Oncologie

Toutes tuées à l'issue pour des analyses sur les tissus prélevés, 328 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, jusqu'à deux injections d'un virus modifié ou de solution salée, et deux séances d'imagerie de seize minutes sur cinq semaines. Le virus retenu se fixe 210 fois plus sélectivement sur les cellules cancéreuses que sa version d'origine, selon des essais menés en culture cellulaire. Parmi les bénéfices attendus, le porteur annonce une régression tumorale "sans perte de poids ou effet secondaire notable", alors que la liste des effets indésirables qu'il prévoit comprend la perte de poids, une nécrose au point d'injection et une encéphalite provoquée par le virus.

Objectifs

Malgré les traitements existants, les tumeurs cérébrales restent parmi les cancers ayant les plus mauvais pronostiques à court terme. La chirurgie n’est pas toujours possible, et même lorsqu’elle l’est, cette solution n’est souvent pas suffisante, comme en témoigne l’émergence de récidives dans la majorité des cas. La radiothérapie et la chimiothérapie ne sont pas plus efficaces, car elles engendrent rapidement une sélection des population cellulaires résistantes responsable des récidives. Ces aspects limitent l’espérance de vie des patients à 1 ou 2 années malgré la prise en charge thérapeutique. L’échec de ces thérapies est généralement lié à la récidive tumorale engendrée par des cellules résistantes aux traitements conventionnels surexprimant un marqueur tumoral spécifique. Le projet vise à développer un protocole complémentaire aux thérapies traditionnelles basé sur l’utilisation de virus capables d’éliminer les cellules cancéreuses. A ce jour le test le plus avancé pour l’utilisation de ce type de virus dans le cadre des glioblastomes repose sur l’injection d’un adénovirus directement dans la tumeur. Toutefois cet adénovirus n’est pas sélectif des cellules cancéreuses. Même s’il les élimine moins efficacement que les cellules cancéreuses, il est aussi capable d’infecter les cellules saines. Cette non sélectivité induit une perte d’efficacité de la thérapie, des effets secondaires et complique son administration aux patients. Afin d’éliminer ces problèmes, nous utiliserons un virus innovant, capable de sélectionner préférentiellement les cellules résistantes exprimant le marqueur spécifique. La modification principale du virus consiste modifier une protéine de surface permettant d’obtenir un virus ciblant spécifiquement les cellules tumorales porteuse du marqueur spécifique. Il a été montré, en culture de cellules, que cette ce virus modifié se réplique préférentiellement sur les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : la mise en évidence d’une régression tumorale suite à l’injection du virus (en mono ou bi injection) sans perte de poids ou effet secondaire notable ainsi que la possibilité d’administrer le virus par voie intraveineuse tout en conservant son efficacité

Procédures

Dans la procédure 1 : Chaque animal recevra au maximum 3 injections sous anesthésie gazeuse de 3 minutes chacune soit 9 minutes maximum. Pas de prélèvement sur animal vigile. Dans la procédure 2 : Chaque animal aura : - 1 anesthésie de 3 minutes pour injection de cellules tumorales à J0 - 2 anesthésies de 3 minutes pour injection de virus ou solution saline - 2 anesthésies de 16 minutes pour les séances d'imagerie . Total 50 minutes maximum sur 5 semaines

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - hématome transitoire au niveau du site d'injection intraveineux caudale (72h maximum) , - nécrose transitoire des tissus au niveau du site d'injection intratumoral, - perte de poids de l'animal, - développement de tumeur suite à l'injection de cellules tumorales, - encéphalite induite par le virus

Devenir

a la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des études complémentaires ex vivo sur les tissus et organes prélevés.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux testés, la spécificité des virus a déjà été étudiée en culture cellulaire in vitro. Le Sindbis (virus non modifié) n’a pas montré de sélectivité particulière pour les cellules tumoralespar rapport aux cellules non tumorales , alors que le virus Sinerpedoxx (virus modifié ciblant les intégrines) permet une infection 210 fois plus sélective (que le variant Sindbis) des cellules cancéreuses par rapport aux cellules non tumorales. La capacité des virus Sindbis et Sinerpedoxx à générer la mort cellulaire des modèles cellulaires tumorales a aussi été démontrée dans des expériences préliminaires (ainsi que dans la littérature). Il est maintenant indispensable de tester l’effet antitumoral de l’administration du virus sur un modèle animal de glioblastome. En effet, le modèle cellulaire ne peut pas recréer le micro-environnement tumoral ni les interactions avec le système immunitaire ainsi que l’impact de la voie d’administration (intraveineuse ou intratumorale) sur l’effet thérapeutique.

Réduction

L’imagerie TEP est peu invasive qui permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin, il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Nous utiliserons ainsi 10 souris par radiotraceur à l'inclusion afin d’avoir des statistiques sur les résultats obtenus. Cet effectif est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude en raison d’atteinte de point limite. Le test statistique utilisé est adapté pour les petits effectifs.

Raffinement

Les animaux sont placés à plusieurs par cage, ont accès à l' eau et à la nourriture à volonté, et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et permettre une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite sa thermorégulation ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de points limites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.

Choix des espèces

Des tests cellulaires in vitro ont déjà été réalisés. Cependant, le modèle animal est indispensable pour évaluer l’effet thérapeutique des virus dans des modèles tumoraux, en l’occurrence le glioblastome. La souris est l’espèce la plus adaptée pour répondre à cette question. De plus par sa taille, elle permet de réduire les quantités de radioactivité injectées à l’animal et donc les effets secondaires. Nous utiliserons des souris adultes de 7 ou 8 semaines conformément à la littérature et à notre expérience

288 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie profonde pour prélever un volume important de sang. Chacune reçoit une injection sous-cutanée sur animal vigile de cellules coliques humaines exposées pendant plusieurs mois à trois pesticides, puis un prélèvement dans le sinus rétro-orbital. La question posée consiste à savoir si ces cellules, déjà transformées en culture par les pesticides, forment une tumeur une fois greffées. Le porteur justifie ce passage à l'animal par le fait que ces pesticides sont commercialisés depuis trop peu de temps pour qu'une étude épidémiologique soit possible chez l'être humain.

Objectifs

Le cancer colorectal, au niveau mondial, est le 3ème cancer le plus diagnostiqué après le cancer du poumon et du sein (plus de 1,8 million de nouveaux cas par an) et le 2ème cancer le plus mortel après le cancer du poumon (plus de 900 000 décès par an). Selon les estimations, ces chiffres devraient encore augmenter et atteindre plus de 2,2 millions de nouveaux cas et 1,1 million de décès par an d'ici 2030. Au cours de ces dernières années, certains facteurs environnementaux sont apparus comme une cause possible de l'augmentation de la prévalence de maladies chroniques, y compris certains cancers. In vitro nous avons observé qu’une exposition chronique de cellules non tumorales coliques pendant plusieurs mois à trois pesticides, seuls ou en cocktail provoque des changements importants et irréversibles (persistant après la levée de l’exposition). Notre objectif est de déterminer si ces altérations reflètent un mécanisme de cancérisation des cellules et si cette exposition chronique aux pesticides peut favoriser ou non le développement tumoral.

Bénéfices attendus

L’objectif est de déterminer si l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales à trois pesticides fréquemment détectés dans notre alimentation favorise ou non le développement tumoral. La mise sur le marché de ces composés est en effet encore trop récente pour permettre de mener des études épidémiologiques chez l’homme et estimer le risque que peut représenter une exposition chronique à ces composés sur la santé humaine. L’étude permettra également de valider des biomarqueurs tumoraux sanguins destinés, à terme, à améliorer le diagnostic et suivi des patients atteints de cancers

Procédures

La procédure implique au maximum une injection sous-cutanée sur animal vigile en début d’expérience (moins d'1 minute) et un prélèvement sanguin sur animal anesthésié en cours d’expérience (1-2 minutes maximum).

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à une légère douleur de courte durée lors des injections de cellules chez l’animal vigile. On peut également s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. Nous n'attendons pas d'autres nuisances ou effets indésirables majeurs sauf peut-être de très rares cas de détérioration de l’état général des animaux (perte de poids, par exemple) ou de nécrose de la tumeur. Un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital au cours du suivi du développement tumoral chez l’animal anesthésié ne devrait pas non plus occasionner de nuisance particulière, si ce n’est peut-être une légère douleur ou inconfort au réveil.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde (sans réveil) et sous analgésie pour permettre le prélèvement d’un volume de sang important.

Remplacement

Nos résultats in vitro démontrent que l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales aux pesticides provoque des changements morphologiques importants et irréversibles. La question que nous posons est de savoir si ces cellules ont acquis la capacité de développer une tumeur, une question qui ne peut être résolue qu’in vivo, dans un microenvironnement complexe. Il n’y a, en effet, pas de systèmes alternatifs pour évaluer de façon fiable le processus d’initiation tumorale.

Réduction

Pour tester l’hypothèse selon laquelle l’exposition aux pesticides in vitro pourrait conférer à nos cellules une capacité à former des tumeurs lorsqu’elles sont xenogreffées chez la souris nude, nous avons évalué, à l’aide du logiciel G-Power, le nombre minimum requis de souris par groupe à 8 pour obtenir des données statistiquement valides.

Raffinement

La procédure a été optimisée au cours d’études similaires précédentes, dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis et la surveillance de l’état clinique des animaux se fera au quotidien, y compris les week-ends et jours fériés afin de détecter le moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. Les observations et l’évolution de l’état général des animaux conditionneront les prises de décisions (injection d’analgésique et si nécessaire, euthanasie).

Choix des espèces

La souris est l’espèce la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence (y compris les nôtres) dans le domaine de la cancérologie sont nombreuses, bien documentées et bien validées. En particulier, les modèles de souris immunodéprimées sont idéaux pour la recherche sur les greffes de cellules cancéreuses et sont classiquement utilisés pour analyser la réponse tumorale. Après 1 semaine d’acclimatation en zone d’hébergement, les souris agées de 6 semaines seront réparties de manière homogène entre les lots à raison de 8 souris/lot. Les souris adultes offrent en effet un modèle expérimental plus robuste, stable et pertinent pour les études de xénogreffe tumorale (plus grande facilité de manipulation, meilleure tolérance des procédures, croissance tumorale plus prévisible et plus uniforme, pertinence par rapport à la tumorigenèse humaine qui est plus fréquente chez les adultes).

Gavées une fois par jour pendant douze semaines, soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes et à une incision du bout de la queue pour un prélèvement de sang, 5 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes. L'objet du projet consiste à reproduire chez la souris des anomalies de comportement et de transit intestinal associées à l'autisme, en administrant des métabolites bactériens à des animaux dès l'âge de quatre semaines. Le porteur annonce des batteries de tests évaluant le comportement social, les comportements répétitifs et l'anxiété, avec des durées allant de quatre minutes trente à soixante-douze heures, sans nommer un seul de ces tests.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un partenaire crucial pour la santé humaine. Des études récentes montrent l’existence d’un axe de communication microbiote-intestin-cerveau par lequel le microbiote peut influencer le comportement. L'autisme, avec une prévalence de 1% s'accompagne de troubles comportementaux (déficits d'intéraction sociale, stéréotypies) et de comorbidités (anxiété, dépression, hyperactivité). Aussi les patients autistes ont fréquemment des symptômes gastro-intestinaux (constipation, diarrhée, douleurs abdominales, ballonnements) associés à des altérations des abondances de certaines bactéries de leur microbiote intestinal et des petites molécules qu’elles produisent, les métabolites microbiens. Ces anomalies sont aussi reproduites dans des modèles souris d’autisme. Les causes de l’autisme sont encore méconnues, mais des dérégulations de l’axe cerveau-intestin-microbiote semblent y jouer un rôle. Cela suggère que des thérapies ciblant les bactéries du microbiote ou bien les métabolites qu’elles produisent pourraient être bénéfiques, comme par exemple le transfert de microbiote, les probiotiques et les prébiotiques. Leur efficacité reste cependant à démontrer. Des métabolites issus de la dégradation de l’alimentation par les bactéries du microbiote présentent des niveaux anormalement élevés ou bas dans l'urine, le plasma et les selles de patients autistes. Les bactéries productrices et consommatrices de ces métabolites sont aussi fréquemment dérégulées chez les patients autistes. Dans ce projet de recherche, nous allons identifier parmi ces métabolites microbiens et ces bactéries ceux et celles capables d'induire chez la souris des anomalies comportementales et/ou gastro-intestinales. Aussi, nous identifierons leur mode d'action en utilisant des approches pharmacologiques. Également, nous identifierons des métabolites et des traitements probiotiques capables de restaurer les anomalies du comportement et les troubles gastro-intestinaux dans des modèles d’autisme. Ce projet ouvrira la voie à une meilleure compréhension de l’autisme et à de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un intérêt translationnel car l'étude apportera des connaissances sur les mécanismes physiologiques et neurobiologiques fondamentaux responsables des troubles du spectre de l’autisme et de l’implication du microbiote intestinal. Ce projet permettra de faire avancer les connaissances sur l'étiologie de l'autisme et pourra contribuer à valider pré cliniquement dans des modèles animaux des stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote pour les troubles du spectre de l'autisme.

Procédures

• Identification par injection sous-cutanée de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement de sang de 100µL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 12 semaines en fonction de la procédure. • Injections intrapéritonéales : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 10 jours en fonction de la procédure. • Anesthésie à l’isoflurane et imagerie sur animal anesthésié : durée 10 min ; fréquence 5 fois sur 48h en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Ce projet obéit à la règle des 3R. Cependant, certains des traitements proposés pourraient impacter le métabolisme, le comportement et\ou la physiologie intestinale des groupes d’animaux traités par rapport aux groupes témoins. Pour détecter ces changements, un suivi au moins 2 fois par semaine du poids des animaux, de leur consommation en eau et nourriture permettra d’évaluer l’état physiologique global de l’animal en réponse au traitement. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée et qui n’induisent pas de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). De plus, l’inconfort sera limité à la durée du test. Concernant l’évaluation de la physiologie intestinale, les tests provoqueront un inconfort mais limité à la durée du test. Un prélèvement sanguin sera réalisé lors du test de perméabilité intestinale, cependant un volume faible de sang sera prélevé et l’inconfort sera limité au temps nécessaire au prélèvement. Dans le cas du traitement administré par voie intrapéritonéale, une attention particulière sera portée à l’état du site d’injection (gonflement, rougeur).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques, indispensable pour une meilleure comprehension des mécanismes associés à notre contexte d'étude.

Remplacement

La littérature scientifique sur notre sujet a permis de sélectionner les métabolites microbiens, les bactéries et les substances pharmacologiques les plus pertinents, ainsi que les quantités et concentrations utilisées respectant un contexte physiologique. Avant les expérimentations sur l’animal, des expériences in vitro ont été et seront réalisées sur des cultures bactériennes permettant de mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Cependant, pour évaluer l'impact du traitement avec des métabolites microbiens, des probiotiques et une substance pharmacologique à l'échelle de l'organisme entier au niveau gastro-intestinal et comportemental, le recours à l'animal sera nécessaire. En effet, l’étude du comportement animal fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et des processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car ce n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.

Réduction

Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs réalisés avec un logiciel dédié ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus pertinents. Les résultats seront analysés avec un logiciel dédié. Un total de 5832 animaux est requis pour ce projet.

Raffinement

Les paramètres suivants basés sur l'expérience de l'expérimentateur seront suivis pour nous permettre d'assurer le suivi du bien-être animal : le poids corporel, l'apparence physique, des signes cliniques objectifs tel qu’un changement de température corporelle suite à une alerte sur un animal, des comportements anormaux ou non provoqués, des réponses comportementales à des stimuli spécifiques ainsi que l'état général du site d'injection et un suivi de l’aspect des fèces indiquant ou non la présence de diarrhée. Nos conditions d’élevage comprennent une stabulation par groupes d'au moins quatre animaux, un enrichissement de l'environnement (coton pour nidifier, maison), ainsi qu'un contrôle strict de la température et de l'humidité. Un suivi quotidien des animaux est également assuré par le personnel animalier et par nous même dans le cadre des expérimentations. La majorité des procédures induiront un inconfort faible et de courte durée, sans causer de dommages. Pour les procédures affectant potentiellement le bien-être des animaux, un suivi basé sur une grille de score pourra être établi et permettra de détecter toute souffrance et de décider de la suite à donner, notamment en appliquant des points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

L'autisme cause des anomalies du comportement handicapantes. Toutes ces anomalies sont modélisables chez la souris à l’aide de batteries de tests de comportement réalisables chez la jeune souris ou l’adulte. Aussi, la physiologie intestinale de la souris (perméabilité, motilité intestinale et colonique) ne peut être appréciée que chez l'animal vivant. Les études précliniques sur l'autisme imposent donc des études in vivo, chez l’animal, afin d'identifier des mécanismes difficilement modélisables in vitro et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Puisque nous nous intéressons aux conséquences neurodéveloppementales de l’exposition aux métabolites Microbiens, nous préférons travailler dans une fenêtre où le système nerveux est encore capable d’une certaine plasticité (adolescence 4 semaines). Pour les procédures 1 et 2, nous recevrons les animaux à l'âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Nous commencerons le traitement dans la 4ème semaine et évaluerons le comportement et le tractus GI après 4 semaines de traitement, soit lorsque les animaux auront entre 8 et 10 semaines. Pour les procédures impliquant un traitement pour restaurer les phénotypes induits par les métabolites microbiens (procédure 3), les animaux seront suivis jusqu'à l'âge de 14-16 semaines.

Greffées d'une tumeur sous la peau ou directement dans le poumon, le pancréas, le foie ou le cerveau, 2 000 souris immunodéprimées sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et les organes. Chaque animal reçoit une injection de nanoparticules puis une séance de radiothérapie, avec une imagerie sous anesthésie par semaine pendant huit semaines au maximum. L'objectif immédiat consiste à choisir un schéma de traitement en vue d'un essai clinique, essai renvoyé au futur. Le porteur écrit que la radiothérapie "ne devrait pas engendrer d'effets indésirables" et que l'imagerie est indolore, tout en reconnaissant que le modèle de souris aux défenses immunitaires réduites constitue "une nuisance en soi".

Objectifs

Selon les données récentes de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués en 2020, et les projections estiment que ce nombre atteindra près de 30 millions d'ici 2040. La radiothérapie est un traitement clé dans la prise en charge du cancer, utilisée chez environ 50 à 60 % des patients à un moment de leur parcours thérapeutique. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses tout en préservant au maximum les tissus sains. La radiothérapie est particulièrement efficace dans le traitement des cancers du sein, de la prostate, du poumon et des cancers de la tête et du cou. Elle reste donc un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de de deux types de particules de très petite taille appelées nanoparticules : 1) des nanoparticules en métal qui permettrait d'augmenter localement la dose de radiation absorbée par les cellules cancéreuses et d’amplifier les dommages infligés aux cellules tumorales lors de l'exposition aux rayonnement, ou 2) des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des thérapies contre le cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester l’utilisation de nanoparticules, soit métalliques soit chargées en drogue anticancéreuse, améliorant la radiothérapie dans différents types de cancer. Ce projet se déroulera sur deux sites. Sur le premier (EU1), auront lieu : l’implantation des cellules cancéreuses et le suivi de croissance tumorale. Sur le deuxième (EU2), auront lieu les radiothérapies.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de développer de nouvelles particules pour pouvoir proposer un schéma de traitement optimal avec une bonne efficacité thérapeutique pour un transfert vers un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Interventions sur les animaux : anesthésie générale (EU1, entre 5 et 25 minutes), implantation sous cutanée et croissance de tumeur sous-cutanée (EU1, durée environ 10 minutes, 1 fois, suivi sur 8 semaine maximum), chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses (EU1, durée environ 20 minutes, 1 fois), croissance de tumeur dans leurs sites d'origine (poumons, pancréas, foie, cerveau , 8 semaines maximum), anesthésie pour imagerie médicale (EU1, durée environ 15 minutes, 1 fois/semaine, 8 semaines maximum), injection de produit de contraste et/ou de particules (EU2, 1 fois), radiothérapie (EU2, durée environ 20 mimnutes,1 fois). Le modèle de souris avec des défenses immunitaires réduites est une nuisance en soi.

Impact sur les animaux

L’inoculation de tumeur peut induire des douleurs que ce soit en sous-cutanée ou en sur le site de la tumeur originelle. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Les procédures d'imagerie sont indolores. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Nous aurons, par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les particules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires sur des tumeurs en culture 3D, nous nous focaliserons sur environ 20 particules différentes, constituant les candidates les plus prometteuses. Les paramètres d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les particules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Les particules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet ont des caractéristiques nuisibles pour leur santé, des mesures compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : mesures d’hygiène supplémentaires, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux avec des défenses immunitaires réduites, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. Le transport entre les EU s’effectuera dans des boites de transport avec enrichissement, boisson et nourriture. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. L’utilisation de souris avec des défenses immunitaires réduites permet l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie médicale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées de 5 semaines permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. À ce stade de développement, on obtient des souris adultes avec des tumeurs bien installées, juste avant que leur système immunitaire, en particulier les cellules qui combattent les infections et les tumeurs, n'atteigne son niveau maximal de production à 8 semaines. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues.

Pour mesurer si des nanoparticules inhalées par une mère abîment les poumons de sa descendance, 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Les femelles gestantes puis allaitantes reçoivent les nanoparticules directement dans la trachée sous anesthésie, une fois par semaine pendant six semaines. Leur descendance passe des mesures de fonction pulmonaire de 5 à 45 minutes, éveillée, à quatre stades de développement, de la fin de gestation à l'âge adulte. Le porteur annonce que les souriceaux grandissent normalement, tout en prévoyant qu'un comportement maternel anormal et des anomalies de développement pourraient apparaître, et une mise à mort rapide dès l'atteinte d'un point limite.

Objectifs

Les nanotechnologies sont en plein essor depuis le début du XXIème siècle. Cependant, l'utilisation exponentielle des nanoparticules (NP) suscite des inquiétudes quant à leurs potentiels effets sur la sante de l’Homme et sur l’environnement. En effet, en raison de leur présence dans de nombreux produits du quotidien (produits cosmétiques, alimentation, produits d’entretien, expositions professionnelles etc.), nous y sommes régulièrement exposés, que ce soit par voie cutanée, orale ou pulmonaire. Des analyses toxicologiques sont donc nécessaires pour connaitre les risques liés à leur utilisation, notamment dans le cadre d’expositions pendant la période périnatale, lorsque l’organisme en développement est particulièrement sensible aux agressions environnementales. Des études récentes réalisées chez la souris ont montré que des nanoparticules administrées à des femelles gestantes ou lactantes peuvent atteindre le fœtus, traversant la barrière placentaire via la circulation sanguine, ou le souriceau après passage dans le lait maternel. Les conséquences de ces expositions périnatales jusqu’à l’âge adulte sont encore peu étudiées, il apparait cependant qu’elles peuvent provoquer des défauts dans divers organes (reins, foie, organes sexuels) chez la descendance. Une étude a montré qu’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la gestation (voie pulmonaire) provoque des anomalies de développement pulmonaire chez la descendance. Ce présent projet s’inscrit dans leur continuité. Le développement pulmonaire (chez l’Homme comme chez la souris) comporte une phase prénatale et une phase post-natale allant jusqu’à un mois après la naissance chez la souris. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la période de lactation sur le développement et la fonction pulmonaires de la descendance et d’évaluer les potentiels effets combinés d’une exposition pendant la gestation et la lactation, à l’aide d’approches in vivo et in vitro complémentaires. Les résultats obtenus permettront de contribuer à l’évaluation des risques liés à ce type d’exposition chez les femmes enceintes, allaitantes et leurs enfants.

Bénéfices attendus

Bien que l’impact d’une exposition directe aux nanoparticules sur le site d’exposition (poumons, systeme digestif) ait été bien décrit ces dernieres années, les conséquences d’expositions maternelles aux nanoparticules sont relativement peu etudiées et se concentrent sur le développement prénatal de la descendance. Les analyses des conséquences a l’age adulte d’expositions périnatales a ces nanoparticules sont rares, notamment dans le cas particulier du développement pulmonaire. Ce projet nous permettra donc d’en apprendre davantage sur la toxicite des nanoparticules chez la souris, dans un modèle in vivo permettant d’étudier la transmission de ces particules de la mère a la descendance (circulation sanguine, lait maternel) et ses conséquences sur le développement pulmonaire des souriceaux dans des conditions physiologiques. Ce projet aura pour bénéfice de contribuer a l’évaluation des risques liés a des expositions périnatales aux nanoparticules pour les femmes enceintes, allaitantes ainsi que leurs enfants.

Procédures

Les femelles gestantes et lactantes seront soumises a des expositions pulmonaires aux nanoparticules (administration par voie pulmonaire via la trachée) sous anesthésie de manière hebdomadaire pendant 6 semaines (geste technique realisé en quelques minutes, réveil et récupération rapides pour l’animal). La descendance sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant de 5 à 45 minutes à plusieurs stades de leurs vies.

Impact sur les animaux

La descendance des souris femelles exposées aux nanoparticules au cours de la gestation ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. Dans le cadre de ce projet, les expositions comprendront la période de gestation ainsi que celle de lactation. L’exposition des femelles chaque semaine pendant la gestation puis la lactation pourrait induire un stress conduisant à un comportement maternel anormal. Des anomalies de développement pourraient apparaitre chez la descendance, une attention particulière sera portée a leur croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux nanoparticules (prélèvement d'organes).

Remplacement

Notre étude porte sur l’impact d’une exposition maternelle aux nanoparticules sur le développement pulmonaire de la descendance. Ces nanoparticules peuvent passer des poumons de la mère à son systeme sanguin, s’accumuler dans ses organes et enfin atteindre la descendance, en traversant le placenta ou en passant dans le lait maternel ingéré par les nouveau-nés. Cette transmission résulte d'une complexité impossible a modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Nous avons optimisé les protocoles afin d’étudier le phénotype pulmonaire à la fois des mâles et des femelles. Nous réalisons un maximum d’analyses sur le même animal afin d’utiliser tous les animaux générés dans nos procédures et d’en minimiser le nombre, tout en gardant la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence des variations biologiques Afin de reduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous n’effectuerons que les seules expériences indispensables, et nous nous efforcerons de réutiliser les animaux lorsque celà est possible, notamment le contingent de mâles d’accouplement nécessaires pour générer des femelles gestantes.

Raffinement

Pour les besoins de notre étude, nous travaillerons avec les femelles gestantes et lactantes particulièrement sensibles au stress. Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser ce stress, en les hébergeant a deux par cage, en rangeant ces cages aux endroits de plus faible passage dans le box d’hébergement, et en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanieres de papier. Apres le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hebergées en groupes sociaux de 5 souris maximum par cage, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront realisées en limitant au maximum la souffrance et l’angoisse animale. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise a mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modele murin a été choisi dans notre projet car la souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la litterature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, le projet nécessite un modèle mammifère permettant la transmission des nanoparticules de la mère a la descendance par la circulation sanguine et le lait maternel. Or, les quelques études décrivant cette transmission ont été réaliées dans le modèle murin. Le but du projet est de caractériser les effets d’une exposition périnatale aux nanoparticules sur le développement et la fonction pulmonaires jusqu’à l’âge adulte, les poumons se développant chez la souris en pré et post-natal. Le phénotype pulmonaire de la descendance sera analysé a 4 stades : en fin de gestation (dernier tiers), a la naissance (nouveau-ne) afin d’étudier l’impact d’une exposition prénatale, au stade juvénile afin de visualiser les effets d’une exposition post-natale pendant la période de lactation et à l’âge adulte afin d’en évaluer les conséquences a long terme

La moitié des souris utilisées est immunodéprimée, dépourvue de lymphocytes T et B matures, ce qui garantit selon le porteur une prise tumorale dans 100 % des cas. 48 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous anesthésie une injection sous-cutanée de cellules de corticosurrénalome puis une injection de lymphocytes modifiés par voie rétro-orbitaire, avant six mesures de tumeur au pied à coulisse ou huit échographies avec rasage des flancs. Le porteur signale que la croissance tumorale peut provoquer une douleur modérée et des métastases, et compte l'usage de souris immunodéprimées parmi ses mesures de réduction du nombre d'animaux.

Objectifs

Le carcinome corticosurrénalien (CCS), est un cancer agressif avec environ 35 % des patients présentant des métastases au diagnostic. Le mauvais pronostic du CCS peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients de CCS à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Malgré des traitements lourds, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, ont de faibles chances de survie à long terme. Des analyses préliminaires ont permis de mettre en évidence que la protéine CD276 est surexprimée dans les CCS de patients et que cette surexpression est associée à une diminution de la survie globale. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’utiliser des lymphocytes T modifiés génétiquement (cellules CAR [Chimeric Antigenic Receptor]-T) dans le but de reconnaître CD276 exprimé à la surface des cellules cancéreuses puis de les éliminer. Ces expériences seront réalisées sur un modèle simple (souris immunodéficientes) pour la preuve de concept puis dans un modèle plus complexe de souris génétiquement modifiées reproduisant les deux altérations génétiques les plus fréquemment retrouvées chez les patients porteurs des CCS agressifs.

Bénéfices attendus

Le carcinome corticosurrénalien est un cancer agressif et de mauvais pronostic, dû au manque de thérapies efficaces. La réalisation de ce projet nous permettra d’évaluer le potentiel antitumoral de lymphocytes T modifiés génétiquement pour reconnaître CD276 exprimé à la surface des cellules cancéreuses puis de les éliminer. L’objectif de ces expériences est de développer une nouvelle approche thérapeutique qui permettra à terme, d’améliorer le traitement et la survie des patients.

Procédures

- Procédure 1, sur les 24 souris : Rasage sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Injection sous-cutanée des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Injection intra-veineuse des cellules CAR-T sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Mesure des tumeurs au pieds à coulisse. Durée 1min, 6 fois - Procédure 2, sur les 24 souris: Injection intra-veineuse des cellules cellules CAR-T sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Mesure des tumeurs par échographie sous anesthésie gazeuse + rasage des flancs. Durée 30min, 8 fois.

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1, l’injection sous-cutanée des cellules dérivées de corticosurrénalome murin, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur légère et de courte durée au site d’implantation. La mesure des tumeurs au pied à coulisse n’est pas douloureuse mais peut induire un stress léger dû à la contention de l’animal. L’injection par voie retro-orbitaire des cellules CAR-T, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. Enfin la croissance tumorale peut engendrer une douleur/gène modérée. Dans la procédure 2, l’injection par voie retro-orbitaire des cellules CAR-T, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. L’échographie, réalisée sous anesthésie gazeuse, n’engendre pas de douleur mais peut induire un stress léger. Le modèle murin de CCS avancé utilisé présente un développement tumoral et éventuellement des métastases.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer les nouvelles approches de traitement des corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro. Ainsi les premiers tests de spécificité et d’efficacité des cellules CAR-T CD276 seront réalisés sur une lignée de cellules dérivées d’un CCS métastatique, dans des conditions de culture optimales. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour des expériences de cytométrie en flux et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. En procédure 1, l’utilisation de souris immunodéficiente permet une croissance tumorale dans 100% des cas, contrairement à l’utilisation de souris immunocompétentes et une survie/prolifération des cellules CAR-T supérieure. Cette procédure nous permettra de vérifier que les cellules CAR-T survivent, prolifèrent et s’attaquent bien aux tumeurs le tout dans d’un modèle plus rapide et à effets indésirables moins important qu’un génotype créant des tumeurs agressives. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’établissement de notre preuve de concept. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 12 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Plus précisément, les souris immunodéficientes seront hébergées dans une zone dédiée aux animaux immunodéficients avec armoire ventilée, couvercle de cage filtrant, litière autoclavée et eau filtrée. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate, de tunnels en plastique ou de billes en inox. Le choix de l’enrichissement sera réalisé en fonction de l’état général de l’animal, par exemple en cas de développement d’une tumeur importante l’ajout de plaques de papier à ronger ou de batons en bois sera choisi à la place de tunnels qui pourraient blesser l’animal. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 individus (sauf indication contraire) pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.

Choix des espèces

Choix des espèces : Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Pour la procédure 1 nous utiliserons une souche de souris immunodéprimée, caractérisée par une absence de production de lymphocytes T et B matures. L’utilisation de cette souche permet une croissance tumorale dans 100% des cas, contrairement à l’utilisation de souris immunocompétentes et une survie/prolifération des cellules CAR-T supérieure ce qui in fine permet de résuire le nombre d’animaux utilisés. La lignée murine utilisée pour la procédure 2 est un modèle préclinique murin pertinant de corticosurrénalome métastatique reposant sur l’invalidation surrénalienne de deux gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients portant les corticosurrénalomes les plus agressifs. Stades de développement : Pour la procédure 1 nous injecterons les cellules dérivées d’un CCS métastatique murin dans les souris à l’âge de 6 semaines, âge où le système immunitaire est mature, puis les cellules CAR-T 7 jours plus tard. La croissance tumorale sera suivie pendant 14 jours supplémentaires soit un âge final de 9 semaines au moment de l’euthanasie. Pour la procédure 2, nous avons montré que notre modèle préclinique murin développe des corticosurrénalomes agressifs à partir de 4 mois et que la dissémination métastatique est évidente à 6 mois. Nous effectuerons donc le traitement avec les cellules CAR-T à 4 mois et effectuerons le suivi longitudinal de la progression tumorale par échographe jusqu’à 6 mois.