Oncologie

Placés quatre semaines dans un caisson d'hypoxie intermittente, huit à seize heures par jour pendant leur phase de sommeil, 434 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire chaque jour, une prise de sang entre le dix-huitième et le vingt-et-unième jour, puis une échographie de l'aorte sous anesthésie gazeuse après un transport entre deux établissements. Presque tous sont tués par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale pour récupérer leurs organes, quinze rats écartés en cours d'étude pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur justifie l'effectif en indiquant que le nombre d'animaux a été fixé à douze, sans dire comment on passe de ce chiffre aux 434 rats déclarés.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.

Bénéfices attendus

Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.

Remplacement

L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.

Greffées de cellules tumorales humaines dans le cerveau sous anesthésie générale, 135 souris femelles dépourvues d'une partie de leur système immunitaire reçoivent une lame de verre de 5 mm à la place d'un morceau de leur crâne. Elles passent ensuite une à deux séances d'imagerie par semaine, sous anesthésie à chaque fois, pendant six mois au plus, hébergées seules pour qu'elles ne rongent pas cette fenêtre crânienne. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et le porteur précise que ni la nanoparticule ni la radiothérapie évaluées ne sont administrées aux souris, l'irradiation étant faite sur cellules. Au terme des six mois, ou dès qu'un point limite est atteint, toutes sont tuées et leur cerveau prélevé.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nanoparticules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique de deux nanoparticules innovante (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine. L’objectif du projet étant d'optimiser les modalités de traitement dans le traitement de tumeurs cérébrales. Nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

-Procédure 1: Sous anesthésie générale, greffe cérébrale de cellules tumorales humaines avec pose de fenêtre crânienne (un lame de verre de 5 mm de diametre vient remplacer une partie du crane) : réalisée une fois au début de l'étude (durée de 30 min) - Procédure 2 : Observation de la croissance/régression tumorale sous anesthésie générale par des techniques d’imageries : réalisée 1 à 2 fois par semaine (durée 10 min) sur maximum 6 mois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire, de plus nous utilisons des analgésiques pour limiter la souffrance des animaux et le traitement NPs + la radiothérapie n’est pas réalisée sur la souris mais effectuée sur cellules. Nous mettons en place des soins post-opératoire rigoureux. L’hébergement en cage individuelle après la chirurgie et durant tout le suivi par microscopie pour éviter que les animaux ne rongent la fenêtre crânienne ; ceci pouvant conduire à un stress des animaux par limitation des interactions sociales directes pour limiter cet effet indésirable nous accolerons les cages transparentes les unes aux autres ce qui permettra une communication visuelle entre les animaux. Suivi par imagerie classée légère : utilisation d'analgésiques pour limiter le stress de l’animal qui doit être maintenu immobile pour ne pas altérer la qualité des images.

Devenir

Procédure 1: Greffe cérébrale de cellules tumorales humaines avec pose de fenêtre crânienne : animaux gardé en vie. En effet, cette procédure ne menace pas leur intégrité physique et constitue le point de départ de notre étude. Procédure 2 : Observation de la croissance/régression tumorale par imagerie : animaux mis a mort à la fin de la période maximal de suivi soit 6 mois ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau sera prélévé pour analyse macroscopique et histologique (mise en évidence des cellules tumorales en surface ou en profondeur).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque l’implantation de tumeurs cérébrales, la croissance ou la régression tumorale post-traitement dépend de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Les différents travaux déjà mener in vitro (sur cellules) et le désire d’évoluer vers la clinique implique une étude préclinique in vivo (sur un modèle animal) du protocole, ainsi que de disposer de tumeurs intracérébrales issues de cellules tumorales humaines pour se rapprocher au mieux de l’histologie tumorale retrouvée en clinique.

Réduction

L’utilisation du modèle de fenêtre intracrânienne permet le suivi sur plusieurs semaines sur un même animal de l’efficacité du traitement permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance, la migration et la régression tumorale. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d’une part lors de la procédure chirurgicale (analgésie avec réitération, opération sur tapis chauffant pour le maintien de la température corporelle, protection de la déshydratation oculaire par du gel ophtalmique, injection d’anti-inflammatoire pour éviter l’œdème cérébral, surveillance au réveil (vérification de l’alimentation et de l’hydratation)) ; Et d’autre part les jours suivant la chirurgie et jusqu’au sacrifice de l’animal (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de papier absorbant et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris nude (dépourvue d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des souris femelles plus sociables, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 7 à 9 semaines au moment de la chirurgie sont utilisées, à un stade où leur poids est suffisant compatible avec l'intervention

Toutes ayant reçu des cellules cancéreuses, aucune ne peut être gardée en vie selon le porteur : les 180 souris de ce projet seront tuées, leurs tumeurs analysées après la mort. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, puis une injection de traitement tous les deux jours pendant trois semaines. Trois à quatre fois par semaine, la tumeur est mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé, maintenu par contention. Le projet teste des promédicaments censés ne s'activer qu'en présence des fortes concentrations de radicaux oxygénés propres aux cellules cancéreuses, sans que le RNT nomme ces molécules ni précise le type de cancer greffé.

Objectifs

Les ROS (espèce réactives de l'oxygène) d'origine naturelle agissent comme des molécules de signalisation, par exemple pour stimuler la croissance des cellules. Cependant, lorsque la production de ROS augmente, des effets nocifs commencent à apparaitre sur des structures cellulaires importantes telles que les protéines, les lipides et les acides nucléiques. Les niveaux élevés de ROS sont une des caractéristiques typiques du cancer , ils favorisent la croissance et la progression de la tumeur. Mais, au-dessus d'un seuil ils deviennent toxique, le stress induit par les ROS peut entraîner l'apoptose ou la sénescence des cellules cancéreuses. Elles ont donc développé la capacité de s'adapter à des concentrations élevées de ROS en augmentant les niveaux d'antioxydants et donc à maintenir les niveaux de ROS en dessous d’un seuil toxique. Ces adaptations pouvent conduire à une résistance au traitement, entraînant ainsi une progression de la maladie ou une rechute. Des molécules thérapeutiques amplificatrices de ROS sont donc développées. Étant donné que les ROS sont hautement toxiques sur toutes les cellules, le défi dans l'application thérapeutique de ces médicaments est donc d'atteindre la spécificité des cellules cancéreuses pour éviter les effets néfastes attendus sur les cellules et les tissus normaux. Des agents ont été crées dans le but de s’activer uniquement en présence d’une concentration de ROS élevée, comme c'est le cas spécifiquement dans les cellules cancéreuses, et entraîner la mort de ces cellules. Nous souhaitons donc tester ces agents in vivo, pour vérifier leur effet ciblé anti-tumoral.

Bénéfices attendus

Les agents testés sont des promédicaments activés par les ROS. Les ROS sont surproduites par de nombreux cancers. Ainsi, ces agents peuvent tuer sélectivement les cellules cancéreuses. Nous souhaitons exploiter cette capacité afin de pouvoir proposer des molécules thérapeutiques très ciblées avec le moins d'effet secondaire possible sur les cellules saines.

Procédures

Toutes les souris recevront des injections de cellules tumorales une fois sous anesthésie (une seule par souris). Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées tous les 2 jours, brièvement (1min) à chaque fois pour mesurer la croissance tumorale. Tous les animaux recevront 1 injection de traitement sous anesthésie locale tous les deux jours pendant 3 semaines (n=10). L’injection prend 1 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 à 4 fois par semaine. Ces différentes manipulations pouvant entrainer une contrainte légère chez l’animal. La croissance des tumeurs en sous-cutané et les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer des contraintes modérées dont une perte d’appétit et donc une perte de poids.

Devenir

Toutes les souris auront reçu des cellules cancéreuses, il n’est donc pas possible de les garder en vie à la fin de la procédure. L’analyse des tumeurs après traitement, post-mortem, nous informera sur la capacité de ces molécules à stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenus in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes d'une taille permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Le calcul de puissance nous a permis de calculer le nombre de souris nécessaires par groupe. Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux témoins.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique, notamment le fait que la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale. Cela permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, suffisamment grand pour une mise en place des méthodologies envisagées relativement aisée et dont la génétique est la mieux connue. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la pratique expérimentale que nous avons acquise sur cette espèce est désormais confirmée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Les souris utilisées ici sont génétiquement modifiées pour que l'ARN LincPint soit inactivé dans leurs vaisseaux lymphatiques, une lignée qui n'existe que dans cette espèce selon le porteur. 280 femelles de cinq semaines vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales sur cinq jours consécutifs, puis une greffe de cellules tumorales, une chirurgie provoquant un lymphœdème ou l'application d'une molécule inflammatoire, avant une lymphographie de moins de cinq minutes. Toutes sont tuées au terme de cette imagerie, pour récolter les tissus.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

434 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité étant tuée par prélèvement complet du sang sous anesthésie. Pendant quatre semaines, ils passent huit à seize heures par jour dans un dispositif d'hypoxie intermittente, pendant leur phase de sommeil, pour reproduire les apnées obstructives, avec un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire, une prise de sang en troisième semaine et une échographie de l'aorte sous anesthésie. Le porteur qualifie de "léger" ou "modéré" chacun des stress attendus, y compris le passage en hypoxie et le transport entre les deux établissements. Quinze rats échappent à la mise à mort et seront réutilisés dans d'autres projets, parmi lesquels ceux qui auront servi à former le personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.

Bénéfices attendus

Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.

Remplacement

L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.

Mesurer l'effet d'une enzyme sur le drainage des vaisseaux lymphatiques et sur la dissémination des métastases : 360 souris femelles de six semaines vont être utilisées dans ce but, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de vingt à trente minutes qui lui provoque un lymphœdème, un gavage, une injection de cellules tumorales, puis une lymphographie sous anesthésie au terme de laquelle elle est tuée sans réveil. La patte opérée gonfle de 10 à 15 % à partir d'une semaine après l'intervention, et reste ainsi jusqu'à la mise à mort. Un score évalue l'apparence, le poids, le comportement naturel et le comportement provoqué sur une échelle de 0 à 12, tout animal atteignant 10 étant tué immédiatement.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal. Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal). Enfin; dans le second établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines

Cinq jours d'injections intrapéritonéales consécutives, puis au choix une greffe de cellules tumorales, une chirurgie destinée à provoquer un lymphœdème de la patte ou l'application d'une molécule inflammatoire, et pour finir une lymphographie après laquelle l'animal est tué. 280 souris femelles vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue pour récolter les tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à établir le rôle d'un ARN non codant, LincPint, dans le fonctionnement des vaisseaux lymphatiques. Pour l'ensemble de ces atteintes, le RNT tient en une phrase sur les effets attendus, les chirurgies et les tumeurs devant engendrer "des douleurs modérées et un léger stress".

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalement implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De meme, la croissance tumorale et le developpement de lymphoedeme secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 12 semaines.

Une tumeur laissée croître jusqu'à 1 300 mm3 avant que la mise à mort soit programmée dans les jours qui suivent : 118 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit sous anesthésie la greffe d'un fragment de tumeur mammaire humaine, puis un traitement à l'olaparib, avec une pesée deux fois par semaine et une mise à mort immédiate à 20 % de perte de poids. L'objet déclaré est de comprendre pourquoi les cancers du sein triple négatif rechutent sous ce médicament. Le porteur retient la souris immunodéprimée parce que la croissance des tumeurs humaines y est "facilitée", et greffe des animaux de cinq semaines pour la même raison.

Objectifs

Le cancer du sein appelé triple négatif ne représente que 15% des cancers du sein, mais en constitue la forme la plus agressive et touche fréquemment les femmes jeunes. Il est associé à un risque élevé de métastases et à un pronostic défavorable. La chimiothérapie restait jusque récemment la seule option thérapeutique disponible dans des formes localisées de la maladie. Les alternatives étaient limitées en cas de récidive et faisaient toujours face à de rapides problèmes de résistances aux traitements. Ces cas de récidives restent encore un problème clinique non résolu dont le pronostic reste sombre pour les cancers du sein métastatiques. Aux stades avancés de la maladie, une sensibilité initiale au traitement fait fréquemment place à l’émergence d’une résistance. L’administration d’une chimiothérapie spécifique pendant un an a été récemment démontrée comme efficace pour améliorer la survie sans récidive de patientes porteuses. Cette amélioration est synonyme de guérison chez une partie des patientes reste partielle ou récidive pour d’autres. Ce qui nécessitant d’identifier les mécanismes de résistance afin de mieux prendre en charge ces patientes. L’une de nos hypothèses repose sur le concept de l’existence de populations de cellules capables de résister sous traitement et qui prolifèrent après l'arrêt du traitement.

Bénéfices attendus

Nous chercherons à établir l’existence de populations cellulaires associées aux rechutes après traitement à une molécule appelée "olaparib" de manière à déterminer si celles-ci sont préexistantes dans la tumeur initiale ou si elles sont induites par le traitement. Dans les deux cas, ces études ouvriraient la voie à des essais précliniques, préliminaires et indispensables à la mise en place d’études cliniques.

Procédures

Chaque animal subira une intervention chirurgicale sous anesthésie général et sous anti-douleur. La durée de l’intervention est en moyenne de 5 à 10 minutes anesthésie, chirurgie et réveil compris.

Impact sur les animaux

La chirurgie de greffe de fragments tumoraux peut engendrer chez les animaux : - Douleurs - Faibles pertes de poids - Déshydratations - Risque d’infection au site d’incision Tous les animaux seront surveillés quotidiennement avec une attention particulière quant à l’apparition de signes cliniques pouvant être caractéristiques de la tumeur : - Nécrose tumorale cutanée - Diarrhées - Déshydratations - Dos courbé - Prolapsus anal - Masque de la douleur - Perte de poids Concernant les animaux qui développent une tumeur, il est possible qu’ils ressentent une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement que la tumeur peut engendrer. Si tel est le cas, des croquettes seront aussi mises à disposition dans un coin de la cage afin de faciliter l’accès à la nourriture. Cependant, si nous voyons que l’animal est trop gêné ou que la tumeur empêche l’accès total à la nourriture ou à l’eau, l’animal sera euthanasié. Enfin, en ce qui concerne les traitements, dans le cadre de nombreuses études précédentes, il a été démontré qu’aucune toxicité n’était associée au traitement par l’Olaparib, contrairement à ce qui peut être observé pour les sels de platines. Grâce à la réalisation de mesures deux fois par semaine du poids des animaux nous serons alertés en cas de toxicité liée aux traitements. Si nous observons des pertes de poids : - de -5% à -10% de perte de poids par rapport au jour de greffe : surveillance, ajout de nourriture gélifiée et mesure de poids tous les jours - de -10% à -15% de perte de poids à partir du jour de greffe : en plus de la surveillance et de la mise en place de nourriture gélifiée, les animaux recevront une injection en sous-cutanée de NaCl car cette perte de poids est souvent associée à une déshydratation. Si l’animal ne reprend pas de poids dans les 24h alors il sera euthanasié. - 20% de perte de poids ou plus : euthanasie immédiate de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude. Au cours de l’étude les animaux ayant atteint les points limites ou présentant des signes inadmissibles de souffrance seront euthanasiés.

Remplacement

Pas de possibilité de remplacement. Au sein de ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative permettant de reproduire aussi fidèlement les caractéristiques histologiques et moléculaires des tumeurs de patients, mais aussi celles de l'environnement tumoral.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux par la mise en pratique de greffes sous-cutanées en multisite pour les étapes de pré-amplification des modèles. Nous considérons une prise de greffe de 30% lors de la décongélation pour la première partie et de 70% lors des passages de tumeurs fraiches (c’est-à-dire sans passer par une étape de congélation/décongélation). Ces % ont été déterminés sur la base de probabilités issues de précédentes études de prise de greffe menées dans notre équipe. Aussi, aucune approche statistique supplémentaire ne sera réalisée.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse et sous analgésie, afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens pourront être utilisés si nécessaire. Les animaux sont hébergés dans une animalerie agréée où les paramètres physiques sont contrôlés. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. A partir de 1300 mm3, les sacrifices seront programmés dans les jours suivants. Les animaux traités par le carboplatine bénéficieront d'une alimentation gélifiée en vue de prévneir les pertes de poids.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine d’un point de vue physiologique et la souris immunodéprimée est un bon modèle pour l’évaluation de la croissance des tumeurs d’origine humaine dans la mesure où cette croissance y est facilitée. Les animaux, âgés de 4 semaines, seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les greffes pourront donc être réalisées sur des animaux âgés de 5 semaines, car la prise de greffe est facilitée sur des animaux de cet âge.

12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, trente semaines de gavage quotidien et trente semaines d'injections intrapéritonéales bihebdomadaires. S'y ajoutent une chirurgie d'implant d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue à six jours de vie et des transports entre cinq sites pour les séances d'imagerie. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients. Le porteur justifie l'effectif par un calcul de puissance mené "en utilisant un logiciel de statistique", sans autre indication sur la façon dont on parvient à 12 812 individus.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.