Oncologie
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Effets de la radioth?rapie sur le remodelage stromal et neuro-immunitaire dans un mod?le murin de cancer de la t?te et du cou
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Faire pousser une tumeur dans la bouche de souris pour observer ce que la radiothérapie change autour d'elle : 60 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Des cellules tumorales sont injectées dans leur muqueuse jugale, puis viennent six à douze séances d'imagerie, six à quinze injections intrapéritonéales et une séance d'irradiation localisée. Le porteur décrit une inflammation de la joue ou de la langue, un bourgeon tumoral pouvant s'ulcérer, des saignements, une infection locale et des difficultés à s'alimenter, sur une durée maximale de quatre à cinq semaines par souris, avec prostration et réduction des interactions sociales. Ce que le projet promet en retour reste au conditionnel et au long terme : de nouvelles cibles thérapeutiques, des biomarqueurs prédictifs de réponse à la radiothérapie, une meilleure stratification des patients.
Objectifs
Les cancers de la cavit? orale repr?sentent un probl?me de sant? publique majeur. Malgr? les progr?s de la m?decine et l'utilisation combin?e de la chirurgie, de la chimioth?rapie et de la radioth?rapie, de nombreux patients font face ? des r?cidives ou ? une r?sistance aux traitements. Actuellement, seul un patient sur deux survit au-del? de cinq ans apr?s le diagnostic. Il est donc indispensable de comprendre pourquoi les traitements actuels ?chouent afin de proposer de nouvelles solutions th?rapeutiques. Une tumeur n'est pas seulement constitu?e de cellules canc?reuses ; c'est un ?cosyst?me complexe qui d?tourne ? son profit des cellules normales de l'organisme, appel?es cellules de soutien (ou cellules stromales), pour se prot?ger des attaques du syst?me immunitaire et r?sister aux traitements. De plus, des ?tudes r?centes sugg?rent que les nerfs situ?s autour de la tumeur jouent ?galement un r?le actif en favorisant la progression de la maladie. Ce projet de recherche poursuit trois objectifs principaux : Comprendre la r?sistance aux traitements : Nous voulons observer comment la radioth?rapie modifie l'environnement de la tumeur. L'objectif est de comprendre si certaines cellules de soutien ou les fibres nerveuses environnantes aident la tumeur ? se "r?parer" ou ? se cacher du syst?me immunitaire apr?s le traitement. ?tudier le r?le des cellules de soutien sp?cifiques : Nous ?tudierons les relations entre les cellules stromales, les cellules tumorales et le microenvironnement immunitaires. Identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques : En analysant finement les interactions entre le cancer, les nerfs et les cellules de soutien, nous esp?rons identifier des signaux de communication que nous pourrions bloquer par de nouveaux m?dicaments. ? terme, les b?n?fices attendus de ce projet sont de fournir des bases scientifiques pour le d?veloppement de th?rapies innovantes qui pourraient ?tre combin?es ? la radioth?rapie classique ou ? l?immunoth?rapie, afin d'augmenter les chances de gu?rison des patients atteints de cancers de la t?te et du cou.
Bénéfices attendus
Ce projet vise ? am?liorer la compr?hension des m?canismes impliqu?s dans la progression des carcinomes ?pidermo?des de la cavit? orale et dans leur r?ponse ? la radioth?rapie, pathologies pour lesquelles les options th?rapeutiques restent limit?es et les taux de r?cidive ?lev?s. Progr?s des connaissances scientifiques (Court et moyen terme) : Ce projet permettra d?acqu?rir de nouvelles connaissances sur les interactions entre les cellules tumorales, le stroma tumoral et les structures nerveuses dans un mod?le murin immunocomp?tent. L?utilisation d?un mod?le orthotopique associ? ? des techniques d?imagerie in vivo permettra une analyse dynamique et non invasive de la croissance tumorale et de sa r?ponse au traitement. L??tude des effets pr?coces et tardifs de la radioth?rapie permettra notamment : ? de mieux caract?riser les modifications du microenvironnement tumoral induites par l?irradiation, ? d?identifier les m?canismes impliqu?s dans la r?ponse ou la r?sistance au traitement, ? d??valuer le r?le des cellules stromales et immunitaires dans ces processus. L?administration de mol?cules modulant le microenvironnement tumoral (agonistes, antagonistes ou anticorps monoclonaux) permettra ?galement d?explorer de mani?re fonctionnelle les voies biologiques impliqu?es. B?n?fices pour la sant? humaine (Long terme) : Les r?sultats issus de ce projet pourraient contribuer ? am?liorer la prise en charge des patients atteints de cancers de la cavit? orale, par : ? l?identification de nouvelles cibles th?rapeutiques, en particulier au sein du microenvironnement tumoral, ? le d?veloppement de strat?gies associant radioth?rapie et modulation du stroma ou du syst?me immunitaire, ? l?identification de biomarqueurs pr?dictifs de r?ponse ? la radioth?rapie, permettant une meilleure stratification des patients. Ces avanc?es pourraient, ? terme, contribuer ? am?liorer l?efficacit? des traitements, ? r?duire les risques de r?cidive et ? limiter l?exposition ? des traitements inefficaces. B?n?fices pour la communaut? scientifique : Ce projet contribuera ?galement ? : ? valider un mod?le pr?clinique pertinent de cancer oral int?grant les interactions avec le microenvironnement, ? promouvoir l?utilisation de techniques d?imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal des tumeurs, ? g?n?rer des donn?es qui pourront ?tre partag?es avec la communaut? scientifique via des publications et des communications.
Procédures
Implantation tumorale : Une injection de cellules tumorales sera r?alis?e une seule fois (J0), sous anesth?sie g?n?rale Nombre : 1 injection par animal Dur?e : 2 ? 5 minutes (anesth?sie incluse : environ 5 ? 10 minutes) Imagerie: Le suivi tumoral sera r?alis? par imagerie non invasive apr?s injection de produit d?imagerie. Fr?quence : 2 ? 3 fois par semaine Nombre total : environ 6 ? 12 s?ances par animal selon la dur?e de suivi Dur?e : 5 ? 10 minutes d?acquisition (dur?e totale avec anesth?sie : environ 15 ? 20 minutes par s?ance) Injections de traitements et de substances d?imagerie Les animaux recevront des injections intrap?riton?ales r?p?t?es. Nombre : variable selon les groupes (environ 6 ? 15 injections au total par animal) Dur?e : quelques secondes par injection (< 1 minute), sans anesth?sie ou sous anesth?sie l?g?re si n?cessaire Radioth?rapie : Une irradiation localis?e sera r?alis?e chez les animaux des groupes concern?s. Nombre : 1 s?ance par animal Dur?e : 5 ? 15 minutes (dur?e totale incluant anesth?sie : environ 20 ? 30 minutes)
Impact sur les animaux
Le protocole exp?rimental est susceptible d?induire plusieurs types de nuisances et effets ind?sirables chez les animaux, principalement li?s ? l?implantation tumorale, ? la croissance de la tumeur, aux proc?dures exp?rimentales r?p?t?es et au traitement par radioth?rapie. Douleur, l?sions et maladies : L?injection de cellules tumorales dans la muqueuse jugale entra?ne une douleur aigu?, br?ve (quelques secondes) li?e ? l?introduction de l?aiguille fine. Le d?veloppement tumoral dans la cavit? orale est susceptible d?induire, ? partir de quelques jours apr?s l?injection et jusqu?? la mise ? mort : ? une inflammation locale (joue et/ou langue), ? l?apparition d?un bourgeon tumoral, pouvant ?voluer vers une ulc?ration de la muqueuse, ? des saignements, ? une infection locale. Ces l?sions peuvent entra?ner des cons?quences fonctionnelles, notamment des difficult?s alimentaires, avec un risque de perte de poids. Les injections peuvent induire une douleur de quelques secondes lors de l?introduction de l?aiguille et une g?ne de quelques minutes au point de ponction. La radioth?rapie localis?e est indolore dans les suites imm?diates mais peut induire des effets secondaires locaux quelques jours apr?s la s?ance jusqu?? la fin de l?exp?rience d?intensit? mod?r?e, comprenant : ? une inflammation de la muqueuse buccale, ? une irritation locale, ? une majoration des troubles alimentaires. Stress physique et effets li?s aux proc?dures : Les animaux seront soumis ? des manipulations r?p?t?es (contention, imagerie, injections intrap?riton?ales, irradiation), susceptibles d?induire un stress l?ger ? mod?r?. Comportement, peur et d?tresse : L?ensemble des proc?dures et la progression tumorale peuvent induire des modifications comportementales, telles que : ? une diminution de l?activit?, ? une r?duction de l?exploration, ? une prostration, ? une alt?ration des interactions sociales. Ces signes traduisent un ?tat de stress ou d?inconfort mod?r?. Dur?e et intensit? des nuisances Les nuisances d?crites sont d?intensit? s?v?re avec un risque d?aggravation li? ? la progression tumorale. Elles s??tendent sur une dur?e maximale de 4 ? 5 semaines par animal, correspondant ? la p?riode de croissance tumorale et de suivi post-traitement.
Devenir
Tous les animaux seront mis ? mort ? la fin de chaque proc?dure car ils ne peuvent ?tre ni r?utilis?s, ni replac?s, ni adopt?s car ils ont une pathologie chronique qui peut avoir des r?percussions sur leur bien-?tre si pas de mise ? mort.
Remplacement
L??tude des m?canismes de r?sistance aux traitements dans les cancers de la cavit? orale repose sur des interactions complexes entre diff?rents compartiments cellulaires et tissulaires. Des m?thodes alternatives non animales existent, mais elles pr?sentent des limites importantes au regard des objectifs de ce projet. Alternatives non animales disponibles et leurs limites : Des approches in vitro, telles que les cultures cellulaires en deux dimensions ou les mod?les tridimensionnels de type organo?des, permettent d??tudier certains aspects sp?cifiques de la biologie tumorale, notamment la prolif?ration cellulaire ou la r?ponse directe ? des traitements (radioth?rapie, agents pharmacologiques). Ces mod?les sont utiles pour des analyses m?canistiques cibl?es. Cependant, ces syst?mes ne permettent pas de reproduire la complexit? du microenvironnement tumoral in vivo. En particulier, ils ne permettent pas d?int?grer simultan?ment : ? les interactions dynamiques entre cellules tumorales, cellules stromales et cellules immunitaires, ? la vascularisation et les ph?nom?nes de perfusion tissulaire, ? la r?ponse inflammatoire syst?mique, ? ni les interactions avec le syst?me nerveux p?riph?rique. Or, ces param?tres sont essentiels dans l??tude des effets de la radioth?rapie et des m?canismes de r?sistance tumorale. Les mod?les in silico (mod?lisation informatique) constituent ?galement des outils compl?mentaires, mais leur capacit? pr?dictive reste limit?e par l?insuffisance de donn?es biologiques int?gr?es, notamment concernant le r?le du microenvironnement stromal et nerveux dans les cancers de la cavit? orale. Justification de l'utilisation d'animaux vivants : ? ce jour, l?utilisation d?animaux vivants reste indispensable pour r?pondre aux objectifs du projet. Seul un mod?le in vivo permet de conserver l?int?grit? de l?architecture tissulaire, de la vascularisation et du syst?me immunitaire, ainsi que les interactions dynamiques entre ces diff?rents compartiments. Le mod?le murin utilis? permet en particulier : ? l??tude de la r?ponse tumorale dans un organisme immunocomp?tent, ? l?analyse des effets locaux et syst?miques de la radioth?rapie, ? et l?exploration des interactions entre la tumeur, le stroma et le syst?me nerveux dans un contexte physiologique. Ces ?l?ments sont essentiels pour obtenir des donn?es biologiques pertinentes et transposables ? la pathologie humaine.
Réduction
Le nombre d?animaux utilis?s dans ce projet a ?t? d?termin? de mani?re ? ?tre le plus faible possible tout en garantissant la robustesse statistique et la validit? scientifique des r?sultats. D?termination du nombre d'animaux : Le nombre de souris par groupe exp?rimental a ?t? estim? ? partir d?une analyse de puissance statistique, bas?e sur des donn?es issues de la litt?rature et de r?sultats pr?liminaires obtenus dans des mod?les comparables. Ce calcul conduit ? un effectif de 15 animaux par groupe, en tenant compte de la variabilit? biologique et des pertes potentielles (?chec de prise tumorale, exclusion selon les crit?res exp?rimentaux ou atteinte de points limites). Mesures prises pour limiter l'utilisation d'animaux : Plusieurs strat?gies sont appliqu?es afin de limiter le nombre d?animaux utilis?s : ? Suivi longitudinal par imagerie non invasive : L?utilisation de l?imagerie permet de suivre la croissance tumorale au cours du temps chez un m?me animal, ?vitant ainsi la constitution de groupes distincts pour chaque point temporel. ? Optimisation du design exp?rimental : Les groupes exp?rimentaux ont ?t? limit?s au strict n?cessaire (contr?le, effet pr?coce, effet tardif), permettant de r?pondre aux objectifs scientifiques sans multiplication des conditions. ? Standardisation des proc?dures : L?utilisation de lign?es cellulaires bien caract?ris?es et d?un mod?le murin homog?ne permet de r?duire la variabilit? interindividuelle et donc le nombre d?animaux n?cessaires pour atteindre une significativit? statistique. ? Mutualisation des pr?l?vements : Les tissus collect?s ? la fin des exp?riences seront utilis?s pour plusieurs types d?analyses (histologie, immunofluorescence, cytom?trie en flux, analyses mol?culaires), permettant de maximiser les donn?es obtenues ? partir de chaque animal. ? Partage des ?chantillons biologiques : Les tissus non utilis?s pour les analyses principales pourront ?tre conserv?s et mis ? disposition d?autres projets de recherche, contribuant ainsi ? limiter le recours ? de nouveaux animaux. M?thodes statistiques Les donn?es seront analys?es ? l?aide de tests statistiques adapt?s, notamment : ? comparaisons de moyennes entre groupes (tests param?triques ou non param?triques selon la distribution des donn?es), ? analyses de croissance tumorale (mod?les longitudinaux ou analyses de variance pour mesures r?p?t?es), ? analyses de survie si applicable
Raffinement
Toutes les proc?dures potentiellement douloureuses sont r?alis?es sous anesth?sie adapt?e : ? anesth?sie par isoflurane pour l?injection tumorale, les injections d?anticorps monoclonaux et les examens d?imagerie, ? anesth?sie g?n?rale pour la radioth?rapie, garantissant une immobilit? compl?te. Une analg?sie syst?matique par morphine ou d?riv? est instaur?e de mani?re pr?ventive d?s l?apparition d?une tumeur palpable et poursuivie jusqu?? la fin de l?exp?rience. Elle pourra ?tre adapt?e en fonction de l??valuation clinique (fr?quence et dose ajust?es si signes d?inconfort). Les injections intrap?riton?ales sont r?alis?es avec : ? utilisation d?aiguilles de petit calibre, ? respect des volumes recommand?s, ? contention douce et rapide. Une surveillance clinique rapproch?e est mise en place tout au long de l??tude : ? suivi quotidien de l??tat g?n?ral, ? pes?e r?guli?re (au minimum 2 ? 3 fois par semaine, voire quotidienne en phase critique), ? ?valuation du comportement (activit?, posture, interactions), ? surveillance de la prise alimentaire et hydrique, ? suivi de la taille tumorale et de son aspect (ulc?ration, n?crose, saignement, infection). Compte tenu de la localisation tumorale dans la cavit? orale, des mesures sp?cifiques sont mises en place de mani?re pr?coce : ? alimentation enrichie et ramollie (gel nutritif, p?t?e) d?s l?apparition de la tumeur, ? acc?s facilit? ? l?eau (biberons adapt?s, gels hydratants), ? r?hydratation sous-cutan?e si n?cessaire, ? adaptation de l?environnement avec une liti?re douce ? base de cellulose pour limiter les irritations et les risques de plaies. Ces mesures visent ? maintenir un ?tat nutritionnel et hydrique satisfaisant et ? limiter la douleur li?e ? la mastication. Une d?marche d?am?lioration continue est mise en place pendant toute la dur?e du projet : ? ?changes r?guliers avec le v?t?rinaire r?f?rent et la structure de bien-?tre animal, ? r??valuation des protocoles en fonction des observations cliniques, ? veille scientifique et technique pour identifier des m?thodes moins invasives ou plus efficaces en termes de raffinement. Toute am?lioration valid?e (optimisation de l?analg?sie, ajustement des points limites, am?lioration des conditions d?h?bergement ou des techniques exp?rimentales) sera int?gr?e en cours de projet, dans le respect des objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris est l?esp?ce la plus appropri?e pour r?pondre aux objectifs de ce projet. Mod?le largement utilis? et valid? en canc?rologie, elle permet l??tude du d?veloppement tumoral dans un organisme immunocomp?tent. Les souris poss?dent un syst?me immunitaire bien caract?ris?, comparable dans ses grands principes ? celui de l??tre humain, permettant d?analyser les interactions entre cellules tumorales, microenvironnement stromal et r?ponse immunitaire. Des mod?les tumoraux adapt?s ? ces souris assurent une bonne reproductibilit?. Aucune autre esp?ce ne permet actuellement de reproduire de mani?re aussi fiable ces interactions complexes tout en limitant les nuisances. La souris est par ailleurs adapt?e aux proc?dures pr?vues (imagerie in vivo, injections, radioth?rapie), r?alisables sous anesth?sie avec un bon niveau de ma?trise. Sa robustesse et sa tol?rance aux manipulations permettent un suivi pr?cis. Ainsi, son utilisation repr?sente le meilleur compromis entre pertinence scientifique et bien-?tre animal. Les animaux utilis?s dans ce projet sont des souris au stade adulte, ?g?es de 8 ? 12 semaines au d?but des proc?dures exp?rimentales. L'utilisation d'animaux adultes est scientifiquement indispensable pour plusieurs raisons : 1. Maturit? des syst?mes : ? cet ?ge, le syst?me immunitaire et le syst?me nerveux p?riph?rique sont pleinement d?velopp?s et fonctionnels. Comme notre ?tude porte sur les interactions complexes entre les nerfs, les cellules immunitaires de l'organisme et les cellules de soutien de la tumeur, il est crucial d'?tudier un organisme dont les fonctions biologiques sont stabilis?es et comparables ? celles d'un patient humain adulte. 2. R?ponse aux traitements : La r?action des tissus ? la radioth?rapie est influenc?e par la maturit? cellulaire. L'utilisation de souris adultes permet de mod?liser fid?lement la r?ponse clinique observ?e chez les patients atteints de cancers de la bouche et de la gorge. 3. Tol?rance aux interventions : Les souris adultes pr?sentent une meilleure tol?rance physiologique aux anesth?sies r?p?t?es n?cessaires pour le traitement et l'imagerie, ce qui participe au raffinement des proc?dures en limitant les risques de complications pr?coces.
Biologie des ?pith?liums cili?s
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Sédatées dans un bain de benzocaïne puis injectées d'hormone gonadotropine sous la peau, des xénopes femelles sont massées le lendemain pour leur faire pondre, à raison de deux injections par an et de deux à trois massages par semaine d'expérimentation. 120 xénopes sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans mise à mort prévue : au-delà de dix-huit injections reçues depuis la naissance, une femelle est gardée en aquarium jusqu'à sa mort naturelle, sinon elle repart dans une autre procédure. Les embryons obtenus servent à étudier la formation de l'épithélium muco-cilié, un tissu que le porteur rapproche de celui des voies respiratoires humaines. Il déduit l'absence de souffrance de la ponte elle-même, écrivant que "la quantité et qualité des œufs est le signe de bien-être des animaux" et que les femelles "ne montrent aucun signe de douleur (cris, débattements)".
Objectifs
Ce projet vise ? comprendre les m?canismes de formation de l??pith?lium muco-cili?, un tissu essentiel pr?sent dans plusieurs organes humains, comme les voies respiratoires, le cerveau et les organes g?nitaux. Ce tissu est compos? de cellules s?cr?trices de mucus et de cellules multicili?es, qui forment une barri?re protectrice contre les pathog?nes et les polluants. Un dysfonctionnement dans sa mise en place peut entra?ner des pathologies graves, comme les ciliopathies, des maladies li?es ? des d?fauts de la ciliog?n?se (processus de formation des cils). Bien que la ciliog?n?se soit un processus biologique central pour le d?veloppement et le fonctionnement des organismes, certaines de ses ?tapes restent mal comprises. Cela limite la mise au point de traitements efficaces, notamment pour les maladies respiratoires chroniques, o? la r?g?n?ration de l??pith?lium muco-cili? est cruciale pour am?liorer les sympt?mes. L?embryon de x?nope est un mod?le id?al, car son ?piderme est un ?pith?lium muco-cili? tr?s similaire ? celui des voies respiratoires humaines. Chez le x?nope, cet ?pith?lium se d?veloppe pendant l?embryogen?se, recouvre l?embryon pr?coce et est compos? des m?mes types cellulaires (cellules s?cr?trices et multicili?es). Nous nous concentrerons ces 5 prochaines ann?es sur plusieurs m?canismes cl?s comme la r?partition r?guli?re des cellules multicili?es dans l??pith?lium, la diff?renciation des diff?rents types cellulaires (s?cr?trices et multicili?es) et l??tablissement d?un flux liquidien g?n?r? par le battement coordonn? des cils (qui recouvrent l?embryon). Comprendre ces m?canismes permettrait d?avancer vers des th?rapies cibl?es pour les maladies li?es aux dysfonctionnements de cet ?pith?lium, comme certaines maladies respiratoires chroniques.
Bénéfices attendus
Notre objectif ? long terme est de d?crypter les m?canismes mol?culaires et cellulaires qui r?gissent la formation, l'organisation et le fonctionnement de l'?pith?lium mucociliaire, afin d'en ?tablir une mod?lisation compl?te et applicable ? l'Homme.
Procédures
Les x?nopes femelles seront soumises ? une injection d'hormone gonadotropine par jour d'exp?rimentation puis mass?es le lendemain. Ces injections seront au nombre de deux par an et les massages de deux ? trois par semaine d'exp?rimentation.
Impact sur les animaux
La r?duction du nombre d'animaux se fait par la r?utilisation des femelles tous les ans. Celles-ci produisant des ?ufs et de qualit?s montrent qu'elles ont retrouv? pleinement leur ?tat de sant? et de bien-?tre g?n?ral. En effet la quantit? et qualit? des ?ufs est le signe de bien-?tre des animaux. Les femelles avant l'injection sous cutan?e seront l?g?rement s?dat?es puis seront plac?es dans le noir (avec un papier absorbant humide sur les yeux par exemple) pour limiter leur stress, elles ne montrent aucun signe de douleur (cris, d?battements) lors des injections.
Devenir
? l'issue de la proc?dure, soit la femelle a re?u depuis sa naissance moins de 18 injections et elle est vou?e ? entrer dans une autre proc?dure, soit elle a atteint les 18 injections max et elle sera conserv?e en aquarium jusqu'? sa mort naturelle.
Remplacement
Notre ?quipe a mis au point une lign?e cellulaire stable de foie de xenope. Ces cellules sont capables de produire des centaines de cellules multicili?es sous l?induction d?un g?ne indispensable ? la multiciliog?se. Cette lign?e cellulaire nous permet de tester et appr?cier les effets en amont de drogues et ainsi de r?duire le nombre d?embryons utilis?s. Par contre ces cellules n?ont pas la capacit? de battement ciliaire coordonn?. Elles ne peuvent donc pas reproduire ce flux biologique puissant et indispensable ? la survie de l?embryon.
Réduction
La r?duction du nombre d'animaux se fait par la r?utilisation des femelles tous les 6 mois. Celles-ci produisant des ?ufs et de qualit?s montrent qu'elles ont retrouv?es pleinement leur ?tat de sant? et de bien-?tre g?n?ral. En effet la quantit? et qualit? des ?ufs est le signe de bien-?tre des animaux. Les femelles avant l'injection sont l?g?rement s?dat?e (niveau I) dans un bain de benzoca?ne ? 240mg/L et lors de l?injection sous cutan?e, elles sont plac?es dans le noir pour limiter leur stress, elles ne montrent aucun signe de douleur (cris, d?battements).
Raffinement
Pour limiter le stress des femelles, g?n?r? par la pr?hension, nous les anesth?sions dans un bain de benzoca?ne ? 240 mg/L entre 7 et 8 minutes ce qui permet d?atteindre le stade I de s?dation (l?g?re anesth?sie caract?ris?e par un retard du r?flexe de retournement, un d?lai dans le r?flexe de fuite et un tonus musculaire l?g?rement relax). Les femelles sont ensuite plac?es sur un linge humide recouvrant ?galement leurs yeux, ainsi plac?es dans l?obscurit?, elles sont plus calmes.
Choix des espèces
L'esp?ce Xenopus Laevis est un organisme mod?le important dans la recherche en biologie depuis un demi-si?cle. La documentation disponible et la large communaut? scientifique en font un mod?le amphibien de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caract?ristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'oeufs, temp?rature, etc.) de cette esp?ce permettent de pr?senter l'ensemble des manipulations ?l?mentaires r?alis?es lors des proc?dures exp?rimentales mises en oeuvre dans les projets de recherche. Les femelles doivent ?tre matures sexuellement soit des animaux ag?s de 2 ? 8 ans (l'animal a une longue dur?e de vie et la qualit? des ovocytes n'est pas alt?r?e). Nos recherches se feront sur les embryons de x?nopes, dans les soixante-douze premi?res heures de leur vie (avant le stade larvaire autonome). ? ce stade ils sont recouverts d'un ?pith?lium muco-cili? qui leur permet de lutter contre les agressions ext?rieures. Ce tissu ?tant tr?s proche de l'?pith?lium de la trach?e, l'embryon de x?nope est un mod?le de choix pour nos recherches.
F?condation : Etude des m?canismes de fusion spermatozo?de-ovocyte et de blocage de la polyspermie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 074 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, et tuées douze heures après la seule intervention du projet. Cette intervention tient en deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle, chacune demandant d'immobiliser la souris une minute dans la main, pour déclencher une superovulation et récupérer trois à quatre fois plus d'ovocytes qu'un cycle spontané. Le projet cherche à comprendre comment un spermatozoïde fusionne avec un ovocyte et comment celui-ci bloque ensuite l'entrée des suivants, question que le porteur relie aux faibles taux de réussite de l'assistance médicale à la procréation. Des cultures cellulaires et des membranes artificielles seront employées quand c'est possible, mais le porteur écrit que "la production de gamètes in vitro n'est pas possible" à ce jour.
Objectifs
Chez l?homme, comme chez tous les mammif?res, la f?condation repose sur une r?gle simple : un ovocyte doit fusionner avec un seul spermatozo?de, puis emp?cher toute fusion suppl?mentaire. Si plusieurs spermatozo?des fusionnent avec l?ovocyte, cela ne donne pas des jumeaux, mais une situation pathologique appel?e polyspermie, incompatible avec un d?veloppement normal de l?embryon. Malgr? des d?cennies de recherche, on comprend encore mal comment cette fusion se produit et comment l?ovocyte bloque ensuite l?entr?e d?autres spermatozo?des. Ce manque de connaissances limite notre capacit? ? expliquer certaines infertilit?s et ? am?liorer les outils de diagnostic et les traitements. Dans un contexte o? l?infertilit? est de plus en plus fr?quente et o? les techniques d?assistance m?dicale ? la procr?ation progressent peu en termes de taux de succ?s, mieux comprendre ces m?canismes est devenu un enjeu important. Dans ce contexte, notre projet vise ? ?tudier, chez la souris, comment le spermatozo?de et l?ovocyte fusionnent, et comment l?ovocyte emp?che ensuite toute fusion suppl?mentaire.
Bénéfices attendus
On estime qu'une personne sur six en France est confront?e ? un probl?me d?infertilit? et a recours ? une assistance m?dicale pour concevoir un enfant. Pourtant, les causes de l'infertilit? restent encore mal connues, et les techniques d'assistance m?dicale ? la procr?ation affichent des taux de r?ussite faibles : un quart seulement des cycles d'AMP aboutissent ? une naissance. Ceci constitue une charge importante en raison de la lourdeur des traitements, du risque ?lev? de fausse couche, et des co?t ?lev?s de chacun de ces traitements (5000 euros par cycle d?aide m?diclae ? la procr?ation). Les r?sultats de ce projet contribueront de mani?re significative ? l?avanc?e des connaissances fondamentales en biologie de la reproduction, en r?v?lant certains des m?canismes qui r?gissent la fusion des gam?tes et le blocage de la polyspermie. Cette avanc?e constitue ?galement un levier essentiel pour am?liorer les outils diagnostiques et orienter le d?veloppement de strat?gies th?rapeutiques plus cibl?es. En permettant d?identifier plus pr?cis?ment certaines causes d?infertilit?, notamment celles li?es ? des d?fauts de fusion gam?tique ou de blocage de la polyspermie, ce projet ouvre la voie ? des approches plus rationnelles et potentiellement moins invasives en assistance m?dicale ? la procr?ation.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises ? deux injections d'hormones r?alis?es ? 48 h d'intervalle pour stimuler l?ovulation. Chaque injection requiert d?immobiliser la souris dans sa main pendant environ une minute. 12 h apr?s la seconde injection, les souris sont euthanasi?es par une m?thode r?glementaire.
Impact sur les animaux
Lors des injections d?hormones, les animaux vigiles pourront subir un stress d? ? la contention et ? la faible douleur lors du franchissement de la peau par l?aiguille. La procedure d'injection, de courtes dur?es (1 minute de contention, et quelques secondes d'injection), ne sont a priori pas de nature ? provoquer de douleur forte ou durable.
Devenir
Tous les animaux soumis ? l'unique proc?dure de ce projet (superovulation) seront euthanasi?s 12h apr?s la proc?dure pour pr?l?vement des ovocytes. Une intervention chirurgicale pour pr?lever les ovocytesdu vivant de l'animal serait inutilement traumatisante pour l'animal puisqu'il ne pourrait plus reservir pour l'?tude et devrait donc ?tre euthanasi?.
Remplacement
Chaque fois que cela sera possible, des approches alternatives seront privil?gi?es, incluant des mod?les in vitro cellulaires ainsi que des syst?mes synth?tiques non cellulaires, tels que des membranes artificielles. Ces approches permettront notamment d??tudier de mani?re cibl?e les interactions entre prot?ines gam?tiques, sans recours direct aux gam?tes. Cependant, les gam?tes constituant les cellules ? l?origine du processus de f?condation, leur utilisation demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. ? ce jour, la production de gam?tes in vitro n?est pas possible, ce qui ne permet pas de s?affranchir totalement du recours au mod?le animal. N?anmoins, le projet est con?u conform?ment aux principes des 3R, avec une r?duction maximale du nombre d?animaux utilis?s et un remplacement partiel d?s que les mod?les alternatifs sont scientifiquement pertinents.
Réduction
La proc?dure de superovulation mise en ?uvre dans ce projet permet de synchroniser l?ovulation et d?augmenter le nombre d?ovocytes r?cup?r?s d?un facteur 3 ? 4 par rapport au cycle spontan?. Elle contribue ainsi ? r?duire le nombre de souris n?cessaires ? la r?alisation des f?condations in vitro sur lesquelles repose le projet. Le nombre d?animaux a ?t? optimis? afin de limiter au maximum leur utilisation, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour l?analyse des six volets de l??tude. Au total, 1 074 animaux sont pr?vus sur une dur?e de cinq ann?es de recherche.
Raffinement
La proc?dure de superovulation par injection intrap?riton?ale d'hormones ?tant class?e l?g?re, elle est ? priori peu douloureuse. Toutefois deux injections ?tant n?cessaires ? 48h d?intervalle, elles seront r?alis?es ? deux endroits diff?rents, dans le but de minimiser la douleur ressentie par la souris en ne repiquant pas une deuxi?me fois une zone potentiellement encore endolorie suite ? la premi?re injection. Quant ? la souffrance et ? l?angoisse ?ventuelles g?n?r?es par cette proc?dure, elles sont minimis?es par la dur?e courte des 2 interventions (1 minute de contention, et quelques secondes d'injection les deux fois) et un retour imm?diat dans leur cage avec leurs cong?n?res apr?s intervention. Les souris sont ? un maximum de 5. Par ailleurs, l?enrichissement syst?matique des cages avec du papier kraft permet ? la souris de retrouver rapidement un environnement r?confortant apr?s la p?riode de stress subi. Les cages se trouvent en portoirs ventil?s. Les conditions d'h?bergement des animaux respectent les r?gles en vigueur : temp?rature (22 degr?s Celsius) et humidit? (55 pourcents) contr?l?es, intensit? et dur?e d'?clairage (7h-19h) avec acc?s ? l'eau et ? l'aliment ad libitum.
Choix des espèces
La souris est un mammif?re pr?sentant de fortes homologies avec l?homme en ce qui concerne les m?canismes d?interaction des gam?tes et de blocage de la polyspermie. Les mol?cules identifi?es ? ce jour dans ces processus sont conserv?es entre les deux esp?ces. Les r?sultats obtenus dans le cadre de ce projet chez la souris seront donc pertinents pour l?homme. Par ailleurs, la souris constitue le mod?le de r?f?rence pour l??tude des processus impliqu?s dans la f?condation. Cet animal se distingue par sa petite taille et son cycle reproductif rapide. Il s?agit d?un animal particuli?rement adapt? aux modifications g?n?tiques, et les lign?es transg?niques n?cessaires ? notre ?tude sont d?j? disponibles chez la souris. Les souris seront utilis?es entre l??ge de 5 semaines et 6 mois. 5 semaines correspondent ? l??ge minimum auquel les souris donnent des ovocytes matures permettant des rendements de f?condation in vitro satisfaisants. A partir de 6 mois, la qualit? des ovocytes peut s'av?rer moins bonne et donner de moins bons r?sultats de f?condation in vitro.
Etude de la morphog?n?se du syst?me nerveux au cours du d?veloppement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale sous anesthésie générale pour atteindre les embryons et y introduire du matériel génétique par électroporation, d'autres reçoivent des injections quotidiennes pendant six jours sur souris vigile. 3 388 souris sont utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux et les fœtus sont placés sous anesthésie générale sans réveil pour le prélèvement du cerveau, une mise à mort que le porteur qualifie d'"indispensable" faute d'imagerie atteignant la résolution cellulaire voulue. La chirurgie des mères est donnée pour "environ 45 minutes" dans la description des procédures, et "limitée à 30 minutes maximum" dans celle des mesures de raffinement.
Objectifs
Comment se construit notre c?blage c?r?bral ? Vous ?tes-vous d?j? demand? comment les milliards de cellules de notre cerveau parviennent ? se ranger exactement au bon endroit pour nous permettre de penser, de bouger ou de ressentir ? Tout se joue avant la naissance. Au stade embryonnaire, de jeunes cellules (les futurs neurones) naissent et entreprennent un v?ritable voyage pour rejoindre leur destination finale dans le syst?me nerveux. Pour se guider dans ce labyrinthe, ces cellules utilisent des signaux chimiques appel?s morphog?nes. Imaginez ces signaux comme des phares dont l'intensit? diminue avec la distance : selon qu'une cellule per?oit un signal fort ou faible, elle sait o? elle se trouve et ce qu'elle doit faire. Cependant, nous ignorons encore comment ces cellules apprennent ? interpr?ter ces messages qui changent tout au long de leur croissance. L'objectif de notre projet est de comprendre comment les cellules nerveuses modifient leur mani?re de r?pondre ? ces signaux pour construire une architecture c?r?brale parfaite. Pour cela, nous utilisons des outils biologiques pour introduire avec une pr?cision chirurgicale des instructions g?n?tiques dans certaines cellules. Cela nous permet d'activer ou d'?teindre certains g?nes interrupteurs. Les ciseaux g?n?tiques (CRISPR) : Nous modifions l'ADN pour observer comment une petite modification change le comportement de la cellule et son d?placement. Pourquoi est-ce important ? Comprendre ces m?canismes, qui restent encore aujourd'hui un myst?re pour la science, est essentiel. De nombreuses maladies, comme les troubles du spectre autistique, les malformations du cerveau ou certaines d?ficiences intellectuelles, trouvent leur origine dans un bug lors de ce voyage des cellules. En d?couvrant comment le syst?me nerveux se construit normalement, nous posons les bases de futurs traitements capables de r?parer ou de pr?venir ces anomalies pr?coces.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche explore les myst?res de la fabrication du syst?me nerveux. Gr?ce ? des technologies de pointe, nous voulons comprendre comment les cellules s'organisent pour cr?er un cerveau fonctionnel. 1. Une meilleure connaissance de nos origines (Court terme) Le cerveau se construit gr?ce ? des signaux complexes que les cellules doivent apprendre ? lire. En utilisant des outils de pr?cision, nous pouvons modifier localement certains g?nes. Cela nous permet d'identifier les moments cl?s o? une cellule d?cide de se d?placer ou de se transformer. L'objectif est de passer d'une simple observation ? une compr?hension r?elle du mode d'emploi du cerveau. 2. Des pistes pour soigner les maladies (Long terme) M?me si les retomb?es m?dicales prendront du temps, elles sont porteuses d'espoir : a) Comprendre les causes : Beaucoup de maladies (autisme, ?pilepsie, malformations) naissent d'un probl?me durant le d?veloppement de l'embryon. Nos travaux permettront de comprendre l'origine de ces troubles. b) R?parer avant la naissance : En testant ces outils g?n?tiques, nous pr?parons les traitements du futur. ? terme, il pourrait devenir possible de corriger des d?fauts de d?veloppement tr?s t?t. c) Nouvelles cibles : Nous identifierons des prot?ines cl?s qui serviront de cibles pour de futurs m?dicaments ou des outils de diagnostic.
Procédures
Des femelles gestantes peuvent ?tre soumises ? une chirurgie abdominale sous anesth?sie g?n?rale d'une dur?e d'environ 45 minutes. Une injection d'analg?sique est administr?e avant l'intervention, et un traitement analg?sique est poursuivi 24 ? 48 heures. Par ailleurs, d?autres femelles re?oivent ?galement des injections de substances sur animal vigile, d'une dur?e d'environ 30 secondes, en une fois ou quotidiennement pendant six jours. En fin de protocole, les souriceaux ou f?tus sont places sous anesth?sie g?n?rale sans r?veil avec et un traitement analg?sique, par une proc?dure d'environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en p?riode post-op?ratoire, correspondant ? la cicatrisation. L?anesth?sie utilis?e peut induire dans de rare cas une hypothermie, une d?tresse respiratoire, voire un arr?t cardiorespiratoire. L?injection d?agents pharmacologiques peut induire une p?ritonite au niveau du site d?injection. Enfin, la manipulation r?p?t?e des animaux peut provoquer un stress.
Devenir
L'ensemble des animaux utilis?s dans ce projet seront euthanasi?s ? l'issue des proc?dures. Cette euthanasie est indispensable car les objectifs scientifiques reposent sur l'analyse des tissus c?r?braux embryonnaires et postnataux, qui ne peuvent ?tre pr?lev?s que post mortem. Aucune technique d'imagerie non invasive ne permet aujourd'hui d'atteindre la r?solution cellulaire n?cessaire pour ?tudier le d?veloppement cortical chez la souris. Les analyses r?alis?es comprennent des coupes histologiques, des marquages par immunofluorescence, des dosages de lipides c?r?braux, des analyses d'expression g?nique et du s?quen?age ? l'?chelle cellulaire. Toutes ces approches requi?rent l'acc?s direct au tissu c?r?bral.
Remplacement
Pourquoi ne peut-on pas se passer d'animaux ? Avant d'utiliser des animaux, nous avons examin? toutes les alternatives possibles. Malheureusement, aucune ne permet de r?pondre ? nos questions. Notre projet cherche ? comprendre comment les cellules s'organisent pour construire un cerveau fonctionnel. Ce processus repose sur des signaux chimiques qui se diffusent dans les tissus, sur des interactions complexes entre diff?rents types de cellules (neurones, cellules de soutien, vaisseaux sanguins), et sur une architecture en trois dimensions qui se met en place progressivement au cours de la grossesse. Or, les cultures de cellules en laboratoire, bien qu'utiles pour ?tudier des m?canismes isol?s, ne reproduisent ni cette organisation spatiale, ni ces interactions entre cellules. Les organo?des c?r?braux cultiv?s en laboratoire, repr?sentent une avanc?e prometteuse, mais ils ne poss?dent ni vaisseaux sanguins fonctionnels, ni l'organisation rigoureuse du cerveau r?el selon ses diff?rents axes. Ils ne permettent pas non plus d'?tudier les ?changes entre la m?re et l'embryon, notamment le passage de substances ? travers le placenta, qui est au c?ur de notre second volet de recherche. La mod?lisation informatique nous aide ? formuler des hypoth?ses, mais elle doit imp?rativement ?tre confront?e ? la r?alit? biologique pour ?tre valid?e. Le recours ? la souris est donc indispensable. C'est le mod?le de r?f?rence pour l'?tude du d?veloppement c?r?bral : sa grossesse est courte, son cerveau se d?veloppe de mani?re tr?s similaire ? celui de l'homme, et il existe des outils de manipulation g?n?tique ?prouv?s et sp?cifiquement adapt?s ? cette esp?ce. C'est le seul mod?le qui nous permet d'observer la construction du cerveau dans un organisme vivant complet, tout en restant au plus proche de la physiologie humaine.
Réduction
Comment avons-nous r?duit le nombre d'animaux au strict minimum ? Le nombre d'animaux a ?t? calcul? avec soin pour chaque exp?rience, en s'appuyant sur notre exp?rience pass?e et sur des m?thodes statistiques adapt?es. Pour la premi?re partie du projet, qui consiste ? modifier l'activit? de certains g?nes dans le cerveau d'embryons, la technique utilis?e ne fonctionne correctement que dans environ un tiers des cas. Nous avons tenu compte de ce taux de r?ussite pour calculer le nombre d'embryons n?cessaires, en veillant ? disposer de suffisamment d'animaux pour obtenir des r?sultats fiables sans en utiliser plus que n?cessaire. Par ailleurs, cette technique permet de tester le r?le d'un g?ne directement chez l'embryon, ce qui ?vite de cr?er des lign?es de souris g?n?tiquement modifi?es (une approche qui n?cessiterait beaucoup plus d'animaux sur plusieurs g?n?rations). Pour la seconde partie du projet, o? nous ?tudions l'effet d'un traitement sur la fabrication du cholest?rol dans le cerveau embryonnaire, nous avons adopt? une m?thode statistique avanc?e qui permet d'analyser chaque embryon individuellement tout en tenant compte du fait que les embryons d'une m?me m?re ne sont pas totalement ind?pendants. Cette approche nous a permis de r?duire de pr?s de moiti? le nombre de m?res n?cessaires par rapport ? une m?thode classique. De plus, nous analysons syst?matiquement tous les embryons de chaque port?e : aucun animal euthanasi? n'est perdu ou inutilis?, ce qui est en accord avec le principe de r?duction. Le nombre total d?animaux de ce projet est 3388.
Raffinement
Comment prenons-nous soin des animaux ? Tout au long du projet, nous mettons en ?uvre des mesures pour minimiser la douleur, le stress et l'inconfort des animaux. Toutes les interventions chirurgicales sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale, avec un traitement contre la douleur administr? avant, pendant et apr?s l'op?ration. Un anesth?sique local est ?galement appliqu? au niveau de l'incision. Pendant l'op?ration, la temp?rature corporelle de l'animal est maintenue gr?ce ? un tapis chauffant, et les yeux sont prot?g?s par un gel pour ?viter le dess?chement. La dur?e de la chirurgie est limit?e ? 30 minutes maximum. Apr?s l'op?ration, les animaux sont plac?s sur un tapis chauffant pour leur r?veil et surveill?s ?troitement deux fois par jour pendant 48 heures. Un aliment enrichi est mis ? leur disposition d?s la veille de l'intervention. Pour les injections quotidiennes (seconde partie du projet), nous utilisons des aiguilles tr?s fines et une technique adapt?e aux femelles en gestation, afin de rendre le geste le plus bref et le moins stressant possible. Chaque manipulation dure moins de deux minutes. Dans les deux cas, les animaux sont h?berg?s dans des conditions optimales : cages ventil?es, liti?re adapt?e, mat?riel de nidification, temp?rature et humidit? contr?l?es. Les femelles en gestation b?n?ficient d'un compl?ment alimentaire. Une grille de suivi du bien-?tre est appliqu?e quotidiennement : poids, ?tat du pelage, comportement, signes de douleur. Tout animal pr?sentant des signes de souffrance significatifs est imm?diatement pris en charge ou, si n?cessaire, exclu du protocole et euthanasi? de mani?re rapide et indolore afin de lui ?viter toute souffrance prolong?e.
Choix des espèces
Chez la souris, la gestation est courte et chaque port?e compte beaucoup de petits. Autre avantage : au sein d'une m?me port?e, on trouve ? la fois les souris que l'on veut ?tudier (dites mutantes) et leurs fr?res et s?urs normaux (les contr?les). Comparer des animaux issus de la m?me port?e rend les r?sultats plus fiables, car ils partagent le m?me patrimoine g?n?tique et le m?me environnement. Le d?veloppement du cerveau de la souris est par ailleurs tr?s bien connu, ce qui facilite les ?tudes d'anatomie et de fonctionnement et aide ? rep?rer des effets nets et reproductibles. Surtout, la formation du syst?me nerveux chez l'embryon de souris ressemble beaucoup ? celle de l'humain : c'est ce qui en fait un excellent mod?le pour comprendre ce qui se passe chez nous. Pour ?tudier le r?le des g?nes pendant cette formation, nous utilisons l'?lectroporation. C?est une technique mise au point chez la souris qui permet d'introduire du mat?riel g?n?tique directement dans le cerveau de l'embryon. La m?thode est simple, rapide et efficace, elle ab?me peu les cellules, et elle pr?sente un avantage ?thique majeur : en traitant environ 6 embryons par port?e, elle n?cessite beaucoup moins d'animaux adultes que la cr?ation d'une lign?e g?n?tiquement modifi?e classique. Nous examinerons ensuite les effets de ces modifications ? plusieurs moments du d?veloppement : soit chez l'embryon (aux 14ieme, 15ieme et 16ieme jours de gestation), soit chez le souriceau apr?s la naissance. Ce suivi ? diff?rents stades est indispensable, car les mol?cules que nous ?tudions (les morphog?nes et leurs r?cepteurs) ne jouent pas le m?me r?le d'un stade ? l'autre : leur action ?volue au fil du d?veloppement. Il faut donc observer chaque ?tape pr?cis?ment pour comprendre l'ensemble de leurs fonctions.
Maintien et cr?ation de lign?es de poisson-z?bre pour l??tude de g?nes responsables de formes rares de surdit? cong?nitale
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
Les poissons-zèbres de ces lignées portent des mutations responsables de formes rares de surdité humaine, et le porteur prévoit chez eux des malformations de la mâchoire gênant le nourrissage, des malformations des extrémités des membres, une nage circulaire et des difficultés à tenir une posture horizontale. 3 500 poissons-zèbres sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le seul geste décrit est le prélèvement d'un bout de nageoire caudale, une fois, en moins d'une minute, sous anesthésie et analgésie, l'analgésie étant maintenue 48 heures. Les individus qui ne portent ni la mutation ni le transgène sont tués dès le résultat du génotypage, les porteurs servant à la reproduction jusqu'à ce que leur descendance soit elle-même en capacité de se reproduire, moment où ils sont tués à leur tour.
Objectifs
Ce projet vise ? ?tudier, dans le mod?le du poisson-z?bre, des g?nes dont les mutations sont ? l?origine de formes rares de surdit?. Il a pour but de d?crypter les m?canismes pathologiques et d?ouvrir de nouvelles perspectives diagnostiques et th?rapeutiques. Le s?quen?age et l'analyse du g?nome chez des familles de patients a permis d'identifier diff?rentes mutations impliqu?es dans des formes rares de surdit? isol?e ou syndromique (associ?e ? d?autres signes cliniques). Des lign?es mod?les de poissons-z?bres permettant d?analyser l?impact de ces mutations sur le d?veloppement de l'oreille interne et sur l'audition seront cr??es et maintenues. Des lign?es transg?niques permettant de suivre le devenir de certains types cellulaires et de mesurer l'activit? de voies de signalisation au cours du d?veloppement de l'oreille interne seront utilis?es.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la fonction de g?nes dont les mutations sont ? l?origine de formes rares de surdit?. En permettant l?identification des g?nes impliqu?s et le d?cryptage des m?canismes pathologiques qui en d?coulent, il permettra d?am?liorer le diagnostique g?n?tique et d?identifier de potentielles approches th?rapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
- pr?l?vement d'un petit bout de nageoire caudale sous anesth?sie et sous analg?sie: 1 fois, < 1 min
Impact sur les animaux
- anesth?sie : stress - pr?l?vement de nageoire caudale : douleur l?g?re soulag?e par l'analg?sie - isolement : stress - malformations de la m?choire : difficult? de nourrissage - malformation des extr?mit?s des membres : difficult? de maintien de posture et de locomotion - troubles ?ventuels du d?veloppement pouvant induire un stress
Devenir
Proc?dure 1 : les individus non porteurs de la mutation ou du transg?ne seront mis ? mort d?s l?obtention du r?sultat du g?notypage. Les individus porteurs de la mutation ou du transg?ne seront utilis?s pour la reproduction et le maintien de la lign?e et ne seront mis ? mort que lorsque leur descendance sera en capacit? de reproduction. Proc?dure 2 : - durant les 4 premi?res g?n?rations faisant suite ? la cr?ation du mod?le, tous les individus seront conserv?s en 2 lots (non porteur vs porteur de la mutation) pour le suivi du ph?notype dommageable. - ? partir de la 5?me g?n?ration, les individus non porteurs de la mutation seront mis ? mort d?s l?obtention du r?sultat du g?notypage. Les animaux porteurs de la mutation ou du transg?ne seront utilis?s pour la reproduction et le maintien de la lign?e et ne seront mis ? mort que lorsque leur descendance sera en capacit? de reproduction.
Remplacement
Le projet vise ? mieux comprendre comment l'oreille interne se forme pendant le d?veloppement embryonnaire, aussi bien dans des conditions normales que lorsqu?elle est touch?e par des maladies g?n?tiques rares. Ce processus est tr?s complexe et d?pend de nombreux facteurs, comme les interactions avec d?autres parties du cerveau et les influences de l?environnement. A ce jour, il n?est pas encore possible de reproduire compl?tement ce d?veloppement in vitro en laboratoire, car il s?agit d?un ph?nom?ne d?licat et interconnect? qui s'organise selon une architecture tridimensionnelle tr?s complexe. ?tudier des organismes vivants reste essentiel pour avancer dans la compr?hension de ces maladies et imaginer de nouveaux traitements.
Réduction
Le nombre d?animaux n?cessaire pour ce projet a ?t? rigoureusement calcul? selon les exp?riences ant?rieures, afin de limiter leur utilisation tout en garantissant la r?alisation du projet.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement adapt? et enrichi. Les poissons sont ?lev?s ? 28?C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/nuit de 14/10h. Le bien-?tre des animaux est assur? au quotidien, par un contr?le pr?cis des param?tres d?eau, de lumi?re et de temp?rature et une observation journali?re des poissons. Le milieu des poissons est enrichi avec l'apport de nourriture vivante stimulant l'instinct de pr?dation. Nous veillerons ?galement ? l'enrichissement social des poissons et nous veillerons ? une mise en reproduction r?guli?re. Pour ?viter toute douleur, les pr?l?vements de nageoire caudale sont r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie. A la suite du g?notypage, les poissons sont maintenus en analg?sie pendant 48h. Pour les lign?es nouvellement cr??es, l?apparition d?un potentiel ph?notype dommageable sera suivi lors de la croissance des premi?res g?n?rations. Du fait de l?implication des g?nes ?tudi?s dans le d?veloppement de l'oreille interne, les poissons des nouvelles lign?es g?n?r?es pourraient pr?senter des difficult?s sp?cifiques dans la locomotion ou le maintien de posture (nage circulaire, mobilit? restreinte, difficult?s ? maintenir une posture horizontale), qui pourraient perturber la capacit? des poissons ? s?alimenter ou g?n?rer un stress. Le comportement des animaux face ? la nourriture sera observ? quotidiennement par les zootechniciens, qui seront attentifs ? un amaigrissement des poissons et ? des signes comportementaux de stress (immobilit? prolong?e, nage uniquement en surface ou au fond du bac). Des points limites stricts et sp?cifiques au projet seront mis en place.
Choix des espèces
Le d?veloppement de l'oreille interne du poisson-z?bre est tr?s similaire ? celui de l?Homme, notamment en ce qui concerne les g?nes impliqu?s, les types cellulaires intervenant et leur organisation. Cette esp?ce pr?sente plusieurs avantages pour la recherche : elle est tr?s prolifique, se d?veloppe rapidement et permet d??tudier le d?veloppement de l'oreille interne sur les embryons aux stades 1-5 jours post-f?condation, en utilisant peu d?animaux adultes reproducteurs. Les pr?l?vements pour suivi g?n?tique des animaux seront r?alis?s chez les adultes.
Production du parasite responsable du paludisme murin pour des études biologiques, immunologiques et pour le développement de vaccins antipaludéens.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 275
Infectés par le paludisme puis contrôlés chaque jour par une goutte de sang, 8 585 rongeurs, 8 310 souris et 275 rats, subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger et sont tous tués, le prélèvement final se faisant sous anesthésie profonde sans réveil. Ces infections servent à produire les parasites P. berghei et P. yoelii, que trois axes de recherche décrits dans un projet complémentaire utiliseront ensuite. Le porteur écrit que les infections "ne nuiront pas aux libertés individuelles des animaux" au motif que les procédures s'arrêteront avant l'apparition des symptômes cliniques. Les inoculations se font sur de jeunes adultes de quatre semaines parce qu'ils "ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite".
Objectifs
Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de la phase initiale du paludisme dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant 2 parasites (P.berghei et P.yoelii) dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle des phases cutanée et hépatique de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre les formes cutanée et hépatique du parasite 3. Développement préclinique d'un vaccin ciblant les formes cutanée et hépatique du parasite Le projet « Production du parasite responsable du paludisme murin pour des études biologiques, immunologiques et pour le développement de vaccins anti-paludéens » concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire pour générer les parasites qui seront utilisés dans ces trois axes de recherche. Les procédures adressant les questions scientifiques spécifiques utilisant des animaux de laboratoire liées à ces trois axes seront décrites dans un projet complémentaire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée à partir d’une goutte de sang. Le prélèvement dure quelques secondes et est effectué quotidiennement, le plus souvent à partir du troisième jour pour 3 jours. Un prélèvement de sang final est réalisé après analgésie et anesthésie. Cette anesthésie est profonde et d’une durée suffisante pour réaliser le prélèvement sans réveil de l’animal. Après le prélèvement, les animaux sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile ne souffrira que de l’inconfort transitoire causé par la réalisation, selon les experiences, d’injections, la réalisation de gavage oral ou le prélèvement de volumes de sang. Les infections mises en œuvre ne nuiront pas aux libertés individuelles des animaux dans la mesure où les procédures prendront fin avant l’apparition des symptômes cliniques, soit par des prélèvements de sang terminaux sans réveil effectués sur des animaux profondément anesthésiés, soit par mise à mort.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans les procédures expérimentales seront mis à mort.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. En l’absence de méthodes alternatives adéquates, l’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Une deuxième difficulté réside dans la production du stade parasitaire inoculé dans la peau de l'hôte par le moustique vecteur. Il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium in vitro. Par conséquent, pour réaliser l’ensemble des études proposées, des infections hebdomadaires de rongeurs et de moustiques sont nécessaires pour l’obtention de ce stade parasitaire. Dans le but de réduire à l’avenir le recours aux animaux, un de nos axes de recherche aborde ce problème en proposant la mise au point d’un système de culture des sporozoïtes in vitro.
Réduction
Nous sommes conscients de la nécessité de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche scientifique. En l’absence de méthodes alternatives permettant de s’affranchir du recours aux rongeurs pour produire les stocks cryo-préservés de sang infecté et les staes parasitaires de Plasmodium berghei et yoelii, nous avons donc mis à profit notre expérience de plus de 15 années dans le domaine pour optimiser nos protocoles d’infection et réduire au minimum nécessaire le nombre d’animaux permettant une production stable et robuste de parasites. Ceci passe notamment par l’utilisation d’inoculums standardisés de parasites, d’une quantification précise de l’infection et d’une étape de contrôle qualité et de standardisation de chaque stock de sang avant utilisation en routine. Par ailleurs, un de nos axes de recherche a pour objectif la mise au point d’une méthode de culture in vitro des parasites, ce qui à l’avenir pourrait permettre de réduire encore le recours aux animaux.
Raffinement
Toutes nos procédures expérimentales ont été établies de manière à causer le moins de souffrance possible aux animaux et calibrées de manière à prendre fin avant l’apparition de symptômes du paludisme chez les animaux infectés. A partir d’une parasitémie seuil correspondant à un délai de deux à trois jours avant la possible survenue de manifestations cliniques liées à l’infection palustre, les animaux seront suivis quotidiennement et leur comportement sera évalué en utilisant une échelle de détresse pour détecter des problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. En particulier, si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié avec litière en cellulose, tunnels en carton, rouleaux de coton, etc. Si les points limites - définis de sorte à précéder l’apparition des symptômes liés au paludisme - sont atteints, les souris seront immédiatement mises à mort. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses seront menées sur des animaux anesthésiés. Pour les procédures invasives, les rongeurs bénéficieront de plus d’une couverture analgésique supplémentaire pour prévenir tout inconfort durant la manipulation. Tous les animaux anesthésiés seront par ailleurs mis à mort avant leur réveil.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La plupart des concepts issus des modèles rongeurs, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-paludisme, se sont révélés exacts chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Les animaux sont acclimatés pendant 7 jours minimum. Les inoculations de parasites aux souris et rats seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite.
Création et élevage de nouvelles lignées de souris permettant l’étude du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Inspectées et pesées deux à trois minutes par semaine pendant huit semaines à partir de quatre mois, soumises à contention lors de prélèvements de matières fécales, 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inactivation de certains gènes doit leur donner des polypes intestinaux, avec anémie, saignements intestinaux et risque de perte de poids, pour obtenir des lignées qui développent d'elles-mêmes des micro-tumeurs de l'intestin. Le devenir compte 680 souris tuées, quand le porteur écrit que les animaux ayant servi à la reproduction ou dépourvus des combinaisons de gènes recherchées seront "en priorité mis à disposition à des fins pédagogiques", ou tués. Les procédures décrites s'arrêtent à l'inspection, à la pesée et aux prélèvements fécaux, sans que le porteur précise ce que subissent les souris dont les polypes progressent, ni ce que couvre l'usage pédagogique annoncé.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste à comprendre le rôle de différents gènes dans les toutes premières étapes de la formation de tumeurs intestinales. A ce titre, nous développerons des lignées de souris génétiquement modifiées développant de manière spontanée des micro tumeurs intestinales, mimant la maladie humaine. Ce projet de création de lignées sera accompagné d’un protocole d’élevage et de suivi adapté.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer de nouveaux modèles d’études valorisables dans le cadre de la lutte contre le cancer colorectal, touchant de nombreuses personnes dans les pays occidentaux. L’exploitation de ces modèles permettront de découvrir de nouveaux éléments clefs dans la prise en charge de l’inflammation et son impact dans la formation des tumeurs.
Procédures
Les animaux, à partir de 4 mois d’âge, seront régulièrement inspectés et pesés (2-3 minutes par semaine, durant 8 semaines). Les animaux seront soumis à contention lors de prélèvements fécaux, et manipulés lors des phases de mises en accouplement et de leur suivi.
Impact sur les animaux
L'inactivation de certains gènes conférera une susceptibilité accrue des animaux à la formation de polypes intestinaux, avec apparition de signe d’anémie, et risque de perte de poid et de saignements intestinaux.
Devenir
Les animaux, après utilisation pour reproduction, ou ne possédant pas les combinaisons de gènes souhaités seront en priorité mis à disposition à des fins pédagogiques ou euthanasiées.
Remplacement
La question centrale de notre projet implique de comprendre les interactions entre les microbes, les cellules intestinales et le système immunitaire dans le cadre de la formation du tumeurs digestives. A ce jour, les alternatives utilisant des cultures de cellules ne permettent pas de reproduire un tel niveau de complexité. Dans ce contexte, le modèle animal représente notre seule alternative
Réduction
Nous avons, sur la base de données précédemment acquises, et grâce à une approche statistique robuste, pu déterminer le nombre minimum d’animaux requis pour permettre d’obtenir des données interprétables.
Raffinement
Nous avons mis en place un mode de suivi adapté à nos procédures, consistant en une surveillance accrue des individus lors des phases de vieillissement, accompagné d’une grille de suivi reprenant les paramètres physiologiques les plus pertinents à mesurer. L’utilisation de points limites adaptés nous permettra de rapidement stopper l’expérience en cas d’atteintes de critères d’arrêts, et réduire toutes nuisances aux animaux.
Choix des espèces
La souris possède de nombreuses similitudes avec l’homme en termes de biologie digestive, et cette espèce permet d’inactiver certains gènes d’intérêts. Les animaux seront utilisés à partir de 5 à 6 semaine, lorsque le système digestif arrive à maturité.
Étude de la mise en place et diversification fonctionnelle du muscle squelettique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une administration par gavage intragastrique ou par injection chaque jour, pendant cinq jours d'affilée au plus, plus une injection sous anesthésie : 4 608 souris déficientes en protéines musculaires vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Certaines sont hébergées seules de deux jours à trois semaines pour les tests, et le porteur signale que des produits dissous dans l'huile peuvent provoquer une inflammation. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les tissus, l'objet étant de comprendre pourquoi certaines maladies musculaires atteignent des muscles et en épargnent d'autres. Les tests comportementaux structurent le protocole et justifient l'isolement, mais le résumé ne dit à aucun moment lesquels sont pratiqués.
Objectifs
Le mouvement constitue une propriété fondamentale des organismes vivants, résultant d’interactions précises entre les muscles, les nerfs et les tissus conjonctifs. Si les muscles du tronc assurent principalement la locomotion, les muscles du visage et de la tête coordonnent des fonctions motrices finement régulées, telles que les mouvements des yeux, l’expression faciale, l’alimentation et la parole. Même si tous les muscles du corps sont spécialisés pour la contraction, une hétérogénéité remarquable existe entre les différents muscles de la tête et du tronc au niveaux physiologique et pathologique. L’ensemble du projet vise à apporter des connaissances fondamentales nouvelles sur la mise en place de la diversité musculosquelettique et leur intégration avec le système nerveux au cours du développement pré- et post-natal, leur fonctionnement à l’âge adulte et les processus de régénération lors de pathologies musculaires. Afin de répondre à ces questions chez le mammifère, nous étudions des modèles de souris déficients pour des protéines musculaires spécifiques. Nos travaux ont des applications potentielles dans le domaine médical, pour la compréhension des maladies musculaires qui affectent de façon sélective les muscles du corps.
Bénéfices attendus
Nos travaux ont un impact fondamental sur la compréhension des caractéristiques uniques des différents muscles du corps. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’apporter des informations nouvelles sur les bases moléculaires qui contrôlent la prédisposition de certains muscles aux pathologies musculaires et épargnent d’autres. De ce fait, ce projet apportera des informations essentielles pour les thérapies à développer, notamment dans le contexte des dystrophies musculaires.
Procédures
Les administrations de produits se feront par administration orale, intragastrique ou par injection. Ces interventions sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les souris subiront une intervention par jour pendant 5 jours maximum à la suite. Elles pourront aussi recevoir une seule injection un peu plus invasive de quelques minutes sous anesthésie. Lors des tests comportementaux, certains animaux devront être hébergés individuellement de façon temporaire (entre 2 jours et 3 semaines maximum).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour l’animal incluent le stress dû aux contentions manuelles de l’animal pour les administrations de produits, le stress lié à un nouvel environnement ou une tâche difficile lors des tests comportementaux et lors de l’hébergement temporaire en cage individuelle. L’injection des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère au point de piqure et de courte durée. Les administrations intragastrique des produits peuvent causer de l’inconfort aux animaux. Certains produits dissouts dans l’huile peuvent entrainer une inflammation.
Devenir
Les animaux qui auront suivi la totalité de chaque procédure expérimentale seront mis à mort pour collecter les tissus nécessaires à nos travaux de recherche.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer le système neuromusculaire dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, le système neuromusculaire est composé de différents tissus (fibres musculaires, cellules souches, vasculaires, nerfs, tissus connectifs) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales. Nous avons considéré des alternatives comme la culture cellulaire ou les organoïdes mais ces approches ne permettent pas de suivre le développement embryonnaire, la mise en place des connections neurone-muscle complet ou la maturation des fibres musculaires durant le développement postnatal. Ainsi, malgré les progrès dans le domaine des alternatives non animales, il n'existe actuellement aucune méthode qui puisse reproduire fidèlement les processus que nous souhaitons étudier. D’ailleurs, en établissant une description fonctionnelle précise du système neuromusculaire le long du corps, nous avons espoir que dans le futur cela rende possible des modèles in silico pour ce type d’études.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été ajusté: 1) en tenant compte de notre expérience et des données bibliographiques, 2) en fonction de la nature de l'expérience et de la variabilité des paramètres mesurés, 3) de façon à pouvoir utiliser les animaux dans des tests de comportement non invasifs avant la mise à mort pour l’analyse des organes. Cela permet de maximiser l’apport de résultats par animal et, ainsi, de réduire le nombre de souris nécessaires pour produire des résultats significatifs.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué régulièrement. Les anesthésies et analgésies sont adaptées aux manipulations avec un suivi renforcé durant et post manipulation (tapis chauffant, protection des yeux, signes physiques, poids). Les animaux sont logés dans des cages spacieuses, enrichies, et adaptées à leurs besoins comportementaux et physiologiques. En cas d’ulcération ou de blessures à la suite de comportements agressifs entre congénères, des traitements par analgésiques locaux sont prévus pour assurer un confort total des animaux. Si l’état de santé général de l’animal se dégrade et atteint un point limite la mise à mort sera effectuée. Pour les expériences de comportement, nous permettons aux animaux de s'habituer à l'environnement d'enregistrement (lieu, expérimentateur), réduisant ainsi leur stress global. Pour l’administration de produits par voie orale nous allons essayer d’apprendre aux souris à ingérer le produit volontairement au bout d’une pipette, notamment pour les traitements répétés, pour limiter les administrations intragastriques et ainsi réduire leur stress. Ces mesures pour assurer le bien-être des animaux dans nos expériences participent aussi à la diminution la variabilité de nos résultats et permettent aussi une réduction du nombre d’animaux nécessaires pour l'obtention de résultats fiables.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est basée sur plusieurs critères : - Les souris sont des petits Mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’homme au niveau neuromusculaire. - Elles constituent un modèle très maîtrisé au laboratoire ce qui est un facteur important pour la réussite des expériences envisagées et pour la minimisation du nombre d'animaux impliqués dans les expériences. - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées plutôt élevés, ce qui permet d’avoir assez rapidement un nombre suffisant d’animaux. - De nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées existent pour tracer les cellules d’intérêt en les rendant fluorescentes ou bloquer/activer l’expression de gènes que nous voulons étudier. Comme nous intéressons à la mise en place du système neuromusculaire, les stades embryonnaires, post-natals précoces et adulte sont nécessaires.
Organisation et plasticité du microenvironnement hypothalamique : contribution de la matrice extracellulaire, des tanycytes et des signalisations neuro-immunes au contrôle des fonctions métaboliques et reproductives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
14 038 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à quatre heures d'anesthésie pour une chirurgie crânienne, une ablation des ovaires ou des testicules de quinze à vingt minutes, des prélèvements sanguins répétés et douze semaines de régime gras ou sucré. Les protocoles s'étalent de deux à soixante-douze semaines, avec des jeûnes allant jusqu'à seize heures et des isolements de deux semaines répétés deux fois, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. L'objet déclaré porte sur la communication entre l'hypothalamus, les vaisseaux sanguins et le système immunitaire, avec un espoir formulé au conditionnel d'améliorer des traitements de l'obésité. Le porteur justifie la mise à mort de toutes par "la nécessité de récupérer les organes et tissus à l'issue des expériences".
Objectifs
Le fonctionnement de l’organisme repose sur une communication constante entre le cerveau et les organes périphériques. Ce dialogue permet de réguler des fonctions essentielles telles que l’équilibre énergétique, qui contrôle la prise alimentaire et la dépense d’énergie, ainsi que la reproduction. Une partie clé de cette régulation se déroule dans l’hypothalamus, une région du cerveau spécialisée dans l’intégration des signaux provenant du reste du corps. Au sein de l’hypothalamus, le noyau arqué joue un rôle central. Cette structure reçoit en permanence des informations issues de la circulation sanguine, notamment sous forme d’hormones, qui renseignent sur l’état physiologique de l’organisme. Ces signaux doivent ensuite être transmis aux neurones pour déclencher des réponses adaptées. Plusieurs types de cellules participent à cette communication. Les cellules endothéliales, qui tapissent les vaisseaux sanguins, régulent le passage des molécules depuis le sang vers le tissu cérébral. Les tanycytes (cellules spécialisées du cerveau), localisés à l’interface entre le cerveau et le liquide cérébrospinal, contribuent également au transfert et à la distribution de ces signaux. En parallèle, l’environnement extracellulaire, c’est-à-dire l’espace situé entre les cellules, constitue un milieu de diffusion essentiel pour les molécules avant qu’elles n’atteignent leurs cibles neuronales. L’ensemble de ces éléments forme un système dynamique dans lequel les interactions cellulaires et moléculaires permettent d’assurer une communication fine entre la périphérie et le cerveau. Certaines composantes de cet environnement, comme la matrice extracellulaire, pourraient jouer un rôle actif dans la distribution et l’efficacité des signaux. De plus, des échanges étroits entre les tanycytes et les cellules vasculaires semblent contribuer à coordonner le passage de l’information. Enfin, des liens existent entre ces mécanismes de régulation et le système immunitaire, suggérant que cette région du cerveau est également sensible aux signaux liés à l’inflammation ou à l’état immunitaire de l’organisme. Mieux comprendre ces interactions représente un enjeu important pour décrypter les mécanismes qui contrôlent les grandes fonctions physiologiques et leurs dérèglements.
Bénéfices attendus
L’hypothalamus médio-basal est une petite région du cerveau qui joue un rôle essentiel dans la régulation de fonctions vitales comme le métabolisme (équilibre énergétique et pondéral) et la reproduction. Ce projet de recherche s’intéresse à l’environnement qui entoure les cellules de cette région cérébrale, ainsi qu’aux échanges entre différents types de cellules, notamment les tanycytes (cellules spécialisées du cerveau), les vaisseaux sanguins et le système immunitaire. L’un des objectifs est de mieux comprendre le rôle de la matrice extracellulaire, c’est-à-dire le réseau de molécules qui entoure les cellules. Cette structure pourrait influencer la manière dont le cerveau répond à certaines hormones impliquées dans le métabolisme, y compris celles utilisées actuellement pour traiter l’obésité. En améliorant ces connaissances, il serait possible d’optimiser les traitements existants ou de développer de nouvelles approches pour lutter contre les maladies métaboliques qui représentent un enjeu majeur de santé publique. Le projet cherche également à identifier de nouveaux mécanismes de communication entre les tanycytes et les vaisseaux sanguins. Ces interactions sont importantes pour maintenir des barrières protectrices entre le sang et le cerveau. Mieux comprendre ces mécanismes pourrait permettre, à terme, de contrôler temporairement ces barrières afin de faciliter l’entrée de médicaments dans le cerveau, ce qui constitue aujourd’hui un défi important pour de nombreuses thérapies. Enfin, cette étude vise à identifier pour la première fois les cellules immunitaires présentes dans cette région du cerveau et à comprendre leur rôle potentiel dans la régulation du métabolisme et de la reproduction. Jusqu’à présent, ces cellules ont été peu étudiées dans ce contexte. Elles pourraient pourtant représenter de nouvelles cibles pour développer des traitements innovants.
Procédures
Selon les procédures, des traitements pourront être administrés de différentes manières : par voie orale (1min), par injection (1min) ou via un implant sous cutané (durée maximale 20 minutes) selon les volumes et fréquences maximales recommandées pour le bien être de l’animal et dans le respect de la réglementation en vigueur. Dans certains groupes, après une anesthésie par voie gazeuse ou par injection, des interventions chirurgicales seront réalisées afin d’administrer des traitements par injection au niveau du cerveau (durée anesthésie : 1h, intervention : 30 à 45 min) ou de mettre en place des dispositifs permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (durée intervention/anesthésie : 2 à 4h). Afin d’étudier les fonctions reproductrices, des ablations des ovaires ou des testicules pourront être réalisées (Durée intervention : 15-20 min. Durée anesthésie maximum 1h). Afin d’étudier les effets des différents traitements sur les animaux, certains groupes pourront : - Subir des prélèvements sanguins unique ou répétés (5 à 20 minutes) - Être isolés physiquement de leurs congénères (pas d’isolement olfactif ou visuel) (maximum 2 semaines, répété 2 fois) - Subir des traitements complémentaires par injection (1 min) - Être pesés plusieurs fois par semaine (1min) Les animaux impliqués dans l’études du métabolisme pourront avoir un régime alimentaire modifié, tel que des régimes riches en graisses ou en sucre (durée maximale 12 semaines), ou une mise à jeun (durée maximale 16h). La prise en charge de la douleur impliquera également des injections d’anti-douleur (1min). Les animaux seront suivis pendant 2 à 72 semaines en fonction des protocoles avec des temps d’acclimatation et de récupération suffisants entre chaque intervention.
Impact sur les animaux
Les procédures de chirurgie, d’injections ou de prélèvements de sang peuvent provoquer des douleurs à court-terme qui seront limitées par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure si nécessaire. Afin d’évaluer l’impact du métabolisme ou des rythmes naturels, il sera parfois nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant deux semaines (pour l’analyse en cages métaboliques par exemple). Cet isolement reste limité puisque les animaux seront maintenus dans des cages transparentes adjacentes, permettant un contact visuel entre congénères.
Devenir
La nécessité de récupérer les organes et tissus à l’issue des expériences implique la mise à mort de l’ensemble des animaux de ce projet
Remplacement
Dans la mesure du possible, nous privilégions des approches sur cellules et réalisées par ordinateur pour atteindre les trois objectifs de ce projet. Ces méthodes incluent : 1) l’analyse des interactions matrice/récepteur par modélisation informatique, 2) l’étude des voies de signalisation cellulaire et 3) la culture en laboratoire de cellules spécifiques. Cependant, pour obtenir une compréhension globale et intégrée de l’hypothalamus médio-basal et de ses mécanismes physiopathologiques, l’approche animale reste indispensable. En effet, les modèles n’utilisant pas d’animaux présentent des limites majeures : 1) Ils ne permettent pas d’étudier les interactions dynamiques entre les cellules et leur matrice extracellulaire, essentielles pour comprendre la plasticité tissulaire, 2) Ils ne reproduisent pas les dialogues complexes entre les cellules spécialisées et les vaisseaux sanguins, cruciaux pour le contrôle de la perméabilité de la barrière entre les vaisseaux et le cerveau, 3) Ils ne capturent pas les interactions entre les cellules immunitaires et le système neuroendocrine, qui jouent un rôle clé dans la régulation métabolique et reproductive. Seule l’approche animale permet d’appréhender ces processus dans leur ensemble, en tenant compte de la complexité des réseaux neuronaux, vasculaires et endocriniens qui régissent cette région cérébrale, essentielle au contrôle du métabolisme et de la reproduction.
Réduction
Nos approches expérimentales ont été conçues pour extraire un maximum de données de chaque groupe d’animaux, en intégrant des mesures multiples et des suivis longitudinaux. Cette démarche permet de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse des résultats. Par ailleurs, certaines parties sont partagées entre les trois objectifs principaux du projet, évitant ainsi une utilisation excessive d’animaux. La taille des groupes a été définie par une analyse de statistique spécifique, fondée sur : 1) les effets biologiques attendus, estimés à partir de nos précédents travaux et 2) les données issues de la littérature pour des modèles similaires.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard et réglementaire d’hébergement. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Un enrichissement est ajouté dans la cage pour stimuler l’activité naturelle et diminuer le stress. Les périodes d’isolement sont limitées et justifiées. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Une attention particulière est accordée au principe de raffinement afin de limiter tout stress, angoisse ou douleur. Une surveillance quotidienne de l’état général et du comportement est réalisée tout au long du projet. Tout animal présentant des signes de souffrance, de détresse persistante, de perte de poids excessive ou d’altération de l’état général sera immédiatement retiré de l’étude et, si nécessaire, sera mis à mort.
Choix des espèces
Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à élucider les interactions entre le cerveau et les organes périphériques, dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies métaboliques et reproductives, telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. La souris, modèle d’étude largement validé dans ce type de recherche, nous permet de nous appuyer sur un socle de connaissances scientifiques solide. Par ailleurs, la disponibilité de nombreux modèles murins génétiquement modifiés offre la possibilité de concevoir des approches ciblées, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires tout en limitant les variations expérimentales. Tous les animaux de ce projet sont utilisés au stade adulte entre 6 semaines et 24 mois selon les objectifs.
Rôle d’un canal exprimé par des cellules du système immunitaire dans la capacité du gras à produire de la chaleur chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
688 souris sont hébergées à des températures dérogatoires, 344 pendant 24 heures et 344 pendant sept jours, la moitié d'entre elles seules dans leur cage. 864 subissent en plus un prélèvement sanguin éveillées, dans un ensemble de 1 032 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur graisse brune, l'objectif déclaré étant de savoir si une protéine des macrophages, TRPV4, leur permet de détecter la chaleur produite par ce tissu. Sur le remplacement, le porteur écrit que les cultures cellulaires ne reproduisent pas "les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la graisse brune", et en conclut que seul le recours à des souris vivantes répond à la question.
Objectifs
Les macrophages sont des cellules du système immunitaire présentes partout dans notre corps. On les connaît surtout pour leur rôle de « nettoyeurs » : ils éliminent les microbes, les cellules mortes et les déchets. Mais, ils ont aussi des fonctions beaucoup plus spécialisées selon l’endroit où ils se trouvent dans l’organisme. Dans la graisse brune (un type de graisse qui sert à produire de la chaleur et à brûler de l’énergie, surtout quand il fait froid) les macrophages jouent un rôle important. Ils aident à contrôler les nerfs qui activent cette graisse et influencent ainsi la capacité du corps à produire de la chaleur et à gérer son énergie. Cependant, une question reste ouverte : ces macrophages sont-ils capables de détecter eux-mêmes la chaleur produite par la graisse brune ? Des analyses ont montré qu'ils possèdent une protéine appelée TRPV4, connue pour être sensible à la chaleur. Le but de ce projet est donc de comprendre si cette protéine permet aux macrophages de « sentir » la chaleur produite par la graisse brune et d’influencer la capacité du corps à gérer son énergie et à maintenir sa température lorsque l’organisme est exposé au froid.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre des fonctions encore peu connues des macrophages, au-delà de leur rôle habituel de "nettoyeurs". Il aidera aussi à mieux comprendre comment ces cellules influencent le fonctionnement de la graisse et la gestion de l’énergie par le corps. À plus long terme, ces découvertes pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches pour améliorer la santé métabolique et lutter contre certaines maladies comme l’obésité ou le diabète.
Procédures
688 animaux seront hébergés à des températures dérogatoires pendant 24h (344 souris) ou 7 jours (344 souris) dont la moitié sera hébergée individuellement (172 souris pendant 24h et 172 souris pendant 7 jours). Un prélèvement sanguin sera réalisé sur 864 animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’exposition au froid induit un stress physiologique et une augmentation de la dépense énergétique qui entraîne une hausse de la prise alimentaire. L’isolement social peut induire un stress. Les prises de température peuvent induire un stress léger et un inconfort transitoires. Le prélèvement sanguin provoque une douleur légère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever la graisse brune dans le but de l’analyser.
Remplacement
Les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires. Cependant, pour comprendre le rôle des macrophages dans la régulation de la production de chaleur par la graisse brune, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la graisse brune et entre les différents organes.
Réduction
Nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Nos visites quotidiennes permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’humain nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’humain. De plus, nous étudions le rôle des macrophages dans le tissu adipeux et nous disposons déjà du modèle de souris permettant d’enlever TRPV4 dans les macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris. Il s’agit donc de l’espèce la plus appropriée pour ce projet. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 8 semaines).
Evaluation pharmacologique, comportementale et métabolique de modulateurs du métabolisme énergétique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Injectées une fois par jour pendant dix jours, contenues à chaque administration, pesées deux fois par semaine, 6 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite les tests moteurs, poutre, rotarod jusqu'à 40 tours par minute et agrippement, puis l'open field pendant trente minutes et cinq minutes de nage forcée, chacun précédé d'une nouvelle injection. Sept jours d'hébergement individuel en cage calorimétrique, sans enrichissement, closent le protocole avant la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur écrit que le nombre de souris "est réduit à son minimum" et le rattache à la littérature et à sa propre expérience, sans donner de calcul pour ces 6 780 individus.
Objectifs
La perte d’appétit, pouvant aller jusqu’à l’anorexie, est un problème fréquent dans de nombreuses situations de maladie ou après des épisodes de stress physique ou psychologique importants. Elle peut entraîner une perte de poids, une fatigue marquée et une dégradation de l’état général, rendant le rétablissement plus difficile. Ce phénomène constitue aujourd’hui un enjeu important pour la santé. Le projet vise à étudier l’effet de différentes substances capables d’agir sur ces mécanismes biologiques de faim, afin de mieux comprendre comment l’appétit et l’équilibre énergétique peuvent être influencés. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour limiter la perte d’appétit et améliorer l’état nutritionnel dans des situations de maladie sévère.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Il permettra d’identifier et de comparer des substances susceptibles de moduler ces paramètres, et de sélectionner les candidats présentant les profils d’efficacité et de tolérance les plus favorables.
Procédures
Injections (10 max par souris; 1 fois par jour pendant 10 jours; durée
Impact sur les animaux
Administrations (injections et contention quotidienne) : peuvent provoquer une douleur légère au point d’injection et un stress transitoire lié à la manipulation, sans chirurgie ni anesthésie générale. Variations de prise alimentaire induites par les composés : peuvent entraîner des fluctuations du poids corporel (jusqu’à une perte de poids significative) avec possible altération transitoire de l’état général (baisse d’activité, pelage altéré, posture inhabituelle). Tests locomoteurs, moteurs et comportementaux : peuvent induire un stress aigu et transitoire lié à l’environnement nouveau et à l’effort demandé. Calorimétrie indirecte : l’hébergement individuel et l’absence d’enrichissement pendant l’enregistrement peuvent générer une gêne/anxiété transitoire liée à l’isolement.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
Pour étudier de manière intégrée la prise alimentaire, le poids corporel, le comportement et le métabolisme énergétique, un modèle souris est indispensable. La souris est le modèle le plus pertinent pour cette étude, car elle présente des similitudes avec la physiologie humaine et constitue une référence largement utilisée dans les travaux sur la régulation métabolique.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur et aux bonnes pratiques de l’établissement utilisateur. Ils sont maintenus en cages collectives de même sexe, avec un accès ad libitum à une alimentation standard et à l’eau, en dehors des contraintes strictement nécessaires à certaines procédures expérimentales. L’environnement est systématiquement enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, favorisant l’expression des comportements naturels et contribuant à la réduction du stress. Une période d’acclimatation est respectée avant toute intervention expérimentale. Un suivi clinique régulier est assuré tout au long des procédures, permettant une détection précoce de toute altération de l’état général. Les critères surveillés incluent le comportement, l’activité spontanée, l’aspect du pelage, la posture, la mobilité et la respiration. Des points limites précoces et prédictifs, spécifiques à chaque procédure, ont été définis et appliqués de manière stricte afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique, en raison des similitudes fonctionnelles avec la physiologie humaine et de la sensibilité de la souche C57BL/6 aux variations nutritionnelles. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines d’âge. À ce stade, ils ont atteint la maturité physiologique et métabolique, garantissant la robustesse des mesures expérimentales et limitant l’impact de la croissance sur l’interprétation des résultats.
Impact de l’obésité et de l’hyper/hypo-charge mécanique sur les atteintes osseuses du myélome
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Des souris sont placées seules dans des cages aménagées pour les empêcher de poser leurs pattes arrière, quatorze jours durant, après avoir reçu une injection de cellules cancéreuses provoquant un myélome et un régime gras destiné à les rendre obèses. 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, avec des séances d'imagerie aux rayons X de trente minutes sous anesthésie et des prises de sang hebdomadaires à partir de la moitié de l'étude. Le résumé qualifie pourtant ces procédures de "gêne limitée" et parle d'un "inconfort temporaire, comme une mobilité réduite" d'un à deux jours, quand la gravité déclarée pour une partie d'entre elles est sévère. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde à la fin des quatorze jours de contrainte mécanique, pour prélever leurs os et leurs organes.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment l’obésité et les contraintes mécaniques sur les os (moins ou plus de charge) influencent la progression de la maladie osseuse liée au myélome multiple. Le myélome multiple est un cancer de la moelle osseuse qui perturbe le renouvellement de l’os. Environ 80 % des patients développent des atteintes osseuses douloureuses qui dégradent fortement leur qualité de vie. Les personnes en surpoids sont plus à risque de développer cette maladie, avec des formes plus graves et une moins bonne réponse aux traitements. Cependant, on comprend encore mal le rôle combiné de l’obésité et des contraintes mécaniques sur cette évolution. Pour répondre à cette question, nous étudierons des souris atteintes de myélome, avec ou sans obésité, soumises à différentes conditions mécaniques (moins ou plus de charge sur les os). Nous analyserons leurs os pour observer les changements structuraux et biologiques. L’objectif est de mieux comprendre comment l’obésité et les contraintes mécaniques influencent la santé osseuse dans cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la façon dont certaines cellules du skelette, appelées ostéocytes, réagissent aux contraintes mécaniques dans des situations d’obésité et de maladie. Ces cellules jouent un rôle central dans le maintien de l’équilibre de l’os. Les résultats permettront aussi de créer une base de données utile pour de futures recherches. À court terme, ce travail sera utile pour les chercheurs dans plusieurs domaines, comme les maladies du sang, le cancer, la physiologie de squelette, le métabolisme et l’étude des mécanismes qui régulent l’activité des gènes. Il servira également de référence pour mieux comprendre l’impact du manque d’activité physique, par exemple chez les patients alités, sur l’évolution du myélome multiple et des maladies osseuses associées, en particulier chez les personnes obèses. Il aidera aussi à mieux comprendre pourquoi les effets de l’exercice physique sur les os peuvent varier selon les patients. À moyen et long terme, cette étude pourra aider à adapter les traitements en fonction du profil des patients, notamment leur état métabolique, et à mieux ajuster les recommandations d’activité physique pour les personnes atteintes de myélome multiple.
Procédures
Nous utiliserons une technique d’imagerie aux rayons X pour observer les os des souris (le tibia et le fémur) directement sur des animaux vivants. Pour cela, les souris seront brièvement endormies puis placées dans l’appareil d’imagerie pendant environ 30 minutes. Plusieurs examens seront réalisés au cours de l’étude pour suivre l’évolution de leurs os. Après chaque examen, les souris seront réchauffées jusqu’à leur réveil, puis remises dans leur cage. L’exposition aux rayons X dans ces conditions est sans danger pour leur santé et n’affecte pas leurs os. À partir de la moitié de l’étude, de petites prises de sang seront réalisées chaque semaine sur des souris éveillées afin de suivre certains paramètres biologiques. À la fin de chaque procédure, les animaux seront placés sous anesthésie profonde afin de permettre un prélèvement final sans réveil.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent ressentir un stress modéré lié à l’isolement et aux manipulations, mais leur état de santé sera surveillé régulièrement et les procédures seront adaptées si nécessaire. Certaines manipulations peuvent entraîner une légère perte de poids temporaire. Cette perte est réversible et le poids des animaux sera suivi quotidiennement. Les différentes procédures peuvent provoquer une gêne limitée : les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie et ne sont pas douloureux ; les prises de sang entraînent une douleur minime ; et les injections dans l’os peuvent causer une gêne légère et passagère, avec prise en charge de la douleur si besoin. Les modèles expérimentaux peuvent aussi entraîner un inconfort temporaire, comme une mobilité réduite ou de légers troubles de l’alimentation pendant un à deux jours. Les animaux restent cependant surveillés en continu, avec un accès adapté à la nourriture et à l’eau pendant la contrainte mécanique. Tout au long de l’étude, l’état de santé des souris et l’évolution de la maladie seront suivis de près grâce à des observations, de l’imagerie et des analyses non invasives. Toutes les précautions seront prises pour limiter au maximum la douleur, la gêne et le stress, en respectant les règles éthiques en vigueur.
Devenir
Toute autres analyses et récoltes d'échantillons sera effectuée après la mise à mort sur toutes nos souris. Les mises à mort seront réalisées par une personne habilitée à la fin du protocole expérimental après les 14 jours de contrainte mécanique, par anesthésie profonde. Toutes les souris seront mis à mort pour prélèvement d'organes à des fins d'investigations moléculaires, histologiques, biochimiques et physiologiques.
Remplacement
Les modèles en laboratoire ou informatiques ne permettent pas de reproduire toute la complexité du squelette. Le squelette est un tissu vivant, où de nombreuses cellules interagissent entre elles et avec d’autres systèmes du corps. Les modèles actuels ne permettent pas de recréer correctement ces interactions, ni d’étudier des phénomènes complexes comme l’obésité ou les effets des contraintes mécaniques sur les os. Ces approches sont surtout utiles pour observer des mécanismes simples, mais elles ne permettent pas d’étudier le renouvellement de l’os ni l’évolution globale d’une maladie osseuse dans l’organisme. C’est pourquoi l’utilisation de la souris est nécessaire. Les souris ont un fonctionnement osseux et un métabolisme proches de ceux de l’humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier les maladies des os. Le modèle utilisé dans ce projet permet de reproduire la progression de la maladie au plus près de ce qui se passe chez l’humain, et d’étudier en même temps l’effet de l’obésité et des contraintes mécaniques sur les os.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été déterminé de manière rigoureuse à partir de précédentes expériences du laboratoire portant sur l’étude du squelette, afin de garantir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux. Lors de ces expériences, il a été observé qu’environ 20 % des souris ne développent pas de tumeur après injection des cellules cancérueses, et qu’environ 5 % ne deviennent pas obèses malgré un régime riche en graisses. Ces animaux ne peuvent pas être inclus dans l’analyse. Le protocole expérimental a été soigneusement conçu pour réduire au maximum la variabilité entre les groupes (conditions de vie identiques, suivi du poids, alimentation contrôlée, suivi dans le temps par imagerie). Cela permet d’obtenir des résultats solides avec le nombre minimum de souris nécessaire. Enfin, ce sujet étant encore peu étudié, il n’existe pas de données publiées équivalentes à ce jour.
Raffinement
Chaque souris est suivie attentivement par du personnel formé afin de garantir son bien-être tout au long de l’étude. Les conditions d’hébergement sont adaptées aux différentes procédures, conformément aux recommandations en vigueur. Dans le cas de la suspension, les souris sont placées seules dans des cages aménagées pour éviter qu’elles ne puissent poser leurs pattes arrière. L’environnement est simplifié progressivement pour les habituer, tout en laissant des éléments à ronger pour leur confort. Les animaux sont surveillés tous les jours, et même deux fois par jour lors des phases plus contraignantes. Leur état de santé général est suivi de près (poids, comportement, alimentation, hydratation), ainsi que tout signe de stress ou d’inconfort. Toutes les observations recueillies serviront à analyser les résultats de l’étude et à appuyer les conclusions scientifiques.
Choix des espèces
Les invertébrés ne peuvent pas être utilisés pour cette étude, car ils n’ont pas d’os mais un squelette externe. Chez les vertébrés, la souris est le modèle le plus adapté, à la fois pour des raisons scientifiques et pratiques. Elle permet d’étudier en détail le fonctionnement des os, le myélome multiple et les effets des contraintes mécaniques. La souris est particulièrement utile car elle permet de suivre l’évolution de la maladie au cours du temps chez un même animal, grâce à des techniques d’imagerie. Elle permet aussi d’analyser précisément les tissus après l’étude. Nous utiliserons des souris adultes, afin d’éviter les biais liés à la croissance. Le régime alimentaire débutera à un jeune âge (8 semaines) pour induire une obésité stable avant le début de l’étude. Cela est important, car l’obésité est un élément central du projet. Les expériences commenceront une fois que les souris auront atteint un stade de maturité comparable à celui des patients adultes. Enfin, le modèle utilisé est bien établi et permet de reproduire de manière fiable la maladie observée chez l’humain, ce qui garantit la pertinence des résultats.