Oncologie

Pour identifier les gènes dont l'inactivation freine le cancer du sein triple négatif, 180 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem. Des cellules tumorales prélevées sur une patiente, modifiées par CRISPR, leur sont greffées dans la glande mammaire pendant une anesthésie d'une heure, puis la tumeur est mesurée au pied à coulisse au fil de sa croissance. Une partie reçoit en plus une combinaison de chimiothérapies. Le porteur annonce une douleur qui peut persister à mesure que la tumeur se développe et une perte de poids pouvant atteindre 20 % du poids normal, avec mise à mort dès l'atteinte d'un point limite fixé sur la taille de la tumeur.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et la première cause de décès par cancer chez la femme en France. Bien que la prévention et de nouvelles options thérapeutiques aient amélioré son prognostique, des phénomènes de résistance aux traitements et l’évolution métastatique de cette pathologie justifient la recherche de nouveaux traitements. Il est aujourd’hui possible de déterminer quels sont les gènes qui sont essentiels à la viabilité d’une cellule et d’en déduire ainsi quelles sont les protéines dont la manipulation par de petits composés chimiques pourrait constituer une approche thérapeutique. Cette investigation repose sur l’outil CRISPR/Cas9 (Prix Nobel de chimie 2020 à J. Doudna & E. Charpentier) qui permet d’interroger si un gène est nécessaire pour la survie d’une cellule dans le contexte d’intérêt. Notre objectif est d’appliquer cette technique aux transplantations de tumeurs humaines (PDX). Les PDXs sont actuellement parmi les modèles les plus proches des tumeurs des patients et permettent ainsi la réalisation d’études dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ce projet devrait donc permettre de prédire la réponse thérapeutique des cancers du sein.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer les gènes dont le ciblage pourrait présenter un intérêt thérapeutique sur une variété de modèles de cancer du sein. Nos premiers efforts se concentreront sur le sous-type de cancer du sein pour lequel les besoins thérapeutiques sont les plus importants (tumeur triple négative) mais sera ensuite étendu à d’autres sous-types si les résultats sont prometteurs. Les gènes seront initialement identifiés par un criblage génétique, cette technique permet de questionner l’essentialité (contribution à la viabilité) de nombreux gènes en une seule expérience. Les candidats les plus intéressants seront ensuite validés un par un. Cela ouvrira potentiellement la voie à une étude clinique.

Procédures

Dans le lot d’animaux concerné par cette demande, un ensemble de cellules tumorales issues du cancer du sein d’une patiente et modifiée génétiquement pour avoir un gène unique inactivé sera injecté dans la glande mammaire d’animaux anesthésiés et sous traitement analgésique (durée de l’anesthésie estimée à 60 min ). Les animaux seront ensuite suivis et la taille de la tumeur sera mesurée grâce à un pied à coulisse . Pour un sous-ensemble des animaux inclus dans cette étude, les animaux seront traités par une combinaison d’agents chimio-thérapeutiques à des doses n’entrainant pas d’effet adverse chez la souris.

Impact sur les animaux

Les principaux gestes qui seront effectués sur les animaux impliquent la greffe de cellules humaines dans la glande mammaire. Les nuisances attendues sont la douleur liée à l’intervention chirurgicale au niveau de la glande mammaire L'ensemble de la procédure peut entraîner une douleur modérée, qui peut persister au stade suivant du développement de la tumeur et une perte de poids ne dépassant pas 20 % du poids corporel normal.

Devenir

Les souris seront mises à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nous effectuons des criblages génétiques sur lignées cellulaires et organoïdes afin de limiter au maximum le recours aux animaux. Toutefois, en raison de l’importance des interactions avec le microenvironnement, l’étude de la progression tumorale dans un contexte aussi proche que possible de celui du patient reste une phase indispensable pour passer rapidement aux essais cliniques impliquant des patients.

Réduction

Nous avons fait des expériences pilotes avec nos collaborateurs pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles . En pratique, une expérience pilote a été menée pour déterminer le nombre de souris nécessaire à ce que la représentativité de la librairie soit maintenue. En d’autres termes, c’est le nombre minimum de souris pour qu’aucun gRNA soit aléatoirement perdu. Nous avons pu établir que 5 souris par réplica sont nécessaires pour la librairie que nous souhaitons utiliser. La librairie a été réduite au maximum pour ne cribler que les gènes susceptibles d’être pertinent thérapeutiquement.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, les procédures techniques seront limitées au strict nécessaire. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec recours aux analgésiques. Dans le cas où un animal présenterait des signes d'inconfort ou de douleur au cours de l'expérience, des analgésiques seront administrés. De plus, nous avons établi des points d'arrêt très précoces pour chaque expérience, en terme de taille de tumeurs, qui nous permet néanmoins de répondre à notre question scientifique. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective, l’état des animaux. Dès l’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Un des problèmes du traitement des cancers est l’existence de cellules résistantes aux traitements et leur apparition en cours de traitement. Le projet a pour but d’identifier les gènes nécessaires au développement tumoral pouvant être des cibles thérapeutiques. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (culture in vitro, organoïdes), l’utilisation du modèle souris, espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie, reste indispensable pour récapituler pleinement l’environnement tumoral. Les lignées murines immunodéficientes permettent la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris), sans provoquer de rejet de la greffe. Ces xénogreffes de tumeurs de patients récapitulent remarquablement bien les tumeurs humaines et constituent donc un modèle idéal pour l’étude des gènes impliqués dans la progression tumorale Des souris adultes pubères de 6 à 10 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, après le développement du tissu épithélial mammaire. Ce choix est justifié par le fait que le cancer du sein touche principalement la femme adulte (99%).

9 132 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse, puis, selon les groupes, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales sur animal vigile ou quatre injections directement dans la tumeur, ses tumeurs étant mesurées tous les deux à trois jours. Le porteur indique que les sites d'injection peuvent s'infecter et que la croissance tumorale peut faire maigrir les souris, et justifie la mise à mort par les analyses menées sur les organes prélevés. L'objectif déclaré est de confirmer chez la souris des gènes repérés lors d'un criblage in vitro, une vérification pour laquelle il écrit qu'il n'existe "pas de modèles alternatifs" et que le recours à un "organisme entier" est une "nécessité".

Objectifs

La chimiothérapie demeure aujourd’hui le traitement de référence pour la majorité des cancers. Un nombre limité d’agents tels que les anthracyclines ou encore l’oxaliplatine ont la capacité de déclencher des signaux de stress pre-mortem qui induisent la mort cellulaire immunogène (ICD, de l’anglais « Immunogenic cell death »). Cette dernière permet la stimulation d’une réponse immunitaire antitumorale, tout en conférant une protection à long terme. Nous avons effectué une étude de criblage multi-omique in vitro qui nous a permis d’identifier des gènes associés à l’ICD, en particulier des gènes codant pour des cytokines et chimiokines. L’objectif de ce projet est de confirmer in vivo l’implication de ces gènes et de leurs voies de signalisation dans l’ICD et plus globalement dans l’immunité antitumorale et leur contribution à l’efficacité thérapeutique. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les chimiothérapies stimulent l’immunité antitumorale et identifiera de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les molécules qui induisent la mort cellulaire immunogène sont très utilisées en clinique pour le traitement des cancers (anthracyclines, oxaliplatine, cyclophospamide, etc). Les expérimentations précliniques prévues visent à confirmer les effets antitumoraux des nouvelles cibles thérapeutiques identifiées in vitro et à approfondir notre compréhension des effets antitumoraux du système immunitaire. Ces études permettront d’explorer plus en profondeur les mécanismes sous-jacents à ce processus. De plus, nous pourrons évaluer si les voies de signalisations identifiées présentent également des propriétés immunogènes afin d’ouvrir le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour l’immunothérapie anti-cancéreuse. Ces travaux permettront d’une part d’induire l’immunogénicité dans le cadre de traitements non inducteurs de mort immunogène et d’autre part d’améliorer l’efficacité des molécules inductrices de ce type de mort cellulaire.

Procédures

Une première partie des animaux subira une expérience de vaccination antitumorale qui impliquera 2 injections sous cutanées sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection). Une seconde partie des animaux sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection) et 1 injection intrapéritonéale (animal vigile, 2 min/souris/injection). Une 3éme partie des souris sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection), 1 injection intrapéritonéale (animal vigile, 2 min/souris/injection), 4 injections intratumorales sous anesthésie gazeuse (2 min/souris/injection). La dernière partie des animaux sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection), 5 injections intrapéritonéales (animal vigile, 2 min/souris/injection). Tous les animaux seront manipulés brièvement (moins d’1 min) tous les 2-3 jours pour mesurer les tumeurs.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Par ailleurs, la croissance tumorale et l’administration de traitements peuvent entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nous avons effectué une étude de criblage à haut débit in vitro qui nous a permis d’identifier des gènes associés à l’implication du système immunitaire dans la morte cellulaire des cellules cancéreuses. Nous souhaitions valider ces data in vivo, car il n’y a pas de modèles alternatifs permettant d’étudier l’efficacité des traitements anticancéreux et de confirmer leur action via l’activation du système immunitaire. Il est donc essentiel d’utiliser un model reproduisant au mieux l’environnement tumoral et le fonctionnement du système immunitaire. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les composants du système immunitaire peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons un maximum de 9132 animaux sur 5 ans. Des groupes de 15 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes, pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque procédure.

Raffinement

Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress. Pour minimiser leur stress, les souris seront logées ensemble (un maximum de 5 souris par cage), offrant un environnement social, au calme et un espace vital suffisant. Les conditions d’hébergement respecteront les normes conventionnelles et les animaux auront accès en permanence à l’alimentation et à l’eau. Un milieu enrichi adapté est prévu : dans les cages il y aura des nids et des tunnels en carton. Le comportement général des animaux sera surveillé régulièrement et leur poids sera mesuré avant le début des traitements, ainsi qu’une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants...). Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteint de ces points limites préétablis.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser la souris dans cette étude repose sur plusieurs raisons. Tout d'abord, la souris est un modèle complet et fonctionnel, offrant des similitudes intéressantes avec le système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle utile pour cette recherche. De plus, nous connaissons bien sa génétique, ce qui facilite les études moléculaires et génétiques. Nous disposons d'installations adaptées pour ces animaux, d’une solide expertise dans les techniques d'expérimentation animale ainsi que dans le suivi vétérinaire et microbiologique. Nous utilisons des souris adultes âgées à partir de 7 semaines, car elles possèdent un organisme avec un développement complet et un système immunitaire fonctionnel.

Gardées en vie à l'issue du projet parce qu'elles n'ont subi aucun traitement invasif, les 40 perdrix rouges sont destinées à d'autres expérimentations. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, quatre tests individuels de moins de trente minutes un jour sur deux, avec une capture par l'expérimentateur qui déclenche des réponses de peur, fuite et envol. L'isolement social pendant ces tests constitue une source de stress pour ces oiseaux grégaires, ce que le porteur reconnaît en invoquant la brièveté des séances. L'objectif déclaré est d'identifier les personnalités les plus aptes à survivre après un lâcher, la perdrix rouge étant une espèce en fort déclin dont des populations captives sont relâchées chaque année en France.

Objectifs

Face à la diminution importante de la biodiversité, de nombreux programmes de conservation proposent de renforcer les populations naturelles par la mise en nature d’individus nés et élevés en captivité. Cependant, il apparait, que pour beaucoup d’entre eux, le taux de survie des individus relâchés est faible, rendant inefficaces les efforts de conservation. Ce faible taux de survie peut être expliqué notamment par une altération des comportements adaptatifs (comportements anti-prédateurs, d’exploration des ressources alimentaires, reproducteurs) chez les animaux nés en captivité. Cependant, au sein d’une même population captive, il existe une très forte variabilité comportementale entre les individus, variabilité qui permet d’identifier des personnalités animales différentes. Certains travaux montrent aujourd’hui un rôle important de ces personnalités animales dans la dynamique naturelle des populations, certaines personnalités étant impliquées dans les processus de dispersion et de colonisation de nouveaux milieux, tandis que d’autres dans le maintien sur une même aire de répartition (sédentarité). Dans ce contexte, le choix de personnalités particulières dans les programmes de repeuplement pourrait être un levier pertinent permettant d’améliorer leur réussite. Aussi, l’objectif de ce projet est de caractériser les différentes personnalités chez la perdrix rouge, espèce dont des populations captives existent et sont mises en nature chaque année en France pour des objectifs de conservation.

Bénéfices attendus

La caractérisation des différentes personnalités chez la perdrix rouge pourrait permettre d'identifier des personnalités plus favorables à la remise en nature et ainsi améliorer la réussite des programmes de repeuplement de cette espèce

Procédures

Les animaux seront uniquement soumis à des tests éthologiques de caractérisation du comportement. Les tests individuels sont au nombre de 4 et restent d'une durée inférieure à 30 minutes chaque jour. Le comportement reproducteur est observé en volière extérieur sans intervention sur l'animal.

Impact sur les animaux

Les oiseaux peuvent subir des nuisances lors de la capture puisqu’ils peuvent émettre des réponses de peur à l’approche de l’expérimentateur (fuite et envol). Cependant, le temps de capture est inférieur à 2 minutes, ceci permettant de limiter les risques de blessure de l’animal lors de ces comportements de fuite. L’isolement social lors des tests peut également être une source de stress pour ces oiseaux sociaux. Cependant, cet isolement sera d’une courte durée (moins de 30 minutes par jour et ce un jour sur deux).

Devenir

Les oiseaux n'ayant pas subi de traitements invasifs, ils seront gardés en vie d'autres expérimentations.

Remplacement

Nous travaillons sur la caractérisation des personnalités animales, nous donc devons expérimenter directement sur l’animal vivant, ce qui exclut tout type de remplacement.

Réduction

Le nombre d’animaux choisi (20 mâles et 20 femelles) permet d’avoir un effectif suffisant pour les comportementales tout en tenant compte d’un possible effet sexe.

Raffinement

Les oiseaux seront hébergés en groupes sociaux mixtes de 5 individus en volières intérieures munies de fenêtres extérieures permettant un éclairage naturel. Chaque volière intérieure sera munie d’une mangeoire et d’un abreuvoir (nourriture et eau à volonté), de litière au sol (copeaux de bois) leur permettant de faire des bains de poussière et de deux abris leur permettant de se soustraire aux perturbations environnementales. Lors de la phase de reproduction, les oiseaux seront placés en volière extérieure de 25m2 (4 couples par volière) comprenant un couvert végétal naturel, de l'alimentation et de l'eau, ainsi que des cachettes pour s'abriter des conditions climatiques. Lors des phases de tests, les oiseaux seront déplacés et manipulés par des personnes compétences et expérimentées. Les phases de tests seront limitées à 30 minutes par jour pour limiter les contraintes pour l’animal. Les oiseaux seront soignés et observés tous les jours par un personnel expérimenté (grille annexe 1). La détection de tout changement de comportement ou de blessure induira un isolement de l'individu pour l’administration de traitement .

Choix des espèces

Les perdrix rouges sont des gallinacés emblématiques des milieux ouverts du bassin méditerranéen. Leurs populations sont en fort déclin actuellement et un certain nombre de programmes de conservation vise à utiliser les populations captives pour des repeuplements. Cependant, la réussite de ces programmes reste mitigée et il convient donc de trouver de nouveaux outils pour améliorer leur efficacité. Les perdrix utilisées seront des adultes âgés de 6 mois. A cet âge le profil comportemental est stable et nous pourrons donc observer des différences interindividuelles robustes, ainsi que de potentielles différences liées au sexe.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, dépourvues de défenses efficaces au point qu'une contamination bactérienne ou virale les tuerait, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable. Elles sont 180, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements post-mortem. Chacune subit jusqu'à cinq injections, dix anesthésies à l'isoflurane, quatre séances d'imagerie de bioluminescence et jusqu'à cinq prises de sang à la mandibule sur animal vigile, l'injection intramusculaire étant couplée à des décharges électriques pour faire entrer un plasmide dans le muscle. L'objectif est de transformer ce muscle en ce que le porteur appelle une "usine de production" d'anticorps, preuve de concept dont il annonce les débouchés chez les espèces domestiques, contre l'arthrite ou le psoriasis.

Objectifs

Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. Le plasmide est injecté dans les cellules musculaires de souris afin d’induire une sécrétion à une dose supérieure ou égale à la dose minimale efficace de l’anticorps. L'objectif est donc double : 1/ mettre en place une méthode d’expression d‘anticorps par les cellules musculaires 2/ induire une expression qui soit suffisante pour être détectée dans le sang des animaux et agir sur des cibles présentes à distance des muscles sécréteurs. Ce projet fait suite à de nombreux tests cellulaires de vérification de la fonctionnalité des plasmides ADN utilisés. Sa réussite ouvrira la voie à des études plus approfondies et à visée thérapeutique chez des espèces domestiques. En bref, nous aurons une preuve de concept de l’utilisation de vecteurs ADN injectés dans les muscles des animaux, qui fonctionneront alors comme des « usines de production » d’anticorps dirigés contre des cibles. La niche d’utilisation de cette stratégie clinique concerne les maladies chroniques, dans notre cas, les maladies chroniques inflammatoires articulaires (ex : arthrite) et cutanées (ex : psoriasis ou pelade).

Bénéfices attendus

Une fois abouti, le présent projet a pour vocation de mettre en place une méthode de production de biomédicament par les cellules musculaires de souris via l’injection d’un vecteur ADN. Celle-ci ouvrira de nombreuses perspectives thérapeutiques et vétérinaires.

Procédures

Les souris de ce projet subiront au maximum : - 5 injections d’une durée total de 12 min (1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10min ; 4 IP pour l’imagerie, soit 2 min) - 10 anesthésies à l’isoflurane pour une durée totale de 70 minutes (5 rasages, soit 10min ; 1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10 min ; 4 imageries de bioluminescence, soit 50 minutes) - 2 à 5 prélèvements de sang sur souris vigile, soit 2 à 5min au total.

Impact sur les animaux

Les injections intramusculaires et l’application de courants électriques pour l’électroporation peuvent potentiellement induire des douleurs. Ils seront réalisés sous anesthésie générale. Une prise de sang au niveau submandibulaire sera également réalisée sur animaux vigiles dans les deux premières procédures. Les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition de signes de souffrance tel que la perte de poids, la modification de la physiologie ou du comportement (dont la locomotion suite à l’injection intramusculaire avec ou sans électroporation). Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui sont à phénotype dommageable car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.

Remplacement

Une première sélection des meilleurs plasmides d’expression a été réalisée en amont par nos collaborateurs par des études in vitro. L’étude de la production d’un anticorps ou d’une protéine recombinante par un tissu musculaire et sa sécrétion dans la circulation sanguine générale n’a pas de méthode alternative que l’utilisation d’animaux vivants à l’heure actuelle.

Réduction

Nos protocoles expérimentaux ont été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en injectant des vecteurs exprimant des protéines bioluminescentes, qu’il est possible de suivre par imagerie de bioluminescence et par luminométrie. Le suivi par bioluminescence in vivo permettra de suivre l’expression de la luciférase au cours du temps sur un seul et même animal et d’éviter de multiplier les groupes. C’est donc un double bénéfice au niveau scientifique et au niveau de l’utilisation d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Sur 5 ans, nous prévoyons l’utilisation au maximum de 180 souris qui seront réparties ainsi : - Mise en place des protocoles de transfert de vecteur ADN au sein de notre laboratoire : 40 souris - Étude du contrôle du système immunitaire : 40 souris - Étude des méthodes de transfert du vecteur ADN dans les cellules musculaires en utilisant soit différents polymères, soit différents produits de transfection : 100 souris.

Raffinement

La modalité d'imagerie mise en œuvre est non invasive et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les injections intramusculaires sont également effectuées sous anesthésie gazeuse. Le matériel stérile à usage unique adapté aux rongeurs, ce qui limite le risque d’infection et la douleur infligés au cours de l'expérimentation. Enfin, les souris auront 1 semaine minimum d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Elles seront 2 à 6 souris maximum par cage de 530 cm² selon leur poids. Ces cages seront en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…). Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Les cages sont enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid et des granulés pour ronger et jouer avec ses congénères. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel assurera l’observation des animaux quotidiennement afin d'anticiper leur souffrance. Néanmoins, en cas de douleur observée en post injection du plasmide, une injection sous-cutanée d’un analgésique) sera effectuée. Une injection intramusculaire peut provoquer une douleur liée à un hématome. Pour les prises de sang, un crayon hémostatique sera appliqué à la fin du prélèvement afin d’arrêter le saignement.

Choix des espèces

Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. La souris est une espèce animale très largement employée dans la littérature pour ce genre d’étude de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d'utiliser des techniques d'imagerie in vivo. C'est ainsi le modèle animal de choix. La méthode mise en place dans ce projet a pour vocation de faire produire notre anticorps d’intérêt dans un système complètement fonctionnel et développé. Les animaux employés seront donc adultes, entre 7 et 10 semaines au moment de l'arrivée des animaux et leur entrée dans le protocole.

Pour vérifier si des cellules neuronales embryonnaires transformées donnent des tumeurs du muscle, et si un pesticide favorise ce basculement, 250 souris de six semaines reçoivent une greffe dans la patte. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, sans possibilité d'être réutilisées. L'épaisseur de la patte greffée est mesurée deux fois par semaine sur animal vigile, jusqu'à seize fois, et le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer une douleur modérée. La mise à mort est déclenchée par l'atteinte de points limites décrits comme précoces et prédictifs d'un mal-être, et le porteur annonce l'ajout de nourriture humidifiée au fond de la cage au cas où les souris auraient des difficultés à se déplacer.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant l’âge de 15 ans. Malgré des essais cliniques internationaux, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de mieux comprendre leurs origines et leurs particularités moléculaires pour développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet a pour objectif de déterminer si des cancers du muscle observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules neuronales, sous l’effet de facteurs environnementaux et/ou génétiques. Cette question est importante, car la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. Il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés chez les patients atteints par ces cancers du muscle dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Par ailleurs, l’exposition de ces cellules aux pesticides favorise leur potentiel tumoral. Il faut maintenant vérifier que les cellules neuronales transformées donnent des tumeurs dans les muscles. Ce projet permettra de fournir de nouvelles pistes pour comprendre l’origine de ces cancers.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer si un type de cellules embryonnaires peut être l’origine de certains cancers pédiatriques.

Procédures

Injection anti-douleur / analgésie avant la greffe (Nombre : 1 fois maxi - Durée : 30 s). Anesthésie lors de la greffe (Nombre : 1 fois au moment de la greffe tumorale - Durée : 5 min) Pesée en début de procédure puis 1 fois par semaine (Nombre : 8 fois maxi - Durée : 30 s). Mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte controlatérale avant la greffe puis 2 fois par semaine (Nombre : 16 fois maxi - Durée : 1 min).

Impact sur les animaux

Avant l’implantation intra-musculaire (IM), l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. L’implantation IM sous anesthésie quant à elle entraîne une douleur légère. Le suivi de la prise tumorale va engendrer un stress léger lors de la mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Le développement de tumeurs peut engendrer une douleur modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure ou en cas d'atteinte de points limites. Les animaux ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expériences.

Remplacement

Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d'intervenir dans le potentiel tumorigénique de ces lignées cellulaires embryonnaires. Des études in vitro précédemment réalisées ne permettent pas de répondre aux objectifs.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les mutations d’intérêt. D’après les données de la littérature et notre expérience, le taux de prise de greffe sera de minimum 50%. Ces données ont été prises en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Une fiche de scoring sera également mise en place. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures. L'administration d’antidouleur, d'anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présentent des difficultés à se déplacer.

Choix des espèces

L’utilisation de ce modèle souris est nécessaire pour étudier le potentiel tumoral des cellules embryonnaires modifiées car ces dernières sont issues du même modèle murin, permettant de s’affranchir du risque de rejet de greffe par le système immunitaire. Les cancers musculaires sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquels autant de jeunes femmes que de jeunes hommes sont touchés. Par conséquent, nous utiliserons des souris mâles et femelles dans cette procédure afin de ne pas introduire de biais liés au sexe. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines, âge optimale pour la prise de greffe d'après la littérature.