Oncologie
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Validation de la perforation des microaiguilles et de leur maintien sur le modèle de porc
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Valider un patch de micro-aiguilles avant le dépôt d'un dossier réglementaire et une mise sur le marché : deux porcs de 40 à 60 kg sont utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun est hébergé seul trois à quatre jours, puis anesthésié par injection intramusculaire et maintenu sous anesthésie gazeuse pendant environ quatre heures, le temps de dix applications de patchs de vingt-cinq minutes chacune. Les sites de pose sont ensuite prélevés, et le porteur indique préférer la mise à mort aux complications que causeraient de multiples plaies. Il décrit le marché visé, à la croisée de la dermatologie et de la thérapie photodynamique, et présente l'évaluation sur des animaux non-humains comme un "impératif réglementaire".
Objectifs
Les cancers de la peau dus à une exposition excessive au soleil sont en forte croissance : l'OMS en dénombre 2 à 3 millions par an. Pour les traiter, il faut parfois recourir à une ablation localisée. C'est pour éviter ce geste que la thérapie photodynamique (PDT) est née. On applique sur la peau une crème dont le médicament, sous excitation lumineuse, attaque et détruit les cellules tumorales. Mais cette technique n'est pas efficace si la lésion est profonde, l’efficacité du traitement étant limité par pénétration modérée du médicament, ce qui empêche l'accès aux couches profondes de la peau. Rendent la PDT inadaptée au traitement de certains type de cancer de la peau dont les cellules tumorales se trouvent dans des couches de peau plus profondent. Pour pallier ce manque de pénétration des médicaments, un patch de micro-aiguilles a été developpé. Les micro-aguilles atteignent des couches plus pronfondent de la peau et permettent grâce au couplage avec un système d'illumination de traiter les lésions plus en profondeur. L'objectif du projet est donc de tester un dispositif médical intégrant : (i) un patch micro-aiguilles (MN) déjà approuvé pour des dispositifs médicaux implantés ; (ii) un composant optique pour l’irradiation avec un champ large (~ 2-3 cm2) de la peau et en profondeur ; (iii) un applicateur de patch de MN et un système de couplage entre le composant optique et le patch de MN. Le marché visé est à la croisée du marché des MN, qui se tourne aujourd’hui activement vers la dermatologie, et du marché de la PDT, à la recherche de dispositifs intégrés bas coût et simples d’utilisation pour se développer. Le projet lèvera notamment le verrou de l’intégration patch MN/composant optique, et permettra de fournir les éléments (sécurité dans le cas d’usage, processus de stérilisation, étude de biocompatibilité…) nécessaires à l’établissement du dossier réglementaire pour mener des études cliniques. Dans le cadre des tests décrits dans ce protocole, il s’agit de valider sur un modèle animal représentatif des tissus humains (1) la perforation des microaiguilles d’une part et (2) leur maintien in situ.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'obtenir des données fiables sur le fonctionnement du système de pose du dispositif et son maintien en conditions réelles d'utilisation. Il permettra de passer a l'étape supérieur afin de répondre au exigences réglementaire concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché, et ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits. Les données obtenues feront partie du dossier réglementaire pour passer aux essais cliniques. A terme cela permettra un meilleur traitement des cancers de la peau, plus aisé et rapide pour le praticien, et moins douloureux pour le patient.
Procédures
Les animaux seront hébergés individuellement pendant la période d'accclimatation pendant 3 à 4 jours. Ils seront anesthésiés pour réaliser l'application des dispositifs. Il s'agira d'une anesthésie chimique. L'injection sera réalisée dans le muscle et sa durée n'excédera pas quelques secondes. Les animaux seront maintenus anesthésiés par une anesthésie gazeuse pendant envirion 4H. Cette durée est estimée en fonction du nombre d'application du dispositif, soit 10 applications à raison de 25 minutes par application.
Impact sur les animaux
Les patchs micro-aiguilles ont déjà été approuvés pour des dispositifs médicaux implantés. Il n'y aura pas de molécules dans les patchs et un leurre du système PDT (photothérapie dynamique) sera utilisé en lieu et place du système réel. Par conséquent les effets néfastes attendus sur les animaux seront : - le stress engendré par l'hébergement individuel pendant l’acclimatation. - la douleur légère pendant l’induction de l’anesthésie. - les éventuelles réactions inflammatoire/irritation provoqués par les patchs.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude pour prélever les sites afin de réaliser des analyses. Les sites de prélèvement seront nombreux et localisés sur différents endroits par conséquent nous préférons l’euthanasie aux souffrances et éventuelles complications causées par les multiples plaies occasionnées.
Remplacement
L'évaluation in vivo des dispositifs médicaux sous leur forme finale est un impératif réglementaire. Si une partie de l'évaluation se fait lors des essais cliniques (chez l'Homme), ces essais cliniques doivent impérativement être précédés de tests chez l'animal afin de valider le fonctionnement des systèmes de pose en conditions réelles d'utilisation, la non dangerosité des dispositifs, et leurs performances. Ce projet est également nécessaire pour constituer le dossier réglementaire en vue de passer aux essais cliniques. De plus, certains tests, à l'image des tatouages encrés pour évaluer la profondeur de perforation des aiguilles, ne peuvent être reproduit sur les peaux artificielles.
Réduction
L'utilisation des animaux vivants ne survient qu'en fin de développement du dispositif, afin d'obtenir les données finales nécessaires pour permettre ensuite la mise en place d'essai cliniques, puis la mise sur le marché. De ce fait, le nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisemmant fiables sur le fonctionnement du système de pose du dispositif et son maintien en "conditions réelles". La possibilité d'appliquer plusieurs dispositif sur différents site sur un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés
Raffinement
Les deux animaux étant espacés de 3 semaines, ils seront hébergés individuellement avant le jour d'implantation des patchs. Pour palier cet isolement, ils seront placés dans une salle dans laquelle des porcs sont déjà présent et dans des boxes où ils peuvent se voir, se toucher au travers de barreaux. Ils disposeront d’un environnement confortable avec une litière propre, des jouets et ils seront régulièrement examinés et caressés voire brossés par les soigneurs. La durée de la période d'acclimatation de 7 jours habituellement sera réduite à 3-4 jours afin de réduire la l'impact de l’hébergement individuel sur les animaux. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Des points limites sufisamment prédictif sont mis en place et en cas d'atteinte de l'un d'eux sans qu'aucune action au préalable ne puisse permettre le retour à l'état basal de l'animal, alors le protocole sera interrompu et l'animal mise à mort selon les modalités éthique. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (Fréquence cardiaque, pression sanguine, température). La procédure est réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie chimique adaptée.
Choix des espèces
Le porc est l'espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l'homme ; notament dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/epiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude les effets attendus en clinique. Sa taille, plus importante permet également l'application de plus de dispositif chez un seul animal, permettant de réduire le nombre d'animaux utilisé. Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 40kg à 60kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.
Evaluation de molécules d’intérêt dans des modèles ectopiques chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 500
Greffés d'une tumeur sous la peau, dans la peau ou dans le coussinet graisseux mammaire, gavés jusqu'à cinq fois par jour et saignés jusqu'à quatre fois par jour à la veine saphène, 88 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme réduire le nombre de manipulations au strict nécessaire, dans un projet dimensionné pour environ 170 études par an pendant cinq ans, à la demande de clients. Les animaux dont la tumeur ne pousse pas sont utilisés pour entraîner le personnel au gavage et aux prélèvements sanguins, ou tués pour fournir des organes témoins. Ceux qui passent d'une procédure à la suivante sont tués à la fin de la seconde, les autres à la fin de la leur.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements dans des modèles ectopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses à un site ne correspondant pas à celui de la tumeur d’origine) chez la souris ou le rat pour les cancers dont les besoins sont non satisfaits. Ce projet comprend quatre procédures : -Développement de modèles ectopiques - Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie (PK/PD) d’une molécule d’intérêt chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de la tolérabilité d’une molécule d’intérêt après administration unique ou répétée chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de l’efficacité d’une molécule d’intérêt sur des modèles ectopiques chez le rongeur. La première étape qui permettra par la suite d’évaluer une nouvelle molécule d’intérêt thérapeutique est le développement de modèles ectopiques. La greffe sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour des cellules tumorales d’origine humaine (xénogreffe) ou sur des animaux immunocompétents de même espèce que la lignée tumorale (modèles syngéniques). En fonction des cellules injectées, les greffes seront réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire. Trois types d’études pourront ensuite être réalisées sur ces souris/rats porteurs de tumeurs décrites ci-dessous. L’évaluation de la PK/PD est réalisée en analysant les concentrations sanguines et/ou tissulaires d’un composé ainsi que les niveaux d’expression/activation de biomarqueurs associés après administration unique ou répétée du composé. Le modèle PK/PD établi est indispensable pour la détermination des doses et fréquence à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et il permet également de prédire les doses à administrer lors des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’Homme. L’évaluation de la tolérabilité d’un composé est réalisée à des doses thérapeutiques déterminées par des études de pharmacocinétique sur souris naïves et des études PK/PD effectuées en amont. Elle consiste en l’administration unique ou répétée d’un composé et à l’observation de signes cliniques des animaux pour déterminer la/les doses et/ou la fréquence d’administration qui pourront être utilisées dans les études consécutives.
Bénéfices attendus
A l’origine de plus de 10 millions de décès par an, le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Les principaux traitements aujourd’hui consistent en la chirurgie et la chimiothérapie, souvent associées à une radiothérapie. Malgré ces options thérapeutiques, le nombre important de décès par an souligne l’inefficacité de ces traitements et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans le domaine de l’oncologie. A long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. Dans le cas de l’utilisation d’un trocart, sous anesthésie gazeuse : durée 30 sec 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs : o Avec le pied à coulisse : durée 30 secondes 2 à 3 fois par semaine sur animaux vigiles. o Avec l’appareil de bioluminescence : durée 10 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour), intratumorale (1 injection/jour), ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irraidation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence o par voie intrapéritonéale (max3xsemaine) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine caudale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) o via amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l’extrémité non innervée de la queue) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).
Impact sur les animaux
Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront injectés avec des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (sévérité légère) et tatoués (sévérité légère). Certains modèles tumoraux peuvent nécroser, d’où l’intérêt de choisir un site d’injection de cellules tumorales adapté (voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire) grâce à la procédure de développement de modèles pour éviter ces nuisances aux animaux. Pour les procédures de PK/PD, de tolérabilité et d'efficacité, les animaux sont traités avec des molécules pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées notamment durant les études de tolérabilité (dose du composé importante) et d’efficacité (traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).
Devenir
Les animaux utilisés pour la procédure de développement de modèles peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou de tolérabilité puis seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de tolérabilité peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou d'efficacité et seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Pour les procédures de PK/PD et d'efficacité, ainsi que pour les animaux des procédures développement de modèles et de tolérabilité non-réutilisés, les animaux seront mis à mort à l’issue de leur procédure respective. Quelque soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …).
Remplacement
Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces modèles in vitro sont utilisés autant que possible en amont pour limiter le recours à l’animal. Cependant, ils ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.
Réduction
Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme) sans recours à l’animal. En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’études prévues pour ce projet se base sur l’analyse rétrospective des trois dernières années, nous estimons que pour les 5 ans de ce projet, 170 études environ seront conduites par an. Les données de mise en place des modèles obtenus dans la procédure développement de modèle" permettront de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de PK/PD, de tolérabilité ou d'efficacité. Une analyse de puissance statistique sera appliquée pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée. Les animaux qui sont exclus des études pour des raisons de taille tumorale trop petite ou trop grande sont toujours utilisés pour permettre d’avoir soit des tissus témoins pour la détermination du pourcentage de liaison aspécifique ou de la concentration des molécules d’intérêt dans les tumeurs. Si des tumeurs n’ont pas du tout poussé, les animaux pourront être utilisés pour des entraînements à différents gestes techniques tels que le gavage ou les prélèvements sanguins ou pour récupérer des matrices blanches (organes, sang, plasma). De plus les procédures sont interconnectées et les animaux peuvent être utilisés pour plusieurs procédures limitant de ce fait l’utilisation d’animaux. Les animaux de la procédure "développement de modèle" peuvent être inclus dans une procédure de PK/PD ou de tolérabilité. Les animaux inclus dans une procédure de tolérabilité pourront également être inclus dans une étude de PK/PD ou d’efficacité.
Raffinement
Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée des procédures. En cas d’apparition de signe de douleur, une injection unique en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Une fiche de suivi des signes cliniques sera mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées et d’appliquer des points d’arrêt anticipés les plus précoces possibles. Ainsi, à partir d’un total de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seront prises telles qu’aliment humide au sol ou ajout d’enrichissement, et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles ectopiques de cancer chez la souris et le rat existent dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références, etc…) Les données de la littérature indiquent clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine du cancer, nous utiliserons donc des animaux adultes.
Etude du rôle des communications inter-organelles (élément intra-cellulaires) dans la sensibilité du gliome à la chimiothérapie dans un model murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
380 souris immunodéficientes albinos vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de trente minutes leur greffe des cellules de glioblastome dans le cerveau, puis viennent jusqu'à 21 gavages, 21 injections intrapéritonéales ou 9 injections intraveineuses sur trois semaines, et quatre séances d'imagerie sous anesthésie. Elles devraient développer, comme les patients, des symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids. Le porteur reconnaît que des organoïdes remplacent une partie des études précliniques, avant de conclure que la greffe intracrânienne chez la souris reste seule capable de modéliser les interactions d'une tumeur avec son environnement.
Objectifs
L’organisation mondiale de santé classifie les cancers du cerveau (ou glioblastomes) comme des tumeurs très agressives. Ils sont caractérisés par une hétérogénéité (zones de mort cellulaire, prolifération, micro-vaisseaux sanguins) et une invasion importante du cerveau. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs se résume à un traitement chimio-thérapeutique concomitant à la radiothérapie. L’ablation partielle ou totale de la tumeur, lorsqu’elle est réalisable, demeure un élément déterminant de cette prise en charge et améliore la survie des patients. Toutefois, malgré la lourdeur des soins, la survie des patients est aujourd’hui évaluée à environ 18 mois.
Bénéfices attendus
Compte tenu de l’agressivité des cancers du cerveau, la recherche d’un nouveau traitement permettant de prolonger la survie des patients est une priorité. Ce projet se propose d’explorer l’intérêt du ciblage thérapeutique des communications se produisant dans la cellule tumorale, récemment identifiées comme des acteurs importants de la biologie de ces cancers. Ces travaux devraient donc fournir de nouvelles pistes thérapeutiques contre ces tumeurs.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie unique de 30 minutes maximum lors de la greffe des cellules tumorales dans le cerveau. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée en présence d’analgésie. Lors des traitements thérapeutiques (durée de trois semaines), certains animaux subiront des gavages (21 fois, 30 sec) ou des injections intrapéritonéales (21 fois, 30 sec) ou des injections intraveineuses (9 fois, 50 sec). Au cours de la mise en place du traitement thérapeutique, certains animaux recevront une anesthésie gazeuse une fois par semaine pendant un mois, pour la réalisation d’un suivi de croissance tumorale par imagerie (4 fois, 30 sec à 8 min). Ils recevront également une injection intrapéritonéale d’une molécule permettant le suivi en imagerie (4 fois, 30 sec).
Impact sur les animaux
Ces animaux développeront des tumeurs avec les nuisances liées aux cellules tumorales de cancer du cerveau qui auront été implantées dans le cerveau. Elles devraient développer comme chez l’homme des symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids. Lors des traitements (durant trois semaines), certains animaux subiront également des gavages ou injections abdominales ou intraveineuses répétées (1 fois par jour maximum, durant environ 30 secondes). Ces traitements pourraient entrainer un inconfort passager avec un stress modéré ou des inflammations.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, afin de collecter les cerveaux pour analyses.
Remplacement
L’existence de modèles cellulaires en 3 dimensions appelés organoïdes permettent de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant in vitro l’efficacité des drogues. Dans le cadre de notre projet, l’utilisation d’un modèle murin de greffe intracrânienne reste néanmoins le seul capable de modéliser finement les mécanismes et les interactions complexes qui prennent place dans une tumeur et son environnement biologique. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales in vitro seront testées in vivo.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé des guides statistiques et des résultats préalables détaillés dans la littérature. Grâce à ces approches, nous avons déterminé que des groupes expérimentaux composés de 10 animaux permettront d’obtenir des résultats statistiquement corrects qui ne compromettront pas l’interprétation de nos résultats. Dans le but de réduire le nombre d’animaux seules les combinaisons de traitements ayant montré des résultats convaincants avec la première lignée de glioblastome (cancer du cerveau) seront testées sur les lignées des autres sous types moléculaires. Cette démarche en plus de réduire le nombre d’animaux, favorisera également la significativité et le succès de l’étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel animalier et les personnes en charge de l’expérimentation afin de d’observer leur comportement, leur apparence et les signes cliniques et identifier ainsi tous signes révélateurs de souffrance. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect du bien-être animal et avec pour objectif de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. C’est pourquoi, avant toute chirurgie, les souris recevront des analgésiques et seront anesthésiées (anesthésie générale et locale), Pendant, la chirurgie les souris bénéficieront d’un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle, du gel sera appliqué sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. L’administration d’analgésiques sera poursuivie pendant 48h après la greffe. Pendant l’imagerie, les souris seront anesthésiées et déposées sur un plateau chauffant. Les animaux seront également suivis quotidiennement et l’atteinte d’un des points limites entraînera leur mise à mort.
Choix des espèces
Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés dans la communauté scientifique. Dans ce contexte, les modèles de souris immunodéficientes permettront de greffer des cellules tumorales de glioblastomes (cancer du cerveau) de patients sans rejet. Le modèle de souris albinos facilitera notamment l’imagerie intracrânienne que nous souhaitons réaliser pour étudier l’évolution des tumeurs en réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, car les lignées cellulaires de glioblastome ont été obtenues à partir de tumeurs chez l’adulte.
Diversité sensorielle et conséquences sur le comportement, la cognition et la neurobiologie du rat
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
96 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun passant 41 jours en cage individuelle et quatre heures par jour sans accès à la nourriture. Ils sont pesés neuf fois, observés chaque jour, et soumis à des tests de dix minutes portant sur la réactivité émotionnelle en environnement nouveau, la reconnaissance d'objets et la mémoire. Le projet évalue si varier les odeurs de leur cage et de leur aliment change leur comportement, leur cognition et leur neurobiologie. Le porteur annonce des retombées pour les élevages de rongeurs puis, plus loin, pour les bovins et les ovins, alors que les rats sont isolés puis tués pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Les rats sont des animaux qui utilisent énormément leur odorat. Pourtant, ils sont le plus souvent élevés dans des cages monotones et peu variés d'un point de vue des stimulations olfactives. Si on considère plus particulièrement leur alimentation, ils sont le plus souvent nourris avec un seul aliment complet, sous forme de granulés ou de poudre, ce qui correspond à un environnement alimentaire monotone (même aliment tous les jours) et sans variété (un seul aliment complet offert). Les rats sont pourtant des animaux omnivores opportunistes et leur comportement alimentaire naturel incorpore divers types d'aliments, variant dans le temps et l'espace. Ainsi, dans la nature, les rats passent une grande partie de leur temps à rechercher des aliments, en utilisant leur odorat. L'objectif de ce projet est de proposer une diversité sensorielle dans l'environnement des rats (sur l'aliment ou dans la cage) et d'en évaluer les conséquences comportementales (comportement alimentaire, comportement d'exploration olfactive, réactivité émotionnelle), cognitives (mémoire, reconnaissance d’objets) et neurobiologiques (notamment système de la récompense).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure connaissance des réponses comportementales et neurobiologiques des animaux se voyant proposer une diversité sensorielle dans un milieu d'élevage classiquement monotone. Il s'agit d'acquérir des connaissances fondamentales qui pourront être appliquées dans les élevages de rongeurs, et être potentiellement transposées à des animaux d'intérêt agronomique (bovins, ovins, ...).
Procédures
Tous les animaux sont soumis à des observations comportementales quotidiennes dans leur milieu de vie. Ils sont tous soumis à des pesées hebdomadaires (9 pesées par animal au total ; durée maximale de la pesée = 1 min ; durée maximale des manipulations pour la pesée, incluant la pesée = 3 min). Tous les animaux sont soumis à des tests comportementaux individuels visant à évaluer leur réactivité émotionnelle face à un environnement nouveau (une seule fois, 10 min), leurs apprentissages pour des objets nouveaux dans un environnement familier (une seule fois, 10 min), leur mémoire dans un environnement familier (une seule fois, 10 min), ainsi qu'un aliment odorisé nouveau dans leur cage de vie (deux fois, 1h - 30 min).
Impact sur les animaux
Les animaux rencontreront des situations pouvant être perçues comme stressantes au cours de ce projet, notamment : - Ce projet implique une légère restriction alimentaire (4h/j). Avant d'être habitués à ce rythme d'alimentation, les animaux peuvent ressentir une légère faim et/ou une frustration modérée. - Le suivi des consommations alimentaires à l'échelle individuelle implique une vie en cage individuelle, impliquant un isolement social partiel (j11-j52) pouvant impacter négativement et modérément le bien-être de l'animal. - Certains tests comportementaux sont mis en place pour évaluer la réactivité émotionnelle des animaux ; ils induisent donc un stress modéré. - Les pesées hebdomadaires nécessitent une manipulation douce de l'animal et le passage dans une cage de pesée (litière propre) sur une courte durée (
Devenir
Les animaux sont tous euthanasiés pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Le rat est le modèle d'intérêt de cette problématique scientifique, cherchant à étudier l’influence d’une diversité sensorielle sur ses comportements alimentaires, sa cognition et sa neurobiologie, il ne peut donc pas être remplacé.
Réduction
Aux vues des variabilités inter-individuelles généralement observées dans le cas de mesures comportementales et d'analyses des structures et stimulations cérébrales, un effectif de 16 individus par groupe et par sexe (soit 96 animaux au total), divisé en deux sous-groupes pour les analyses des structures et stimulations cérébrales, est recommandé pour conduire cette expérimentation et permettre une analyse statistique fiable des données récoltées.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par la présence de bâtons de bois pouvant être grignotés, de matériel de nidification, d'objet à manipuler (boule à thé), et la présence de stimulations olfactives variées pour 2 groupes sur 3. Le raffinement des procédures expérimentales se traduit par la mise en place de phase d'acclimatation à l'environnement de vie, d'habituation aux procédures expérimentales, et de familiarisation progressive aux odeurs. La restriction alimentaire 4h/j est spécifiquement mise en place en fin de phase diurne, quand les animaux sont au repos et consomment pas (ou très peu) d'aliment pour réduire les effets négatifs potentiels. La période de vie en cage individuelle est réduite autant que possible au regard des objectifs scientifiques du projet. L'isolement social n'est pas total puisque des communications olfactives, visuelles et auditives sont possibles dans l'élevage. Une feuille de papier, type sopalin, est ajoutée en tant qu’enrichissement occupationnel, pouvant aussi servir de matériel de nidification, pendant les périodes d'isolement social partiel des animaux. De plus, lors de ces périodes, un enrichissement social est mis en place avec des animaux réunis en paires stables (toujours les mêmes animaux réunis ensemble), dans une cage d'hébergement standard dédiée, 1h/j, 6j/7. Lors du changement de litière dans les cages de vie, une partie du nid des animaux est transféré dans la nouvelle litière pour permettre une continuité olfactive et limiter le stress potentiellement induit par la modification sensorielle de leur environnement de vie.
Choix des espèces
Les rats représentent 8% des animaux utilisés à des fins scientifiques et ils sont élevés dans des conditions olfactives qui peuvent ne pas répondre à leurs besoins naturels et comportementaux. En effet, ce sont des animaux curieux, olfactifs, omnivores opportunistes qui sont pourtant élevés dans des environnements olfactifs et alimentaires plutôt monotones. La question de la diversité sensorielle et de son influence potentielle sur les comportements alimentaires, la cognition et la neurobiologie est donc tout à fait pertinente chez cette espèce. Les animaux étudiés sont âgés de 4 semaines (stade juvénile) à 11 semaines (début de la phase adulte). Cette période correspond à une période de maturation du système olfactif chez les rats, ce qui rend donc cette période pertinente pour répondre à nos questions de recherches.
Evaluation de l’immunogénicité de deux paires de vecteurs lentiviraux d’intérêt immuno-oncothérapeutique dans le contexte d’une co-administration dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système urogénital
Des injections de quelques secondes, une mise à mort quatorze jours plus tard : les souris de ce projet reçoivent des vecteurs lentiviraux candidats vaccins contre des cancers du col de l'utérus, de la prostate et du sein. 204 animaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le décompte varie à l'intérieur du même résumé, qui annonce ailleurs 228 souris immunisées au maximum, et le porteur affirme que "l'animal ne va pas souffrir" tout en prévoyant des mesures pour les poils hérissés et l'inactivité. Chaque souris est tuée pour le prélèvement de sa rate, où la réponse immunitaire sera analysée.
Objectifs
Le cancer est caractérisé par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement les lymphocytes T cytotoxiques, capables de lyser les cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des vecteurs lentiviraux ayant pour cible des antigènes tumoraux pertinents dans les cancers du col de l’utérus, de la prostate et du sein, pourrait être particulièrement efficace pour permettre l’activation des lymphocytes T spécifiques de ces antigènes et le contrôle immunitaire de la prolifération tumorale. L’objectif du présent projet est d’établir la preuve de concept préclinique de la co-administration de deux paires de ces vecteurs, sélectionnés en fonction du profil d’expression des antigènes par les tumeurs des patients. Ultimement, la co-administration des candidats immuno-thérapeutiques ayant une immunogénicité préservée sera proposée en vue d’un essai clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont la preuve du concept préclinique d'utilisation des paires vecteurs lentiviraux dans la vaccination thérapeutique contre le cancer du col de l’utérus ou de la prostate. Les vecteurs lentiviraux codant pour des antigènes pertinents se sont révélés sûrs et efficaces comme des candidats vaccins contre des flavivirus (ZIKA et Dengue), le SARS-CoV-2, Mycobacterium tuberculosis, d'autres agents pathologiques, ainsi que des tumeurs induites par des HPV. L’avantage à long terme du projet actuel sera l'utilisation de ces vecteurs immuno-oncothérapeutiques dans le contexte d’une co-administration en clinique.
Procédures
Dans deux procédures de sévérité légère, environ 228 souris au maximum seront immunisées avec des candidats vaccins (injections de quelques secondes), et mises à mort au bout de 14 jours afin d'analyser leur réponse immunitaire.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection des vecteurs, pendant une courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous avons besoin de prélever leur rate pour réaliser les expériences nécessaires.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats vaccins destinés à l’humain. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale et immuno-thérapeutique sur les animaux, car aucun modèle in vitro ne permet d’évaluer l’immunogénicité des vecteurs d’immunisation, car les mécanismes en jeu sont très multifactoriels et pas encore caractérisés de façon exhaustive.
Réduction
Des études précédentes ont permis d’optimiser le protocole de vaccination étudiée et de définir la cinétique de vaccination permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vaccins ont été préalablement validés par des études chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses contre des tumeurs pertinentes dans des modèles souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. L'objectif de ce projet est de vérifier l'absence de différence entre les groupes. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques. Le nombre de souris/groups expérimental a été de 6 dans chaque groupe expérimental, soit un total 204 souris.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de vecteurs lentiviraux n’induit aucun signe clinique chez les souris. L’animal ne va pas souffrir et l’injection sera faite en respectant les bonnes pratiques vétérinaires; matériel unique, peau désinfectée avant l’injection. Les animaux seront surveillés après l’injection. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés ou l’inactivité, plusieurs mesures seront prises, incluant surveillance renforcée, l’ajout de gel hydrique pour faciliter l’accès à l’hydratation, réhydratation sous cutanée ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose pour éviter l’irritation par les coupons de bois.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogéniques chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.
Transgénèse et transfert d’embryons pour la création de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Cent cinquante femelles subissent une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie gazeuse pour recevoir des embryons, trois injections sous-cutanées et la pose d'une agrafe sur le dos. Mille souris au pelage agouti sont ensuite anesthésiées pour qu'un bout de queue leur soit prélevé et qu'une boucle d'identification leur soit posée, l'ensemble représentant 1 150 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet est technique, il crée des lignées génétiquement modifiées pour des équipes travaillant sur les lymphocytes B et les lymphomes. Six cents animaux porteurs de la mutation recherchée partiront vers un autre projet autorisé, les 550 autres seront tués, dont les 150 femelles pseudo-gestantes une fois les portées nées et 400 souris qui n'ont pas la mutation attendue.
Objectifs
Ce projet technique de trangénèse permet de générer de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées pour différentes équipes de recherche dans le cadre d'études portant sur le contrôle de la réponse immune des lymphocytes B et du développement des lymphomes. Ces modèles in vivo sont indispensables pour une compréhension globale des systèmes complexes et multi-localisés tel que le système immunitaire. Les études in vitro utilisant des lignées cellulaires ou des études in silico ne peuvent pas remplacer l'animal pour ces études car elles ne permettent pas de retranscrire toutes les interactions existantes au sein du système immunitaire et entre le système immunitaire et d'autres systèmes physiologiques. Les modifications génétiques permettent de mieux comprendre le rôle d'un gène en particulier dans le développement normal et tumoral du système immunitaire B ce qui peut donner des pistes d'intervention thérapeutique innovante pour les lymphomes. Les souris sont utilisées pour ces études car leur génome (ensemble de leurs gènes) et leur système immunitaire est proche de celui de l'Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de créer de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées permettant ainsi aux chercheurs de l'unité d'obtenir un modèle d'étude pour mener à bien leur projet de recherche. La technique de transgénèse est essentielle au developpement de modèles murins génétiquement modifié car elle permet d'intègrer une modification génétique précise au sein d'un organisme possèdant un système immunitaire physiologique complet. La modification spécifique d'un géne cible permet d'analyser et de comprendre la physiopathologie de nombreuses maladies en lien avec le dysfonctionnement du système immunitaire et particulièrement les lymphomes ou les maladies de depôts. Ces modèles peuvent également, à terme, servir dans le devellopement d'essai préclinique.
Procédures
Au cours de ce projet, 150 femelles seront soumises à 1 chirurgie de réimplantion d'embryons sous anesthésie gazeuse lors du transfert d'embryon d'une durée de 15 minutes maximum et 3 injections sous-cutanées. 1000 souris au pelage marron devant être identifiés comme possèdant ou non la mutation seront anesthésiées afin qu'un petit morceau de queue leur soit prélevé et qu'une boucle d'identification leur soit mise.
Impact sur les animaux
La piqûre d'aiguille pour l'injection de l'anti-douleur aux femelles recevant les embryons entraine une douleur légère et de courte durée et un stress physique de courte duré. L'intervention chirurgicale des femelles recevant les embryons entraine un stress physique ainsi qu'une gêne liée à la présence de l'agrafe sur le dos. Le prélèvement de bout de queue des animaux entraine une douleur légère et de courte durée au niveau du site de prélèvement et un stress physique de courte duré.
Devenir
En fin de procédure "transfert d'embryons"sur 5 ans : aucun animal ne sera réutilisé, ni replacé. En fin de procédure "genotypage de souris au pelage agouti" sur 5 ans: 600 animaux possédant la mutation génique d'interêt seront placés en zone d'élevage et utilisés dans un autre projet APAFIS sous la responsabilité d'un autre porteur de projet. Pour ce projet, ce sont 550 animaux qui seront euthanasiés (150 femelles pseudo-gestantes aprés la naissances des animaux chimériques + 400 animaux pelage agouti ne possédant pas la mutation génique d'interêt)
Remplacement
Ce projet permet de générer de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées pour différentes équipes de recherche dans le cadre d'études portant sur le contrôle de la réponse immunitaire et le développement de lymphomes. Ces modèles in vivo sont indispensables pour une compréhension globale des systèmes complexes et multi-localisés tel que le système immunitaire. Les études in vitro utilisant des lignées cellulaires ne peuvent pas remplacer l'animal pour ces études car elles ne permettent pas de retranscrire toutes les interactions existantes au sein du système immunitaire et entre le système immunitaire et d'autres systèmes physiologiques.
Réduction
Les femelles utilisées pour la production d'embryons ne recevront pas de traitement de superovulation. En effet, la technique de micro-injection nécessite d'avoir un embryon resistant à la pression de la pipette de micro-injection. Or, aprés traitement hormonal, les embryons générés sont moins resistant à la pression ce qui rend plus diffcile la micro-injection. Le nombre de femelles utilisées sera donc limité au strict minimum nécessaire pour avoir suffisement d'embryons. Les femelles fertiles utilisées qui ne présentent pas de bouchon vaginal seront réutilisées pour une expérimentation ultérieure. Les accouplements de chimères seront arrétés dès que les premiers animaux agoutis positifs pour la mutation d'interêt seront génotypés. Ainsi, le nombre d'animal engendré est limité au strict minimum nécessaire pour générer les fondateurs de la nouvelle lignée. Le nombre d'animaux utilisé sera limité au strict minimum nécessaire pour mener à bien toutes les procèdures de la demande d'autorisation de projet.
Raffinement
Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum afin d'avoir suffisamment d'animaux pour les expérimentations. Les mâles seront hébergés deux par deux afin de limiter le nombre d'animal isolé. Le personnel menant à bien les expérimentations est formé aux gestes de manipulation sur le petit animal ainsi qu'aux techniques de chirurgie. Leurs compétences sont maintenus au cours du temps limitant ainsi la douleur liée à la manipulation et à l'expérimentation. Les animaux bénéficient d'enrichissement dans les cages conformes aux recomandations de la structure du bien être animal de l'établissement. Pour chaque expérimentation, des points limites spécifiques ont été définis et une prise en charge de la douleur est prévue avec un protocole utilisant des analgésiques afin de reduire la souffrance animal au cours du temps.
Choix des espèces
La modification du génome dans le cadre de recherches fondamentales visant à comprendre, dans sa globalité et sa complexité, le contrôle de la réponse immune et les lymphoproliférations ne peut s'effectuer que dans certaines espèces animales pour lesquelles les techniques de transgénèse ont été mises au point et ont fait leurs preuves. Les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas pour l'étude des systèmes complexes et multilocalisés tel que le système immunitaire. Les techniques de transgénèse sont très performantes dans l'espèce Mus musculus. Cette espèce possède un génome très proche de celui de l'Homme (99% d'homologie), ce qui en fait un outil idéal pour comprendre les effets de ces modifications génétiques sur les systèmes étudiés. Les systèmes immunitaires de l'Homme et de la souris sont très proches. Les animaux femelles utilisées, seront en âge de procréer (de 2 à 12 mois) que ce soit pour l'étape de production de blastocystes, l'étape de production de femelles pseudo-gestantes ou l'étape de transmission germinale des modifications génétiques. Pour l'étape de micro-injection de cellules ES modifiées dans des blastocystes, des embryons de 3,5 dpc (days post-coïtum) seront utilisés. Les animaux (mâles et femelles au pelage agoutti) seront génotypés au moment du sevrage soit aux alentours de 4 semaines.
Production d’anticorps chez le lapin
- Production de routine
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
La quantité d'anticorps commandée par le client détermine le nombre de lapins engagés dans chaque expérimentation, à raison de deux lapins par immunogène. 1 050 lapins vont être utilisés sur la durée du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour développer environ 500 anticorps destinés à la recherche. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt-cinq injections intraveineuses, quinze injections intramusculaires, huit injections sous-cutanées, trois injections intradermiques d'une vingtaine de points chacune et dix prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes sans animaux comme le phage display, affirme qu'elles "n'apportent pas la même qualité d'anticorps", et indique tuer les lapins en fin de projet pour obtenir "le maximum de sérum".
Objectifs
Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Les anticorps seront utilisés principalement dans la recherche académique. Environ 500 nouveaux anti-corps seront développés.
Bénéfices attendus
Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenu grâces aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement.
Procédures
- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 10 prélèvements. - Injection intraveineuse sur animaux vigile, environ 1 min, maximum 25 injections. - Injection en intradermique (une vingtaine de points environs par inejction), environ 3 minutes, maximum 3 injections. - Injection en sous cutané, environ 1 minutes, maximum 8 injections. - Injection en intramusculaire, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection en intraveineuse dans la veine marginale, environ 1 min, maximum 25 injections. -
Impact sur les animaux
La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. De par notre expérience Nous ne nous attendons pas à d’autres nuisances, mais nous resterons vigilants à tous effets imprévus
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.
Remplacement
Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent (type phage display), ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. La qualité de la banque naïve utilisée et la méthode de screening de cette banque de phages display ne permet pas d’obtenir de anticorps d’affinité suffisante. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin ou la souris, ne sont pas encore complètement matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés. Les chances de succès sont limitées comme le démonter le nombre d’anticorps en clinque issue de phage display qui reste marginal. Enfin l’obtention d’anticorps polyclonaux ne peux pas être remplacée par un mélange d’anticorps monoclonaux. Cette approche des anticorps multi clonaux ne permets pas non plus d’obtenir la même efficacité.
Réduction
Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, mais est déterminé par la quantité d’anticorps attendue par le client. Nous obtenons environ 50 à 60ml de sérum au minimum par lapin, la majorité des projets nécessite plus 100ml. En effet, l’immuno purification par chromatographie d’affinité de ces sérums requiert un volume suffisamment pour obtenir quelques milligrammes d’anticorps c’est pourquoi nous utiliserons 2 lapins par immunogènes.
Raffinement
Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.
Choix des espèces
Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum) car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.
La metformine peut elle promouvoir B. faecichinchillae, espèce commensale du microbiote intestinal humain possèdant des propriétés anti-diabétiques équivalentes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Un gavage orogastrique quotidien de metformine, un prélèvement de selles par semaine et trois minutes de contention dans un tube de PVC pour mesurer la composition corporelle : 192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont nés sans flore intestinale, puis colonisés par gavage avec le microbiote fécal d'un donneur humain volontaire. L'enjeu déclaré est de savoir si la metformine favorise une bactérie intestinale aux propriétés antidiabétiques, qui pourrait ensuite être proposée comme probiotique. Le porteur écarte l'anesthésie pendant les gavages pour éviter les fausses routes, et écarte les antalgiques au motif qu'ils modifieraient les métabolismes étudiés.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si la metformine, traitement thérapeutique du diabète de type II, peut promouvoir la population bactérienne d'intérêt, Bacteroides Faecichinchillae, possédant également des propriétés anti-diabétiques, dont les effets sur la santé seront évalués, en particulier au niveau tissulaire.
Bénéfices attendus
Si le traitement à la metformine permet de promouvoir l’espèce commensale d’intérêt, B. faecichinchillaeae, l’utilisation de cette bactérie sera proposée comme probiotique chez l’homme soit en remplacement de la metformine soit en association avec la metformine. L’administration de la souche permettrait en effet de limiter les effets secondaires observés chez l’homme suite à la prise de ce médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, et enfin 3) une supplémentation quotidienne de Metformine par un gavage oro gastrique (200mg/kg de poids corporel) pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de projet des volontaires sains, aucun effet indésirable n'a été constaté lors du developpement et de l'utilisation de ce modèle, l'alimentation est, de plus, adaptée et n'entraine donc pas de troubles digestifs ou de croissance. Plus de 60 ans d'utilisation de la metformine en santé humaine ont démontré l'efficacité et l'inocuité de ce médicament, toutefois, selon les doses prescrites, des effets secondaires sont observés chez près de 25 % des patients en particuliers des intolérances gastrique et nausées. Si dans la bibliographie, ces symptômes ne sont pas mentionnés dans les éudes in vivo, une attention particulière sera, cependant, portée sur une apparition potentielle de ces symptômes lors de l'observation quotidienne des animaux. Le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’évaluation de l’impact de la metformine sur le microbiote nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ce produit sur le rôle de la paroi intestinale (perméabilité, immunité) et sur les métabolismes hépatiques (céramides, voies métaboliques de l'insuline, etc...) chez l’homme. De plus, ceci nécessite une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.
Raffinement
Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques ainsi que les prélèvements de selles. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvements de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. l'anesthésie ne sera pas utilisée, il est nécessaire que les animaux restent vigils pour éviter les fausses routes qui pourraient être provoquées par son absence de consience. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement. Pas d'utilisation d'antalgiques qui pourraient modifier les métabolismes ciblés dans le projet et rendent incomparables les résultats.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 10 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 10 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.
Etude de la libération pulsatile de l’hormone de croissance sur l’inflammation et la fibrose hépatique dans un modèle murin de glycogénose de type 1a
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour tester si le rétablissement du rythme naturel de sécrétion de l'hormone de croissance freine l'atteinte du foie, 48 souris rendues malades d'une glycogénose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. À sept jours de vie, un morceau de queue leur est prélevé pour le génotypage, puis viennent cinq jours d'injections, une chirurgie de trente minutes pour poser un cathéter dans la veine jugulaire et une pompe programmable, cinq jours de perfusion et un jeûne de six heures avant la mise à mort. La glycémie se mesure sur une goutte de sang obtenue en sectionnant l'extrémité de la queue, ce que le porteur décrit comme douloureux. Il indique que ces souris peuvent faire des hypoglycémies sévères avec un mal-être important, et que la gestion de l'élevage laisse subsister 1 à 2 % de décès, généralement la nuit.
Objectifs
Alors que le diabète se caractérise par trop de sucre (glucose ; hyperglycémies) dans le sang, la glycogénose de type 1 est une maladie métabolique rare qui entraine des hypoglycémies (baisse du glucose dans le sang) pouvant être fatales. Elle est due à des mutations génétiques d’une enzyme qui permet à l’organisme de produire du glucose en dehors des périodes de prise alimentaire, pour maintenir un taux de glucose sanguin stable (1g/L). Une prise en charge nutritionnelle est basée sur la consommation de sucres complexes comme la Maïzena et sur une prise alimentaire régulière y compris la nuit. Ces patients développent aussi un foie gras, et environ 80% de ces patients présentent des tumeurs du foie. Contrairement à ce qui est observé chez la plupart des diabétiques, la maladie hépatique ne progresse pas avec la même incidence entre les femmes et les hommes et n’évolue pas vers le stade de cirrhose. Grâce au développement d’un modèle de souris viables reproduisant toute la pathologie du foie de la glycogénose, il a été montré un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance. Cette hormone, produite par l’hypophyse, a la particularité d’être sécrétée différemment chez les mâles (de façon pulsatile) et les femelles (en continu à faible niveau), ce qui lui confère des effets sexe-dépendants sur un de ses organes cibles qu’est le foie. Cette pulsatilité de sécrétion est perdue chez les souris mâles atteints de glycogénose, ce qui pourrait expliquer l’évolution particulière de la maladie du foie dans cette maladie. Notre projet consiste à évaluer l’effet de la libération physiologique de l’hormone de croissance en rétablissant la pulsatilité de sécrétion de l’hormone de croissance chez des souris atteintes de glycogénose. Ceci sera réalisée grâce à une mini-pompe programmable délivrant l’hormone dans la circulation sanguine. L’importance de la pulsatilité sera évaluée par comparaison à des souris traitées avec une dose supra-physiologique quotidienne unique, qui reflète le mode de traitement administré chez l’homme. Le non-respect de la pulsatilité pourrait avoir un impact non négligeable sur l’évolution à long terme de la maladie hépatique de la glycogénose.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie hépatique associée à la glycogénose. A partir de nos données préliminaires démontrant un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance, nous avons émis l’hypothèse que le rétablissement de sa sécrétion à des rythmes physiologiques devrait permettre de retrouver un contexte hépatique similaire à ce qui est observé chez les patients diabétiques obèses qui présentent aussi un foie gras. Dans le cadre de la glycogénose, quelques rares données suggèrent des perturbations hormonales, en particulier une diminution de la sécrétion de l’hormone de croissance. Ceci explique les retards de croissance observés chez ces patients. Notre étude devrait mettre en évidence que ces perturbations hormonales ont un impact plus large, en particulier sur la progression de la maladie hépatique. Nos résultats pourraient être importants pour la prise en charge d’autres pathologies puisque la pulsatilité de la sécrétion de l’hormone de croissance n’est jamais prise en compte dans les traitements chez l’homme. Une délivrance plus physiologique de cette hormone pourrait éviter les effets secondaires liés à son injection chronique à des doses supra-physiologiques.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (1mm) de tissu sera prélevé à l’extrémité de la queue pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. A l’âge de 6-8 semaines, les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Environ 4 mois après le développement de la glycogénose, une partie des souris subira une chirurgie afin de poser un cathéter en veine jugulaire et une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. La chirurgie devrait durer au maximum 30 min. Après une période de récupération post-opératoire d’au moins 1 semaine, les souris seront perfusées soit avec une solution d’hormone de croissance, soit avec du sérum physiologique, de façon pulsatile (changement de débit toutes les 3h), pendant 5 jours. Un autre lot de souris subira 1 injection quotidienne d’hormone de croissance pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Un groupe de souris saines injectées avec du sérum physiologique constituera le groupe de référence (quelques secondes/souris) pendant 5 jours. En fin de protocole (5 jours après le début des traitements à l’hormone de croissance), les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Une mesure de glycémie sera réalisée à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue dès 2h30 de jeûne. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. Le prélèvement durera environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie de la queue afin de les génotyper. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. L’induction de la glycogénose sera obtenue après une série d’injections en sous-cutané pendant 5 jours, à l’âge de 6-8 semaines, pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Ces souris peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement. Dans ce cas, les souris présentent un mal-être important lié à l’hypoglycémie. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Les hypoglycémies peuvent être plus fréquentes lors de l’anesthésie et lors de la mise à jeun en fin de protocole. La glycémie sera mesurée à partir d’une goutte de sang obtenue après section de l’extrémité de la queue ce qui entraine de la douleur Au-delà de 15 mois de maladie, ces souris peuvent développer des tumeurs du foie. Dans ce projet, les souris seront mises à mort au plus tard 6 mois après l’induction de la maladie. Après 4 mois d’induction de la maladie, certaines souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter en veine jugulaire et d’une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. Le risque d’hémorragie lors de la chirurgie est très faible et la chirurgie est susceptible de provoquer de la douleur. Un autre lot de souris subira 1 injection/jour pendant 5 jours, ce qui peut induire une légère douleur. L’immobilisation de la souris pour ces injections ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et les testicules afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires
Remplacement
Même s’il est maintenant possible de produire des petits organes en culture qui intègrent les différents types de cellules du foie, la pathologie hépatique de la glycogénose met en jeu un dialogue complexe entre ces cellules du foie et les cellules du système immunitaires de la circulation sanguin ainsi que des régulations hormonales. Une étude préliminaire réalisée in vitro sur des cellules du foie de souris traitées avec de l’hormone de croissance de façon cyclique a permis de valider notre hypothèse de travail. Cependant, il est important maintenant de conserver la physiologie de l'organisme pour comprendre les mécanismes initiés par la pulsatilité de l’hormone de croissance sur le foie. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Dans le cadre de cette étude, l’hypothalamus, l’hypophyse, les testicules, le foie et le sang seront prélevés pour étudier en détail l’ensemble des régulations à l’échelle de l’organisme.
Réduction
-Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 10 souris maximum, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. -Dans le but de réduire le nombre d’animaux à produire, certains animaux sont des souris déjà utilisées dans un autre protocole, sans avoir subi de procédures sévères entrainant un mal-être ou une douleur importante. -Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera au maximum 48 souris, incluant l’obtention de 22 nouvelles souris transgéniques et de 26 souris « réutilisées ».
Raffinement
-La pathologie est induite uniquement dans le foie des souris à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères qui peuvent être fatales et de passer la période néonatale. -Contrôle des risques d’hypoglycémie en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes dans la cage et tétines de biberon longue). En cas d’hypoglycémie, une solution de sucre (glucose) sera administrée à la souris et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. Les animaux seront entraînés à recevoir du glucose à la pipette par voie orale avant l’induction de la maladie. -Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. -Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Elle sera réalisée dans des conditions d’asepsie afin d’éviter tout risque d’infection. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction et un tapis chauffant seront utilisés. La glycémie sera aussi contrôlée régulièrement afin d’intervenir au plus tôt pour administrer une solution de sucre. Enfin, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce permettant de garder les souris à thermoneutralité. Un suivi de poids hebdomadaire, puis quotidien pendant la période post-opératoire permettra d’identifier une perte de poids anormale de l’animal. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.
Choix des espèces
En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris transgéniques reproduit toute la pathologie humaine de la glycogénose, y compris le développement de tumeurs. Le protocole sera débuté chez des souris adultes âgées d’au minimum 6 à 8 semaines. L’induction de la glycogénose sera réalisée à l’âge adulte ce qui permet d’éviter l’apparition de retard de croissance dû à la maladie et de passer la période périnatale sans phénotype dommageable. Les perfusions seront réalisées 4 mois après le développement de la glycogénose. Seule la biopsie caudale pour génotypage sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7 jours.
Etude du rôle du système lymphatique dans la dissémination métastatique EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Modifiées pour suractiver leur système lymphatique, 430 souris femelles vont être utilisées à partir de cinq semaines, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections intrapéritonéales tous les deux jours pendant trois semaines, avant d'être transportées vers un second établissement où leur est infligée une perfusion intracardiaque sans réveil. Le porteur résume les atteintes en une phrase, des douleurs modérées et un léger stress liés au développement de la tumeur. La mise à mort sert à récolter les tissus, et le résumé revendique l'expérimentation animale comme "l'unique approche" pour comprendre ces processus.
Objectifs
Le système vasculaire lymphatique a pour but de drainer les graisses, les liquides interstitiels, les macromolécules et les cellules immunitaires afin de maintenir l'homéostasie tissulaire. En condition pathologique, il joue un rôle primordial dans le cancer. En effet, le système lymphatique est le premier site de dissémination métastatique des tumeurs solides, notamment au niveau des ganglions lymphatiques. La lymphangiogenèse, croissance de nouveaux vaisseaux lymphatiques à partir de vaisseaux préexistants, se développe à la fois sur le pourtour des tumeurs et dans le ganglion sentinelle afin de préparer la « niche métastatique ». Bien que ce processus ait été clairement démontré au cours des 20 dernières années, les mécanismes moléculaires restent encore à élucider. Dans ce projet, nous postulons que la croissance du système vasculaire lymphatique péritumoral est stimulée à la fois par la tumeur primaire, mais également par son microenvironement (tissu adipeux). Nous postulons qu’en ciblant le microenvironement tumoral, nous allons pouvoir réduire la lymphangiogenèse et inhibiter la formation de métastases. Afin d’identifier des cibles thérapeutiques anti-lymphangiogéniques, nous allons utiliser trois modèles murins de tumeurs solides ainsi qu’un modèle spontané de carcinome mammaire. D’autre part, des études récentes ont démontré que le système lymphatique participait activement à l’échappement des tumeurs face au système immunitaire en exprimant des récepteurs des points de contrôle immunitaires. Nous allons dans un deuxième temps évaluer les inhibiteurs des points de contrôle dans ces modèles.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle du système lymphatique dans la progression cancéreuse. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Nous espérons pouvoir identifier quels sont les points de contrôle immunitaires exprimés par le système lymphatique afin de proposer des agents anti-lymphangiogéniques en combinaison avec ces molécules.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, 2 interventions : injection de cellules tumorales en sous-cutané (une seule fois) suivi d'injections intraperitonéales tous les 2 jours pendant 3 semaines. Dans le second établissement utilisateur, 1 intervention : perfusion intracardiaque sans réveil.
Impact sur les animaux
Le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
Le système lymphatique joue un rôle primordial dans les communications inter-organes et dans l’homéostasie tissulaire. Les effets pléiotropiques de ce système font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l'expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est calculé à l'aide d'un logiciel dédié (G power). Le logiciel utilise un modèle mathématique pour déterminer le nombre d'animaux minimum pour avoir des résultats stastitiquement significatifs à l'aide d'un test two way ANOVA afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement. Nous nous tiendrons au nombre d'animaux par groupes indiqués par le logiciel. Ainsi, il est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car la suractivation du système lymphatique par expression du transgène Ap2-VEGFC a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des modèles de carcinomes murins (PyMT, LLC, B16). Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 26 semaines.
Caractérisation de lignées de rats portant des mutations dans le gène CLCN4
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
100 rats porteurs de mutations du gène CLCN4 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils passent une batterie de tests entre douze et vingt semaines d'âge, activité locomotrice et anxiété pendant trente minutes, coordination, force musculaire, comportement compulsif, apprentissage et mémoire sur huit jours, plus trois nuits d'isolement en cage individuelle pour évaluer un état dépressif. La mise à mort sert à prélever les organes pour des analyses histologiques et protéomiques. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de comprendre cette maladie neurodéveloppementale rare par un modèle animal, et conclut que seul l'animal permet d'en caractériser les symptômes, les approches in vitro se limitant selon lui aux mécanismes.
Objectifs
La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.
Bénéfices attendus
Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.
Procédures
Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); AMENDEMENT-1 - ajout d'un test pour évaluer la dépression (3*16h); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide AMENDEMENT-1 - sous anesthésie. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant. AMENDEMENT-2: Le prélèvement et fixation des organes sera réalisé sous anesthésie profonde
Impact sur les animaux
Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype, les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention durant quelques secondes. AMENDEMENT-1 - une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux. AMENDEMENT-1 - Le test de préférence du saccharose nécessite d'isoler les animaux pendant 3 nuits, tout en gardant le contact visuel avec leurs congénères: les animaux seront placés seuls dans des cages d'hébergement de 17h à 9h le lendemain matin pendant 3 jours. De 9h à 17h, les animaux retrouveront leur cage et leur congénère d'origine. AMENDEMENT-2: Le prélèvement et fixation des organes sera réalisé sous anesthésie profonde.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. AMENDEMENT-1 - L'isolement des animaux lors du test de préférence du saccharose (3*16h) se déroulera dans des cages d'hébergement avec enrichissement (nid, bâton et balle à ronger). Ces cages sont transparentes et les animaux continueront d'avoir un contact visuel avec leurs congénères.
Choix des espèces
Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.
Implication du microbiote intestinal dans le développement de la polyarthrite rhumatoïde chez le rat – stratégies thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Dès le premier symptôme d'arthrite, sept jours sont comptés avant de décider du sort de l'animal, délai que le porteur justifie par le temps nécessaire pour que les quatre membres soient potentiellement atteints et que le score maximum soit obtenu. 768 rats vont être utilisés, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués et autopsiés à l'issue. Nés sans aucune flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de donneurs humains, puis deux injections de collagène sous la peau de la base de la queue pour déclencher la maladie, et pour certains un gavage quotidien de probiotique. Le porteur écrit que l'atteinte articulaire va "inévitablement" générer une douleur chronique modérée à sévère, quand les bénéfices annoncés se limitent à l'identification de groupes bactériens et, "à terme", à des stratégies de modulation du microbiote.
Objectifs
L'objectif du projet est de développer un modèle expérimental pour l'étude mécanistique de la Polyarthrite Rhumatoïde (PR), pour la description de la physiopathologie générale de la PR dans une situation de déséquilibre du microbiote (dysbiose) et de proposer des solutions innovantes de prise en charge de la pathologie (développement de nouveaux pré- et probiotiques, d'aliments fonctionnels et de nouveaux antalgiques ciblant les moécules identifiées).
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de mettre en évidence les groupes bactériens susceptibles d'être impliqués dans le processus d'inflammation chez les personnes souffrant de polyarthrite rhumatoïde, et à terme, de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à moduler le microbiote intestinal.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions au cours de projet 1)des gavages orogastriques pour 1a) l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 1b) pour l'administration d'une bactérie probiotique, cette intervention sera quotidienne dès l'apparition du 1er symptôme post injection, pratiquée en moins d'une minute par des zootechniciens formés. 2) ils subiront également 2 injections espacées de 7 jours, en intra-dermiques à la base de la queue, sous anesthésie générale, espacées de 7 jours, d'une solution permettant l'induction de la polyarthrite rhumatoïde. 3) Des prelèvements de fecès seront réalisés avant implantation du microbiote, 15 après l'implantation, et de façon hebdomadaire pendant les 4 semaines maximum d'observation post injection (1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute)
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de projet des volontaires sains, aucun effet indésirable n'a été constaté lors du developpement et de l'utilisation de ce modèle, l'alimentation est, de plus, adaptée et n'entraine donc pas de troubles digestifs ou de croissance. En ce qui concerne l'induction de la polyarthrite rhumatoïde, les premiers signes visibles liés à l'apparition de la pathologie induite devraient survenir entre 7 et 10 jours après l'injection de collagène de type II. Les symptômes sont habituellement maximaux 15 jours post injection avant de se stabiliser voir, de régresser légèrement. L'atteinte articulaire va inévitablement générer une douleur chronique modérée à sévère et un stress important pour les animaux. En fonction du stade de la pathologie, apprécié par une grille d'évaluation, les déplacements des animaux pourront être réduits et l'état général affecté.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’étude du phénotype arthritique, de l’implication du microbiote intestinal dans le développement de la polyarthrite rhumatoïde et de l'effet d'une stratégie thérapeutique par administration d'une bactérie probiotique, ne peut être évaluée que sur un organisme vivant pris dans sa globalité,les méthodes non animales ne permettront pas de répondre à la question de la relation hôte-microbiote dans le cadre d'une pathologie extra digestive induite.
Réduction
Pour le respect de la règle des 3Rs, le nombre de chaque groupe d’animaux et le nombre de répétition de chaque procédure (6 expériementations correspondant à 6 microbiotes différents) a été réduit au minimum nécessaire, grâce au précédent projet qui a permis de déterminer un nombre d'animaux pour discriminer un effet statistiquement significatif entre les traitements et également. Ainsi quatre lots de 16 rats seront utilisés pour chaque expérience et ils correspondent à des inocula microbiens et des traitements différents : -un lot de rats à microbiote humain issu d’un patient souffrant de polyarthrite rhumatoïde, qui recevront une injection pour induire la polyarthrite - un lot de rats à microbiote humain issu d’un patient souffrant de polyarthrite rhumatoïde, qui recevront une injection de sérum physiologique (injection contrôle) -un lot de rats à microbiote humain issu d’un volontaire sain (microbiote contrôle), qui recevront une injection pour induire la polyarthrite - un lot de rats à microbiote humain issu d’un volontaire sain (microbiote contrôle), qui recevront une injection de sérum physiologique (injection contrôle).
Raffinement
Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne pour, tout d'abord, déterminer le score clinique évalué selon les critères définis comme l'aspect visuel des articulations, la mesure de l'épaisseur des chevilles à l'aide d'un pied à coulisse et/ou du volume de la patte à l’aide d’un pléthysmomètre, mais également pour détecter tout autre signe d'inconfort, de douleur, de détresse ou d'angoisse pour le réduire, le soulager, le supprimer. Dès l'apparition de ces signes, l'arbre décisionnel sera suivi. L'évaluation retrospective du précédent projet a entrainé une modification des points limites. En effet, dès le développement du 1er symptôme défini par la fiche de scoring, 7 jours sont comptabilisés pour observer la poursuite ou non du développement de la pathologie. Ce délai correspond au temps nécessaire pour que potentiellement les 4 membres soient atteints et donne ainsi le score maximum. Au terme de cette période, les animaux sont soit mis à mort et les prélèvements réalisés selon la procédure décrite dans la DAP, si la pathologie reste établie sur au moins un des quatre membres, soit resteront inclus dans le projet si la pathologie réverse (effet traitement ou inflammation transitoire/pathologie non établie). Pendant cette période, l'accès à l'alimentation et la boisson sera facilité pour les animaux developpant la pathologie (croquettes humidifiées dans la cage, gels nutritifs, tétines de biberons rallongées).
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats femelles et mâles fischer 344 nés axéniques âgés de 6 à 7 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 à 9 semaines au moment de l'injection de collagène de type II. Ce stade de développement, jeune adulte, est optimal pour permettre une bonne reproductibilité de l'induction de l'arthrite rhumatoïde par le collagène de type II. Ainsi ils auront environ 6 semaines au moment de la transplantation fécale.