Oncologie

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines recevant jusqu'à 260 gavages ou 260 injections abdominales étalés sur douze mois. Le protocole commence tôt : biopsie de la queue à six jours pour l'identification génétique, injection unique d'un composé cancérogène à quinze jours, puis à partir de huit semaines l'administration répétée de benzo[a]pyrène, un polluant issu de la combustion, avec pour certains groupes des injections destinées à provoquer une fibrose du foie. Une inflammation hépatique, du tissu cicatriciel et des tumeurs du foie sont attendus et se développent progressivement. Les retombées annoncées, mieux évaluer le risque lié aux polluants et ouvrir des pistes de prévention, sont formulées au long terme, quand les atteintes du foie, elles, sont provoquées d'emblée.

Objectifs

Les polluants présents dans l’environnement peuvent avoir des conséquences importantes sur la santé humaine. Parmi eux, le benzo[a]pyrène (B[a]P) est une substance produite lors de la combustion incomplète de matières organiques, par exemple par le trafic routier, le chauffage, certaines activités industrielles ou le tabagisme. L’être humain y est exposé quotidiennement, notamment par l’alimentation et l’air ambiant. Plusieurs études suggèrent qu’une exposition prolongée à cette substance pourrait favoriser le développement de maladies du foie, notamment la fibrose (formation excessive de tissu cicatriciel) et le cancer du foie. Cependant, les mécanismes par lesquels ce polluant agit sur le foie restent encore mal connus. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une exposition chronique au benzo[a]pyrène influence l’apparition et l’aggravation des maladies hépatiques. Le projet vise également à déterminer si le benzo[a]pyrène peut aggraver une maladie hépatique déjà présente et favoriser la progression du cancer du foie. Enfin, il permettra d’évaluer si un traitement expérimental capable de bloquer certains effets de ce polluant peut limiter le développement des lésions hépatiques et du cancer. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les effets des polluants environnementaux sur le foie et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement des maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains polluants présents dans l’environnement, et en particulier le benzo[a]pyrène, peuvent contribuer au développement de maladies du foie lorsqu’une exposition se prolonge sur une longue période. Les connaissances acquises aideront à identifier les mécanismes responsables de l’apparition de la fibrose hépatique et du cancer du foie liés à ces polluants. Elles permettront également de mieux comprendre comment certaines cellules du foie sont affectées par l’exposition chronique à ces substances. Le projet évaluera par ailleurs l’intérêt d’une approche thérapeutique expérimentale visant à limiter les effets nocifs du benzo[a]pyrène sur le foie. Ces travaux pourraient ainsi contribuer, à plus long terme, au développement de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement des maladies hépatiques associées à l’exposition aux polluants environnementaux. Enfin, les résultats obtenus permettront d’améliorer l’évaluation des risques liés à l’exposition à ces polluants et pourront contribuer à l’élaboration de recommandations destinées à mieux protéger la santé humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions consistant principalement en l’administration répétée de substances par voie orale (gavage) ou par injection dans la cavité abdominale. Selon les groupes expérimentaux, les souris recevront : une biopsie de queue réalisée à l’âge de 6 jours pour l’identification génétique ; une injection unique à l’âge de 15 jours ; deux injections par semaine pendant 12 semaines (soit 24 injections au total) ; deux gavages par semaine pendant 12 semaines (soit 24 administrations) ; cinq gavages par semaine pendant 6, 9 ou 12 mois (soit respectivement 130, 195 ou 260 administrations) ; cinq injections par semaine pendant 12 semaines (soit 60 injections au total) ; cinq injections par semaine pendant 6, 9 ou 12 mois (soit respectivement 130, 195 ou 260 administrations). La durée de chaque intervention est courte : environ 5 à 30 secondes pour un gavage et environ 15 secondes pour une injection. À la fin de l’étude, un prélèvement sanguin sera réalisé au moment de la mise à mort des animaux afin de permettre les analyses nécessaires au projet.

Impact sur les animaux

Les animaux participeront à des études nécessitant l’administration répétée de substances par voie orale ou par injection. Ces manipulations pourront entraîner un stress ou une gêne légère et de courte durée liés à la contention et à l’administration des traitements. Certaines souris seront exposées à une substance polluante susceptible d’induire progressivement des atteintes du foie. Selon les groupes expérimentaux, ces atteintes pourront se traduire par une inflammation du foie, l’apparition de tissu cicatriciel (fibrose) ou le développement de tumeurs hépatiques. Ces effets apparaîtront de manière progressive au cours de l’étude. Les animaux seront surveillés régulièrement tout au long du projet afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets du B[a]P.

Remplacement

Le recours à un modèle animal est indispensable pour répondre aux objectifs de ce projet. En effet, l’étude de l’impact d’une exposition chronique au benzo[a]pyrène (B[a]P) sur le développement de la fibrose et du cancer du foie nécessite l’analyse de processus physiopathologiques complexes impliquant de multiples types cellulaires (hépatocytes, cellules endothéliales, cellules immunitaires) ainsi que leurs interactions au sein d’un organisme intact. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire de manière intégrée les phénomènes de fibrogenèse, d’inflammation chronique et de carcinogenèse hépatique induits par une exposition prolongée à un polluant environnemental. Les modèles in vitro, bien que complémentaires, ne permettent pas de recapituler l’ensemble des interactions cellulaires, des réponses systémiques et de la cinétique d’évolution des lésions observées in vivo. L’utilisation de la souris constitue un modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies hépatiques humaines, en particulier dans les modèles de fibrose et de carcinome hépatocellulaire chimio-induits. Elle permet notamment d’étudier de manière intégrée les effets du B[a]P sur le foie dans un contexte physiologique pertinent, incluant le métabolisme des xénobiotiques et les réponses inflammatoires et vasculaires. Ainsi, en l’absence de méthodes substitutives adaptées, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre de souris a été limité à celui nécessaire pour obtenir une validation statistique des résultats expérimentaux. Il a été déterminé de manière à permettre la mise en évidence d’une différence statistiquement significative de 30 % d’un principal paramètre étudié, l’aire de fibrose hépatique. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques adaptés aux effectifs. Ce choix permet de garantir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour étudier la fibrose et le développement du cancer du foie. Ce modèle présente également l’avantage de permettre l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Nous utilisons notamment des souris dans lesquelles le gène AhR, impliqué dans la réponse au stress cellulaire, est inactivé uniquement dans les cellules des vaisseaux sanguins du foie (cellules endothéliales). Cette inactivation est ciblée grâce à un système génétique permettant de supprimer ce gène uniquement dans ce type cellulaire, sans modifier les autres tissus de l’organisme. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement selon les objectifs des expériences. Dans les procédures visant à induire un cancer du foie, les souris recevront une injection unique d’un composé chimique (DEN) ou d’un produit contrôle à l’âge de 15 jours. Ce moment est choisi car le foie est encore en développement et les cellules se divisent activement, ce qui favorise l’apparition de modifications nécessaires à l’initiation de tumeurs. À l’âge adulte (8 semaines), certaines souris recevront des injections répétées de d’un autre composé chimique (CCl4) ou du produit contrôle afin d’induire une fibrose du foie, c’est-à-dire une accumulation excessive de tissu cicatriciel. Enfin, dans toutes les procédures, un polluant environnemental (B[a]P) ou son véhicule sera administré à partir de l’âge de 8 semaines, correspondant à l’âge adulte chez la souris.  

La souris sylvestre est un rongeur nocturne dont la reproduction varie avec la durée du jour, ce qui vaut à cette espèce d'être retenue pour un projet sur la pollution lumineuse. 312 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux groupes sont exposés sept semaines durant à des LED allumées la nuit, avec une prise de sang par semaine sur souris consciente, soit sept prélèvements par individu. Une partie des cerveaux sera prélevée pour des études ultérieures, et le porteur annonce que les corps des souris surnuméraires et de celles n'ayant subi que des prises de sang seront congelés puis mis à disposition des enseignants et des responsables d'animalerie de l'université pour des travaux pratiques d'anatomie comparée.

Objectifs

Chez tous les organismes, dont les mammifères, c’est l’horloge biologique interne qui contrôle les rythmes de nombreuses fonctions (sommeil, reproduction, etc.) selon un cycle d’environ 24 heures. Cette horloge est principalement synchronisée par l’alternance naturelle du jour et de la nuit grâce à la lumière, qui influence notamment la production de mélatonine, une hormone impliquée dans le rythme veille-sommeil. Lorsque l’environnement nocturne est éclairé artificiellement, comme avec l’éclairage public, ce signal naturel peut être perturbé. Cette pollution lumineuse risque alors de dérégler l’horloge biologique et d’avoir des conséquences sur la santé et le fonctionnement de l’organisme. Dans ce contexte, le projet a pour objectif de reproduire une exposition à la pollution lumineuse pendant la nuit (LAN) chez un mammifère nocturne particulièrement sensible à la durée du jour et de la nuit, la souris Sylvestre, en s’appuyant sur des protocoles expérimentaux réalisés en conditions contrôlées. Plus précisément, il vise à explorer les conséquences d’une exposition nocturne à deux types de lumières LED, l’une majoritairement utilisée dans l'éclairage public nocturne, qui stimule fortement les mécanismes contrôlant l’horloge biologique, et l’autre émettant dans une gamme de longueur d’onde plus élevée, qui pourrait être moins perturbatrice. Le projet a pour objectifs d’évaluer l’impact de la LAN sur : 1) les régions du cerveau qui contrôlent la reproduction ; 2) la production d’hormones liées à la reproduction. Les analyses seront réalisées sur des individus mâles et femelles de la génération F0 exposés ou non, ainsi que chez des individus mâles et femelles de la génération F1 afin de voir si les effets peuvent se transmettre à la génération suivante. Les résultats obtenus contribueront à une meilleure compréhension des effets de la pollution lumineuse et permettront d'élaborer des stratégies d’éclairage respectueuses de la biodiversité pour une meilleure gestion environnementale de la pollution lumineuse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de 4 ordres principaux. 1/ Les résultats obtenus contribueront à mieux informer les décideurs sur les conséquences écologiques de la pollution lumineuse. En effet, les pouvoirs publics pourront s’appuyer sur les données scientifiques précises obtenues à l’issue de ce projet pour établir des recommandations visant à limiter l’exposition aux LED. Ces recommandations pourraient inclure une meilleure régulation de l’usage des LED en fonction de leur spectre lumineux, en privilégiant des spectres moins perturbateurs pour la biodiversité. 2/ Les mécanismes moléculaires et les systèmes neuroendocriniens sous-jacents au fonctionnement de l’horloge circadienne sont communs à une vaste majorité de vertébrés. Les résultats obtenus à l’issue de ce projet seront donc susceptibles de concerner d'autres taxons et participeront à la compréhension du rôle de la lumière artificielle la nuit dans la contribution au déclin ou à l'extinction des populations d'espèces. 3/ Au-delà des aspects applicatifs et réglementaires, ce projet aura également un impact sociétal en sensibilisant le grand public aux effets des LED sur la biodiversité. 4/ Ce projet contribuera également à élargir nos connaissances sur les effets de la LAN sur la santé humaine, en particulier sur les rythmes circadiens et les régulations neuroendocriniennes. Les données scientifiques issues de ce projet pourront fournir des éléments contribuant au reclassement de la pollution lumineuse nocturne comme un agent physique à effet perturbateur endocrinien.

Procédures

Deux groupes de souris seront exposées à un traitement luminaux nocturne chacun durant 7 semaines. Les souris auront 1 prise de sang par semaine pendant 7 semaines, soit 7 prélèvements/souris (vigile) au total. Chaque prélèvement dure entre 30 secondes et 1 minute.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables attendus sont les suivants : - Une exposition à des traitements lumineux nocturnes peut entrainer des perturbations comportementales et physiologiques, ce qui constitue l’objet de notre étude ; - Une douleur transitoire hebdomadaire suite à l’introduction de l’aiguille lors des prélèvements de sang ; - Un stress aigu de quelques dizaines de secondes n’induisant pas d’effet à long terme peut être généré dû à la manipulation des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort et pour une partie d’entre eux les cerveaux seront prélevés pour des études ultérieures. Nous congelerons des animaux surnuméraires ainsi que ceux n’ayant subit que des prises de sang et les mettrons à disposition des enseignants chercheurs ainsi des responsables d'animalerie de l’Université pour des TP d'anatomie comparée sur cadavres.

Remplacement

A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou in silico) ne peut être utilisée pour ce projet qui étudie l’effet d’une exposition à la LAN sur les systèmes neuroendocriniens. Il est donc impératif d’utiliser l’animal entier pour en comprendre les effets et étudier les mécanismes altérés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé de façon à obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Afin de limiter le nombre de naissances et d'éviter la production d'animaux surnuméraires, une gestion rigoureuse des accouplements sera mise en place en adoptant une stratégie d'accouplements discontinus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux (3 à 5 souris par cage) en présence de plusieurs enrichissements (abris cartonnés avec matériel de nidification et jouets en bois) avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. La surveillance des souris sera accrue lors de leur première semaine d'exposition à la lumière artificielle nocturne. Suite à la prise de sang hebdomadaire, l’animal sera placé dans une cage sans congénère pour récupération et jusqu’à l’arrêt complet du saignement (1-2 min). Un petit morceau de cookie lui sera donné en récompense. Il sera ensuite replacé avec ses congénères. Une grille de score d'évaluation du comportement des souris sera mise en place afin d'identifier précocement d'éventuels points limites adaptés. Un arbre décisionnel guidera la décision de retrait des animaux du protocole lorsque les critères prédéfinis seront atteints afin d'interrompre toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nos recherches portent sur les effets d’une exposition à la lumière artificielle nocturne sur les systèmes neuroendocriniens contrôlant la fonction de reproduction chez les mammifères nocturnes. La souris Sylvestre est un excellent modèle animal de référence puisqu’elle est photosensible et présente des variations saisonnières de ses fonctions de reproduction, physiologiques et comportementales. Ces caractéristiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Nous utiliserons des animaux mâles et des femelles adultes qui seront âgés de 6 à 16 semaines au début des expériences.

Une puce implantée sous la peau après incision, une pompe posée sous la peau ou dans la cavité abdominale pour cinq semaines de traitement continu, puis jusqu'à seize heures de tests par souris réparties sur quatre semaines : 2 784 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des crises d'épilepsie leur sont provoquées et leur sensibilité à la douleur est mesurée, deux points dont le porteur indique qu'ils entraînent un inconfort supérieur à celui des autres tests. L'objet déclaré est d'évaluer cinq médicaments déjà autorisés pour d'autres maladies neurologiques et de chercher des mécanismes communs à deux troubles du neurodéveloppement. Les tests restent désignés par leurs catégories, sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés, sans qu'aucun dispositif soit nommé, et l'effectif tomberait à 864 souris si deux mesures de réduction s'appliquaient, écart que le résumé laisse sans commentaire.

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau touchent environ 1% de la population mondiale. Ils sont fréquemment associés à des formes d’autisme, des déficits intellectuels et moteurs, ainsi qu’à de l’anxiété, de l’épilepsie et à des altérations des sensations, notamment de la perception de la douleur. À ce jour, ces troubles ne disposent encore que de peu ou pas de médicaments efficaces. Dans le cadre d’un projet financé par le programme Européen sur les maladies rares (ERDERA) réunissant quatre associations de patients et cinq équipes de recherche, ces travaux, dans leur ensemble, visent à mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces troubles, à identifier des marqueurs biologiques et à évaluer le potentiel de repositionnement de candidats médicaments dans des modèles murins. Comme ces troubles pourraient partager certains mécanismes communs, le premier objectif de cette étude est de les identifier en étudiant le comportement et le fonctionnement de ces neurones dans deux modèles murins de ces troubles. Le second objectif du projet consiste à évaluer cinq médicaments déjà approuvés pour d’autres maladies neurologiques (repositionnement) afin de déterminer s’ils pourraient également être bénéfiques pour ces deux troubles. Leur efficacité sera étudiée dans ces deux modèles murins en analysant leurs effets sur les anomalies comportementales et sur le fonctionnement neuronal. Les résultats de cette étude, intégrés au projet européen dans son ensemble, permettraient d’envisager un transfert vers la clinique et les patients à court terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances sur les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau. Cette étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes communs à l’origine de ces maladies et évaluera le potentiel de médicaments déjà utilisés pour d’autres maladies. Dans leur ensemble, ces travaux permettront d’accélérer le développement de médicaments pour les patients concernés par ces troubles.

Procédures

Les souris anesthésiées seront implantées avec une puce d’identification par radiofréquence à l’aide d’une petite incision (une seule fois, 5 minutes par animal). Cette puce permettra d’identifier chaque animal et de suivre ses interactions avec les autres souris lors des tests de comportement. Si un des médicaments ne peut pas être donné oralement dans l’eau de boisson ou la nourriture, une pompe placée sous la peau pourra également être utilisée pour administrer certains traitements de façon continue pendant cinq semaines (en même temps que les puces). Si aucune de ces voies n’est possible, une intervention chirurgicale sera réalisée pour placer la pompe dans la cavité abdominale. Les souris seront évaluées sur leurs comportementaux sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés et leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition aux crises d’épilepsie (maximum 60 minutes par jour sur 4 semaines, soit un total de 16 heures par animal).

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, et les tests comportementaux peuvent entraîner un léger stress temporaire chez l’animal. Leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition à l’épilepsie peuvent entraîner un inconfort modéré, supérieur à celui associé aux autres tests comportementaux. L'implantation des puces et des pompes peut provoquer une légère douleur minorée par l'administration d'antalgiques. Des crises d’épilepsie seront induites, ce qui pourrait entraîner une diminution de leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour réaliser des prélèvements de différents tissus (sang et cerveau) et faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Les médicaments seront d’abord testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour les expériences de comportement et tester des médicaments, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection, leur passage dans le cerveau jusqu’à l’observation de leurs effets in vivo.

Réduction

Le nombre de 2784 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Si aucun effet sexe n’est observé lors de la caractérisation des modèles, le nombre de souris sera réduit de moitié pour l’évaluation des effets des médicaments. De plus, si la dose la plus faible d’un médicament permet d’obtenir des résultats satisfaisants, la dose plus élevée ne sera pas testée. Si ces deux mesures de réduction peuvent être appliquées, le nombre total d’animaux nécessaires sera limité à 864.

Raffinement

L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, mais également pour vérifier leur état de santé. Les caractéristiques génétiques des souris et les croisements utilisés ont été adaptés afin de limiter l’apparition de signes indésirables pouvant affecter leur bien-être. Les souris soumises à une incision pour injecter des puces d’identification ou les pompes libérant le médicament seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Elles constituent ainsi un modèle pertinent pour étudier les troubles du neurodéveloppement qui ont un impact important sur la qualité de vie des personnes atteintes. Les études seront réalisées chez des souris adultes âgées de deux mois, ayant un cerveau mature, qui recevront les traitements avec ces médicaments un mois ou une semaine avant l’évaluation de leurs comportements.

Les souris employées ici portent un marquage fluorescent de leurs fibroblastes, obtenu par modification génétique, pour suivre ces cellules pendant que la tumeur se développe. 2 862 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène chimique identique à ceux du tabac, une fois par semaine pendant dix semaines pour les tumeurs du poumon, ou dans l'eau de boisson pendant quatre à quatorze semaines pour celles de la vessie, et pour une partie d'entre elles une greffe de cellules tumorales introduite dans la vessie par un cathéter urétral sous une heure d'anesthésie, une tumeur trop volumineuse pouvant ensuite obstruer l'organe et provoquer une rétention d'urine douloureuse. Toutes sont tuées, celles dont le génotype ne sert pas au projet dès l'élevage, les autres pour l'analyse de leurs tumeurs après la mort.

Objectifs

Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.

Procédures

Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines. (MODIFICATION) Dans une 3ème expérience, les animaux recevront une greffe de cellules tumorales avec ou sans fibroblastes directement dans la vessie via l’urètre. Ce geste provoque uniquement une gêne à l’animal, ce même geste étant appliqué aux patients atteints de tumeurs de vessie pour apporter localement le traitement anticancéreux[VD1.1]. Les animaux seront anesthésiés au début de l’expérience par injection d’un produit non douloureux pour effectuer ce geste afin de les stabiliser pour le succès de la greffe. Les animaux seront anesthésiés pendant 1 heure le temps de garantir l’entrée des cellules dans la vessie et éviter leur sortie à cause d’une potentielle miction des souris.

Impact sur les animaux

Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre) Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle. (MODIFICATION) Une gêne de courte durée peut survenir suite à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre afin d’injecter les cellules tumorales/fibroblastes dans la vessie.

Devenir

Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem

Remplacement

Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. (MODIFICATION) En effet, nous avons montré in vitro que les CAFs issus de tumeurs humaines de vessies favorisent l’invasion des cellules tumorales de stade précoce. Cependant, l’invasion vers le muscle de la vessie étant critique cliniquement et ne pouvant être mimée in vitro, il nous est indispensable d’utiliser des modèles murins pour le montrer. De plus, seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’étudier l’origine et le devenir de ces populations au cours de la progression tumorale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici. Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure. MODIFICATION L’utilisation de l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux utilisés et suivre la progression tumorale in vivo. Une variabilité interindividuelle est attendue, notamment en raison des différences potentielles de prise de greffe et d’implantation tumorale. Ceci nécessite 15 animaux par groupe afin de pouvoir observer des différences biologiquement pertinentes entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. (MODIFICATION) Les souris opérées seront anesthésiées afin de réduire la gêne liée à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la greffe et pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite

Choix des espèces

Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.

528 souris subissent l'implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie générale, 456 reçoivent trois séances d'irradiation de 4 Gy sur trois jours consécutifs, et 120 une injection intracardiaque pour provoquer des métastases cérébrales. 648 souris en tout sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur attend chez les souris porteuses de glioblastome une perte de poids, de motricité et de sensibilité, qu'il annonce limitée à 24 heures par le respect des points limites. L'injection intracardiaque, elle, apparaît dans la liste des procédures sans durée ni mention d'anesthésie, et les séances d'IRM sans nombre ni durée.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de vésicules extracellulaires (EV) sur les tumeurs cérébrales hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels et notamment à la radiothérapie. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, l’efficacité des thérapies actuelles. L’objectif dans la première procédure est de déterminer, dans un modèle de glioblastome murin, le mode d’administration le plus pertinent et la dose d’EV les plus efficaces. Puis dans les procédures suivantes, d’analyser l’efficacité des EV dans 3 autres modèles animaux de glioblastome murin ou humain ou métastatique, présentant des spécificités différentes.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court terme est une amélioration des stratégies thérapeutiques conventionnelles du glioblastome en utilisant des EV qui ont montré, par des études précédentes dans d’autres pathologies, leur capacité à améliorer les thérapies actuelles. A long terme, le bénéfice attendu est l’administration de ces EV lors des stratégies thérapeutiques conventionnelles chez l’Homme.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : -Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 528 animaux sont concernés. -Injection intracardiaque pour les 120 animaux des procédures concernées par les métastases cérébrales. -Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 456 animaux sont concernés. -Injection d’analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la chirurgie et 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale

Impact sur les animaux

Les séances fractionnées de radiothérapie n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Le degré de sévérité de ces interventions est donc léger. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeurs cérébrales et la procédure d’injection du traitement peuvent induire des douleurs. Ces nuisances sont atténuées par l’utilisation d’un agent anesthésique et l’administration d’analgésiques et leur durée est de quelques minutes. Ces interventions sont donc de sévérités modérées. Nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM ; ces effets indésirables surviennent en fin de protocole et grâce au respect des points limites, leur durée est de maximum 24h . A ce titre la procédure dans son ensemble de suivi d'efficacité thérapeutique a été classée modérée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer des organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et aux réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures EV (taille, aspect de toxicité,) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité de mettre à mort plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. De plus, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence qu’il faudrait un maximum de 12 animaux par groupe afin d’obtenir une différence significative . Ce nombre d’animaux pourra être revu à la baisse durant l’étude après une analyse statistique séquentielle.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissements des cages. Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 2 à 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids due aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Afin d’étudier l’effet des traitements sur les cellules tumorales au sein même de leur microenvironnement, il est nécessaire d’utiliser des modèles murins, les modèles in vitro ne répliquant pas toutes les composantes étudiées (hypoxie, inflammatoire et vasculaire). Les modèles animaux de tumeurs sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la croissance tumorale tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes car ces souris présentent la composante inflammatoire. Les modèles de tumeur cérébrale murin utilisés repose sur l’implantation de cellules de gliome issues de ces souris immunocompétentes. De plus, l’efficacité du traitement sera évaluée sur des modèles de tumeurs cérébrales humaines et métastases qui seront alors implantés chez des souris immunodéficientes permettant ainsi le développement de la tumeur d’origine humaine. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire.

Quatorze jours consécutifs d'injections sous-cutanées d'hormones, six prélèvements de sang, une transplantation de cellules mammaires dans le coussin adipeux de souris receveuses de trois semaines : 5 072 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélever leurs glandes mammaires et leurs tumeurs. Le projet relève de la recherche fondamentale, comprendre comment le gène p16 limite la plasticité des cellules mammaires hors de son rôle dans le cycle cellulaire. Le porteur estime à un à deux mois l'inconfort lié au développement des tumeurs mammaires, et à 24 ou 48 heures la douleur modérée qui suit la pose d'un implant ou la greffe. Il justifie le recours à la souris par les cinq paires de glandes collectables sur un même individu, et étudie des femelles vierges, gestantes, allaitantes, ou âgées de 18 mois selon le stade visé.

Objectifs

La glande mammaire est un organe doté d’une plasticité exceptionnelle et d’un développement postnatal dynamique. Elle contient des types cellulaires spécifiques, essentiels pour les remaniements morphologiques postnataux. Cependant, les mécanismes permettant à ces cellules de maintenir leur plasticité restent encore mal compris. Le cancer du sein de type basal, un sous-type particulièrement agressif, se caractérise par la perte d'expression des récepteurs hormonaux et du récepteur du facteur de croissance épidermique humain. Certaines cellules ont été identifiées comme les cellules d’origine de ce cancer, suggérant qu’elles acquièrent une plasticité anormale lors de la tumorigenèse. Ainsi, l’un des objectifs centraux de ce projet est d’élucider comment ces cellules limitent leur plasticité en situation d’homéostasie. Nos résultats préliminaires indiquent qu’un gène pourrait réguler la plasticité de cellules mammaires qui nous intéressent même en dehors de son rôle classique dans le contrôle du cycle cellulaire. Ce projet s’articule autour de deux questions majeures : 1. Comment notre gène d’intérêt régule-t-il la plasticité dans un contexte normal ? 2. Quelles sont les conséquences d’une dérégulation de cette plasticité sur les processus physiologiques (comme la lactation et/ou l’involution) et pathologiques (comme la tumorigenèse) de la glande mammaire ? En répondant à ces questions, nous espérons approfondir notre compréhension des mécanismes qui gouvernent la plasticité cellulaire mammaire et leurs implications dans la tumorigenèse.

Bénéfices attendus

La souris est fréquemment utilisée pour étudier le développement de la glande mammaire après la naissance, car il s’agit d’un mammifère dont l’organisation de la glande mammaire présente de nombreuses similarités avec celle de l’être humain. De plus, il existe des modèles de souris génétiquement modifiées qui permettent d’étudier précisément le rôle de certains gènes, dans différentes étapes de la vie de la glande mammaire comme la gestation, la lactation et l’involution (retour de la glande à son état normal après l’allaitement). Ces modèles permettent également d’étudier les mécanismes impliqués dans la régénération des tissus et dans le développement des cancers du sein. La souris possède également plusieurs glandes mammaires, ce qui permet de réaliser différentes analyses à partir d’un même animal afin de limiter le nombre de souris utilisées. Les tissus prélevés permettront d’étudier la structure des glandes, l’expression de certains gènes ainsi que l’activité de mécanismes biologiques impliqués dans le fonctionnement normal ou pathologique des cellules mammaires. Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre comment certaines cellules de la glande mammaire conservent leurs caractéristiques tout en étant capables de s’adapter aux besoins du tissu au cours de la vie. Nous cherchons également à comprendre pourquoi des dérèglements de ces mécanismes peuvent favoriser l’apparition de cancers du sein. Plus précisément, nous étudierons le rôle d’un gène qui produit une protéine connue pour limiter la multiplication des cellules et prévenir la formation de tumeurs. Nos premiers résultats obtenus en laboratoire suggèrent que cette protéine pourrait aussi jouer un rôle important dans le maintien de l’identité des cellules mammaires.

Procédures

Dans ce projet, 9 types de manipulations sont prévues : 1/ Implantation ou retrait d’implants hormonaux : 1 fois, 15 minutes par souris 2/ Injection de substance en intrapéritonéal (dans la cavité abdominale) : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 3/ Administration de substance par gavage : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 4/ Injection sous cutanée d’hormones : 14 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 5/ Procédure chirurgicale de transplantation sous anesthésie gazeuse, de cellules mammaires dans le coussin adipeux de souris receveuses pré-pubères de 3 semaines : 1 fois, 15 minutes par souris 6/ Prélèvement de sang : 6 fois sur plusieurs semaines, quelques secondes par souris 7/ Injection d’une autre substance en intrapéritonéal : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 8/ Injection de cellules tumorales dans la glande mammaire (sous cutanée) : 1 fois, quelques secondes par souris 9/ Procédure chirurgicale de retrait de tumeur primaire sous anesthésie : 1 fois, 15 minutes par souris

Impact sur les animaux

Pour les femelles qui entreront dans ces procédures, ce projet occasionnera essentiellement un stress léger à modéré dû : 1- à l’administration des différentes molécules destinées à moduler l’expression d’un gène ou d’une protéine (introduction d’une aiguille ou d’une sonde de gavage). La durée de ce stress est estimée à quelques secondes lors de l’introduction de l’aiguille ou de la sonde de gavage. 2- à la procédure chirurgicale de transplantation cellulaire ou de greffe d’implant (gène de déplacement lié à l’implant dorsal). La durée de ce stress (inconfort et douleur modérée) est estimée à 24h (implant) à 48h (greffe), mais sera contrôlée par la mise en place d’un traitement analgésique 3- au développement des tumeurs (gène de déplacement lié au développement du tumeurs mammaires). L’inconfort lié à cette procédure expérimentale est estimé à 1 à 2 mois

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car pour l’ensemble des procédures expérimentales, le but est de collecter les glandes mammaires et/ou tumeurs en vue de leurs analyses.

Remplacement

Pour étudier le rôle de p16 dans le développement et la tumorigenèse de la glande mammaire, nous ne pouvons pas utiliser exclusivement la culture cellulaire in vitro. En effet, nous n’avons pas réussi pour le moment à mimer fidèlement l’organisation 3D du tissu et à reproduire l’ensemble du cycle reproductif de la glande mammaire ainsi que du développement tumoral. Nous souhaitons donc utiliser la souris comme organisme modèle. Cet animal présente de nombreux avantages pour notre étude. C’est un mammifère dont l’organisation du tissu mammaire est similaire à celle de l’être humain.

Réduction

Toutes les souris utilisées seront du même fond génétique entre les groupes contrôles et les groupes traités ou génétiquement modifiés, ce qui préviendra la fluctuation des résultats due aux variations génétiques entre les animaux et permettra d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant moins d’animaux. Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux est déterminé par rapport aux expériences préliminaires ne nécessitant pas d’autorisation (mise à mort des animaux afin de collecter leurs tissus sans utilisation de gestes technique au préalable), ainsi que sur les méthodes employées dans la littérature scientifique relative à l’élaboration de ces modèles animaux. De plus, la souris possède 5 paires de glandes mammaires, permettant de réaliser à partir d’une seule souris de nombreuses analyses et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous allons utiliser le nombre minimum d’animaux nous permettant d’obtenir des résultats homogènes et suffisant pour obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes contrôles vs les groupes expérimentaux (Mutants ou traités). Les animaux seront générés à partir de croisement nous permettant de garder le maximum d’animaux d’une même portée pour les utiliser soit dans des procédures expérimentales, soit maintenir les génotypes pour les accouplements. Par conséquent, la majorité des animaux obtenus à partir des accouplements pourront être utilisés dans des expériences en évitant ainsi la surproduction inutile de souris. Les mâles seront utilisés comme mâles reproducteur afin d’induire les gestations. Lors de procédures nécessitant des gestations synchronisées de façon très précises entre 2 groupes et éviter de faire se reproduire des animaux qui ne pourraient finalement pas être inclus dans notre études, nous mettrons également en place une procédure chirurgicale légère consistant à l’introduction d’un implant en silicone permettant la libération d’hormones en continue afin de mimer une pseudo gestation et garantir la synchronisation des animaux.

Raffinement

La manipulation des animaux sera strictement limitée aux interventions décrites dans les protocoles et aux soins, afin de limiter leur stress. Nous surveillerons régulièrement les souris et respecterons les points limites définis pour limiter la souffrance des animaux. Quelles que soit les procédures mises en place : injection intra-péritonéale, gavage, transplantation dans le coussin adipeux et prélèvement sanguin, les souris serons systématiquement évaluées quotidiennement pendant 3 jours, puis de façon hebdomadaire ou bi-hebdomadaire dans les procédures induisant un développement tumoral mammaire et des points limites spécifiques et précoces seront mis en place. La douleur chez les souris sera évaluée selon l’apparence (normale, pelage ébouriffé avec expression modérée, dos voûté avec expression sévère), le score de condition corporelle, le poids corporel et l’apparition de lésion nécrotique. Du gel nutritif sera mis à disposition des animaux dès l’apparition des signes cliniques afin de favoriser leur hydratation et un traitement avec un désinfectant sera appliqué sur les petites lésions nécrotiques. De plus, une litière douce et adaptée sera utilisée lorsque les souris commenceront à développer des tumeurs.

Choix des espèces

En tant que mammifère, la souris est le modèle animal le plus approprié pour étudier le développement de la glande mammaire car la structure du tissu mime fidèlement celui retrouvé chez la femme. De plus, il existe déjà de nombreux modèles murins génétiquement modifiés mimant les altérations existantes dans les pathologies humaines, notamment pour le cancer du sein. Enfin, la souris possède 5 paires de glandes. A partir d’un seul individu, nous pouvons donc collecter une grande quantité de matériel, réduisant ainsi la quantité d’animaux utilisés dans cette étude. Les animaux utilisés pour les expériences seront pour la plupart des souris adultes âgées de plus de 8 semaines. Nous étudierons soit des souris vierges et donc avant leur mise en accouplement, soit des souris qui auront été accouplées et que nous analyserons au cours du cycle de développement de la glande mammaire, à savoir : la gestation, la lactation et l’involution. De plus, certaines procédures expérimentales incluront des souris de 6 semaines afin d’analyser les glandes mammaires au cours de la puberté. Le choix de ces stades de développement est totalement dicté par le développement de la glande mammaire qui est essentiellement post natal et qui subit de nombreuses modifications au cours des cycles reproductifs que nous souhaitons étudier. Enfin, nous utiliserons également des souris âgées de 3-4 semaines dans les expériences de transplantation (souris receveuses) et des souris de 18 mois afin de suivre le développement des tumeurs.

Jusqu'à neuf gavages sur animal éveillé et huit prélèvements de fèces, chacun précédé de cinq minutes seule dans un pot transparent : 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte d'organes et de tissus. Le projet doit vérifier si des mélanges de bactéries intestinales mis au point par un partenaire industriel s'implantent dans l'intestin de la souris et y produisent les métabolites attendus. Le porteur décrit la souris comme un "modèle établi" pour la recherche sur le microbiote intestinal, d'une "pertinence démontrée pour la situation humaine", et retient des adultes de 8 à 12 semaines. Il ne retient comme atteintes que le stress des gavages et des prélèvements de fèces, plus une légère douleur à l'injection de l'anesthésique, pour un projet qu'il classe en souffrance modérée.

Objectifs

Ce projet vise le développement de technologies permettant d’accéder à l’ensemble de la diversité des bactéries intestinales en vue de concevoir un ensemble de souches bactériennes fonctionnelles pour des patients atteints de maladie métabolique et inflammatoire. Il cherche à traiter les déséquilibres des relations entre le microbiote et l’organisme de ces patients. L’objectif du projet est de vérifier l’implantation des bactéries dans le système intestinal de la souris et d’en évaluer la production métabolique

Bénéfices attendus

Les avancées scientifiques ont souligné le rôle des bactéries intestinales dans diverses maladies humaines. L'introduction de grandes quantités de bactéries intestinales non caractérisées chez des individus malades comporte des risques significatifs, soulignant l'urgence de développer des produits davantage définis, contrôlés et fonctionnels. Des mélanges de bactéries, soigneusement étudiés en laboratoire pour ressembler à une flore intestinale saine, pourraient aider à rééquilibrer un intestin perturbé et ouvrir la voie à des traitements efficaces et accessibles contre plusieurs maladies du système digestif. Pour comprendre comment y parvenir, des expériences sont nécessaires pour transposer nos résultats de laboratoire dans un modèle animal plus complexe. Les résultats de ce projet permettront de vérifier si les mélanges bactériens mis au point par le partenaire industriel remplissent leur fonction. A long terme, les résultats de ce projet permettront d’améliorer les performances des thérapies de restauration du microbiote chez les patients atteints de maladie métabolique ou inflammatoire de l’intestin.

Procédures

Les souris subiront les interventions suivantes : - Gavage (1 à 2 minutes) sur animal vigile, 9 fois au maximum au cours de l’expérimentation - Prélèvement de fèces (5 minutes) sur animal vigile, 8 fois au maximum au cours de l’expérimentation - Pesée des animaux (5 minutes), 4 fois au cours de l’expérimentation - Injection (1 minute) sur animal vigile, 1 seule injection pour anesthésier les animaux - Injection (1 minute) sur animal anesthésié, 1 seule injection pour l’analgésique local - Deux prélèvements sanguins (1 à 2 minutes) sur animal anesthésié, 1 seule fois

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors des gavages et lors des prélèvements de fèces (5 minutes de séjour dans le pot transparent). De plus, les animaux subiront un léger stress et une légère douleur lors de l’injection des anesthésiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte d’organes et de tissus pour des analyses métaboliques.

Remplacement

Actuellement, aucun autre modèle que l’animal n’existe pour caractériser l’implantation de microbiote complexe dans le système intestinal et en évaluer les effets sur les différents organes. Par contre, les données cliniques recueillies dans ce projet serviront à créer des modèles informatiques du système digestif et des microbes qui y vivent (modélisation in silico). Les microbes étudiés sont d’abord analysés en détail en laboratoire, ce qui permet de mieux comprendre comment ils interagissent entre eux et ce qui se passe lorsqu’on les associe différemment. Grâce à ces informations, les expériences sur les animaux peuvent être mieux préparées et le nombre de souris utilisées est ainsi réduit.

Réduction

Le nombre d'animaux requis a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation des résultats. Étant donné que ces expériences testent des effets encore peu documentés, elles comportent un niveau d'incertitude. Pour contrer cela, les calculs s'appuient sur des données publiées, permettant d'estimer les effets attendus. Pour les groupes témoins, le nombre de souris testées lors de ces expériences a été diminué et les données seront regroupées afin d’avoir des données statistiques fiables.

Raffinement

L’expérience commencera après une semaine d’acclimatation aux nouveaux groupes sociaux et aux nouvelles conditions environnementales. Il y aura une observation quotidienne des animaux depuis l’extérieur de leur cage, une observation individuelle et une pesée hebdomadaire à l’occasion des prélèvements fécaux, ainsi qu’une observation accrue dans les heures qui suivront les inoculations orales. Les animaux seront dans des cages standards à couvercle filtrant par groupe de 3 souris du même sexe. Du papier absorbant ou des nids de papier kraft à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des abris en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. Des points limites ont été déterminés dans ce projet et seront mis en place si besoin. De plus, avant les prélèvements sanguins en phase terminale, les souris seront placées sous anesthésie profonde. Des points limites adaptés sont définis et seront appliqués en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgés de 8 à 12 semaines. En effet, l’utilisation de souris à l’âge adulte garantit qu’elles ont dépassé les phases critiques du développement et que leurs systèmes immunitaire et hormonal sont relativement stables et matures, ce qui constitue une condition préalable à l’étude des différences liées au traitement.

Les souris sont tuées à partir d'une taille de tumeur fixée à l'avance, mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine. 46 souris immunodéficientes NSG vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus et des organes. Elles reçoivent une injection unique de cellules humaines de cancer du sein triple négatif sous anesthésie locale, et la tumeur qui pousse peut provoquer une gêne mécanique et une perte d'appétit. Le projet ajoute deux lignées cellulaires à un projet antérieur mené jusqu'à son terme, pour les tester dans les mêmes conditions et comparer.

Objectifs

Ce projet est la suite d'un projet déjà validé et qui a donné les résultats prévus. Nous avons depuis obtenu deux nouveaux modèles cellulaires (ajout d'un gène déficient) qui nécessitent d’être testés dans les mêmes conditions pour comparaison. Cette demande a donc pour objectif de compléter le projet précédent et renforcer l’analyse biologique associée. Parmi les différents types de cancer du sein, le cancer triple négatif (TNBC) est l’un des plus difficiles à traiter. Contrairement à d'autres formes, il ne répond pas aux traitements ciblés habituels, et la chimiothérapie y est souvent peu efficace. Ce type de cancer est donc particulièrement agressif et a un risque plus élevé de récidive ou de propagation à d’autres organes (métastases). Dans une étude menée par notre équipe, nous avons découvert qu’un certain gène, est quatre fois plus souvent altéré dans les formes avancées et métastatiques de ce cancer que dans les formes précoces. Cela nous a poussés à penser qu’il pourrait jouer un rôle dans la capacité du cancer à se propager. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons créé en laboratoire des cellules cancéreuses issues d’un cancer du sein triple négatif reproduisant cette altération génétique. Nous avons observé que ces cellules devenaient plus agressives : elles bougent plus facilement, s'accrochent moins aux autres cellules (ce qui facilite leur dispersion dans le corps), résistent mieux à certains stress, et sont capables de survivre même dans des conditions difficiles (manque de nutriments). Ces résultats suggèrent que les mutations du gène en question pourraient rendre les cellules cancéreuses plus agressives capables de former des métastases plus facilement. Le projet de départ initial comportait trois lignées cellulaires : une lignée normale et deux clones mutés pour le gène d'intérêt. Ce projet a pour objectif de rajouter deux nouveaux modèles cellulaires qui complémentent le gène déficient des deux clones mutés (pour récupération du gène initialement muté). Les informations apportées par ces deux nouvelles lignées seront très importantes pour valider les résultats obtenus par les trois lignées du projet initial. Les résultats attendus viendront compléter nos travaux in vitro pour suggérer que la détection d’altérations du gène d'intérêt dans des tumeurs triple-négaitf est un marqueur de risque accru de dissémination métastatique et de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet de validation préclinique vise à confirmer l’implication des altérations du gène étudié dans la promotion de la dissémination métastatique des cellules de cancer du sein triple-négatif. Les informations attendues sont essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle visant à déterminer si ce gène pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif, de mauvais pronostic et aux traitements limités.

Procédures

Injection de cellules tumorales : une fois par animal, durée 10 minutes, anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Le développement du modèle de cancer du sein triple négatif métastatique nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances modérées pour les souris. La greffe des cellules, engendre du stress et une douleur transitoire et légère chez l'animal. Le suivi longitudinal individuel de nos souris (2 fois par semaine puis 5j/semaine si nécessaire) avec la mesure de la taille tumorale peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps par habituation. La tumeur par elle même peut induire une gène mécanique et une perte d'appétit modérées

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leur dissémination à d’autres organes distants. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans la dissémination métastatique dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle orthotopique et xénogénique de souris.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Les souris sont laissées une semaine en quarantaine après leur arrivée pour qu'elles s'habituent à leur nouvel environnement. Les souris sont hébergées en locaux confinés dans des portoirs ventilés, avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux seront au nombre maximum de 5 par cage, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux sont surveillés et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permet de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. Un pied à coulisse est utilisé pour mesurer la taille de la tumeur. Le sacrifice des animaux est effectué à partir d’une taille tumorale limite définie dans la procédure de suivi des animaux. Si une souris semble souffrir, elle reçoit une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Afin de répondre à la directive européenne 2010/63/UE sur les conditions de vie des animaux confinés, de l’enrichissement environnemental a été ajouté dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant à la détection de points limites (suivi régulier de l’état de santé des animaux et contrôle du poids).

Choix des espèces

Nous implanterons des cellules tumorales humaines. Le modèle de souris immunodéficientes NSG sera utilisé pour éviter un rejet de la greffe des cellules humaines. L'espèce souris est l'espèce de choix en oncologie préclinique. Pour ce projet, le fait qu'il soit possible d'utiliser des animaux immunodéficients bien caractérisés dans cette espèce est crucial. De plus, de précédentes études au laboratoire ont été réalisées sur ce modèle de souris avec la lignée MDA-MB-231. Nous devrions faire des mises au point supplémentaires en utilisant un autre modèle et nous utiliserions plus d’animaux pour cela. Enfin, l’animalerie du site n’héberge que des souris. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures (souris adultes).

Rendues obèses par un régime riche en graisses maintenu jusqu'à vingt-deux semaines, des souris reçoivent ensuite une implantation de tumeur mammaire, puis jusqu'à trente administrations de molécules en trente jours. 1 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec quinze prélèvements sanguins répartis sur deux journées. Le porteur écrit que "seule la température d'hébergement sera modifiée pour améliorer les résultats du projet", après avoir compté cette même température parmi les sources de stress et d'altération de la thermorégulation des souris. Les tumeurs, la rate et les ganglions sont prélevés après la mise à mort, ainsi que le tissu adipeux, l'intestin et le foie, destinés à d'autres projets.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment l’alimentation et la perte de poids influencent le système immunitaire dans un contexte d’obésité. Des souris rendues obèses par un régime riche en graisses seront utilisées pour comparer deux approches : une amélioration de l’alimentation (vitamines et prébiotiques) et une perte de poids par retour à un régime normal. Leur impact sera évalué sur le développement d’un cancer du sein et sur la réponse immunitaire. Le microbiote intestinal des animaux sous différents régimes sera également analysé, afin de mieux comprendre les interrelations possibles entre la flore intestinale, l’alimentation et l’immunité. Certaines molécules seront également testées pour mieux comprendre les mécanismes impliqués. L’objectif est de déterminer si ces approches peuvent améliorer la réponse immunitaire et limiter la progression tumorale chez des individus en situation d’obésité. Si ces résultats sont confirmés, ils pourraient contribuer à développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et thérapeutiques pour améliorer la réponse immunitaire et la prise en charge des cancers chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des interactions entre alimentation, obésité, système immunitaire et développement du cancer du sein. Cette première étude permettra d’explorer les mécanismes immunitaires et métaboliques impliqués, notamment au sein du micro-environnement tumoral, et d’identifier des cibles potentielles grâce à des analyses globales et quantitatives. Elle vise également à évaluer l’intérêt d’approches nutritionnelles, seules ou en combinaison avec des immunothérapies, pour améliorer la réponse immunitaire et limiter la progression tumorale. Cette étude constitue une preuve de concept qui pourrait ouvrir la voie à des études précliniques et cliniques chez des patients en situation d’obésité, afin d’évaluer l’efficacité de stratégies nutritionnelles innovantes, notamment via l’alimentation et le microbiote, dans la prévention et la prise en charge du cancer du sein.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en thermoneutralité à 30 degrés (animal vigile, 22 semaines maximum en continu). Des animaux pouront être sous régime alimentaire obésogène (animal vigile, 22 semaines maximum en continu). Une partie changera ensuite en passant avec une alimentation contrôle ou sous régime avec supplémentation (animal vigile, 14 semaines maximum en continu). Des challenges métaboliques seront effectués : un test de tolérance au glucose (animal vigile, 1 fois, 2 heures) et un test de tolérance à l'insuline (animal vigile, 1 fois, 2 heures). Ces tests nécessiteront une administration (animal vigile, 4 fois, 1 minute) et des prélèvements sanguins répétés de faible volume (une goutte) (animal vigile, 15 prélèvements au total : 7 sur une journée, 6 sur une autre, l'acte dure quelques secondes). Certains animaux auront une implantation tumorale (animal anesthésié, 1 fois, 10 minutes) combinée ou non avec l'administration de molécules (animal vigile ou anesthésié, 30 fois maximum sur 30 jours, durée 1 minute). En fin de procédure un dernier prélèvement sanguin sera effectué (animal anesthésié, 1 fois, 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques qui pourront engendrer les nuisances suivantes : 1) Le régime alimentaire riche en gras pourra entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. 2) L'obésité peut conduire à des problèmes cardiovasculaires. 3) Les différentes températures d'hébergement pourront entrainer un stress chez les animaux et une altération de leur thermorégulation. 4) L'anesthésie pourra engendrer une hypothermie et une détresse cardiorespiratoire dans de rares cas. 5) La pousse tumorale pourra induire une gène et une douleur modérée. 6) Les différents traitements pourraient induire des effets indésirables comme la diarrhée et une perte de poids. 7) Les différentes administrations peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections répétées peuvent induire risque de péritonite ou une irritation à la zone d'injection. 8) Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo ou une hyperglycémie durant quelques heures. Une sensation de faim et un léger stress peuvent également être ressentis lors des mises à jeun. 9) Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire car les tumeurs, la rate, les ganglions doivent être prélevés pour analyse dans le cadre de ce projet. D’autres prélèvements seront réalisés (tissus adipeux, intestin, foie…) pour faire bénéficier des résultats pour d’autres projets.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de l’alimentation et de l’obésité sur la réponse immunitaire et le développement tumoral. Ces mécanismes impliquent des interactions complexes entre différents organes (tissu adipeux, système immunitaire, tumeur, microbiote) qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des modèles in vitro ou in silico. L’étude de la réponse immunitaire dans un contexte d’obésité, ainsi que son influence sur la progression tumorale, nécessite donc une approche intégrée à l’échelle de l’organisme. L’utilisation de modèles murins est particulièrement adaptée, notamment grâce à la possibilité de reproduire des situations physiopathologiques pertinentes (obésité induite par régime, modèles de cancer) et d’étudier finement le micro-environnement tumoral et les réponses immunitaires associées. Toutefois, dans une démarche de réduction de l’utilisation animale, des approches complémentaires in vitro seront utilisées en amont lorsque cela est possible, afin de sélectionner et de valider certaines hypothèses avant leur exploration in vivo.

Réduction

Cette étude nécessitera 1225 souris. Le nombre d'animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude. Pour l’analyse statistique, les groupes seront comparés avec des tests statistiques classiques. A la fin du projet, différents organes seront prélevés pour analyse afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux. De plus, nous optimiserons les groupes expérimentaux en partageant les témoins entre protocoles compatibles afin de limiter le nombre total de souris utilisées. Toutes les analyses seront réalisées par des experts en bio-informatique et en biostatistiques au sein du laboratoire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, seule la température d'hébergement sera modifiée pour améliorer les résultats du projet. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en armoire thermostatée avec biberon et un accès ad libitum à l'eau et la nourriture. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Un bâton à ronger est systématiquement mis en place pour les animaux sous régime alimentaire spécifique mou. Ce régime est renouvelé régulièrement pour éviter son oxydation et le changement de cage sera augmenté si l'aliment s'effrite trop afin de réduire l'inconfort des animaux. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Quand cela est nécessaire pour limiter la douleur et le stress des animaux, les actes techniques seront réalisés sous anesthésie générale. La durée des administrations sera réduite au maximum et quand cela sera possible. Les volumes injectés seront également toujours réduit au maximum. Lors des challenges métaboliques, les animaux seront étroitement surveillés et les animaux bénéficieront toujours d'un temps de récupération adapté. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris permet de reproduire de manière fiable des situations physiopathologiques humaines, notamment l’obésité induite par un régime riche en graisses ainsi que des modèles de cancer du sein orthotopiques, dans lesquels la tumeur se développe dans un environnement proche de celui observé chez l’homme. Ce modèle offre également la possibilité d’étudier finement tous les mécanismes qui rentrent en jeu dasn ces situations. Par ailleurs, les interventions nutritionnelles et pharmacologiques peuvent être contrôlées de manière précise et reproductible. Ainsi, le modèle murin constitue à ce jour le modèle le plus pertinent pour répondre aux objectifs du projet. Des souris âgées de 5 semaines seront utilisées. Après une semaine d’acclimatation, les animaux entrent dans le protocole expérimental. Ce stade correspond à des souris jeunes adultes présentant un système immunitaire fonctionnel et stable, ce qui est nécessaire pour étudier les réponses immunitaires et métaboliques. Ce choix est également justifié par la durée du protocole, qui s’étend sur plusieurs mois. L’utilisation de jeunes adultes permet ainsi de mener l’ensemble des expérimentations sur une période prolongée tout en limitant les effets liés au vieillissement.