, de ce fait, à une réduction des séquelles à long terme de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections en bolus ou en perfusion de 30 min (animal anesthésié) (EU1). Les modèles nécessitent des procédures chirurgicales (EU1), celles-ci seront de maximum 120 min et réalisées sous anesthésie générale. Des IRM (EU2) de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC. Une seule chirurgie et une seule IRM seront effectuées sur les animaux. Une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque (animal anesthésié) seront réalisées pour permettre une analyse histologie de l’AVC. Ces gestes seront réalisés sur une durée de 20 min (EU1).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision ou au site chirurgical. Des saignements ainsi qu’un œdème pourraient être observé suite à la craniotomie. De manière plus spécifique, les souris peuvent avoir des signes cliniques neurologiques pendant les 72h qui suivent l’intervention chirurgicale : modification du comportement (activité réduite, voire prostration), de l’apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), de la prise alimentaire et de la motricité (rotation), même si les premiers tests sur ces modèles semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale. Les traitements antiplaquettaires pourraient conduire à des saignements au niveau des plaies chirurgicales. Durant l’imagerie IRM, l’anesthésie pourrait avoir un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort car le développement d’un AVC n’est pas compatible avec un maintien en vie de la souris. Des tissus seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’AVC impliquant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro. Cependant, tous les traitements utilisés dans cette étude sont soit déjà utilisé en clinique, en essai clinique ou ont été préalablement testés dans des modèles in vitro afin de valider leur effet antithrombotique.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. • Par une habituation au gel nutritif avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure • Par application de gel protecteur sur les yeux lors de l’anesthésie et par injection de sérum physiologique avant la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. • L’animal est acheminé par nos soins dans une boîte de transport équipée de litière et d’aliment hydraté dans le laboratoire où se trouve l’IRM afin d’y effectuer un examen IRM. Du coton et de la frisure seront rajoutés dans la cage de transport.

Choix des espèces

Chez la souris, les modèles in vivo sont largement répandus et maitrisés, notamment les modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). De plus, les techniques de modifications génétiques ont permis d’obtenir des souris déficientes pour un récepteur plaquettaire, sans fibrinogène ou incapable de former de la fibrine, tout comme des souris exprimant 2 récepteurs humains distincts. Ces souris nous permettent donc d’évaluer le rôle de ces récepteurs/protéines dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC afin de mieux comprendre les mécanismes, mais aussi de tester de nouveaux traitements ciblant ces récepteurs humains. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Il n’y aura pas d’effet lié à l’âge.

60 souris subissent chacune deux implantations de cellules tumorales, l'une sous la peau, l'autre directement dans la prostate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les effets attendus courent sur les trente jours de la procédure, perte de poids, perte d'appétit, douleurs prolongées au site de greffe, et pour l'implantation intra-prostatique des saignements, des difficultés urinaires et une gêne des mouvements. Les tumeurs sous-cutanées sont mesurées deux fois par semaine sous anesthésie gazeuse. Toutes sont tuées par dislocation cervicale après anesthésie, pour prélever les tumeurs, les organes lymphoïdes et le foie.

Objectifs

Le taux de cholestérol peut modifier la prolifération et l’activation des cellules immunitaires. La concentration du cholestérol dans les cellules est contrôlée par des récepteurs spécifiques, les récepteurs nucléaires LXRs (Liver X Receptors). Le rôle de ces LXRs dans la composante immunitaire de la prostate tumorale n’est pas clairement établi. Il existe deux récepteurs LXRs, alpha et beta codés par des gènes différents. Au niveau des cellules immunitaires, les deux types de récepteurs semblent avoir des rôles distincts et spécifiques de certains sous-types cellulaires. Ce projet consiste à définir si les deux types de récepteurs ont des conséquences différentes sur la nature et la fonction de l’infiltrat immunitaire des tumeurs prostatiques. Les études seront conduites sur des tumeurs greffées sur des souris avec des cellules immunitaires dont le gène codant pour chacun des récepteurs LXRs est non fonctionnel. Le but de ces travaux sera de définir l’impact de l’absence des récepteurs LXRs dans l’infiltrat immunitaire tumoral prostatique.

Bénéfices attendus

Plusieurs études montrent que les LXRs peuvent moduler le paysage immunitaire de différentes tumeurs avec des rôles différentiels pour les deux isoformes de LXRs . L’objectif de ce travail est de définir les différences d’implication des deux LXRs sur la croissance tumorale et sur la réponse immune antitumorale dans un modèle pré-clinique de cancer de la prostate. L’utilisation d’un modèle syngénique (cellules greffées et hôte de la même espèce) est pertinent pour s’approcher au mieux d’une réponse immunitaire réelle et complète, à l’inverse de l’utilisation de modèles xénogreffés sur souris immunodéprimées. A court terme ce projet donnera des arguments pour poursuivre l’investigation entre les LXRs et la réponse immune chez la souris, notamment pour établir des modèles transgéniques dans lesquels on manipulera de façon génétique l’expression des LXRs dans certaines cellules immunitaires. L’élucidation des rôles précis des LXRs dans ces sous-types immunitaires et la possibilité d’utiliser des modulateurs de leur activité permettrait le développement de thérapies adjuvantes pour accroître l’efficacité de l’immunothérapie du cancer de la prostate.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions :1) implantation sous-cutanée de cellules tumorales de souris réalisé 1 seule fois durée de la procédure maximum 10 secondes 2) une implantation intra-prostatiques des cellules tumorales de souris réalisé une seule fois, durée de la procédure maximum 10 minutes. Toutes les souris seront observées deux fois par semaine selon une grille de score permettant d'évaluer leur comportement et les tumeurs sous-cutanées mesurées deux fois par semaine sous anesthèsie gazeuse (environ 30 secondes).

Impact sur les animaux

Le projet proposé est susceptible d’induire des nuisances, telles qu’une perte de poids, un stress, une perte d’appétit et des douleurs successives au geste chirurgical et à la prise tumorale. En particulier , l’implantation de tumeur en sous-cutanée peut induire des grosseurs susceptibles de gêner les mouvements normaux de l’animal. Il peut induire des douleurs de longue durée ou gonflements au niveau du site de greffe. Une infection/inflammation locale au site d’injection, ainsi que l’apparition d’hématomes font également partie des effets indésirables possibles (sévérité modérée). Des effets systémiques peuvent être attendus : perte de poids, faiblesse musculaire, altération du comportement (sévérité modérée). Ces effets peuvent apparaître pendant toute la durée de la procédure c'est a dire 30 jours. L’implantation de tumeur en orthotopique (intra-prostatique) est une procédure pouvant également induire des effets néfastes, tels qu’une inflammation locale et des douleurs moyennes, de moyenne durée. L’insertion de cellules tumorales dans la prostate (organe richement vascularisé) peut entraîner des saignements locaux de courte durée. Malgré un geste maitrisé, la lésion des structure et tissus environnants est possible, entrainant des difficultés urinaires. La prise tumorale et le développement d’une masse pelvienne peuvent également entrainer des douleurs, et des difficultés urinaires et de motilité de l’animal (sévérité modérée). Ces effets peuvent apparaître pendant toute la durée de la procédure c'est a dire 30 jours. Des effets indésirables consécutifs à l’anesthésie sont possibles : détresse respiratoire, hypotension, bradycardie, hypothermie. Ces effets indésirables sont immédiats et seront pris en charge dans les minutes post-observation. Les données de la bibliographie n’indiquent pas de potentiel métastatique de cette lignée cellulaire, les effets indésirables liés aux métastases ne sont donc pas attendus.

Devenir

Les animaux seront mis a mort par dislocation cervicale apres une anesthesie à l'isoflurane pour les prélèvements de tumeurs, organes lymphoïdes et foie pour analyses.

Remplacement

Ces études sont précédées par des études in vitro de cocultures de milieu tumoral obtenu à partir de lignées cellulaires (cellules tumorales de souris ou autres cellules de cancer de la prostate) et de cellules immunitaires. Nous évaluons notamment l’effet de l’activité ou de l’inactivation des LXRs sur les mécanismes cellulaires impliquant les cellules immunitaires (activation, capacités phagocytaires et migration), permettant de limiter le recours à l’expérimentation animale. Cependant l’utilisation de modèles tumoraux syngéniques (mêmes espèces entre tumeur greffée et animal receveur) permettra d’avoir une cartographie de l’ensemble des cellules immunitaires en fonction de l’état d’activation des LXRs au sein d’un système complet. .

Réduction

Une étude pilote, permettant d’ajuster la dose/le modèle de souris à utiliser dans l’étude principale, effectuée sur un petit lot d’animaux, permettra de limiter le nombre d’animaux inclus dans l’étude. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé et minimisé tout en maintenant la puissance statistique de l’étude. Le prélèvement de plusieurs organes par animal à la fin des expérimenations permet également d’optimiser ce nombre utilisé. Des données préliminaires obtenues par l’équipe in vitro/sur d’autres études ont également été utilisées dans la mise en place du design expérimental, afin d’affiner les hypothèses de recherche et d’éviter l’utilisation trop importante d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 4 souris avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre). L’ensemble des enrichissements est adapté aux éventuels changements de corpulence du rongeur induits par la prise tumorale (grosseurs/gènes locomotrices). Les animaux bénéficieront d’un suivi pré, per et post-opératoire renforcé, qui permettra de détecter toute apparition de souffrance ou de mal être (feuille de score pour chaque animal). Une observation quotidienne est réalisée par les zootechniciens et un suivi bihebdomadaire par les participantes au projet. Une intervention par des traitements analgésiques et anti-inflammatoires est prévue le cas échéant.

Choix des espèces

La réponse immunitaire anti-tumorale est un processus complexe impliquant le dialogue entre de nombreux types cellulaires notamment les cellules de la tumeur et les cellules immunes. L’utilisation d‘animaux immunocompétents permet d’étudier les mécanismes mis en jeu dans un organisme complet, ce qui est majeur pour le developpement de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. L’utilisation du modèle souris permet aussi d’utiliser des organismes modifiés génétiquement et d’étudier des régulateurs spécifiques. Nous utiliserons des individus post-puberts de 2 à 4 mois, correspondant à a période optimale pour les procédures d’implantation au niveau de la prostate.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries dès la gestation avec un régime carencé en oméga 3 ou équilibré, elles subissent une injection stéréotaxique de virus dans le cerveau, une injection de N-oxyde de clozapine, puis un test de mémoire de travail spatiale et un test de mémoire associative. Ce second test consiste à associer un environnement à des "stimulations" appliquées aux pattes, susceptibles selon le porteur de provoquer une douleur passagère, sans qu'il précise lesquelles. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale" et qu'aucune méthode de remplacement n'apparaît dans les bases de données consultées, l'apport annoncé étant une meilleure compréhension des liens entre alimentation et mémoire.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de notre équipe et fait suite à plusieurs années de recherche sur l'impact des acides gras polyinsaturés oméga 3 sur la physiologie du cerveau. Les données obtenues sur ce projet ont donné lieu à plusieurs publications et nous ont permis d'obtenir des soutiens financiers importants (ANR JCJC, JPND Solid européen). La carence en lipides oméga 3 est associée à des déficits du développement cérébral et des altérations de comportement à l'âge adulte. Nos résultats récents indiquent une augmentation de l'activité des neurones de l'hippocampe dans le cerveau lorsque les souris sont soumises à un régime déficient en lipides oméga 3 depuis la gestation chez les mâles et les femelles à l'âge adulte. Cette hausse d'activation de l'hippocampe est associée à une altération des mémoires de travail et associatives dépendantes de l'hippocampe en condition de carence en oméga 3. Notre objectif est de démontrer que cette hyper-activation est responsable des déficits comportementaux par des approches de pharmacogénétiques permettant de diminuer l'activité des neurones de l'hippocampe pendant la tâche comportementale.

Bénéfices attendus

Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche de pharmacogénétique et comportementale. Elle apportera des connaissances nouvelles visant à mieux comprendre les mécanismes cérébraux des troubles de la mémoire en lien avec l'alimentation.

Procédures

Les animaux seront soumis à des régimes carrencés ou équilibrés en oméga-3 depuis la gestation. Ils sont soumis à 1 test comportemental à 3 mois visant à mesurer la mémoire de travail spatiale et la mémoire associative, toutes deux dépendentes de l'hippocampe. Une injection intrapéritonéale de N-oxyde de clozapine juste avant le comportement sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux de la procédure 1 réaliseront un test de mémoire de travail spatiale qui dure 15 min au total sur deux jours (acquisition, test) et ne cause aucune détérioration de l'état général des animaux. Les animaux de la procédure 2 subiront un protocole d'association d'un environnement donné à des stimulations pouvant entrainer une douleur passagère au niveau des pates mais n'entrainant pas de perte de poids, ni d'altération de l'état général des animaux. Pour les deux procédures, les régimes équilibré, carencé en Oméga 3 n’impactent pas le bien-être général de l’animal en termes de comportements alimentaire ou social mais pourraient modifier les capacités cognitives que nous voulons étudier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection stéréotaxique chirurgicale d'un virus dans le cerveau, qui induira une douleur passagère chez les animaux, traitée par une approche d'antalgiques pré et post-opératoire. Une baisse de l'appetit et une diminution du poids des animaux est possible en post-opératoire et nécessitera un suivi post-opératoire journalier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection de N-oxyde de clozapine en périphérie, qui n'a pas d'effet indésirables à la dose et fréquence d'administration sur l'état de bien être des animaux, mais induira une légère douleur passagère liée au geste.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en oméga n-3 sur les mémoires à l'âge adulte chez la souris. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique afin de permettre un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre dans les destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer, notamment concernant l'étude des exosomes. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu tel que des igloo en carton ou en plastique, ainsi que de l'eau et de la nourriture à volonté. Les souris auront plusieurs phases d'habituation : une semaine d'habituation à l'arrivée des géniteurs, une habituation à l'experimentateur avant les tests et/ou les chirurgies, une habituation aux pièces de comportement avant les tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Le projet porte sur le stade adulte des animaux pour lequel des données préliminaires ont été générées chez la souris et la genèse de données nouvelles sur le modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et déclin cognitif, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement notamment à l'âge adulte.

Injection de cellules tumorales en moins d'une minute, mesure du volume de la tumeur tous les deux jours sur animal vigile, trois vaccinations sous anesthésie espacées d'une semaine, deux prises de sang, puis radiothérapie. 2 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans un modèle de cancer du sein pour les femelles et de mélanome pour les mâles. Le porteur affirme que le développement de la tumeur ne créera pas de contrainte mécanique et que la radiothérapie, administrée au quart ou à la moitié de la dose maximale tolérée, n'induit aucune nuisance. Toutes sont tuées, soit après avoir atteint les points limites, soit pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité antitumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par le matériel génétique tumoral hors des cellules. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération du matériel génétique tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et potentialise l’immunité antitumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité du matériel génétique dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité antitumorale. Nous avons caractérisé récemment une composante dont la fonction principale est de couper/digérer le matériel génétique libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience de cette enzyme limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de protéine, ciblant le matériel génétique tumoral, dans la régulation de l’immunité antitumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de cette composante dans la régulation de l’immunité antitumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser le rôle d'une composante ciblant le matériel génétique libéré dans les tumeurs dans la régulation de l’immunité antitumorale induite par différentes radiothérapies en oncologie. C’est une question fondamentale car le matériel génétique libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Des résultats préliminaires de nos collaborateurs semblent indiquer que cette composante soit requise pour l’induction de l’immunité antitumorale induite par certaines chimiothérapies, notre but est d’étudier les rôles de cette composante dans les mêmes modèles tumoraux mais traités par radiothérapies. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Procédures

1. L’injection des cellules tumorales ou des anticorps est réalisée en moins d’une minute. 2. Certains animaux de l’étude auront deux prélèvements de sang. 3. La mesure du volume tumoral est effectuée tous les deux jours sur des animaux vigiles. et dure moins d’une minute par souris. 4. La vaccination par des cellules s’effectue sur souris endormies à 3 reprises espacées d’une semaine ; l’injection dure au maximum une minute par souris.

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée à l'injection de cellules par voie sous-cutanée ou dans le coussinet de la glande mammaire est équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille. Le développement des tumeurs sera suivi par des mesures régulières et leur développement ne créera pas de contraintes mécaniques chez les souris. Concernant les nuisances associées aux traitements par les vésicules, des études préliminaires ont montré qu’elles ne seraient pas supérieures à celles induites par une piqûre d’aiguille ; aucune autre douleur n’est prévisible. Dans ce projet, la thérapie radioactive n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la dose maximale tolérée.

Devenir

Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront euthanasiés à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction d’une enzyme coupant/digérant le matériel génétique relargué par les cellules cancéreuses impliquée dans la mise en place de la réponse antitumorale suite aux traitements anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés avec une déficience de cette enzyme. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudierons l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Concernant la gestion de la colonie de souris, nous utilisons les souris femelles pour le modèle de cancer du sein, tandis que les souris mâles seront utilisées pour le modèle de mélanome. Ainsi, les mâles et les femelles issues de notre colonie seront utilisés pour l’un de nos modèles, afin d’optimiser au maximum la gestion de notre colonie.

Raffinement

Nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures (décrits dans la section procédure) mises en œuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. L’approche des points limites entrainera une surveillance accrue des animaux (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car nous avons une souche de souris génétiquement déficiente pour la composante que nous étudions afin répondre au mieux à nos objectifs. Nous utiliserons les souris adultes à partir de 8 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle d’une composante l’induction de l’immunité antitumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein et du mélanome, des pathologies qui affectent exclusivement l’adulte.

Prélèvement du bout de la queue sous anesthésie gazeuse au sevrage, deux injections immunisantes, deux prises de sang, puis surveillance de l'apparition de tumeurs pendant douze mois. 486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les lignées sont construites pour surexprimer le facteur c-MYC dans les lymphocytes B, afin d'observer la transformation tumorale qui mène à la leucémie lymphoïde chronique, la moitié des souris de la lignée témoin développant un lymphome vers neuf semaines. Le porteur décrit une douleur continue dès que la tumeur devient palpable, tout en classant l'ensemble du projet en souffrance modérée, la détection de la tumeur servant de point limite.

Objectifs

La Leucémie Lymphoïde Chronique est un lymphome, c’est à dire un cancer des lymphocytes B, très fréquent, particulièrement chez les personnes âgées, dont l’évolution est variable mais qui demeure encore aujourd’hui incurable. Les lymphocytes B assurent normalement la défense de l’organisme contre les agents pathogènes (virus, bactéries…) mais peuvent être sujets à la transformation tumorale en cellules cancéreuses. Nous cherchons à identifier les mécanismes à l’origine de la transformation des lymphocytes B en cellules cancéreuses de la leucémie lymphoïde chronique. A partir de prélèvements de patients nous avons identifié l’altération de l’expression d’un gène qui régule la prolifération cellulaire et la mort cellulaire dans les cellules tumorales. Aujourd’hui, nous souhaitons reproduire cette dérégulation dans les lymphocytes B de souris afin d’étudier son impact sur la transformation tumorale des lymphocytes B. Le modèle murin présente une très forte homologie de structure et de fonction des gènes avec l’humain, et permet de récapituler la complexité des systèmes et interactions cellulaires des organismes entiers nécessaires pour comprendre les évènements mis en jeu dans la transformation tumorale. Dans ces animaux, nous détecterons l’émergence de lymphome et nous étudierons la fonction des lymphocytes B normaux et tumoraux.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence le rôle de l'altération génétique identifiée dans l'altération de la fonction des lymphocytes B ainsi que dans la transformation tumorale de ces cellules. Les bénéfices attendus sont l’apport de nouvelles données permettant une meilleure compréhension de la transformation tumorale dans la leucémie lymphoïde chronique mais aussi de façon plus générale des mécanismes physiologiques qui régissent le développement, la fonction et l’homéostasie des lymphocytes B.

Procédures

Tous les animaux générés seront génotypés au moment du sevrage par prélèvement de bout de queue sous anesthésie gazeuse, un seul prélèvement sera effectué par animal. Tous les animaux du groupe immunisation vont recevoir deux injections de solution immunogène et une injection de marqueur de prolifération cellulaire. Ces animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La survenue de tumeur peut entrainer de la douleur continue. L’injection en intra-péritonéale peut entrainer une douleur d’intensité légère de courte durée. Le prélèvement de bout de queue ainsi que la pose de boucle sous isoflurane induisent un stress physique et transitoire chez l'animal provoqué par la contention ainsi qu'une douleur de faible intensité durant une courte durée au réveil de l'animal. L'immunisation va provoquer un stress physique chez l'animal dû à la contention et une douleur de faible intensité et de courte durée suite à l'administration de l'aiguille. L’apparition de tumeur chez l'animal va entrainer une gêne et une douleur continue chez l'animal lorsque celle ci pourra être détectée par palpation. L'administration de l’analgésique va provoquer un stress physique chez l'animal dû à la contention et une douleur de faible intensité et de courte durée suite à l'administration de l'aiguille.

Devenir

A l’issue des procédures 1 et 2, les animaux de génotype non d’intérêt seront euthanasiés. Tous les animaux sont euthanasiés au cours des procédures 1, 2, 3 et 4. Pour caractériser les sous-populations de lymphocytes B et caractériser les cellules cancéreuses nous devons travailler à partir des lymphocytes B isolés à partir des cellules de la rate et de la moelle osseuse des souris ce qui nécessite l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Dans le but de remplacer l'utilisation des animaux, ce projet a été initié dans une étude pilote menée sur une lignée cellulaire cultivée in vitro. Les résultats obtenus justifient l'approfondissement du projet qui ne peut être mené autrement que dans un organisme entier qui récapitule la complexité du système immunitaire, des intéractions entre populations cellulaires et les évènements oncogéniques. La très forte homologie de structure et fonction entre les gènes d'immunoglobuline humains et murins faisant de la souris le modèle expérimental incontournable pour cette étude.

Réduction

Le nombre des animaux sera réduit au minimum permettant l'obtention de résultats avec une valeur statistique. L'analyse des lymphocytes B normaux et tumoraux des 4 lignées sera réalisée par 4 expériences indépendantes pour assurer la reproductibilité des données. Pour chaque expérience, l'utilisation de 5 souris de chaque lignée permettra de diminuer l'écart type entre les résultats obtenus. Nous pourrons ainsi réaliser une analyse statistique des résultats. Soit un total de 80 souris, c'est à dire 20 souris de chaque lignée. Pour les immunisations, 4 expériences indépendantes seront réalisées avec l'utilisation de 5 souris de chaque lignée (total de 80 souris). Pour l'analyse des lymphocytes B et les immunisations, nous utiliserons des souris d’âge entre 12 et 16 semaines. Pour le suivi du développement de lymphome dans la lignée test d'intérêt en comparaison de la lignée contrôle, pour avoir une valeur statistique, il est nécessaire d’observer l’émergence de tumeur sur un nombre suffisant de souris. Dans la lignée contrôle, l’incidence de lymphome est de 50% à l’âge moyen de 9 semaines. Alors, la surveillance de l’émergence de lymphome, sera effectuée par le suivi de 50 souris de chaque lignée, test et contrôle, jusqu’à l’apparition de tumeurs ou pendant 12 mois afin de pouvoir comparer l’émergence de lymphome entre les deux lignées.

Raffinement

Le phénotype de la lignée contrôle développant des lymphomes est bien décrit et connu, il s’agit d’un phénotype dommageable avec émergence de lymphome caractérisé par des tumeurs à un âge précoce. La lignée test est une lignée créée dans le projet. Son phénotype n’est pas encore connu mais très vraisemblablement il s’agira d’un phénotype dommageable proche de celui de la lignée contrôle avec émergence de lymphome. Les souris feront donc l’objet d’une surveillance accrue consistant à détecter les premiers signes de suspicion d’émergence de lymphome : -aspect : poils hérissés, dos courbé, perte de poids, anomalie du déplacement, apparition d’une masse; -comportement : isolement. En cas de suspicion, l’animal concerné sera palpé afin de déceler une masse cellulaire anormale non décelable à l’observation. La détection de tumeur est un point limite est les animaux concernés seront euthanasiés.

Choix des espèces

Il existe une très forte homologie de structure et fonction entre les gènes d'immunoglobuline humain et murin faisant de la souris un modèle expérimental incontournable pour l'étude du système immunitaire et des évènements oncogéniques aboutissant à des cancers des lymphocytes B, ainsi la souris est l'espèce de référence internationale pour l'étude des cancers des lymphocytes. Les souris utilisées seront adultes âgées d'au moins 10 semaines, âge à partir duquel le système immunitaire est mature, et euthanasiées à l'âge maximum de 12 mois, âge après lequel la lymphomégénèse peut être due à une immunodépression associée au vieillissement.