Oncologie

Injectées à une ou deux reprises alors qu'elles sont éveillées, puis piquées cinq à six fois pour des prélèvements sanguins, 5 274 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole prévoit un dernier prélèvement sous anesthésie, et les injections d'anticorps peuvent faire chuter leur température centrale de deux à trois degrés pendant une demi-heure. L'objectif déclaré porte sur l'optimisation d'anticorps thérapeutiques et sur la "bioproduction" de différents formats, la seule répétition des prélèvements suffisant à faire classer l'ensemble en souffrance modérée. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que leur système immunitaire a été modifié de manière pérenne.

Objectifs

Nous cherchons à améliorer et à optimiser les anticorps thérapeutiques pour le traitement de diverses pathologies. Nous cherchons à améliorer la sélection d'anticorps innovants et d'optimiser la bioproduction de différents formats d'anticorps en comparant les choix possibles pour leur activité in vivo. Ceci sera étudié dans des souris humanisées pour des molécules affectants le rôle des anticorps pour une meilleure translation des résultats à l’homme.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à améliorer notre compréhension de la fonction effectrice d'anticorps à visée thérapeutique pour améliorer le traitement de diverses maladies humaines. La comparaison d’anticorps produits sous différents formats avec différentes modalités servira à mieux maîtriser leur développabilité dès les premières phases de développement et d'optimiser la bioproduction de formats d'anticorps.

Procédures

- Injections sous-cutanées, intradermique, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale et intranasale sur animaux vigiles : quelques secondes. 1-2 injections par animal. - Prélèvement sanguin sur souris vigiles : quelques secondes. 5-6 prélèvements par animal. - Prélèvement sanguin sur souris anesthésiés : quelques minutes. 1 prélèvement par animal.

Impact sur les animaux

Au cours de ces expériences, il n’est pas théoriquement envisagé de douleur ou effet indésirable majeur du fait de la nature des produits injectés (anticorps ou protéine). Les prélèvement répétés de sang représentent la nuisance principale dans ce projet. Il est également possible que les animaux présentent une légère irritation au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention suivi de l’introduction d’une aiguille. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. La sévérité globale des procédures est considéré comme modérée uniquement du fait de la répétition des prélèvements sanguins au cours des protocoles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car leur système immunitaire aura été modifié de manière pérenne durant les procédures, impactant leur capacité de réponse à d’autres stimuli.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires du système immunitaire sont difficiles, voire impossible à étudier in vitro, en raison de l'implication de plusieurs organes et de l'absence d'un système circulatoire intact. Les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.

Réduction

Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs. Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances sera réalisée entre les groupes.

Raffinement

Mesures prises pour minimiser les atteintes au bien-être des animaux. Il n’est pas attendu d’effet secondaire délétère pour la santé des animaux. L'état général des animaux et le point d'injection seront surveillés quotidiennement. La procédure sera interrompue si des signes généraux sont observés. Une légère irritation peut survenir au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Si l’animal présente une posture prostrée, un poil hérissé ou une perte de poids de plus de 10-15% le raffinenement sera renforcé avec du gel hydrique ou une réhydratation sous cutanée pour prévenir/traiter les signes cliniques. Si l’animal présente une hypothermie prolongée de plus de 30 min suite à une injection ou un prélèvement, les cages pourront être chauffées avec des chaufrettes. Les soins adéquats à apporter à l'animal seront déterminés par le vétérinaire. L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte à adulte » : entre 6 et 15 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs. Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.

Inoculées à 14 jours avec un virus de la maladie de Marek modifié pour être suivi par fluorescence, 54 poules subissent ensuite six prélèvements de sang et quatre prélèvements de plumes sur animal éveillé. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que le porteur décrit une maladie hautement contagieuse et fatale pour la majorité des oiseaux infectés et attend que la plupart des animaux inoculés la développent en 63 jours, avec fièvre, ataxie, difficultés respiratoires et fatigue. Toutes les poules sont tuées en fin d'expérience pour prélever organes et plumes, les plus atteintes étant tuées plus tôt. Le porteur retient le poulet parce que cet herpèsvirus ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés, ce qui exclut selon lui tout modèle animal moins sensible.

Objectifs

Le virus de la maladie de Marek est un herpesvirus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux en quelques semaines. Ce virus se transmet entre animaux par l'intermédiaire de poussières d'élevage contaminées. Les virions présents dans l'environnement sont excrétés à partir des follicules plumeux infectés, contaminant durablement l'environnement. En effet, l'infectiosité de ce virus dans l'environnement perdure pendant plusieurs mois, ce qui est tout à fait inhabituelle pour un herpesvirus. L’objectif de ce projet est d’approfondir les connaissances sur l'excrétion de ce virus dans l'environnement en suivant les particules virales par imagerie dans les plumes et dans les poussières et de caractériser la nature du matériel infectieux. Ce virus permettra aussi d'approfondir nos connaissances sur la latence et la réactivation virale dans les tumeurs et la rate aux stades tardifs de la maladie. Dans le cadre de ce projet, nous proposons de générer un nouveau virus avec un système innovant qui permet de suivre le génome viral par fluorescence. Il sera validé en culture de cellule avant d'être testé in vivo chez le poulet. L’approche in vitro a montré ses limites, car elle ne permet pas la formation de tumeurs dans leur environnement naturel ni l'excrétion virale telles que décrites à partir des plumes avec la libération de virions infectieux, à haut titre, indépendamment de cellules vivantes.

Bénéfices attendus

Le suivi du génome viral en fluorescence dans les tumeurs, les rates, les plumes et les poussières d'élevage requiert un volet in vivo. Aucun nouveau virus n'a jamais été décrit pour MDV (virus de la maladie de Marek). Au travers de ce projet, nous espérons (i) visualiser les particules virales matures dans l'épithélium des plumes et dans les poussières de l'environnement; (ii) visualiser les cellules infectées (en latence et/ou en réactivation (centre de réplication)) dans les tumeurs et les rates, voire de les quantifier ; (iii) collecter des poussières infectieuses pouvant servir de matériel pour déterminer la nature des poussières infectieuses (taille) mais aussi l'ultrastructure des particules virales dans les poussières après enrichissement sur la base de la fluorescence. Les poussières d'élevage pourront aussi servir de matériel pour réinfecter des animaux, mais aussi pour développer un test d'infectiosité avec des cellules en culture. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : - Maladie de Marek : Meilleure caractérisation de la maladie par une détection des cellules infectées directement dans les tissus par imagerie. - Virologie : Méthode pour visualiser les particules virales MDV dans les plumes et les poussières. Description de la nature des particules virales excrétées présentes dans les poussières et des poussières contaminées. Capacité à infecter des cellules directement à partir de poussières infectieuses. - Diagnostic : Méthode pour l'évaluation de l'infectiosité des poussières dans un système en culture. Aucune méthode de ce type n'existe actuellement.

Procédures

une inoculation de virus sur animaux vigiles + 6 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 4 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute

Impact sur les animaux

(i) Hébergement. L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek afin de protéger l'environnement de la contamination par le MDV. L’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. (ii) Maladie de Marek. La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que la majorité des animaux inoculés développent la maladie durant le temps de l’étude (63 jours). Parmi les symptômes de la maladie de marek qui conduisent à un mal être de l’animal, sont retrouvés : fièvre, ataxie, difficultés respiratoires, fatigue. (iii) Gestes techniques. Les injections et prélèvements de sang et de plumes entraineront un stress chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles au niveau du site d'injection ou de prélèvement.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche limitée de la maladie. Notamment, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro la lymphomagenèse et l'excrétion à partir des plumes sous la forme de poussière. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible, est également impossible car cet herpèsvirus n’infecte que les gallinacés.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été déterminé statistiquement sur la base de résultats d’expériences précédentes avec des constructions de virus mutants. Ce nouveau virus est construit de la même façon.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe dans des isolateurs adaptés en nombre et en taille, dans des conditions environnementales contrôlées, avec nourriture et boisson à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement social. Dans les isolateurs, des objets à picorer seront à disposition. Une visite des animaux sera effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié. Les animaux présentant des symptômes graves seront euthanasiés après confirmation du diagnostic de la maladie de Marek. Les animaux présentant des symptômes légers seront surveillés plus attentivement pour détecter l'apparition de nouveaux symptômes. Les euthanasies seront réalisées par injection de pentobarbital. L'ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention sera effectuée en douceur et les prélèvements seront réalisés le plus rapidement possible. Les prélèvements de petites plumes et de sang seront réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements sera réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l'inoculation du virus, nous utiliserons des seringues à insuline et des aiguilles courtes et fines. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l'entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux.

Choix des espèces

Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront infectés à l’âge de 14 jours. Ils seront euthanasiés à maximum 78 jours d’âge. L’âge d’inoculation de 14 jours a été choisi car il permet de commencer les prélèvements sanguins dès le début de l’expérience, tout en restant suffisamment sensible à la maladie pour obtenir des résultats robustes en un minimum de temps.

Des cellules de cancer du sein triple négatif sont injectées à des souris, la tumeur mammaire est retirée sous anesthésie deux à trois semaines plus tard, puis les métastases pulmonaires sont suivies par imagerie une fois par semaine pendant quatre semaines. 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Le porteur décrit un travail préalable sur lignées cellulaires humaines et organoïdes pulmonaires, et réserve à l'animal l'étude de la progression métastatique elle-même. Sur les nuisances attendues, il retient la piqûre, "gêne de courte durée", puis mentionne des métastases pulmonaires capables d'entraîner une gêne respiratoire.

Objectifs

La progression métastatique des cancers reste le principal défi en oncologie. Le cancer du sein occupe la première position parmi les cancers féminins, et son sous-type le plus agressif, dit « triple négatif », métastase principalement dans le poumon. Les projets de notre équipe visent à comprendre les mécanismes qui permettent aux cellules cancéreuses d’atteindre le tissu pulmonaire. Dans notre équipe, nous utilisons le modèle organoïde pour étudier l’interaction entre le tissu pulmonaire et les cellules du cancer du sein. Nos données montrent que la présence de cellules cancéreuses qui métastasent spécifiquement dans le poumon in vivo modifient l’expression de gènes liés à la réponse inflammatoire dans le poumon. Notre hypothèse est donc la suivante : les cellules cancéreuses induisent un état pro-inflammatoire et donc pro-métastatique dans le poumon via une communication à distance. En partant de nos données ex vivo, notre objectif en utilisant le modèle animal est de comprendre le rôle de ces gènes liés à la réponse inflammatoire dans l’établissement de la niche métastatique pulmonaire. En modélisant la progression métastatique dans des souris sauvages ou déficientes de ces gènes, nous cherchons à comprendre la dynamique du microenvironnement pulmonaire dans le contexte des métastases.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet avanceront notre compréhension des processus métastatiques, essentielle pour arriver à terme de mieux prendre en charge des patients atteints de cancer, tout d’abord en cas de rechutes, mais surtout à les prévenir. Notre projet vise le cancer du sein triple négatif, le sous-type le plus agressif du premier cancer détecté chez les femmes, pour lequel les avancements thérapeutiques sont les plus urgents. Nous envisageons que la compréhension du rôle de gènes liés à la réponse inflammatoire dans la prévention des métastases pulmonaires pourrait donner suite aux études évaluant le potentiel thérapeutique des molécules ciblant ces gènes.

Procédures

Dans un premier lot, les animaux vigiles seront injectés avec des cellules tumorales (durée du geste

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de l’administration des cellules par injections intraveineuses ou injections dans l’abdomen seront celles liées à la piqûre elle-même (gène de courte de durée). L’injection de cellules tumorales causera le développement des tumeurs au niveau mammaire ou des métastases pulmonaires, qui pourront entrainer respectivement une gêne à la mobilité ou une gêne respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nous utilisons plusieurs stratégies de remplacement : (1) Tout d’abord, pour étudier les mécanismes intrinsèques aux cellules tumorales de propension métastatique, nous disposons de plusieurs lignées cellulaires humaines de cancer du sein triple négatif qui diffèrent dans leurs potentiels et tropismes métastatiques. Nous utilisons donc systématiquement ces modèles in vitro. (2) Pour mieux comprendre l’interaction entre les cellules tumorales et le tissu pulmonaire, nous utilisons le modèle organoïde. Nous dérivons des organoïdes pulmonaires des cellules souches pluripotentes humaines, et procédons aux co-cultures avec les cellules de cancer du sein. Seuls les gènes candidats dont nous aurons montré l’importance dans ces deux systèmes seront ensuite étudiés in vivo. Cependant, la progression métastatique est un processus multi-organe, qui implique plusieurs étapes complexes, et enfin l’établissement dans le tissue secondaire. Modéliser ce processus ex vivo reste encore un défi à atteindre. Nous envisageons donc à procéder à l’utilisation des organoïdes vascularisés, et ensuite assemblés avec les cellules immunitaires pour mieux modéliser la progression métastatique. Cependant, l’animal vivant reste le modèle le plus adapté pour l’étude de progression tumorale, surtout métastatique, car ce processus est multi-organe. L'apprentissage des gestes techniques sera réalisé dans un premier temps sur mannequins puis sur cadavres frais.

Réduction

Nous allons utiliser le nombre minimal d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs. Nous utiliserons systématiquement l’imagerie pour les suivis de la progression métastatique dans le poumon. Cette méthode permet d’éviter la mise à mort des animaux à différents temps pour le suivi des métastases pulmonaires. Chaque mise à mort des animaux sera exploitée et optimisée en récoltant un maximum de prélèvements, permettant ainsi de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. Dans les procédures où la tumeur primaire est enlevée chirurgicalement, les tumeurs seront récupérées pour différentes analyses. L'utilisation de mannequins ou de cadavres pour l'apprentissage des gestes techniques permettra de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux, et les valeurs seuil sont définies pour commencer les soins nécessaires ou mettre à mort les animaux. Les gestes invasifs ou nécessitant l’immobilité de l’animal seront réalisés sous anesthésie générale avec recours aux analgésiques si nécessaire. Toutes les mesures seront prises pour éviter l’hypothermie, la déshydratation et le stress respiratoire liés à l’anesthésie. Les soins post-opératoires seront mis en place pour réduire la douleur et l’inconfort des animaux : surveillance accrue, analgésie, prévention des infections, aliment hydraté. L'apprentissage des gestes techniques sera réalisé de manière séquentielle, sur mannequin puis sur cadavre frais avant de passer à l'animal vivant. L'acquisition du geste technique sear validée, par des opérateurs expérimentés, grâce à des critères précis et précoces.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier la biologie de cancer en général, et pour comprendre le processus métastatique en particulier. Cela est dû au fait que les systèmes de plusieurs organes (y compris pulmonaire, vasculaire, immunitaire) sont comparables à ceux de l’homme et très bien caractérisés depuis plusieurs décennies. De plus, le modèle souris et les procédures utilisées sont très bien établis et standardisés dans le domaine. La disponibilité de lignées génétiquement modifiées et de souris immunodéficientes est un autre atout très important pour la faisabilité des expériences et pour les greffes de cellules humaines. Les souris adultes, âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour toutes les expériences. Le cancer du sein se manifeste chez les femmes adultes, et les souris de cet âge sont couramment utilisées pour modéliser la progression métastatique par greffe des cellules cancéreuses

Injectées d'une toxine bactérienne dans l'abdomen, prélevées de 20 microlitres de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, 144 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le dernier jour, sous anesthésie profonde, la peau du crâne est ouverte pour observer la moelle osseuse au microscope à travers l'os, pendant trois heures. Le porteur anticipe pour cette étape un risque d'hypothermie, un dessèchement des yeux et une douleur liée à la durée de l'anesthésie, et attribue aux cycles répétés d'anesthésie et de réveil une nuisance modérée. Toutes les souris sont tuées par prélèvement de 800 microlitres de sang à l'aorte abdominale ou à la suite de la chirurgie crânienne, gestes qu'il qualifie de terminaux.

Objectifs

Les plaquettes sanguines, qui jouent un rôle vital dans l’arrêt des saignements, sont produites dans la moelle osseuse à partir des mégacaryocytes, des cellules remarquables par leurs grandes tailles et leur noyau polyploÏde. Les processus de différenciation et de maturation vers la lignée mégacaryocytaire (mégacaryopoïèse) s’effectuent sous l’influence du microenvironnement médullaire, incluant notamment des macrophages qui ont pour rôle principal la phagocytose. Des observations récentes au laboratoire mettent en évidence l’existence, dans la moelle osseuse, des nombreuses interactions entre les mégacaryocytes et les macrophages et leur implication dans la mégacaryopoïèse et la production éventuelle de plaquettes. Les macrophages jouent un rôle essentiel dans l’initiation, le maintien et la résolution de l’inflammation. De plus, on sait que les conditions de stress telles que l’inflammation ont un impact significatif sur le phénotype et la fonction des macrophages. Ainsi, il sera intéressant d’étudier l’impact de l’inflammation sur l’interaction entre les macrophages et les mégacaryocytes dans le microenvironnement de la moelle osseuse avec un accent particulier sur son influence sur la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre l’impact de l’inflammation sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la maturation des mégacaryocytes et la formation des plaquettes notamment dans les maladies inflammatoires permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par des mégacaryocytes dans les conditions pathologiques, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements adaptés chez les patients avec l’inflammation systémique et risque de thrombose. Les données recueillies concernant l’effet induit par l’infection permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués à la fois dans le développement des maladies parodontales et leur implication dans la perturbation de l'homéostasie de la moelle osseuse et sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines ainsi que des pathologies associées par exemple thrombose afin de pouvoir, par la suite développer de nouvelles thérapeutiques. La mise en évidence de nouveaux mécanismes, notamment l’identification de nouveaux récepteurs et/ou molécules, permettra de mieux comprendre les interactions entre les maladies parodontales et les maladies générales, ces bactéries ayant été retrouvées, à distance au niveau d’organes tels que le foie, le cœur et les vaisseaux, et la moelle notamment. Les mécanismes impliqués semblent mettre en jeu une activation exacerbée, locale et à distance, de la réponse immune innée induisant une sécrétion amplifiée de médiateurs de l’inflammation aboutissant à la destruction tissulaire. L’amélioration des connaissances mécanistiques et moléculaires permettra à terme d’améliorer les stratégies de prise en charge des patients atteints de comorbidités et de développer de nouvelles approches pharmacologiques spécifiques.

Procédures

Les injections en IP se font en une fois et les prélèvements 20µL de sang à la queue se font sous anesthésie courte à l'isoflurane 2% de 10 minutes en début et en fin d'expérience. La dissection du crâne et l'immobilisation de l'animal sous le microscope se fait le dernier jour de l'expérience, sous anesthésie profonde. Injection en ip pour l'anesthésie profonde en 1x. Injection sc de l'analgésique : 1x Anesthésie gazeuse au masque 2% 10 minutes pour les étapes de prélèvements à la queue et 0.5% 3h pour l'observation au travers du crâne le dernier jour. Chirurgie crâniale : sous anesthésie profonde en ip pour 30 minutes. Le prélèvement de sang de 800µl à l'aorte abdominale sous anesthésie profonde est terminal. Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Les injections et prélèvements de sang (seulement une fois) présentent un risque léger de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés au LPS (toxine bactérienne) ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie au travers du crâne de l'animal anesthésié, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales que ce soit par prélèvement à l'aorte abdominale ou suite à une chirurgie craniale.

Remplacement

Cette approche in vivo permettra de confirmer les résultats obtenus par l’approche in vitro ayant permis de mettre en évidence des preuves de concept et l’identification de nouveaux mécanismes moléculaires associant bactériémie et l’inflammation systémique car il n’est pas possible de reproduire de manière fidèle la complexité des interactions tissulaires et cellulaires de la moelle osseuse in vitro. Un modèle expérimental d’injection intra-péritonéale permettra de mimer la situation clinique observée à savoir la bactériémie associée avec l’inflammation systémique. Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie des mégacaryocytes et la production des cytokines, diffèrent fortement dans des mégacaryocytes en culture par rapport à ceux observés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit par l’emploi de méthodes statistiques adaptées. Les mécanismes seront dans un premier temps évalués in vitro dans des cultures cellulaires pour déterminer les cibles d’intérêt physiopathologiques et thérapeutiques. A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris déterminé permettra d’obtenir des résultats statistiques solides. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).

Raffinement

Le raffinement se fera par une prise en compte du bien-être animal (enrichissement du milieu comprenant la mise à disposition de languettes de papier et d’un large tube en carton. Ce tube est utilisé comme refuge ou bien déchiqueté par les rongeurs comme substrat permettant, en complément des languettes de papier et de la litière, la composition d’un nid et soins quotidiens aux animaux) et par l’établissement de points limites permettant de limiter la douleur et la souffrance de l’animal. Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. Lors de la chirurgie pour les expériences intra vitales sous anesthésie une analgésie par injection sous cutanée de buprénorphine et de lidocaïne est apportée.- Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont sacrifiés avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Quand un score de 4 est observé, la souris est mise à mort par inhalation progressive de CO2. Quand un score de 2 est observé, une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Le prélèvement à l'aorte se fera sur des souris adultes sans distinction entre 8 et 35 semaines, il est connu que la moelle des souris plus agées change et présente plus de cellules graisseuses de type adypocyte interférent dans nos études. Par contre l’approche d’imagerie intravitale requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière.

Jusqu'à 25 injections intracérébrales sur animal éveillé, une à deux neurochirurgies de 45 minutes, une à deux semaines en cage individuelle : 6 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau et d'autres tissus. Le régime hyperlipidique imposé peut doubler leur poids initial, et des jeûnes de 4 à 24 heures alternent avec des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur veut comprendre le rôle des cellules immunitaires de l'hypothalamus dans la prise de poids, et présente la souris comme un bon modèle prédictif du contrôle de la prise alimentaire humaine. Les retombées thérapeutiques annoncées restent suspendues à l'hypothèse de départ, qu'il formule au conditionnel, "dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse".

Objectifs

L’obésité est un fléau dans nos sociétés modernes. Cette maladie chronique touche presque un quart de la population mondiale et s’accompagne de nombreuses comorbidités (diabète, maladies cardio-vasculaires, anxiété, cancers…). Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité, il est notamment nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Le cerveau orchestre cette régulation en engageant une « communication » avec les différents organes du corps. Pour cela, il reçoit des signaux les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. Ces signaux sont captés par des neurones spécialisés, situés dans l’hypothalamus. Outre les neurones, certaines populations de cellules immunitaires du cerveau sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. L’hypothalamus réagit à la consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD), en déclenchant une neuroinflammation locale, qui correspond à une activation des cellules immunitaires hypothalamiques. On peut imaginer que c’est un peu comme quand les cellules immunitaires réagissent à un microbe. Cette inflammation est néfaste à long-terme car elle dérègle le fonctionnement des neurones hypothalamiques, et donc le contrôle du poids corporel. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment fonctionnent les différentes cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l’inflammation en réponse à un régime HFD qui déclenche l’obésité. Ces connaissances permettront de mettre en place des stratégies pour mieux limiter l’inflammation, prévenir la prise de poids et les comorbidités associées à l’obésité. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux mutés génétiquement). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène (HFD). Nous réaliserons un suivi métabolique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques et comportementaux), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend huit procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans l’hypothalamus. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation des cellules immunitaires hypothalamiques afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur tous les animaux vigiles : 5 min, entre 2 et 5 fois. Nombre d’animaux : 6496. 2) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, entre 1 et 2 fois. Nombre d’animaux : 1712 (1 chirurgie) et 384 (2 chirurgies). 3) Test de tolérance au glucose (GTT) et d’insuline (ITT) sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min), répétée 2 fois (GTT) et 1 fois (ITT). Nombre d’animaux : 3648 (GTT) et 1248 (ITT). 4) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : entre 1 et 2 semaines en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 992 pour une semaine, 1392 pour deux semaines. 5) Injections intracérébrales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 3-4 min (contention d’une minute maximum). Répétition : entre 14 (toutes les 24h) et 25 fois (tous les 4 jours). Nombre d’animaux : 384 pour le groupe « 14 fois », 864 pour le groupe « 25 fois ». 6) Injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 30 sec max, entre 1 et 9 injections. Nombre d’animaux concernés : 1120. 7) Tests comportementaux de la mesure de l’anxiété. Durée : entre 10 et 40 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de 2 jours. Nombre d’animaux : 2400.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser le double du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeûne (4h ou 24h). 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. Suite aux incisions chirurgicales, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins d’une heure, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle des cellules immunitaires présentes dans une région du cerveau sur la régulation du poids, de la masse grasse et du taux de sucre dans le sang (glycémie). Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. Enfin, les modèles d’animaux génétiquement modifiés (pour tester nos hypothèses) sont largement développés chez la souris.

Réduction

Ce projet a fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures primaires de cellules) afin de tester différentes hypothèses en amont. Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différentes tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. La surveillance des animaux sera quotidienne et renforcée durant les périodes expérimentales et au constat possible de dégradation du bien-être des animaux. 2) L’évaluation de la prise alimentaire individuelle nécessite parfois l’hébergement individuel des animaux. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres (maintien d’interactions olfactives, visuelles et sonores). L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que l’évaluation du maintien du bien-être animal. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée : anatomique, physiologique et comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, des mesures conservatoires et des critères d’arrêt de l’expérimentation seront rapidement mis en place, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, du comportement alimentaire et de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux modifiés génétiquement, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les effets cérébraux d’un régime hypercalorique est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neurochirurgie ainsi que de s’affranchir des effets de la croissance pubertaire.

Des cellules cancéreuses sont injectées dans la veine de la queue ou sous la peau de souris sans poils, l'expansion tumorale gagnant les membres inférieurs et le bassin jusqu'à gêner progressivement les déplacements. 576 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec 10 à 12 prélèvements sanguins hebdomadaires sur animal éveillé et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées entre la douzième et la quatorzième semaine, quand la greffe est jugée assez développée pour l'analyse. Le porteur ne retient des gestes pratiqués qu'une douleur "légère et de courte durée", et lit les mouvements d'étirement des pattes comme le signe d'une greffe réussie qui évolue.

Objectifs

Le projet vise à démontrer, chez l’animal, comment deux gènes mutés dans la même cellule contribuent au développement de la mastocytose, une maladie qui affecte plusieurs organes ou uniquement la peau. Nous pourrons ainsi valider les observations réalisées in vitro sur l'implication de nouveaux gènes dans la maladie et qui soulignent la nécessité de développer des traitements personnalisés ciblant les effets de ces gènes sur les patients. Avant de tester de nouveaux médicaments, il est crucial de comprendre comment ces gènes influencent la maladie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet confirmeront la nécessité de développer des thérapies personnalisées ciblant les dérégulations qui ont lieu chez les patients. La réalisation de ce projet est indispensable avant de prévoir l’étude préclinique qui consistera à tester l’efficacité de nouvelles drogues. Cette stratégie a démontré son efficacité dans notre précédente étude.

Procédures

Une seule injection de cellules cancéreuses sera réalisée chez les souris, soit par voie intraveineuse (dans la veine) soit par voie sous-cutanée (sous la peau). L’injection, effectuée sous anesthésie générale (pour les injections sous la peau) ou sans anesthésie (pour l'injection dans la veine de la queue), dure seulement quelques secondes. Un petit échantillon de sang sera prélevé chaque semaine sur les souris, avec un total de 10 à 12 prélèvements ; chaque prélèvement dure moins de 5 secondes (animal éveillé). Ces animaux seront également examinés par imagerie 3 à 5 fois au total. Les deux méthodes d’analyse sont complémentaires pour le suivi précis de la cinétique de multiplication des cellules. Pour les souris ayant reçu une injection sous-cutanée, un seul prélèvement de sang sera réalisé à la 10ème semaine, pour vérification, car les cellules ne devraient pas migrer dans le sang. Le suivi de la greffe cutanée est fait par imagerie (8 au total). L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale et dure maximum dix minutes.

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale provoque une baisse de la température corporelle, un assèchement des yeux et un stress dû à la manipulation. L’injection des cellules pourrait provoquer une douleur légère et de courte durée après le réveil. L’imagerie peut entrainer du stress et une gêne de courte durée liée à l’anesthésie. Les prélèvements de sang, bien que brefs, peuvent provoquer du stress et une douleur légère durant les minutes qui suivent le réveil. L’expansion des cellules au niveau cutané peut provoquer des démangeaisons. L'expansion des cellules préférentiellement au niveau des membres inférieurs et du bassin, peuvent entrainer une difficulté progressive de se mouvoir. Des mouvements d’étirements des pattes indiquent une greffe réussie qui évolue, à surveiller de près.

Devenir

Les animaux utilisés sont euthanasiés entre la 12 et la 14 semaine suivant l’injection des cellules, ce délai correspondant au stade où la greffe est suffisamment développée pour permettre l'analyse des souris.

Remplacement

Au cours des trois dernières années, nos recherches en laboratoire ont cherché à comprendre comment certains gènes interagissent dans la mastocytose, un type de cancer qui peut se manifester soit dans plusieurs organes, soit uniquement sur la peau. Cependant, ces études en laboratoire ont leurs limites, car elles ne reproduisent pas entièrement les conditions réelles, où l'environnement autour des cellules joue un rôle crucial dans le développement du cancer, sa propagation et la résistance aux traitements. Les souris sont essentielles pour recréer, même partiellement, les conditions pathologiques chez les humains et pour explorer comment les gènes interagissent afin de tester de futurs traitements. Par exemple, pour mieux étudier la forme cutanée de la maladie, nous utilisons des souris sans poils. Ce modèle nous aide à suivre de près comment les cellules cancéreuses envahissent la peau, de manière similaire à ce qui se passe chez les patients.

Réduction

Nous avons choisi deux types de souris pour notre étude en raison de leur pertinence pour notre travail et de leur utilisation fréquente en recherche. Le premier type nous aide à étudier le cancer quand il touche différents tissus dans le corps, tandis que le second est utilisé pour observer la forme du cancer qui se manifeste uniquement dans la peau. Grâce à notre expérience et aux informations recueillies de précédentes études, nous savons combien de cellules injecter, comment les tumeurs se développent avec le temps, à quelle fréquence nous devons prélever du sang, quand et comment réaliser l’imagerie et quand il est nécessaire de mettre fin à l’étude.

Raffinement

Dans le cadre de notre projet, nous mettrons en place des méthodes de raffinement qui visent à garantir que les modèles animaux sont traités de manière éthique et que leur bien-être est pris en compte. 1.Anesthésie pour réduire la douleur et l'inconfort des animaux. 2.La surveillance régulière de la santé des animaux permet de détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse, ce qui permet une intervention précoce. 3. Enrichissement de l'environnement avec des éléments tels que des abris, des jouets, ou des matériaux à mâcher pour stimuler les comportements naturels et améliorer le bien-être des souris.

Choix des espèces

Le modèle souris s'avère particulièrement approprié pour notre étude sur la mastocytose, car il répond à notre besoin de comparaison avec la pathologie observée chez les patients et repose sur des recherches préexistantes, éliminant ainsi la nécessité de mises au point supplémentaires. Les souris seront greffées entre 5 et 8 semaines d'âge. Les expériences antérieures montrent que ce stade est optimal pour une bonne prise de greffe dans les deux souches, bien qu'il soit possible de les greffer jusqu'à 12 semaines d'âge.