Oncologie

100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leur microbiote intestinal est d'abord éliminé par quatre gavages d'une solution purgative à vingt minutes d'intervalle, ce qui provoque des diarrhées, puis remplacé par un microbiote humain administré en trois gavages espacés de trois jours, avant des injections d'anticancéreux et d'antibiotique dans l'abdomen. Elles passent huit jours isolées, cage par cage, pour éviter que les bactéries ne circulent entre elles. Le porteur écrit qu'un placement auprès d'une association de protection animale ne semble pas approprié vu l'état de santé de l'animal, et que le recours aux souris est "indispensable" faute de méthode reproduisant un microbiote humain in vitro.

Objectifs

Le traitement des cancers solides consiste fréquemment en l’utilisation de médicaments cytotoxiques (chimiothérapies) lesquels ciblent l’ADN des cellules cancéreuses, dont la prolifération est rapide. Les très nombreuses bactéries du microbiote digestif du patient sont des cellules à prolifération rapide et il a récemment été montré qu’elles sont aussi la cible des médicaments cytotoxiques. L’altération de l’ADN bactérien par les molécules antimitotiques strese les bactéries et favorise l’émergence de mutants in vitro. Dans le tube digestif des patients traités par anticancéreux, ces mutants résistants pourraient être ensuite sélectionnés par un traitement antibiotique (très fréquemment prescrite en traitement des complications infectieuses en cours de chimiothérapie), et ainsi augmenter le risque d'infections nosocomiales à bactéries résistantes aux antibiotiques, plus difficiles à traiter. Les résultats obtenus jusqu’à présent résultaient d’expérimentations in vitro, qui confrontaient une molécule anticancéreuse à une seule espèce bactérienne, ne tenant compte ni de la composition en nutriments du système digestif, ni de la complexité du microbiote digestif. Il est en effet établi que la communauté bactérienne digestive (composée d’environ 500 espèces) protège de la colonisation par les bactéries résistantes en raison de compétition pour les nutriments chez des individus sains. Dans ce projet, nous souhaitons de manière inédite mesurer l’influence d’un traitement par des molécules anticancéreuses connues pour stresser les bactéries sur l’émergence de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques dans le microbiote digestif d’un modèle murin de microbiote humanisé par greffe fécale. Nous souhaitons ainsi démontrer que les traitements anticancéreux favorisent l'apparition de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques (objectif principal). Nous explorerons aussi les mécanismes sous-jacents à cette émergence, en mesurant les modifications de la composition et des fonctions biologiques des microbiotes soumis à des doses thérapeutiques d’anticancéreux (objectif secondaire).

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le modèle murin et combinées à celles d’une étude clinique qui sera réalisée en parallèle, permettront de générer de nouvelles hypothèses d’optimisation des stratégies thérapeutiques des cancers chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux auront les interventions suivantes : gavage (4 fois avec une solution purgative à 20 min d’intervalle, 3 gavages de greffon, à 3 jours d’intervalle, durée de gavage < 1 min) ; injections intra-péritonéales (1 fois l’anticancéreux/sérum physiologique, 3 fois l’antibiotique, durée d’injection < 10 s).

Impact sur les animaux

Des nuisances d'intensités légères dues aux injections intra-péritonéales des chimiothérapies/sérum physiologique et de l’antibiotique ainsi que des douleurs au niveau des points d’injection peuvent être attendues. Par ailleurs, même si l’expérience montre que l’injection de molécules anticancéreuses est bien tolérée par les souris, des effets indésirables liés à l’administration d’agents cytotoxiques ne peuvent pas être exclus (nuisances modérées). Le mode d’élimination du microbiote naturel de la souris par une solution purgative (préalable à l’installation du microbiote humain) risque de causer des diarrhées ainsi qu’un inconfort de courte durée (< 30 min) et le gavage oro-gastrique peut induire du stress responsable d’une augmentation de la morbidité et mortalité des souris (évèvements rares, nuisances modérées). Les implantations de microbiote humain ne présentent a priori aucune implication pathologique pour les animaux. En effet, l'introduction d'un microbiote particulier n'induira pas le développement de maladies. Cependant les souris seront étroitement surveillées par un vétérinaire en cas de survenue de diarrhées (nuisance modérée).

Devenir

Les animaux seront mis à mort car il ne sera pas possible de réutiliser ces animaux pour une autre expérimentation en raison de l’administration d’anticancéreux notamment. Un placement de l’animal auprès d’une association de protection animale ne semble pas non plus appropriée en raison de l’état de santé de l’animal qui ne peut être garanti à l’issue de l’expérimentation.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable un microbiote intestinal humain in vitro d’autant plus qu’une partie du microbiote est constitué de bactéries viables mais non cultivables. Les modèles les plus fiables requièrent l’humanisation, partielle et temporaire, du microbiote d’animaux. Actuellement, il est impossible de ne pas recourir à des modèles animaux. Le recours aux souris est donc indispensable pour ce projet qui utilisera le minimum de souris nécessaire en respectant le plus possible le bien-être animal.

Réduction

Cette étude comportera des petits groupes animaux (n=10) pour pouvoir faire des tests statistiques validant les résultats. Un support en biostatistique est apporté par un expert de la spécialité, afin d’optimiser les méthodes expérimentales. L’utilisation de 10 souris par lot permet de lisser les variations interindividuelles. Les souris utilisées pour l’étude pilote des points limites pourront entrer dans les statistiques finales, réduisant ainsi le nombre de souris par lot dans l’étude principale.

Raffinement

L'hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignées de souris. La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), et maintien des animaux en groupes de 5 afin d’éviter le stress de l’isolement jusqu’à l’administration des antibiotiques (J8). Ensuite les souris devront impérativement être hébergées individuellement pour éviter les contaminations croisées par les bactéries du microbiote digestif (objet de l’étude). Nous limiterons l’hébergement individuel à 8 jours (entre J6 et J14) pour réduire l’inconfort des souris. Pendant cette période, les animaux garderont un contact visuel et olfatif avec leurs congénères et l’enrichissement dans leur cage sera augmenté et varié. Les conditions d’hébergement seront optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), En rapprochant les cages au maximum, nous nous assurerons que les animaux puissent communiquer. Les Souris pourront voir leurs congénères (cages transparentes) et les sentir (pas de couvercle filtrants). L’enrichissement sera renforcé (tubes en Plexiglas, billes de bois à ronger). La durée maximale de leur vie solitaire sera de 8 jours (J6 à J14). Une surveillance attentive est assurée quotidiennement, y compris les week-ends et les jours fériés. Une intervention immédiate et appropriée sera entreprise dès l'apparition de tout signe de détresse selon les scores des points limites fixes dans la procedure.

Choix des espèces

En plus des avantages pratiques liés à l’élevage ainsi qu’à l’expérimentation sur ce modèle animal parmi toutes les possibilités qu’offre l’expérimentation animale, la Souris est celui le plus utilisé dans les études sur le microbiote intestinal en général et plus particulièrement sur la greffe de microbiote fécal. En utilisant des souris, nous pouvons bénéficier des retours d’expérience d’autres équipes et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés pour la mise au point des protocoles. De plus, les résultats obtenus pourront être comparés aux études précédentes et permettre une analyse plus fine. Le protocole que nous allons suivre utilise des souris adultes de 8 semaines. Nous n’avons pas de raison de modifier ce paramètre dans notre étude.

Jusqu'à vingt séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse par animal, une injection de cellules cancéreuses dans l'oreille, l'ablation de cette oreille si la tumeur grossit trop vite, puis une injection dans la rate. 724 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, y compris celles dont la tumeur régresse. Les métastases hépatiques attendues peuvent provoquer douleur abdominale, fatigue, perte d'appétit et perte de poids, et chaque animal reçoit en plus une injection de médicament tous les deux jours pendant quatre à huit semaines. Le choix de la souris est justifié par un contexte immunitaire complet et par des molécules cibles que le porteur décrit comme conservées à 100 % chez l'humain, les animaux étant utilisés à six ou sept semaines pour limiter les variations physiologiques.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur qui se développe à partir de cellules épidermiques appelées mélanocytes. Bien qu’il ne représente qu’environ 1% des cancers cutanés, le mélanome est responsable de 75% des décès dus aux cancers de la peau. L’agressivité du mélanome est liée à son très fort potentiel métastatique et à la capacité de ces cellules cancéreuses à proliférer dans les organes vitaux, notamment le foie. Il est donc crucial de comprendre quels sont les mécanismes qui gouvernent le développement des métastases, pour envisager des traitements qui bloqueront ou ralentiront la progression tumorale dans les organes vitaux. Dans le but d’étudier ces mécanismes, nous avons mis en place une méthode qui nous a permis d’identifier des gènes impliqués dans le développement des métastases pulmonaires et nous souhaitons maintenant étendre cette méthode aux métastases hépatiques. Les mélanomes utilisent des signaux produits localement dans chaque organe pour stimuler leur croissance. Empêcher les mélanomes de percevoir ces signaux, devrait en théorie prévenir leur croissance. Dans le but de tester cette hypothèse, nous avons mis au point un système qui permet d’éteindre individuellement l’expression d’une sélection de gènes impliqués dans la réception des signaux stimulant la croissance des mélanomes. Grace à cette méthode, nous avons pu déterminer quels sont les récepteurs qui sont responsables de la croissance des mélanomes dans les poumons. Nous souhaitons maintenant étendre notre étude au foie car le mélanome conduit fréquemment à des métastases dans cet organe. Nous avons choisi le modèle souris pour ce projet car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome ainsi que la réponse anti-tumorale. Le modèle cellulaire choisi récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique chez les souris . Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un anti-douleur pourra être administré et un enrichisement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage. Pour réduire le nombre d'animaux, une étude statistique préliminaire a été réalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’implication des gènes étudiés dans la croissance des métastases de mélanomes. Il permettra d’identifier précisément quels récepteurs sont utilisés lors de la colonisation spécifique du foie. Ces gènes ont un potentiel thérapeutique formidable puisqu’environ 40% des médicaments sur le marché sont des agonistes ou antagonistes de ces récepteurs. Cela permet donc d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter la progression tumorale chez les patients ayant un mélanome avancé (stade 2 à 4) mais n’ayant pas de métastases détectables au moment de l’exérèse de la tumeur primaire. En effet, chez la plupart de ces patients, les métastases ne sont détectables que plusieurs années après la chirurgie. Outre les retombées médicales envisageables, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la progression tumorale des mélanomes cutanés.

Procédures

Injection de cellules dans l'oreille 1 par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Procedure chirurgicale d'ablation de l'oreille (uniquement si la tumeur atteint un certain volume avant l'apparition des métastases) sous anesthésie gazeuse, une seule fois, durée maximale 30 min. Injection de cellules 1 par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Injection de cellules en dans la rate : 1 par souris sous anesthésie générale, durée maximale 20 min. Injection de médicaments : 1 fois tous les deux jours après anesthésie locale (Lidocaïne) pendant 4 à 8 semaines (en fonction des résultats). Anesthésie gazeuse pour imagerie, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant au maximum 10 semaines soit 20 séances maximum, durée maximale des procédures.

Impact sur les animaux

Les animaux auront des nuisances légères dues aux injections sous anesthésie locale ou générale dans le derme (flanc (anesthésie locale), ou oreille (anesthésie générale)) ou dans la rate (anesthésie générale). Avant l'anesthésie, une analgésie adaptée sera administrée. L'excision d'une oreille sous anesthésie générale avec analgésie pourra entraîner une gêne et un handicap modérés. La croissance de tumeurs dans le derme peu entraîner une gêne physique et des douleurs modérées. La croissance de tumeur dans la rate peut entraîner des symtômes de douleur abdominale modérée. L'apparition de métastases hépatiques peut entraîner des symptômes de gravité modérée: douleur abdominale, fatigue, perte d'appétit et éventuellement perte de poids.

Devenir

Tous les animaux ayant reçu une injection de cellules seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils développeront tous potentiellement des tumeurs et des métastases. Pour les animaux pour lesquels on observerait une régression tumorale, ils seront aussi euthanasiés car on ne peut pas éliminer la possibilité d'une reprise de la tumeur et/ou une progression lente. Tous les animaux ayant été utilisés pour la procédure de détermination de la dose maximale d'antagonistes seront aussi euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme entier (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome dans les organes distants. Enfin, notre projet offre une opportunité thérapeutique qui justifie la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme.

Réduction

Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficicacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire permet d'établir le nombre d'animaux nécessaire par groupe pour les étapes de validation des gènes d'intérêt et l'étude de leur effets sur la croissance primaire et pour l'étude des effets des antagonistes. De même, seuls les gènes d'intérêt validés seront étudiés par la suite. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses d'antagonistes seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. De même, une période de wash out sera observée entre l'injection de deux doses lors de l'évaluation de la dose maximale tolérée , ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux.

Raffinement

Les animaux sont observés tous les jours par le personnel de l'équipe de recherche. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Un score de contrainte est établi en observant le comportement des animaux toutes les semaines. Des points limites pour traitement ou arrêt ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront anesthésiées lors des différentes procédures. Si des métastases hépatiques se développent, nos méthodes de suivi (palpation abdominale et luminescence) nous permettront d'arrêter le procédure à un stade de gravité modérée.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser le modèle de la souris pour étudier les mécanismes de développement de métastases de mélanome. L'utilisation de ce modèle nous permet d'être dans un contexte immunitaire complet. Ce modèle nous a déjà permis d'identifier des molécules impliquées dans la croissance métastatique du mélanome dans les poumons. D'une part, le modèle cellulaire choisis récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique. D'autre part, les molécules identifiées chez les souris sont 100% conservés chez l'homme. Nous souhaitons utiliser les souris à maturité sexuelle, adulte, de 6 à 7 semaines, jeunes adultes. En effet, le développement de la souris entraîne des variations d'expression géniques, hormonaux, des changements physiologiques qui peuvent avoir des effets sur l'expression des gènes étudiés et donc biaiser nos résultats. Nous souhaitons limiter les variations de ceux-ci et pouvoir standardiser au maximum la physiologie des souris à un jeune âge.

1 019 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir douze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, douze à seize jours d'isolement pour la mesure du métabolisme et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et commencent par une chirurgie cérébrale de vingt minutes sous anesthésie générale, suivie d'injections dans l'abdomen. Certaines lignées développent à partir de neuf mois des problèmes musculaires ou une paralysie, que le porteur présente comme une caractéristique de la lignée. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, muscle, tissu gras et foie, la question posée étant de relier le dérèglement du métabolisme à la maladie d'Alzheimer.

Objectifs

Les maladies liées à l'âge constituent l'un des principaux défis des sociétés modernes, à mesure que l'espérance de vie augmente. C’est notamment le cas des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, la plus répandue dans le monde. Malgré des avancées importantes, les mécanismes pathologiques de la maladie d’Alzheimer restent mal compris et les options thérapeutiques insatisfaisantes. De nombreux éléments suggèrent que la maladie d’Alzheimer n'est pas seulement caractérisée par un dysfonctionnement neurologique mais également par des troubles métaboliques. Un dysfonctionnement métabolique est un trouble du corps qui perturbe la manière dont il transforme les aliments en énergie, pouvant mener à des maladies telles que le diabète ou l'obésité. Ce projet vise à comprendre comment la dérégulation du métabolisme est liée aux maladies neurodégénératives. Pour atteindre cet objectif, nous allons caractériser l'impact du dysfonctionnement métabolique sur la progression de la neurodégénérescence chez des modèles animaux de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Nous étudierons également la régulation du métabolisme au cours de la progression de la neurodégénérescence chez ces modèles. Afin de prendre en compte des facteurs liés au sexe et au stade de développement de la maladie, l’étude sera menée sur des mâles et des femelles, et sur des groupes ayant deux âges différents. Enfin, nous proposons de valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la maladie par imagerie. Le projet se déroulera dans 2 Établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre l’implication du contrôle métabolique sur les mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence et vice-versa. À plus longue-terme, nous espérons que ces connaissances aideront à révéler de nouvelles perspectives thérapeutiques, ciblé sur l’amélioration de la fonction métabolique, pour prévenir ou ralentir le déclin cognitif liée à la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurodégénératives. Enfin, nous espérons valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la neurodégénérescence par imagerie, ce qui pourra réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la recherche préclinique à l’avenir.

Procédures

- Chirurgie sous anesthésie générale et analgésie afin d’injecter des composés dans le cerveaux (durée: 20 minutes) - Détermination du poids, da composition corporelle et de la fonction métabolique sur souris vigile (durée : 4 jours). - Isolement des souris pour l’étude individuelle de la fonction métabolique (durée: 12 a 16 jours). - injection péritonéale sur la souris vigile (1-3 injections par souris ; durée : 30 secondes). - Prélèvement de sang sur animaux vigiles, par incision du bout de la queue. Fréquence : 12 fois par souris, reparti en 6 fois à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h ; et 6 fois une semaine après, à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h. - Imagerie de la souris sous anesthésie générale (4-12 fois par souris, 1 fois / semaine sur 1 ou 3 mois; durée : 3 minutes). L’étape de chirurgie se déroulera dans l’établissement EU1 puis, les analyses de la fonction métabolique et l’imagerie se feront dans l’établissement EU2. Les deux établissements sont attenants.

Impact sur les animaux

- Douleur locale transitoire après injection et en post-opératoire ; - Après la chirurgie, il est possible que certains animaux développent une infection, présentent des problèmes de cicatrisation, ainsi qu'une perte de poids ou du stress. - le transport des animaux du fournisseur vers l’animalerie et d’une animalerie à l’autre peut induire du stress. - Stress ou anxiété à cause de l’isolement pour la mesure de la fonction métabolique chez les souris en isolement - Certains animaux plus âgés (à partir de 9 mois) appartenant à l'une des lignées de souris utilisées peuvent développer des problèmes musculaires ou une paralysie, caractéristiques de cette lignée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (cerveau, muscle, tissu gras, foie) pour analyse des molécules clés dans la régulation du métabolisme et des protéines pathologiques liées au processus de neurodégénérescence.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique. Des expériences sur cellules ont déjà été réalisées et ont validé notre hippothèse sur l’effet inhibiteur des facteurs pathologiques sur la fonction métabolique et sur l’activité des cellules neuronales. Pour continuer notre étude, nous avons maintenant besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée du métabolisme en lien avec la progression des maladies neurodégénératives. Cela ne peut se faire que sur l’animal vigile. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques et des maladies neurodégénératives, car les modèles utilisés ont été générés chez la souris.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Les mesures de la fonction métabolique et d’imagerie de bioluminescence sont effectuées sur plusieurs jours sur le même animal, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Plusieurs mesures spécifiques seront prises pour minimiser les nuisances causées aux animaux, telles que : - anesthésie et analgésie pour limiter la douleur; - des mesures spécifiques pour éviter l'hypothermie; - des mesures spécifiques pour diminuer le stress et l’angoisse des souris pendant le transport des animaux entre les deux établissements; - les animaux sont hébergés groupés (sauf si une nécessité d’individualisation se présente), dans un milieu avec enrichissement approprié, et avec de la nourriture et d'eau ad-libitum; - Tout au long de la procédure, les souris seront observées quotidiennement conjointement par les soigneurs et/ou les expérimentateurs; - application de points limites stricts et spécifiques au projet; - Ce projet privilégie les techniques non invasives d'analyse métabolique globale et d'imagerie.

Choix des espèces

L’espèce Mus Musculus a été choisie car plusieurs modèles de souris présentant des caractéristiques similaires à celles des patients atteints de maladies neurodégénératives ont été développés et validés. De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude de la fonction métabolique car la régulation métabolique est similaire entre la souris et l’homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes (dans le contexte des maladies métaboliques et neurodégénératives) sur la souris est un atout majeur dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, lorsque leurs comportements alimentaires et locomoteurs, ainsi que leur masse, sont stables. Les souris seront utilisées à l’âge de 3, 6 et jusqu’à 9 mois. Ce choix se justifie par le fait qu’à l’âge de 3 mois les souris transgéniques sont à un stade précoce de la maladie, tandis que à 6 mois et 9 mois les troubles de mémoire et d’apprentissage sont bien documenté dans la littérature.

870 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de tumeur par injection sous-cutanée, puis un gavage quotidien pendant deux semaines et des injections intrapéritonéales, quotidiennes ou réparties sur la semaine selon le traitement testé, avant un prélèvement de sang sous anesthésie le jour de sa mise à mort. Le porteur reconnaît que sur les trois semaines de l'expérience, les souris porteuses de tumeurs peuvent perdre du poids et montrer des signes de souffrance, immobilité, isolement, dos voûté, poil terni. L'objet est de comparer plusieurs traitements anti-angiogéniques associés à des immunothérapies afin de "mieux les prescrire", et l'atteinte d'un point limite qui ne peut pas être soulagé conduit à tuer l'animal avant la fin du protocole.

Objectifs

La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, est nécessaire au développement tumoral. Les cellules tumorales, ainsi que les cellules du microenvironnement tumoral produisent des facteurs favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au sein de la tumeur. Mais il a été observé que ces facteurs agissaient également sur le système immunitaire de souris porteuses de tumeurs et de patients atteints de cancer, et aboutissaient au blocage de la réponse immunitaire. Or, la réponse immunitaire contre la tumeur est nécessaire à l’élimination de celle-ci. Des traitements ciblant ces facteurs sont utilisés pour traiter certains cancers. Ils réduisent non seulement les vaisseaux sanguins au niveau de la tumeur mais aident également à améliorer la réponse immunitaire contre la tumeur. Ces traitements sont associés à des immunothérapies en particulier dans le cancer du rein résultant en une augmentation des effets anti-tumoraux observés. Plusieurs traitements ciblant la formation des vaisseaux sanguins sont actuellement associés à des immunothérapies sans avoir vraiment d’argument pour privilégier l’un de ces traitements. Il est important de comprendre l’impact de ces traitements sur la réponse immunitaire pour permettre de mieux les prescrire et de proposer de nouveaux traitements aux patients atteints de cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra donc à la fois de faire progresser les connaissances concernant l’interaction entre l’angiogenèse (formation des vaisseaux sanguins) et la réponse immunitaire anti-tumorale et pour les patients atteints de cancer de mieux prescrire les traitements anti-angiogéniques en association avec des immunothérapies. Cette étude pourrait également permettre de proposer de nouvelles combinaisons d’anti-angiogéniques et d’immunothérapies.

Procédures

Injection sous-cutanée 1 fois au début de la procédure sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Gavage 1 fois par jour tous les jours sur 2 semaines sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Injection intrapéritonéale 1 fois par jour tous les jours sur 2 semaines ou 2 ou 3 fois par semaine selon le traitement administré sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Prélèvement de sang sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (durée totale environ 10 min puis mise à mort)

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales se fait par voie sous-cutanée. L’injection par voie sous-cutanée cause un stress et une douleur légère de courte durée. Le gavage cause un stress et une douleur légère de courte durée. L’injection par voie intra-péritonéale cause un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements de sang peuvent induire des douleurs légères et transitoires. Sur la durée entière de l’expérience (3 semaines environ), les souris avec des tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des signes évocateurs de souffrances tels que des troubles du comportement (immobilité, isolement...) et de l’aspect physique (dos vouté, apparence du poil...).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes pour l'étude de la réponse immunitaire.

Remplacement

Le microenvironnement tumoral est complexe, les modèles in vitro ne permettent pas de le mimer fidèlement. Les modèles organoïdes ne reproduisent pour l’instant pas la complexité du microenvironnement tumoral. Il est en effet possible de faire se développer de petites sphères de cellules tumorales in vitro, mais il est très difficile de faire se développer des vaisseaux sanguins et d’y ajouter les différentes populations immunitaires. Les cellules immunitaires survivent très mal dans ces conditions. La présence de la tumeur et le développement des vaisseaux sanguins vont modifier le microenvironnement tumoral en induisant en particulier le développement de cellules immunosuppressives. C’est ce développement et l’impact des traitements anti-angiogéniques sur ces processus que nous étudierons dans ce projet, ce qui ne peut donc se faire qu’in vivo. C’est pourquoi l’expérimentation utilisant un modèle animal mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral est indispensable. En parallèle à ce projet d’expérimentation animale, des expérimentations seront réalisées à partir de prélèvements humains (sanguins ou tumoraux).

Réduction

L'implantation des cellules tumorales est mise au point. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour le suivi de la croissance tumorale. De nombreux outils sont disponibles pour analyser la réponse immunitaire chez la souris (en particulier des anticorps). D’autre part, les anti-angiogéniques utilisés dans ce protocole ont déjà été utilisés chez la souris et ont montré un impact sur la croissance tumorale. Des souris adultes à partir de 6-8 semaines seront utilisées car c’est à cet âge que le système immunitaire est complètement développé.