Oncologie

Six heures de perfusion de glucose radiomarqué par pompe osmotique implantée sous la peau, trois prélèvements de sang, puis deux séances d'IRM séparées par un trajet en voiture d'un site à l'autre : 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des souris Nude, immunodéficientes, dont le porteur reconnaît le "phénotype dommageable", choisies pour qu'elles ne rejettent pas les greffes de cellules tumorales de surrénale posées dans leur flanc ou dans le coussin graisseux du cou. Ces greffes peuvent gagner en profondeur, fusionner avec les muscles dorsaux et comprimer la colonne vertébrale, jusqu'à une paraplégie. Toutes seront tuées pour récupérer la tumeur, le porteur estimant qu'il ne serait "pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur".

Objectifs

Les cancers de la glande surrénale sont des cancers rares qui ont la particularité d’être fréquemment héréditaires. Les patients sont porteurs d’anomalies génétiques qui leur procurent un risque très important de développer une ou plusieurs de ces tumeurs au cours de leur vie. Dans certains cas, ces anomalies génétiques sont par ailleurs la cause de forme plus agressives de la maladie avec le développement de métastases dans les os ou le foie notamment. A l’heure actuelle, les traitements sont peu efficaces pour traiter ces patients et le diagnostic précoce de la présence d’une tumeur, permettant de la retirer par chirurgie reste le traitement le plus efficace. Dans le cas des formes héréditaires, l’identification d’une anomalie génétique permet de proposer un test génétique au membre de la famille pour identifier les individus porteurs de l’anomalie et leur proposer un suivi préventif. Des travaux antérieurs ont montré que l’une des conséquences de ces anomalies génétiques étaient une modification de la façon dont les cellules cancéreuses transforment les sucres, en particulier le glucose. Ces modifications du métabolisme peuvent être utilisées à la fois comme outils diagnostiques (les modifications étant différentes en fonctions du type d’anomalie génétique) et thérapeutique (le ciblage de ces modifications pourrait empêcher les cellules cancéreuses de se nourrir et donc de proliférer). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles souris chez qui nous grefferons sous la peau des cellules tumorales ayant différentes anomalies génétiques retrouvées chez les patients. Dans ces modèles, nous étudierons comment les cellules cancéreuses utilisent le glucose pour proliférer. Nous développerons également des techniques d’imagerie par IRM qui permettront d’identifier les anomalies du métabolisme du glucose, en lien avec chaque type d’anomalie génétique. Ces travaux devraient permettre à fois d’identifier des voies qui pourraient être la cible de thérapie anti-cancéreuses spécifiques des anomalies génétiques (et donc potentiellement responsables de moins d’effets secondaires des traitements), et de développer des outils facilement utilisables en radiologie pour détecter les patients porteurs de ces anomalies génétiques. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs ou "EU. La mise en place des modèles de souris est réalisée dans l'EU1 et l'imagerie sera effectuée sur deux appareils d’IRM différents situés sur 2 sites distincts (EU2 et EU3).

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des différents mécanismes de malignité des tumeurs en fonction de leurs mutations ainsi qu’à la compréhension de leur métabolisme complexe dans un contexte in vivo, le laboratoire pourra proposer de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant des métabolites uniquement dans les cellules tumorales de la surrénale. Cette étude pourrait également permettre de développer une méthode innovante de diagnostic précoce ou de réponse thérapeutique pour les tumeurs pouvant, in fine, être transférée chez les patients.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour avoir une greffe de cellules tumorales dans le flanc ou dans le coussin graisseux sous anesthésie et analgésie (moins de 10 minutes). Une partie des animaux subira une perfusion intraveineuse de glucose radiomarqué durant 3h, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une autre partie des animaux subira une perfusion de glucose radiomarqué durant 6h par pompe osmotique, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une troisième partie des animaux sera transportée en voiture du site 1 vers le site 2 pour une première séance d’imagerie IRM de 30 minutes sous anesthésie gazeuse. Après transport en voiture de 30 minutes vers le site 3, ces animaux auront une acclimatation de 3 à 7 jours puis une seconde séance d’imagerie IRM de 30 minutes sur le site 3.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un léger stress lors de la contention, de l’anesthésie et lors du transport vers les différents sites d'expérimentation. L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation. L'implantation d’une pompe osmotique sous cutanée ainsi que le développement d’une tumeur dans le coussinet graisseux peuvent causer une légère douleur et potentiellement une réduction temporaire de la mobilité de la souris. Les tumeurs greffées sous le coussinet graisseux des souris peuvent potentiellement se développer en profondeur et adopter un comportement métastatique en fusionnant avec les muscles dorsaux résultant en une compression de la colonne vertébrale. Les animaux peuvent rarement montrer rapidement des signes de difficultés motrices dans les postérieurs, se développant en paraplégie.

Devenir

Les animaux seront élevés pour être utilisés lors d’expérience où ils développeront des tumeurs, suite à une injection de cellules ou une greffe d’un fragment de tumeur dans le flanc ou dans la graisse du cou. À la fin de ces expériences les animaux seront euthanasiés pour récupérer la tumeur car il ne serait pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur.

Remplacement

Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude des mécanismes de cancérogenèse, notamment la caractérisation des évènements menant au processus métastatique, qui intègre le microenvironnement tumoral, la néovascularisation, et les régulations endocrines. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de ce cancer ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle murin afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines.

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitement, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre restreint d’animaux au maximum de sorte à pallier le problème de variation observable in vivo mais également dû à la différence de taille des tumeurs qui peut considérablement altérer le métabolisme intra tumoral, soit 2240 animaux au total sur 5 ans. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.

Raffinement

Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des maisonnettes et morceaux de bois si nécessaire. Les animaux sont hébergés à un maximum de 5 par cage et s'il y a nécessité d'un hébergement individuel dû à une blessure ou une bagarre, il sera placé en cage double séparé d’un congénère par une cloison transparente trouée. Les animaux Nude présentent un phénotype considéré comme dommageable à cause de leur statut immuno-déficient. Ils seront hébergés en zone d’expérimentation dédiée aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous une hotte de change préalablement désinfectée afin de réduire l'impact de leur phénotype et qu'il ne s’exprime en développant une quelconque maladie. La procédure chirurgicale pour les greffes est pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 minutes avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenu par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux est observé, au minimum, deux fois par semaine afin de monitorer leur bien-être et d’observer l’apparition des tumeurs. Les souris sont pesées toutes les semaines pour détecter toute variation de poids anormal, ou stagnation malgré l’augmentation du volume tumoral. Dès l’apparition de tumeurs, celles-ci seront mesurées avec un pied à coulisse deux fois par semaine. Les animaux ayant reçu une greffe de pompe osmotique seront monitorés toutes les heures jusqu’à la fin de l’expérimentation. Le transport des animaux entre les sites d'expérimentation se fera en voiture dans des cages de transport adaptée avec litière, cotons compactés et gelée alimentaire adaptée au besoin des animaux. Des points limites adaptés ont été défini au préalable afin de réduire au maximum la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’augmenter les chances de prise tumorale à partir des greffes de cellules, nos lignées cellulaires étant également d’origine murine. Par ailleurs le modèle murin nous permet d’avoir accès à des animaux immunodéficients qui constituent un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou murines. Nos lignées cellulaires sont issues de différentes souris, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse immunodéficiente afin de minimiser le risque de rejet de greffes. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’Homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

8 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau et, par chirurgie, dans le colon et dans le foie, puis jusqu'à trois traitements, deux vaccins, douze injections de substrat et treize anesthésies gazeuses, avec prélèvements de sang et de fèces. Le porteur attend de ces modèles qu'ils éclairent le rôle de lymphocytes intestinaux dont il a déjà breveté l'"énorme potentiel clinique", les retombées pour les patients restant au conditionnel. Il écrit par ailleurs qu'"en général, aucun signe de souffrance des animaux n'est observé dans les jours qui suivent les implantations de tumeurs".

Objectifs

Notre projet vise à améliorer la prise en charge des patients souffrant de cancer colorectal métastatique, souvent incurable. Nous cherchons à développer de nouvelles thérapies, en particulier des immunothérapies. Pour cela, nous voulons mieux comprendre l’immunité développée dans les tumeurs primitives, situées au niveau du colon, ainsi que dans les tumeurs secondaires (les métastases), principalement situées au niveau du foie dans ce type de cancer. Nos travaux précédents, ainsi que ceux d’autres groupes, ont démontré que l’immunité mise en place spécifiquement dans l’intestin, jouait un rôle déterminant dans le devenir des tumeurs aussi bien localement dans le colon qu’à distance, dans les métastases hépatiques ou dans d’autres localisations métastatiques. La réponse immunitaire, développée localement dans l’intestin, est très particulière et comprend notamment des lymphocytes intestinaux spécifiques (cellules immunitaires « tueuses » de tumeurs), qui ont des propriétés et des caractéristiques différentes des lymphocytes localisés dans les autres organes. Dans les modèles murins, ces lymphocytes intestinaux spécifiques ont la capacité, après avoir été activés par les tumeurs de colon, de sortir de l’intestin, migrer dans l’organisme et aller infiltrer et éliminer des tumeurs « extra-intestinales » localisées par exemple dans le foie ou sous la peau. Ainsi, pour étudier ces lymphoyctes intestinaux spécifiques, leurs voies d’activation dans l’intestin, leurs « super-propriétés » anti-tumorales, leurs migrations dans l’organisme, nous devons reproduire la maladie dans sa complexité multi-tumorale chez l’animal, avec des tumeurs primitives localisées dans l’intestin (dans le colon) et des métastases à distance. A terme, étudier ces cellules « tueuses » de l’intestin, nous permettra d’exploiter i) leur potentiel à représenter chez le patient un marqueur biologique (biomarqueur) traduisant la réponse aux thérapies ou ii) leur potentiel à représenter une cible thérapeutique, par exemple pour le développement d’un vaccin.

Bénéfices attendus

Dans le but d’améliorer la prise en charge des patients souffrant de cancer colorectal métastatique, nous utilisons dans ce projet des modèles précliniques afin d’étudier en détail les lymphocytes intestinaux spécifiques "cellules immunitaires tueuses de tumeurs" chez la souris. Nous avons montré que ces cellules sont particulièrement performantes pour éliminer les tumeurs primitives de colon mais aussi leurs métastases (tumeurs secondaires à distance). Nous avons récemment publié des travaux scientifiques dans lesquels nous avions déjà utilisé ces modèles précliniques, ainsi que des cohortes de patients. Nous avons également breveté l’énorme potentiel clinique derrière l’exploitation de ces cellules antitumorales mais beaucoup reste à faire et plusieurs bénéfices sur la prise en charge des patients peuvent decouler de notre projet. Nous pensons que ces lymphocytes spécifiques, provenant de l’intestin, pourraient être augmentés dans la circulation sanguine lors d’un cancer colorectal métastatique, chez les patients avec un bon pronostic. Ainsi, ces cellules pourraient être utilisées comme biomarqueur d’une bonne réponse des patients aux immunothérapies. De plus, nous pensons que ces cellules intestinales ont des meilleures capacités anti-tumorales comparées à des lymphocytes non intestinaux. Il serait potentiellement possible, à l’avenir, de les exploiter pour le développement de vaccins anti-cancer colorectal métastatique chez la souris, puis chez l’homme.

Procédures

Les animaux sont soumis à: 1) des procédures d'implantation de cellules tumorales par voie sous-cutanée mais aussi par chirurgie au niveau du colon et du foie (1 seule fois par animal et dure 5 min par animal) 2) des procédures d'injection intra-péritonéale d’anesthésiant (1 fois à l'implantation du cancer, 2 min par animal), de substrat ( 12 fois par animal, sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal à chaque mesure lors du suivi d’imagerie), de traitements (3 fois par animal, elle dure 2 min par animal) 3) une procédure d'administration sous-cutanée de vaccin (2 fois par animal, elle prendra 5 min par animal) 4) un prélèvement sanguin dans la veine maxillaire qui dure 2 minutes par animal 5) des prélèvements de fécès sur animal vigile, 6 fois max par animal, qui dure entre 5 sec et 2 min. L’anesthésie par voie gaseuse sera effectuée 13 fois par animal (12 fois pour le suivi biolum, 1 fois pour l’euthanasie).

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort. Des mesures seront effectuées, des tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés post-mortem. Ces organes comprennent: tumeurs, sang, organes lymphoides secondaires (ganglions lymphatiques, rate), organes sains en bordure de tumeurs (poumons, muqueuse orale, peau). Ces organes ainsi que les cellules immunitaires extraites seront analysés par des approches de protéomique et de transcriptomique.

Remplacement

Notre projet a pour but de comprendre comment l’immunité localement développée dans l’intestin, en particulier par des tumeurs intestinales lors d’un cancer colorectal métastatique, peut impacter l’organisme entier. Pour cela, nous avons absolument besoin d’utiliser un organisme entier, afin d’explorer une immunité locale, intégrant tous les composants cellulaires et la complexité de tumeurs localisées dans le colon et dans d’autres organes (le foie, la peau). Les tumeurs doivent se développer dans leur organe d’origine, afin de développer une architecture, une vascularisation, un réseau cellulaire au plus proche de la réalité d’un organisme. Par ailleurs, nous travaillons sur la migration des cellules immunitaires entre les orgranes ou entre les tumeurs (du colon vers le foie, du colon vers la peau). Pour cela, nous devons travailler sur un système vasculaire et lymphatique complet, tel que l’on peut retrouver uniquement dans un organisme entier. Les études déjà réalisées ex vivo ou in vitro (par exemple dans des organoïdes ou des flasques de culture) ne permettent pas de conserver et reconstituer le microenvironnement des tumeurs et de reproduire sa constitution globale, son évolution complète, sa vascularisation et ainsi que le réseau vasculaire élaboré reliant plusieurs tumeurs dans l’organisme, tels qu’ils ont lieu in vivo. Ainsi, nous ne pouvons pas Remplacer le modèle animal in vivo.

Réduction

Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous limitons nos expériences au nombre de 2 (et non 3 comme classiquement fait dans la littérature) car au vu du nombre d’animaux inclus dans chaque groupe, cela suffit pour obtenir des statistiques solides sur nos expériences. Nous concevons également nos expériences afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, en prélevant en fin d’expérience un nombre important d’organes et de compartiments chez l’animal, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Toutes les mises au point sur l’utilisation de ces modèles précliniques ont déjà été validée dans nos précédentes études, de façon la plus rigoureuse et solide possible (dose de cellules à implanter, fenêtre de traitements et de prélèvements). Ainsi, nos protocoles expérimentaux sont verouillés et suivis à la lettre, afin que chaque expérience réalisée dans ce projet soit reproductible et comparables aux autres et que des animaux ne soient pas injectés en vain.

Raffinement

Pour optimiser le Raffinement, notre long recul (>18 ans) sur ces modèles permettra d'évaluer précisément l’apparition de souffrance. Moins de 15% des animaux développeront un cancer au delà du 14eme jour. Un suivi quotidien permettra d’anticiper et d'euthanasier immédiatement les animaux en cas d’apparition de douleur ou de stress. Aucun animal ne sera maintenu en souffrance, ils seront euthanasiés en anticipation du point limite. Toutes les procédures seront réalisées sous narcolepsie. Notre expérience nous permet de réaliser des gestes rapides et précis pour les implantations, diminuant ainsi le temps de manipulation des animaux. Pour les chirurgies, les animaux seront sous analgésie et co-analgésique myorelaxant. Les animaux seront opérés sur des tapis chauffants, jusqu’à leur réveil pour éviter l’hypothermie. Le risque d’hypoventilation sera diminué par oxygénation des animaux opérés. Du gel occulaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. De plus, lors des chirurgies, nous veillerons à bien refermer la membrane péritonéale et la peau séparément afin de ne pas entrainer des adhérences et réduire la douleur post-opératoire. Après intervention, les animaux seront remis en cages, sous surveillance, et les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien vigiles, afin d’éviter que la ventilation du rack ne provoque une hypothermie chez les souris. En général, aucun signe de souffrance des animaux n 'est observé dans les jours qui suivent les implantations de tumeurs. Cependant, si des signes de douleur ou stress venaient à apparaitre rapidement en post-opératoire (4 ou 5 jours), cela serait exceptionnel et inhabituel et la décision d’euthanasier les animaux serait immédiatement prise. Cela conduirait à l'exclusion de ces animaux de nos expériences. Les conditions d’hébergement suivront les recommandations de la directive européenne en vigueur. Les souris recevront une alimentation enrichie ainsi que des granulés alimentaires déposés dans les cages afin de limiter le redressement pour se nourrir. Du papier absorbant, des lanières de papier kraft, des rouleaux de carton seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, réduire l’ennui, et leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. Ces produits d'enrichissement contribuent à diminuer le stress et facilitent la thermorégulation des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées dans le domaine de l’onco-immunologie car: -d’apres la litérature scientifique, le système immunitaire murin, proche de celui de l’Homme est pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo. -la biodisponibilité. Les souris adultes seront utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.

Douze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, en deux séries de six réparties sur deux heures et espacées d'une semaine : 1 019 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit aussi une chirurgie sous anesthésie pour injecter des composés dans le cerveau, jusqu'à seize jours d'isolement en cage individuelle pour la mesure du métabolisme, et jusqu'à douze séances d'imagerie. L'objectif déclaré est de relier dérèglement métabolique et neurodégénérescence chez des souris porteuses de mutations liées à la maladie d'Alzheimer, l'une des lignées développant en outre des troubles musculaires ou une paralysie à partir de neuf mois. Le porteur retient la souris parce que la régulation métabolique y serait proche de celle de l'humain et que les modèles existants ont été construits sur cette espèce, tout en annonçant que la méthode d'imagerie validée ici "pourra réduire significativement le nombre d'animaux" plus tard.

Objectifs

Les maladies liées à l'âge constituent l'un des principaux défis des sociétés modernes, à mesure que l'espérance de vie augmente. C’est notamment le cas des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, la plus répandue dans le monde. Malgré des avancées importantes, les mécanismes pathologiques de la maladie d’Alzheimer restent mal compris et les options thérapeutiques insatisfaisantes. De nombreux éléments suggèrent que la maladie d’Alzheimer n'est pas seulement caractérisée par un dysfonctionnement neurologique mais également par des troubles métaboliques. Un dysfonctionnement métabolique est un trouble du corps qui perturbe la manière dont il transforme les aliments en énergie, pouvant mener à des maladies telles que le diabète ou l'obésité. Ce projet vise à comprendre comment la dérégulation du métabolisme est liée aux maladies neurodégénératives. Pour atteindre cet objectif, nous allons caractériser l'impact du dysfonctionnement métabolique sur la progression de la neurodégénérescence chez des modèles animaux de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Nous étudierons également la régulation du métabolisme au cours de la progression de la neurodégénérescence chez ces modèles. Afin de prendre en compte des facteurs liés au sexe et au stade de développement de la maladie, l’étude sera menée sur des mâles et des femelles, et sur des groupes ayant deux âges différents. Enfin, nous proposons de valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la maladie par imagerie. Le projet se déroulera dans 2 Établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre l’implication du contrôle métabolique sur les mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence et vice-versa. À plus longue-terme, nous espérons que ces connaissances aideront à révéler de nouvelles perspectives thérapeutiques, ciblé sur l’amélioration de la fonction métabolique, pour prévenir ou ralentir le déclin cognitif liée à la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurodégénératives. Enfin, nous espérons valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la neurodégénérescence par imagerie, ce qui pourra réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la recherche préclinique à l’avenir.

Procédures

- Chirurgie sous anesthésie générale et analgésie afin d’injecter des composés dans le cerveaux (durée: 20 minutes) - Détermination du poids, da composition corporelle et de la fonction métabolique sur souris vigile (durée : 4 jours). - Isolement des souris pour l’étude individuelle de la fonction métabolique (durée: 12 a 16 jours). - injection péritonéale sur la souris vigile (1-3 injections par souris ; durée : 30 secondes). - Prélèvement de sang sur animaux vigiles, par incision du bout de la queue. Fréquence : 12 fois par souris, reparti en 6 fois à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h ; et 6 fois une semaine après, à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h. - Imagerie de la souris sous anesthésie générale (4-12 fois par souris, 1 fois / semaine sur 1 ou 3 mois; durée : 3 minutes). L’étape de chirurgie se déroulera dans l’établissement EU1 puis, les analyses de la fonction métabolique et l’imagerie se feront dans l’établissement EU2. Les deux établissements sont attenants.

Impact sur les animaux

- Douleur locale transitoire après injection et en post-opératoire ; - Après la chirurgie, il est possible que certains animaux développent une infection, présentent des problèmes de cicatrisation, ainsi qu'une perte de poids ou du stress. - le transport des animaux du fournisseur vers l’animalerie et d’une animalerie à l’autre peut induire du stress. - Stress ou anxiété à cause de l’isolement pour la mesure de la fonction métabolique chez les souris en isolement - Certains animaux plus âgés (à partir de 9 mois) appartenant à l'une des lignées de souris utilisées peuvent développer des problèmes musculaires ou une paralysie, caractéristiques de cette lignée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (cerveau, muscle, tissu gras, foie) pour analyse des molécules clés dans la régulation du métabolisme et des protéines pathologiques liées au processus de neurodégénérescence.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique. Des expériences sur cellules ont déjà été réalisées et ont validé notre hippothèse sur l’effet inhibiteur des facteurs pathologiques sur la fonction métabolique et sur l’activité des cellules neuronales. Pour continuer notre étude, nous avons maintenant besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée du métabolisme en lien avec la progression des maladies neurodégénératives. Cela ne peut se faire que sur l’animal vigile. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques et des maladies neurodégénératives, car les modèles utilisés ont été générés chez la souris.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Les mesures de la fonction métabolique et d’imagerie de bioluminescence sont effectuées sur plusieurs jours sur le même animal, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Plusieurs mesures spécifiques seront prises pour minimiser les nuisances causées aux animaux, telles que : - anesthésie et analgésie pour limiter la douleur; - des mesures spécifiques pour éviter l'hypothermie; - des mesures spécifiques pour diminuer le stress et l’angoisse des souris pendant le transport des animaux entre les deux établissements; - les animaux sont hébergés groupés (sauf si une nécessité d’individualisation se présente), dans un milieu avec enrichissement approprié, et avec de la nourriture et d'eau ad-libitum; - Tout au long de la procédure, les souris seront observées quotidiennement conjointement par les soigneurs et/ou les expérimentateurs; - application de points limites stricts et spécifiques au projet; - Ce projet privilégie les techniques non invasives d'analyse métabolique globale et d'imagerie.

Choix des espèces

L’espèce Mus Musculus a été choisie car plusieurs modèles de souris présentant des caractéristiques similaires à celles des patients atteints de maladies neurodégénératives ont été développés et validés. De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude de la fonction métabolique car la régulation métabolique est similaire entre la souris et l’homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes (dans le contexte des maladies métaboliques et neurodégénératives) sur la souris est un atout majeur dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, lorsque leurs comportements alimentaires et locomoteurs, ainsi que leur masse, sont stables. Les souris seront utilisées à l’âge de 3, 6 et jusqu’à 9 mois. Ce choix se justifie par le fait qu’à l’âge de 3 mois les souris transgéniques sont à un stade précoce de la maladie, tandis que à 6 mois et 9 mois les troubles de mémoire et d’apprentissage sont bien documenté dans la littérature.

720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant repasser la même batterie de tests jusqu'à trois fois au cours de sa vie. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale tous les trois jours pendant douze semaines, des prises de sang à la queue, des gavages au glucose, et sont isolées 48 heures en cage de calorimétrie. S'y ajoutent une course sur tapis roulant et une suspension à une grille inversée, dont la durée dépend des capacités de chaque animal, jusqu'à quarante-cinq minutes pour la première et trente pour la seconde. Toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs tissus, au bénéfice de cibles thérapeutiques contre la fonte musculaire liée à l'âge que le porteur situe au conditionnel et à distance.

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous étudierons l'impact de la perte d'adipocytes chez la souris jeune et âgée (en utilisant une souris transgénique) afin d'étudier l’implication du tissu adipeux dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement et dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l'âge. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication de l'adipocyte dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du tissu adipeux ayant un impact délétère sur la physiologie musculaire, l’identification d’un pool de métabolites appartenant à l’axe tissu adipeux-muscle dérégulés avec l’âge devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter dans le contexte de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l’âge.

Procédures

Nos animaux recevront un traitement pharmacologique tous les 3 jours par injection intra-péritonéale (moins de 15 secondes par souris) pour une durée maximale de 12 semaines (EU1/2). Ces animaux pourront être soumis à des prises de sang à la veine de la queue (durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris) (EU1/2). Leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (isolement en cage individuelle pendant 48h) (EU2/2). Leur fonction musculaire pourra être évaluée à l'aide de différent tests non invasifs (mesure de l'équilibre (durée: 5 minutes maximum, répétée 2 fois avec 15 minutes de repos entre 2 essais ; analyse de leur démarche (durée approximative: 5 minutes), mesure de leur force musculaire (durée totale approximative: 5 minutes, 3 mesures consécutives séparées par 1 min de repos, expérience répétée une fois après 15 min de repos), test de suspension sur une grille inversée (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques secondes à 30 minutes), course sur tapis roulant (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques minutes à 45 minutes) (EU1/2). Des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pourront également être réalisés (prélèvements de sang pour la mesure de la glycémie à 8 temps donnés espacés de 15 minutes minimum (8 x 5 secondes) suite à un gavage au glucose (moins de 15 secondes par souris) ou une injection intra-péritonéale d'insuline (moins de 15 secondes par souris) (EU1/2). L'ensemble de ces tests pourront être répétés jusqu'à 3 fois dans la vie de l'animal, avec une période minimale de 4 semaines entre deux tests.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : 1. L’isolement des souris pour la calorimétrie indirecte (48h au total, acclimatation puis mesure) est une source de stress. Les animaux gardent toutefois un contact visuel avec leurs congénères dans les cages voisines et sont rapidement remis dans leur cage d’origine ; 2. stress au moment des manipulations pour les tests de caractérisation de la fonction musculaire et métabolique (habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux); 3. Des injections intra-péritonéales répétées peuvent induire une douleur au niveau du site d'injection (les sites d'injection seront changés à chaque intervention) 4. la mise à jeun des animaux représente une source de stress (le temps de jeûne sera limité à 6 heures). 5. les prises de sang à la queue sont source d'inconfort (prélèvement d'un volume restreint de sang).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Ce projet vise à démontrer l’existence d’une communication inter-organes via les métabolites entre le tissu adipeux (et plus particulièrement son type cellulaire majoritaire : l'adipocyte) et le muscle squelettique au cours du vieillissement. Bien que nos données préliminaires obtenues in vitro et les données bibliographiques actuelles suggèrent l’existence d’un tel axe, le démontrer nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier. En effet, notre objectif est d’étudier l’impact d’une manipulation de l'adipocyte à la fois sur les compartiments sanguin et musculaire. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques actuelles et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet. Compte tenu de la variabilité des capacités physiques et des paramètres métaboliques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 10 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Ce nombre d’animaux est classiquement utilisé dans la littérature pour réaliser ce type d'études, en particulier dans un contexte de vieillissement, où la variabilité inter-individuelle tend à augmenter avec l'âge. Dans un souci de réduction, le projet a été designé de façon à réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes d'animaux dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour l’analyse du métabolome (par spectrométrie de masse) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir leur stress et permettre aux animaux de faire un nid. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour les expériences de calorimétrie indirecte). Les cages seront passées en revue deux fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés au moins deux fois par semaine. Les tests fonctionnels seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux utilisés, afin de réduire le stress engendré et améliorer la reproductibilité des résultats. Lors du transport des animaux entre les établissements utilisateurs, l’enrichissement de leur cage sera multiplié afin de les occuper pendant le trajet (coton salivaire et bouts de bois à ronger en plus du matériel de nidification). Les animaux seront protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil ou des écarts de température. Leur exposition au bruit et aux vibrations sera limitée au maximum et les souris ne seront jamais transférées en présence d’espèces différentes – hors rongeurs – dans le même véhicule. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris de différents âges : 3-6 mois pour les souris « jeunes », 12-14 mois pour les souris adultes d'âge moyen et 18-24 mois pour les souris « âgées » afin de déterminer la contribution du tissu adipeux dans la régulation du métabolome circulant et la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques qui lui sont associés au cours du vieillissement.

720 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à trois fois la batterie complète de tests au cours de sa vie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le programme comprend une injection intrapéritonéale tous les trois jours pendant douze semaines, des prises de sang à la queue, 48 heures seule en cage de calorimétrie, une suspension à une grille retournée jusqu'à trente minutes, une course sur tapis roulant jusqu'à quarante-cinq minutes et huit prélèvements successifs pour les tests au glucose et à l'insuline. Certaines ont 18 à 24 mois, l'étude portant sur le vieillissement, et toutes sont tuées à la fin pour collecter leurs tissus. Le porteur attend de ce travail de futures cibles thérapeutiques contre la fonte musculaire liée à l'âge, quand les jeûnes, les isolements et les épreuves d'effort sont, eux, déjà programmés.

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous étudierons l'impact de la perte d'adipocytes chez la souris jeune et âgée (en utilisant une souris transgénique) afin d'étudier l’implication du tissu adipeux dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement et dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l'âge. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication de l'adipocyte dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du tissu adipeux ayant un impact délétère sur la physiologie musculaire, l’identification d’un pool de métabolites appartenant à l’axe tissu adipeux-muscle dérégulés avec l’âge devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter dans le contexte de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l’âge.

Procédures

Nos animaux recevront un traitement pharmacologique tous les 3 jours par injection intra-péritonéale (moins de 15 secondes par souris) pour une durée maximale de 12 semaines (EU1/2). Ces animaux pourront être soumis à des prises de sang à la veine de la queue (durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris) (EU1/2). Leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (isolement en cage individuelle pendant 48h) (EU2/2). Leur fonction musculaire pourra être évaluée à l'aide de différent tests non invasifs (mesure de l'équilibre (durée: 5 minutes maximum, répétée 2 fois avec 15 minutes de repos entre 2 essais ; analyse de leur démarche (durée approximative: 5 minutes), mesure de leur force musculaire (durée totale approximative: 5 minutes, 3 mesures consécutives séparées par 1 min de repos, expérience répétée une fois après 15 min de repos), test de suspension sur une grille inversée (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques secondes à 30 minutes), course sur tapis roulant (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques minutes à 45 minutes) (EU1/2). Des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pourront également être réalisés (prélèvements de sang pour la mesure de la glycémie à 8 temps donnés espacés de 15 minutes minimum (8 x 5 secondes) suite à un gavage au glucose (moins de 15 secondes par souris) ou une injection intra-péritonéale d'insuline (moins de 15 secondes par souris) (EU1/2). L'ensemble de ces tests pourront être répétés jusqu'à 3 fois dans la vie de l'animal, avec une période minimale de 4 semaines entre deux tests.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : 1. L’isolement des souris pour la calorimétrie indirecte (48h au total, acclimatation puis mesure) est une source de stress. Les animaux gardent toutefois un contact visuel avec leurs congénères dans les cages voisines et sont rapidement remis dans leur cage d’origine ; 2. stress au moment des manipulations pour les tests de caractérisation de la fonction musculaire et métabolique (habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux); 3. Des injections intra-péritonéales répétées peuvent induire une douleur au niveau du site d'injection (les sites d'injection seront changés à chaque intervention) 4. la mise à jeun des animaux représente une source de stress (le temps de jeûne sera limité à 6 heures). 5. les prises de sang à la queue sont source d'inconfort (prélèvement d'un volume restreint de sang).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Ce projet vise à démontrer l’existence d’une communication inter-organes via les métabolites entre le tissu adipeux (et plus particulièrement son type cellulaire majoritaire: l'adipocyte) et le muscle squelettique au cours du vieillissement. Bien que nos données préliminaires obtenues in vitro et les données bibliographiques actuelles suggèrent l’existence d’un tel axe, le démontrer nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier. En effet, notre objectif est d’étudier l’impact d’une manipulation de l'adipocyte à la fois sur les compartiments sanguin et musculaire. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques actuelles et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet. Compte tenu de la variabilité des capacités physiques et des paramètres métaboliques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 10 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Ce nombre d’animaux est classiquement utilisé dans la littérature pour réaliser ce type d'études, en particulier dans un contexte de vieillissement, où la variabilité inter-individuelle tend à augmenter avec l'âge. Dans un souci de réduction, le projet a été designé de façon à réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes d'animaux dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour l’analyse du métabolome (par spectrométrie de masse) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir leur stress et permettre aux animaux de faire un nid. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour les expériences de calorimétrie indirecte). Les cages seront passées en revue deux fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés au moins deux fois par semaine. Les tests fonctionnels seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux utilisés, afin de réduire le stress engendré et améliorer la reproductibilité des résultats. Lors du transport des animaux entre les établissements utilisateurs, l’enrichissement de leur cage sera multiplié afin de les occuper pendant le trajet (coton salivaire et bouts de bois à ronger en plus du matériel de nidification). Les animaux seront protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil ou des écarts de température. Leur exposition au bruit et aux vibrations sera limitée au maximum et les souris ne seront jamais transférées en présence d’espèces différentes – hors rongeurs – dans le même véhicule. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris de différents âges : 3-6 mois pour les souris « jeunes », 12-14 mois pour les souris adultes d'âge moyen et 18-24 mois pour les souris « âgées » afin de déterminer la contribution du tissu adipeux dans la régulation du métabolome circulant et la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques qui lui sont associés au cours du vieillissement.

Injectées de cellules tumorales puis irradiées localement à faible dose sous anesthésie générale, 1 765 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour analyse des organes. Elles reçoivent jusqu'à cinq injections de traitement, deux gavages et une ponction sanguine. Le projet cherche à comprendre pourquoi seuls 10 à 30 % des patients répondent à l'association radiothérapie-immunothérapie, à partir d'une observation faite sur des malades dont l'intestin avait été irradié par erreur. Le porteur écrit que cette irradiation "n'induit pas de nuisance" et range la croissance des tumeurs greffées sous une "gêne locale modérée".

Objectifs

Les principales méthodes de traitement du cancer sont la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et l'immunothérapie. La radiothérapie tue les cellules cancéreuses en provoquant directement des dommages définitifs à l'ADN. Elle peut également déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale. La combinaison de la radiothérapie et de d'une immunothérapie pourrait donc avoir un effet antitumoral synergique. Cette nouvelle combinaison thérapeutique a d'abord été testée dans des modèles précliniques, puis validée dans quelques essais pionniers chez l'Homme avec des résultats prometteurs. Depuis, des centaines d'essais ont été lancés pour examiner cette combinaison thérapeutique dans divers cancers. Toutefois, il convient de noter que seuls 10 à 30 % des patients participant à ces essais ont présenté une réponse objective à ce traitement. Les mécanismes qui sous-tendent la résistance des patients au traitement restent insaisissables. De nouvelles stratégies sont nécessaires pour améliorer les résultats pour les patients. Nous avons mené un essai clinique de phase II pour évaluer l'efficacité thérapeutique d'un type de radiothérapie en combinaison avec l'immunothérapie dans le cancer métastatique. Le suivi à long terme suggère qu'environ 20 % des patients bénéficient du traitement avec une survie globale supérieure à 24 mois. L'objectif du projet est de tenter de déterminer les mécanismes de résistance mis en cause et d'améliorer la proportion de patients répondant bien au traitement.

Bénéfices attendus

L'étude de l'ADN des échantillons fécaux des patients traités indique que les répondeurs sont associés à un enrichissement de l'abondance des espèces bactériennes immunogènes. En outre, la moitié des patients recrutés dans cet essai ont subi une exposition hors cible de la zone intestinale à l'irradiation lorsque l'irradiation a été administrée à des métastases hépatiques. Il est frappant de constater que le nombre de patients ayant une survie à long terme est plus élevé dans le sous-groupe des patients ayant subi une irradiation non voulue que dans le sous-groupe des patients n'en ayant pas subi (38 % contre 5). Notre hypothèse est que cette irradiation pourrait stimuler la réponse des patients à l'immunothérapie en modulant la composition du microbiote intestinal. L'étude de cette irradiation pourrait fournir des indications importantes sur le traitement personnalisé du cancer et ouvrir la voie à de nouvelles thérapies. Nous nous attendons à trouver que la combinaison de cette irradiation et une immunothérapie conduisent à un effet synergique sur le contrôle de la tumeur. Cette étude fournira donc des informations importantes sur le traitement individualisé du cancer pour les patients et aidera à développer de nouvelles thérapies pour améliorer leurs résultats.

Procédures

Nous prélèverons le sang des souris par ponction (1 fois) sous anesthésie générale, durée une minute. Les souris recevront également une injection de cellules tumorales (1 fois, durée une minute), les souris recevront jusqu'à 5 injections pour traitement (durée 1 minute), sous anesthésie locale. Certains animaux auront des administrations par gavage (n=2), durée 1 minute. Les souris recevront une irradiation localisée sous anesthésie générale (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans certaines procédures les souris seront irradiées localement à faible dose. L'irradation limitée et localisée n'induit pas de nuisance. L'implantation tumorale (1 fois) par injection sous anesthésie locale entraîne une douleur légère et transitoire. La croissance des tumeurs peut entraîner une gêne locale modérée. Les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable). Les administrations orales entraînent une contrainte transitoire légère de courte durée due à la préhension et au geste lui même.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Il n'y a pas de modèle de remplacement, car il est impossible de récapituler et reproduire toutes les interactions immunologiques dans l'organisme in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un cadre de cancer du colon, avec toutes les interactions nécessaires notamment les effets de l'irradiation sur la partie intestinale, impossible à reproduire in vitro. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet de l'administration orale d'un composé sur différents organes, sur l'expression de gènes et protéines mais surtout sur la migration de cellules immunitaires entre ces différents organes.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D Après un calcul de puissance, nous avons pu déterminer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux ont été préalablement définis. Au vu du nombre d'animaux utilisé par groupe, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés.Les concentrations de traitements ont déjà été établies par notre laboratoire et sont donc optimisés pour réduire au maximum les animaux en procédure.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis quotidiennement pour effectuer un examen clinique et observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement adéquat. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Les souris comme les humains font partie des Mammifères, ce qui les rend génétiquement proches de l’Homme. De plus, leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie étant plus petite, font d'elles de parfaits organismes-modèles. Les modèles tumoraux existants sont issus de lignées cellulaires murines et plus particulièrement avec un fond génétique utilisé. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, c'est à partir de cet âge, qu'elles sont catégorisées comme adulte et donc ayant un métabolisme fonctionnel et une immunité normale.